PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE...
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PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO
M. Pía Cerdeiras
CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA
FACULTAD DE QUIMICA
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Requisitos para el desarrollo de un ACB
• Selección de un agente superior.• Producción abundante y a un costo adecuado de
propágulos.
• Formulación adecuada.
• Vida útil del producto final adecuada, preferiblemente sin refrigeración.
• Eficacia alta y estable en condiciones de uso a través de un sistema de aplicación adecuado.
• Registro/aprobación.
• Patente
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Producción
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Producción de ACBs
• Fermentación sumergida (sustrato líquido) (FSL)
• Fermentación sobre sustrato sólido (FSS).
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Crecimiento
Crecimiento implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y
no solamente de alguno de ellos.
En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de
células más que un aumento en el tamaño celular
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Crecimiento de un microorganismo en medio de cultivo líquido
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Crecimiento en cultivo en lote (batch)
• Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen
• Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares, tiempo de generación mínimo
• Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 ó estadísticamente = 0
cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte)
– nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad
– acumulación de desechos, inhibición del crecimiento
• Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división celular
Luego de la adición de m.o. al medio líquido fresco se observa la siguiente cinética de crecimiento
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Fermentación sobre sustrato sólido
Existe falta de conocimiento en cuanto a patrones y cinética de crecimiento en FSS
• La disposición 3-D del micelio y del sustrato.
• La heterogeneidad del sustrato en sí.
• La dificultad de obtener medidas directas de la biomasa microbiana formada.
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1- Determinación del número de microorganismos
• Métodos directos: recuento total
• Métodos indirectos: recuento de viables
Evaluación del crecimiento
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2- Determinación de la masa celular
• Métodos directos–Medida de la masa–Medida del volumen
• Métodos indirectos–Determinación del contenido de N, C, P, etc–Turbidimetría
3- Determinación de la actividad celular
–Actividad enzimática–Concentración de un metabolito–Medida de la respiración
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Diferencias entre FSS y FSL
• Algunos hongos filamentosos no pueden ser crecidos en FSL.
• Algunos hongos sólo esporulan en FSS.
• Los sistemas de fermentación a nivel industrial están más desarrollados para la FSL.
• Los sistemas de FSL son más fáciles de controlar (temp., pH., etc.).
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El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo
• Relación C/N
• Actividad de agua
• Sistema de cultivo (FSL oFSS)
• Momento de la cosecha
• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
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El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo
• Relación C/N
• Actividad de agua
• Sistema de cultivo (FSL oFSS)
• Momento de la cosecha
• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
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Influencia del medio de cultivo sobre la eficiencia de las ascosporas de Talaromyces flavus contra
marchitamiento a VerticiliumSpores produced per petri dish
2 x 1010
4 x 1010
8 x 109
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El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo
• Relación C/N
• Actividad de agua
• Sistema de cultivo (FSL oFSS)
• Momento de la cosecha
• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
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Relación C/N del medio de cultivo afecta la morfología de los conidios de Colletotrichum
truncatum
10:1 30:1 80:1
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Relación C/N del medio de cultivo afecta la calidad de los conidios de Colletotrichum
truncatum
Parámetro de calidad
Relación C/N
1:10 1:30 1:80
Producción de conidios
+ ++ +
Velocidad de germinación
rápida lenta lenta
Formación de apresorios
Alto bajo bajo
Contenido de proteínas
alto bajo Bajo
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El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo
• Relación C/N
• Actividad de agua
• Sistema de cultivo (FSL oFSS)
• Momento de la cosecha
• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
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Efecto del potencial de agua (WP) sobre la cantidad y calidad de conidios de
Trichoderma harzianum
Medio WP Biomasa Log conidia Germinación Mpa g/l por g (%)
RM8+0% glicerol -0.8 358 A 10.72 A 4.0 A
RM8+3% glicerol -2.0 492 D 10.75 A 15.3 B RM8+6% glicerol -2.8 447 C 10.86 B 35.9 C RM8+9% glicerol -3.7 444 C 11.04 C 67.3 D RM8+12% glicerol -4.8 400 B 10.76 A 37.0 D
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El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo
• Relación C/N
• Actividad de agua
• Sistema de cultivo (FSL oFSS)
• Momento de la cosecha
• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
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Influencia del sistema de cultivo sobre la producción de conidios de Trichoderma
harzianum
Parámetro Sólido Líquido
Producción (log esporas/ml) 10.0 8.0
Tiempo de incubación (h) 76.0 48.0
Productividad (log esporas/ml/h) 8.1 6.3
Sistema de cultivo
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Propiedades de esporas de Trichoderma harzianum producidas por FSS y FSL
Esporas producidas por Propiedad
FSS FSL
Resistencia a UV (LD50, min.)
4.0 2.4
Vida util (% ufc luego de 45 días a 25C)
100.0 15.0
Hidrofobicidad ++ -
Grosor de pared (nm) W2 W1 Total
119.0 116.0 235.0
30.0 150.0 180.0
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El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo
• Relación C/N
• Actividad de agua
• Sistema de cultivo (FSL oFSS)
• Momento de la cosecha
• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
![Page 26: PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE QUIMICA.](https://reader036.fdocumento.com/reader036/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f7952/html5/thumbnails/26.jpg)
Crecimiento de un microorganismo en medio de cultivo líquido
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Efecto del momento de la cosecha sobre la viabilidad de clamidosporas de Gliocladium
virens
25C4C
88981.25 x 108160
82981.2 x 108135
73861.2 x 108120
62781.0 x 108113
29596.1 x 10791
17415.2 x 10787
12192.5 x 10664
00043
Viabilidad luego de 300 días Productividad
UFC ml –1
Cosecha (h)
Eyal et al., 1997
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El método de producción puede afectar la morfología, cantidad y calidad de los
elemento de propagación
• Grosor de la pared de los conidios • Tipo y tamaño de los conidios• Velocidad de germinación• Hidrofobicidad• Vida útil• Productividad• Resistencia al UV• Eficiencia como biocontrolador
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Formulación
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Formulación
La mezcla de ingredientes y la forma de preparar un principio activo para su empaque, almacenamiento y expedición al lugar de uso.
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Cuatro funciones básicas de la formulación:
• Estabilizar el principio activo.
• Ayudar en su manejo y aplicación.
• Protegerlo de factores ambientales adversos en el sitio de acción, y por lo tanto aumentar su persistencia.
• Aumentar su actividad en el sitio de acción, ya sea por aumento real de la actividad, y/o por aumento de la reproducción, contacto o interacción con el patógeno diana.
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Problemas hallados durante la formulación de ACBs.
Cosecha
Estabilización
Almacenamiento
Aplicación
Post-aplicación
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Tipos de formulaciones
Productos secos
Polvos, gránulos
Perlas de alginato, capsulas
Polvos mojables
Productos líquidos
Suspensiones acuosas u oleosas
Emulsiones w/o o o/w
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Aditivos (excipientes)
• Carriers• Binders• Adherentes• Surfactantes• Emulsificantes• Humectantes• Desecantes• Protectores solares
![Page 35: PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE QUIMICA.](https://reader036.fdocumento.com/reader036/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f7952/html5/thumbnails/35.jpg)
Supervivencia de Pseudomonas fluorescens en diferentes carrier a 25°C
Carrier 0 30 60
Número de P. flourescens (10x UFC/g) a distintos días de almacenamiento
Turba 6.6 a 5.2 a 4.4 aTalco 6.8 a 3.7 c 2.9 bLignita 6.4 a 4.9 b 2.7 b
(Rabidran & Vidhyasekaran, 1996)
![Page 36: PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE QUIMICA.](https://reader036.fdocumento.com/reader036/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f7952/html5/thumbnails/36.jpg)
![Page 37: PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE QUIMICA.](https://reader036.fdocumento.com/reader036/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f7952/html5/thumbnails/37.jpg)
Número de conidias y clamidosporas de Trichoderma en tierra
![Page 38: PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO M. Pía Cerdeiras CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA FACULTAD DE QUIMICA.](https://reader036.fdocumento.com/reader036/viewer/2022062409/5665b4241a28abb57c8f7952/html5/thumbnails/38.jpg)
0 10 20 30 40 50 600
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Sphagnum-bran, 4 C
Sphagnum-bran + Si, 4 C
Sphagnum-bran, 20 C
Sphagnum-bran + Si, 20 C
Weeks
log
cfu
/g i
no
cu
lum
Supervivencia de IK726 con y sin agregado de desecante
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Formulación óptima se relaciona con:
• El ACB en particular
• Método de producción
• Excipientes