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VII CAIQ2013 y 2das JASP
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PRODUCCIÓN DE BIOMASA MICROALGAL EN UN
FOTOBIORREACTOR DISCONTINUO EN ESCALA PILOTO
DE CONFIGURACIÓN VARIABLE EN RÉGIMEN DE
INCREMENTO LINEAL DE LA CONCENTRACIÓN.
E. J. Rost1
, L. B. Pérez2, M. R. Carstens
1, S. G. Perales
2
1Facultad de Ingeniería;
2Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nac. de la
Patagonia S. J. Bosco. Ruta Prov. 1 Km 4, 9000 Comodoro Rivadavia, Chubut.
Resumen. Se estudia el desarrollo del cultivo de microalgas fototróficas en un
fotobiorreactor de burbujeo de escala piloto y geometría variable, constituido
por dos tubos cilíndricos verticales concéntricos, con burbujeo distribuido en
el espacio anular. Esta geometría permite optar entre dos variantes
fluidodinámicas denominadas de flujo restringido y de flujo total. Se ha
ensayado con dos especies de microalgas marinas, Phaeodactylum
tricornutum y Tetraselmis sp., en condiciones de sobre disponibilidad de
nutrientes. En ambos casos, en operación semicontinua, se han registrado
períodos de incremento lineal sostenido de las concentraciones de biomasa, de
entre 0,2 y un máximo de 3,0 g/L. La máxima concentración obtenible y la
velocidad de producción de biomasa se ven afectadas por el cambio que sobre
la disponibilidad de energía lumínica provoca el cambio de la fluidodinámica
del fotobiorreactor (FBR). Por último, se propone una modificación del
modelo cinético de crecimiento exponencial de modo de introducir el efecto
del ensombrecimiento muto entre células a alta concentración, consiguiendo
un adecuado ajuste con los datos obtenidos.
Palabras clave: fotobiorreactor, modelamiento, microalgas.
A quien debe dirigirse toda la correspondencia.
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1. Introducción
El diseño de reactores es una de las temáticas de mayor valor económico industrial
entre las que son consideradas especialidades de la Ingeniería Química. En la búsqueda
de procesos de mayor eficiencia económica, es práctica necesaria obtener información
empírica pertinente al escalamiento de las unidades en desarrollo. En el área de la
biotecnología esta tarea se encuentra entre las de mayor complejidad, con datos de
difícil reproducibilidad por el número y tipo de variables que influyen en el proceso,
toda vez que se trabaja con material biológico vivo.
Existen dos diseños básicos de sistemas para el cultivo artificial de microalgas: los
abiertos, en los que el cultivo se realiza en contenedores agitados expuestos a la
atmósfera, y los sistemas cerrados, comúnmente denominados fotobiorreactores (FBR).
En éstos últimos la luz que incide sobre el cultivo lo hace a través de las paredes
translúcidas del recipiente que lo contiene, presentando importantes ventajas respecto de
los sistemas abiertos debido a un mejor control de las condiciones de operación
(Grobbelaar, 2008). Esto permite obtener mayores volúmenes de producción con altas
concentraciones celulares (más de 3 g/L en los denominados de “alta densidad celular”).
Desde el punto de vista de su diseño, los FBR pueden ser construidos con diferentes
geometrías y alternativas de iluminación, favoreciendo un empleo óptimo de la energía,
y aplicando diferentes métodos de mezclado mediante agitadores, bombas o,
comúnmente, burbujeadores de aire. Constituyen por lo tanto, sistemas cerrados con una
gran flexibilidad para permitir muchas opciones de optimización para una mejor
productividad y acorde con las características de crecimiento y reproducción que poseen
las distintas especies cultivables.
Se presentan aquí los resultados empíricos obtenidos en un FBR de escala piloto, de
tubos concéntricos verticales con burbujeo en el espacio anular, del cultivo de dos
especies de microalgas de aguas salobres, Phaeodactylum tricornutum y Tetraselmis sp.,
típicas productoras de ácidos grasos poliinsaturados -3. La geometría de este FBR
permite alternar entre dos configuraciones que involucran diferentes volúmenes de
cultivo, con lo que se puede analizar el efecto que sobre la producción de biomasa
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realiza un aumento del volumen de cultivo en desmedro del empobrecimiento de la
captación de energía lumínica. Adicionalmente, se propone un modelo cinético simple
de estimación de la evolución de la concentración de biomasa, mediante la afectación de
la ecuación cinética de crecimiento exponencial de modo de considerar el fenómeno de
ensombrecimiento mutuo de las células, y que ajusta convenientemente los datos
obtenidos en la fase lineal.
2. La unidad experimental
Una de las variantes de FBR más empleadas para el cultivo de microalgas es la de
tubos cilíndricos verticales, en los que se ha dispuesto en su base un burbujeador por el
que se introduce aire y un pequeño volumen de CO2. Las geometrías más utilizadas son
las de un cilindro vertical simple (bubble column) y la de tubos concéntricos (draft
column), en ambos caso con un burbujeador central y caracterizados por un flujo
ascendente en el centro del reactor y descendente por la zona inmediata a la pared
externa. Se ha estudiado también la configuración de tubo dividido (split column), con
un tabique plano vertical que separa el espacio interior en dos mitades y con burbujeador
desplazado hacia una de éstas (Sánchez Mirón et al., 2002; Luo y Al-Dahhan, 2011).
El FBR en escala piloto de que se dispone para este trabajo es de tubos concéntricos
con burbujeo en el espacio anular. De acuerdo a los esquemas presentados en la figura 1,
el mismo permite trabajar con dos configuraciones alternativas de interés para la
obtención de datos empíricos: a) de flujo restringido, con el cultivo desarrollándose en el
espacio anular entre tubos, donde desde el punto de vista fluidomecánico el ascenso de
burbujas provoca un vigoroso mezclado, y b) con flujo total, donde el cultivo ocupa el
total del volumen del reactor –anular más interior del tubo interno- provocándose por
efecto air-lift del sistema de burbujeo un flujo ascendente por el espacio anular con
retorno o flujo descendente por el interior del tubo interno. La capacidad de cultivo que
tiene la unidad disponible para este trabajo, es de 15 L en flujo restringido y 22 L en
flujo total.
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Figura 1. Representación esquemática de los dos
modelos de flujo alternativos del FBR de burbujeo
de tubos concéntricos.
Los tubos son de metacrilato de etilo con las siguientes dimensiones: cilindro externo
de 200 mm de diámetro externo (pared de 4 mm) y cilindro interior de 120 mm (pared de
4 mm), con una longitud total o altura de 1000 mm. En la variante de flujo total la
longitud del tubo interno es de 750 mm, ubicándose su extremo inferior a 20 mm por
encima del fondo del FBR.
En la figura 2 se presenta un esquema de la instalación en lo concerniente al
transporte de fluidos. El aire es provisto por un compresor equipado con trampa de
líquidos y válvula reductora de presión y el CO2 proviene de un cilindro a presión
también a través de una válvula reductora. Los caudales de ambas corrientes son
medidos mediante dos caudalímetros del tipo rotámetro, antes de mezclarse de acuerdo
a la proporción que se fija mediante sendas válvulas aguja. El volumen de aire
ingresado es del orden de 200 L/min y la de CO2 de 5 L/min. La mezcla se hace
circular luego por un filtro estéril con membrana de polietileno de tamaño de poro de
0,2 m para eliminar contaminantes y se envía a un pulmón-distribuidor de donde la
mezcla es conducida a los burbujeadores.
Los gases ingresan a través de 8 burbujeadores independientes, distribuidos
simétricamente en la zona correspondiente al espacio anular. Se trata de tubos de acero
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inoxidable de ⅛” de diámetro con forma de “L” con tres perforaciones laterales de 1 mm
en el tramo horizontal.
El sistema se encuentra equipado con un sistema de luz artificial, con tubos
fluorescentes de luz blanca de 30 W cada distribuidos uno alrededor del FBR, con una
capacidad máxima de instalación de 8 tubos (lo que corresponde a una irradiancia
promedio máxima disponible de 180 E/(m2.s) en la superficie interna del FBR de
acuerdo a determinaciones realizadas empíricamente).
Figura 2. Esquema de instalación del FBR con detalle de las líneas de
gas y líquido. 1) fotobiorreactor (FBR); Líneas de gas: 2) compresor, 3)
trampa de condensado, 4) válvula reductora de presión, 5) caudalímetro
(rotámetro), 6) válvula aguja, 7) fuente de CO2, 8) válvula reductora, 9)
caudalímetro, 10) válvula aguja, 11) mezclador, 12) filtro esterilizador, 13)
pulmón y distribuidor de gas a burbujeadores, 14) conjunto de válvulas de
regulación de caudal independiente de cada burbujeador, 15) descarga de
gases y espuma. Líneas de líquido: 16) depósito de agua y medio de
cultivo, 17) purga, 18) filtro esterilizador, 19) puerto de ingreso de inóculo y
otros volúmenes pequeños previamente esterilizados, 20) juego de válvulas
de ingreso, 21) válvula de muestreo y de cosecha, 22) circuito de
refrigeración.
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3. Metodología experimental
Para la preparación del medio de cultivo se ha adoptado la formulación de Laing
(1991) empleando agua de mar recogida en un lugar de baja contaminación
comprobada, de un punto costero distante 40 km al sur de Comodoro Rivadavia, y
mantenida en ambiente oscuro durante 4 meses (como mínimo) antes de su utilización.
Durante el llenado del reactor esta agua es esterilizada mediante su pasaje por un filtro
de membrana de polietileno.
El pH del medio de cultivo se mantiene mediante la introducción de un porcentaje
constante de CO2 en la corriente de aire que ingresa al FBR, normalmente entre 2 y 3%
del volumen de éste (Wu et al., 2004; Barbosa et al., 2003), realizando periódicamente
un control manual coincidente con el muestreo realizado para cuantificación del
crecimiento de la biomasa.
El mantenimiento de las cepas disponibles se realiza en el cepario del Laboratorio de
Microalgas del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias Naturales,
siguiendo la metodología descripta por Provasoli (1968) y McLachlan (1973). Para ello
se inocula 0,1 ml de la cepa original en tubos de ensayos con 10 ml de medio
Erdschreiber líquido, que se disponen en un ambiente acondicionado a 21°C con
iluminación intermitente (fotoperiodo de 16 hs) con una intensidad lumínica de 120
E/(m2.s). Los repiques se realizan cada 25 días. La preparación del inóculo que se
planta en el FBR se realiza a partir de los tubos de ensayo mencionados antes, mediante
el cultivo en mayor volumen (de 125 a 500 cm3) con un medio de cultivo idéntico al que
se emplea en la unidad piloto. En el proceso de cambio de volumen se emplea una
concentración inicial de 5x104 cel./ml, en condiciones de crecimiento en fase
exponencial.
Para la esterilización de los elementos y de los medios de cultivo empleados en la
preparación del inóculo se emplea autoclave y la preparación de medios y el manipuleo
de las algas se realizan en un cuarto de siembra provisto de luz UV. Para la
esterilización del FBR, en función de su tamaño, se procede a lavar con agua oxigenada
de 10 volúmenes.
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El FBR es operado en modo semicontinuo, esto es, realizando cosechas parciales en
períodos de crecimiento en fase lineal, y con fotoperiodo de 16 h. El período de cultivo
entre cosechas se fija determinando en el primer ciclo el cambio de fase lineal a
estacionaria, de modo de estimar la concentración de biomasa máxima alcanzable. A los
efectos de no introducir disturbios en el cultivo, el muestreo periódico se realiza
extrayendo cantidades mínimas, del orden de 10 mL, determinando la concentración de
biomasa por técnica turbidimétrica mediante un fotómetro Hach modelo DR2010. El
factor de respuesta de este instrumento se ajusta tomando de referencia la medición de
concentración final, realizada mediante pesada de la biomasa cosechada deshidratada a
la finalización de cada ciclo.
Una muestra de 400 mL del cultivo cosechado al final de cada ciclo es centrifugado
para obtener la biomasa que luego se procede a secar en estufa a 3640°C hasta pesada
constante. La misma es mantenida en freezer a -18°C para su conservación para
determinación del contenido de lípidos.
4. Modelamiento
Durante el proceso de reproducción de la biomasa microalgal, en forma semejante a
otros microorganismos, ocurren etapas características que es necesario describir para
lograr una adecuado modelamiento del mismo. En condiciones de ausencia de
limitación de insumos, se presenta una etapa inicial de adaptación cuando la
concentración de biomasa es muy pequeña, seguida de una fase de rápido crecimiento de
orden exponencial. Se presenta luego una situación de competencia espacial en la
captura de la energía lumínica disponible para fotosíntesis, debido a que en la línea de
transferencia de luz desde la superficie del FBR las células (que pueden ser consideradas
como centros de captación fotónica) que se encuentran más cercanas a la fuente de luz
interceptan la misma ensombreciendo a las que se encuentran más lejanas. En esta fase
se puede observar que el incremento de la concentración de biomasa se ajusta a un
modelo lineal o de productividad constante.
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Esto se mantiene hasta que, debido a limitación de los recursos de consumo (ya sea
lumínico o de nutrientes) se observa una rápida disminución de la tasa de crecimiento,
ingresando en una fase estacionaria con producción nula, con equilibrio entre las
velocidades de reproducción y de muerte de células. Finalmente, si la tasa de muerte es
superior a la de reproducción, se produce una fase de declive (tasa negativa de
crecimiento) con tendencia a desaparición de la biomasa.
En la etapa de crecimiento exponencial típicamente la velocidad de producción de
biomasa se ajusta al modelo cinético:
1
max
dC
C dt (1)
siendo C la concentración másica y max la velocidad específica máxima. Esta ecuación
puede integrarse, en condiciones de cultivo discontinuo y con concentración inicial 0C
para obtener la función:
0( ) exp( )maxC t C t (2)
Dado que la velocidad de reproducción se ve afectada por el fenómeno de
ensombrecimiento mutuo de las células, el modelo exponencial sólo es útil para
concentraciones de biomasa reducidas. Para simular la fase de crecimiento lineal, se ha
encontrado que es posible mantener el modelo anterior afectando la velocidad específica
por el cociente de la irradiancia promedio en el medio de cultivo Iav y la irradiancia de la
luz incidente en la superficie externa del FBR, I0:
0
0
( ) exp( ); avav av max
IC t C t
I (3)
Para evaluar la irradiancia o densidad de flujo fotónico en el interior de un FBR se
han desarrollado ecuaciones basadas en la ley de Lambert-Beer. Aunque válida sólo para
propagación unidimensional, se ha encontrado que es satisfactoria para su aplicación a
un FBR cilíndrico sobre la base de considerar que la superficie del mismo está
uniformemente iluminada y que cada punto de la superficie interna de la pared se
comporta como una fuente de luz. Entonces, la irradiancia en el interior del medio de
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cultivo en función de la concentración de biomasa puede describirse mediante la
ecuación (Evers, 1991):
2 2 2 0,50
0( , ) exp ( )cos ( ( ) sen )C
II d C K C R d R R d d
(4)
donde KC es un coeficiente de extinción, R el radio del cilindro del FBR y d la distancia
desde la superficie del reactor al elemento receptor. En esta ecuación no se considera
interferencia debida al material de la pared del FBR.
Cuando la concentración de biomasa es alta la I(d,C) es sustancial sólo cerca de la
superficie del FBR y en esta situación la ecuación (4) se puede reducir a (Barbosa et al.,
2003; García et al., 2006; Wu y Merchuk; 2001, 2004):
0( , ) exp( )CI d C I K d C (5)
La irradiancia promedio en el interior del cultivo, finalmente, se puede calcular
integrando la función previa obteniéndose la siguiente ecuación (García et al., 2006;
Acién et al., 1998):
0 1 exp(av C
C
II K RC
K RC (6)
A los efectos de su aplicación al FBR empleado, y con los resultados que se indican a
continuación, se ha identificado a R con la profundidad del cultivo en el espacio anular,
o sea el espesor de este volumen, lo cual es apropiado operando con el FBR en la
variante de flujo restringido. En el caso de flujo total se ha hecho consideración de que a
concentraciones donde predomina el ensombrecimiento entre células se puede ignorar el
proceso de evolución del cultivo en el volumen interno, por cuanto la irradiancia I(d,C)
disminuye muy rápidamente en las capas líquidas más cercanas a la pared iluminada.
Así mismo, se considera aceptable emplear el valor de irradiancia promedio en el
espacio anular debido a que el intenso mezclado provocado por el burbujeo de gases
permite inferir que todas las células acceden a dosis de energía lumínica en forma
homogénea durante su trayecto en esta zona.
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5. Resultados
Del total de experiencias de cultivo realizadas en las dos variantes de flujo y con las
dos especies de microalgas indicadas, se han seleccionado los datos que se presentan a
continuación. En todos los casos el valor de irradiancia promedio en la superficie
externa del FBR fue de 125 E/(m2.s).
En la figura 3 se presentan las evoluciones de concentración de biomasa
determinadas durante dos de las experiencias realizadas de cultivo de la especie
Phaeodactylum tricornutum, correspondiendo el diagrama de la izquierda a la
configuración de flujo restringido (volumen de cultivo de 15 L). La misma comprende 4
ciclos (o sea, 4 cosechas) con valor final de concentración de cerca de 2 g/L en cada
uno, sin arribar netamente a la fase estacionaria, como se puede observar. El diagrama
de la derecha indica la evolución determinada operando en la configuración de flujo
total (22 L) con 3 ciclos.
Figura 3. Evolución de la concentración de biomasa durante experiencias realizadas con
la especie P. tricornutum. El primer diagrama corresponde a operación con el FBR en
flujo restringido (15 L) y el segundo en flujo total (22 L). Se utilizó una técnica
turbidimétrica para determinar los valores de concentración durante el proceso y el valor
final de cada ciclo se obtuvo por pesada de la biomasa cosechada.
En función de los valores obtenidos de velocidad de producción de biomasa, de 0,214
y 0,133 g/(L.día) para flujo restringido y total respectivamente, queda en evidencia que
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el mayor volumen atenta contra la captación de energía lumínica, provocando una
velocidad de crecimiento menor como así también una concentración final posible
menor (en el segundo caso se puede observar en la figura que en cada ciclo el cultivo se
acerca a la meseta de fase estacionaria).
La figura 4 es semejante a la anterior, correspondiendo a dos de las experiencias
realizadas con Tetraselmis sp. Para esta especie se obtuvieron velocidades de
crecimiento promedio de 0,167 y 0,105 g/(L.dia) operando con flujo restringido y flujo
total respectivamente y concentraciones finales máximas del orden de 2,5 g/L en la
primera opción. En estos últimos ensayos, además y como se puede observar en los
diagramas presentados, cada ciclo de cultivo fue iniciado con una concentración del
orden de 0,2 g/L, lo que permitió operar casi permanentemente en condiciones de
crecimiento lineal.
Figura 4. Evolución de la concentración de biomasa durante experiencias realizadas con la
especie Tetraselmis sp. El primer diagrama corresponde a operación con el FBR en flujo
restringido (15 L) y el segundo en flujo total (22 L). Se utilizó una técnica turbidimétrica
para determinar los valores de concentración durante el proceso y el valor final de cada ciclo
se obtuvo por pesada de la biomasa cosechada.
Las velocidades de producción de biomasa en fase lineal informadas se obtuvieron
mediante regresión lineal involucrando el total de los datos de concentración de cada
experiencia. En la configuración de flujo total, la relación de volumen iluminado (la del
espacio anular) a volumen total es de 0,63. Este factor es coincidente, dentro de
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márgenes de error razonables en función de los recursos empíricos empleados, con el de
la relación de las velocidades de crecimiento lineal en las variantes de flujo fraccionado
y flujo total, lo que puede entenderse como una relación directa entre la velocidad de
reproducción celular y la fracción del período de iluminación a que acceden las células
en su recorrido por el interior del FBR.
Para realizar el modelamiento matemático de la evolución de la concentración de
biomasa en cada ciclo, tal como se indicó en Modelamiento, se propuso emplear el
modelo de crecimiento exponencial modificado de modo de considerar el efecto de
ensombrecimiento entre células, que es cada vez más severo al aumentar el número de
éstas. Se obtuvieron resultados notablemente satisfactorios, como puede observarse en
las figuras 5 y 6, al menos en lo que a predicción del comportamiento se refiere por
cuanto sólo se realizó un tratamiento estadístico en forma aislada para cada experiencia.
Figura 5. Incremento de la concentración de biomasa: valores empíricos indicados mediante
marcadores (rombos), modelo exponencial (ecuación 2) con línea a trazos y modelo
exponencial modificado (ecuación 3) mediante línea llena. El primer diagrama corresponde
al ciclo 2 del cultivo en flujo restringido (15 L) de P. tricornutum presentado de la figura 3;
max = 0,91 dia-1
. El diagrama de la derecha es del ciclo 2 del cultivo de T. sp. en flujo
restringido (15 L) de la figura 6; max = 0,80 dia-1
.
A estos efectos, la irradiancia inicial I0 (de concentración nula) se determinó
empíricamente y la irradiancia promedio Iav se calculó con la ecuación (6) a partir de los
valores experimentales de concentración. El valor del factor de extinción fue adoptado
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de acuerdo a García et al (2006), KC = 0,1m2/g. Los valores de la velocidad específica
máxima max indicados en las figuras 5 y 6 se obtuvieron mediante ajuste por mínimos
cuadrados de las diferencias entre valores empíricos y del modelo, de la concentración
de biomasa.
Figura 6. Incremento de la concentración de biomasa: valores empíricos indicados mediante
marcadores (rombos), modelo exponencial (ecuación 2) con línea a trazos y modelo
exponencial modificado (ecuación 3) mediante línea llena. El primer diagrama corresponde
al ciclo 2 del cultivo en flujo total (22 L) de P. tricornutum presentado de la figura 3; max =
0,92 dia-1
. El diagrama de la derecha es del ciclo 2 del cultivo de T. sp. en flujo total (22 L)
de la figura 6; max = 0,55 dia-1
.
6. Conclusiones
En las experiencias de cultivo de microalgas realizadas en un FBR de cilindros
concéntricos con burbujeo en el espacio anular, de escala piloto de 15 L de capacidad
en flujo restringido y 22 L en flujo total, se registraron períodos de incremento lineal
sostenido de las concentraciones de biomasa. Tanto la velocidad de reproducción de la
biomasa como la concentración máxima alcanzable en iguales condiciones de
disponibilidad de nutrientes se vieron afectadas al alternar de configuración,
disminuyendo ambos al operar en condiciones de flujo total debido a un menor acceso a
la energía lumínica disponible.
En condiciones de alta concentración de biomasa, la relación de volumen iluminado
(la del espacio anular) a volumen total del FBR es de valor coincidente con el de la
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relación de las velocidades de crecimiento en fase lineal en las variantes de flujo
fraccionado y flujo total, lo que puede atribuirse a una relación directa entre la velocidad
de reproducción celular y la fracción del período de iluminación a que acceden las
células.
Adicionalmente, se encontró que el incremento de concentración de biomasa puede
ser modelado matemáticamente en forma satisfactoria en estas condiciones,
introduciendo una modificación en la ecuación cinética de crecimiento exponencial para
tener en cuenta la disminución de irradiancia en el interior del medio de cultivo
producido por el ensombrecimiento mutuo entre células.
Reconocimiento
Se agradece el apoyo de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional
de la Patagonia San Juan Bosco.
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