PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN...

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 1

PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD

EN BACTERIOLOGIA

INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

BOLETIN INFORMATIVO Nro. 5 OCTUBRE - 2012

COMENTARIOS ENCUESTA 44

Cepa Nº1: Proteus mirabilis

Esta cepa correspondía a un aislamiento de P. mirabilis aislado de orina de un

paciente de sexo femenino con infección urinaria baja no complicada. P. mirabilis

es uno de los agentes más frecuentes de infecciones urinarias de la comunidad aunque

también se lo puede asociar a infecciones intrahospitalarias. Este microorganismo es,

dentro la familia Enterobacteriaceae, uno de los más sensibles a los antibióticos ß-

lactámicos, probablemente por la gran permeabilidad de su membrana externa y por una

expresión prácticamente indetectable de su ß-lactamasa cromosómica. Por ello, las cepas

salvajes de P. mirabilis presentan sensibilidad incluso a ampicilina. La resistencia a los

antibióticos ß-lactámicos es casi siempre debida a la adquisición de distintas enzimas

plasmídicas. Para esta cepa, el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) recibió la

respuesta de 377 laboratorios. El 97,4 % (n=367) de los laboratorios informaron

correctamente género y especie. Tabla 1.a


Tabla 1.a. Cepa 1: Concordancia en la Identificación bioquímica.

Nº Porcentaje (%)Género y especie correctos 367 97,3Género correcto 0 0Género correcto y especie incorrecta 9 2,4Género incorrecto 1 0,3

Concordancia

Nueve laboratorios (2,4%) contestaron “género correcto y especie incorrecta”, estos

informaron P. penneri (4), P. vulgaris (4) y P. mulieris (1). Sólo un laboratorio informó

género incorrecto (Staphylococcus epidermidis) probablemente debido a una

contaminación accidental, por lo que este dato fue retirado del análisis global de pruebas

de sensibilidad.

Con respecto a la sensibilidad, la Cepa 1 posee un mecanismo de resistencia enzimático a

β-lactámicos ya que es portadora de una β-lactamasas tipo AmpC de naturaleza

plasmídica, perteneciente a la familia CIT/CMY.

Las β-lactamasas tipo AmpC plasmídicas (BLAP) son enzimas de clase C de Ambler y grupo

1 de Karen Bush y tienen su origen en las β-lactamasas AmpC cromosómicas propias de

Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Morganella morganii y Hafnia Alvei. En el caso

de las enzimas de la familia CIT/CMY el origen es C. freundii. Las BLAP, al igual que sus

progenitores cromosómicos, confieren un patrón característico de resistencia a los

antibióticos β-lactámicos que incluye: resistencia a amino, carboxi y ureidopenicilinas;

cefalosporinas de primera y segunda generación y, en la mayoría de los casos, resistencia a

cefamicinas (cefoxitina). La actividad in vitro sobre las cefalosporinas de tercera generación

(C3G) y el aztreonam es variable. A diferencia de las β-lactamasas de espectro extendido

(BLEE) más frecuentes en nuestro país (CTX-M y PER), las BLAP tienen muy débil actividad

sobre cefalosporinas de cuarta generación (C4G). Los inhibidores clásicos de enzimas de

clase A como ác. clavulánico, sulbactam y tazobactam tienen escaso poder inhibitorio sobre

las BLAP, aunque algunas pueden ser levemente inhibidas por sulbactam y tazobactam. Los

inhibidores por excelencia de estas enzimas son los compuestos derivados del ácido

borónico y oxacilina o cloxacilina (Beesley y cols. Biochem J.17:316; 1982; Yagi y cols.

JCM, 43:2551; 2005).


El P. mirabilis enviado presenta resistencia neta a los antibóticos ß-lactámicos solicitados en

la encuesta (ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefalotina) y sensibilidad a ciprofloxacina,

trimetoprima/sulfametoxazol y gentamicina. Los rangos de halos de inhibición obtenidos en

el LNR se muestran en la Tabla 1.b.

Tabla 1.b. Cepa 1: Rangos de referencia y resultados de interpretación de las zonas de

inhibición del LNR.

Antimicrobiano Rango de referencia (mm) Interpretación

Ampicilina 6-6 Resistente

Ampicilina/sulbactam 6-9 Resistente

Cefalotina 6-6 Resistente

Ciprofloxacina 31-41 Sensible

Trimetoprima/sulfametoxazol 23-30 Sensible

Gentamicina 19-25 Sensible

Con el envío de esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios

participantes de sospechar y detectar mecanismos de resistencia a C3G partiendo de los

datos de un antibiograma mínimo como es el que puede utilizarse en aislamientos de

bacilo gram negativos en muestras de infección urinaria no complicada de la comunidad.

A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de

sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretación fue 98.8%. Solo se

detectaron 1,2% de errores en la interpretación (27/2242), de los cuales el 55,6% fueron

errores menores (15/27), 25,9% muy graves (7/27) y 18,5% graves (5/27). Todos los

errores menores y muy graves estuvieron asociados a los datos de sensibilidad de

ampicilina/sulbactam. En el resto de los antimicrobianos no se observaron dificultades de

interpretación, excepto 5 errores graves en los antibióticos no ß-lactámicos (Tabla 1.c).

Una explicación posible para los errores graves podría ser que en las lecturas de los halos

de inhibición se haya tenido en cuenta el “swarming” (invasión superficial de los halos de

inhibición), típico del género Proteus (debemos recordar que éste no debe ser tenido en

cuenta en la determinación del diámetro de inhibición).


Tabla 1.c. Cepa 1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los

labs. del PCC-NAC y el LNR.

S I R

Nº Respuestas Nº % Nº % Nº %

Ampicilina 373 0 0 -- -- 373 100 Ampicilina/Sulbactam 371 7 1,9 15 4 349 94,1 Cefalotina 375 0 0 -- -- 375 100 Ciprofloxacina 375 374 99,7 -- -- 1 0,3 Trimetoprima/Sulfametoxazol 374 372 99,5 -- -- 2 0,5 Gentamicina 374 372 99,5 -- -- 2 0,5

S: sensible, I: intermedio, R: resistente

Resultado correcto Errores menores Errores graves Errores muy graves

Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos

establecidos por el LNR con una concordancia global de 89,2%. Hubo más de un 98% de

concordancia para ampicilina y cefalotina, mientras que el 22,5% de los participantes

obtuvieron valores de halos de inhibición por fuera del rango esperado para

ampicilina/sulbactam. La concordancia para los antimicrobianos no ß-lactámicos fue entre

83,8 y 89,4 % (Tabla 1.d).

Tabla 1.d. Cepa 1: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y

el rango calculado por el LNR.

Dentro del rango Fuera del rango

Nº Respuestas Nº % Nº %

Ampicilina 355 353 99,4 2 0,6 Ampicilina/Sulbactam 351 272 77,5 79 22,5 Cefalotina 355 350 98,6 5 1,4 Ciprofloxacina 359 301 83,8 58 16,2 Trimetoprima/Sulfametoxazol 358 320 89,4 38 10,6 Gentamicina 359 312 86,9 47 13,1

Como ya se mencionó, el aislamiento en estudio presentaba una BLAP. Un total de 349

laboratorios respondieron sobre el mecanismo de resistencia utilizando el campo sugerido

ad hoc (Tabla 1.e). El 76,5% de los laboratorios respondió correctamente “AmpC


plasmídico”. 45 laboratorios (12,9%) indicaron como mecanismo sugerido “BLEE” o

“BLEE+impermeabilidad” posiblemente porque algunos participantes detectaron una leve

inhibición (efecto “huevo”) entre amoxicilina/ác. clavulánico y las C3G. Si bien el inhibidor

característico de la BLAP son los derivados del ácido borónico, estas enzimas puede ser

levemente inhibibles por ác. clavulánico, sulbactam y tazobactam, por lo que puede

observarse dicho efecto. El aislamiento presentaba otros indicios que descartaban la

presencia de BLEE como único mecanismo, como ser: halos de sensibilidad para

cefepime similares a las cepas salvajes (30mm) y falta de agrandamiento ≥5mm para las

combinaciones cefotaxima/cefotaxima+ac. clavulánico y ceftacidima/ceftacidima+ac.

clavulánico.

Tabla 1.e. Cepa 1: Mecanismo de resistencia sugerido.

Mecanismo de referencia inferido Nº

Respuestas % AMPC PLASMIDICO 267 76,5 BLEE 42 12 HIPERPRODUCCION/DERREPRESION DE AMPC 18 5,2 AMPC+ IMPERMEABILIDAD 5 1,4 BLEE+ IMPERMEABILIDAD 3 0,9 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras) 2 0,6 AMPC PLASMIDICO + SENSIBILIDAD DISMIN. A FQ 1 0,3 BETALACTAMASA (Haemophilus spp./ Enterococcus spp. / Moraxella spp.) 1 0,3 NO APLICA 10 2,9

Los laboratorios que informaron como mecanismo inferido hiperproducción/derrepresión de

AmpC no tuvieron en cuenta que P. mirabilis no posee naturalmente una AmpC

cromosómica por lo que el término hiperproducción/derrepresión no sería aplicable a esta

especie. El aislamiento no poseía señales de impermeabilidad ni sensibilidad disminuida a

las fluorquinolonas (ác. nalidíxico: 24mm, ciprofloxacina: 36mm). La cepa no presenta

ningún mecanismo que afecte la actividad de los carbapenemes. Es importante recordar

que el género Proteus presenta sensibilidad disminuida de manera natural a imipenem (los

otros carbapenemes como meropenem o ertapenem no se ven afectados). Sin embargo

esta sensibilidad disminuida difícilmente confiera valores de resistencia.

Nota: se recuerda a los participantes que la sospecha de carbapenemasa en este genero

requiere de halos disminuidos a dos carbapenemes simultaneamente, a saber imipenen

<=22 + meropenem <=27 mm.


Detección de BLAP

P. mirabilis no presenta resistencia natural a ningún antibiótico β-lactámico activo sobre

bacilos Gram negativos, por lo que la resistencia neta (6mm) observada a cefalotina

debería haber sido un llamado de atención a la hora de analizar los posibles mecanismos

de resistencia involucrados. Halos de cefalotina de 6mm son una alerta para la

presencia de ß-lactamasas tipo BLEE o BLAP en las enterobacterias carentes de

AmpC inducible (E. coli, Klebsiella spp, P. mirabilis, Shigella spp, Salmonella sp y C.

koseri), por lo que amerita completar el antibiograma para caracterizar el mecanismo

implicado de resistencia a los ß-lactámicos.

Al completar el antibiograma se pudo observar la resistencia a cefoxitina y sensibilidad

reducida a C3G. Se observaron halos de resistencia a cefotaxima (22mm) y sensibilidad a

ceftacidima (21mm), con halos de inhibición muy cercanos al punto de corte. Se obtuvieron

los valores de CIM para C3G por método automatizado (Vitek) y por dilución en agar. El

valor de CIM para cefotaxima fue 8 μg/ml para ambos métodos siendo interpretado como

resistente, mientras que la CIM de ceftacidima fue de 16 μg/ml y 8μg/ml respectivamente

siendo resistente e intermedio según el método ensayado. El aislamiento NO presentó

agrandamiento ≥5mm para las combinaciones cefotaxima/cefotaxima+ac. clavulánico ni

ceftacidima/ceftacidima+ac. clavulánico, característicos de las BLEE y se observó

sensibilidad a cefalosporinas de cuarta generación (cefepime: 30mm, ≤1μg/ml). De esta

manera, se confirma la ausencia de BLEE en esta cepa.

Todos estos indicios nos conducen a sospechar de la presencia de una β-lactamasa tipo

AmpC plasmídica. Debido a que P. mirabilis no posee una β-lactamasa tipo AmpC en su

cromosoma, la detección de esta enzima implica la adquisición de un elemento móvil

(plásmido). Para la confirmación fenotípica se debe realizar la búsqueda de sinergia

(efecto “huevo”) entre cefoxitina y/o las C3G y el ácido 3-amino-fenil-borónico

(APB) (300 μg/disco) (como se ve en el ejemplo de la Foto 1 – disco 33= APB). El APB se

desempeña como inhibidor de las β-lactamasas tipo AmpC, independientemente de su

codificación cromosómica o plasmídica, y aunque también actúa como inhibidor de

carbapenemasas de clase A (KPC, SME, IMI/NMC, etc), esta característica no dificulta la

detección de BLAP en aislamientos que no presenten compromiso en la sensibilidad a los

carbapenemes. Otro inhibidor de las β-lactamasas tipo AmpC es la cloxacilina, que inhibe

específicamente a estas enzimas pero no a las carbapenemasas de clase A. El desempeño

de este inhibidor fue recientemente evaluado en el LNR al desafiar la capacidad de

detección de BLAP de dos métodos comerciales (AmpC Confirm ID Pack y ESBL+AmpC

Screen Pack, ROSCO Diagnostica) que comparan los halos de inhibición obtenidos con

discos de C3G solas y su combinación con cloxacilina. Ambos métodos tuvieron un muy


buen desempeño en la detección de las BLAP. Las fallas de detección correspondieron a

mecanismos de baja prevalencia y a cepas multirresistentes con más de un mecanismo

adquirido de resistencia a C3G (BLEE más BLAP) (Ver Posters adjuntos: Rapoport y col.

SADEBAC 2012).

Otra prueba simple para corroborar la naturaleza enzimática de la resistencia a cefoxitina

son los métodos microbiológicos (Masuda, Hodge, y modificaciones de éstos). En presencia

de BLAP, estos métodos presentan un resultado positivo, como el caso de la cepa en

estudio. Las BLAP no son el único mecanismo que afecta cefoxitina: la resistencia puede

ser de naturaleza no enzimática debida a impermeabilidad de la membrana externa. Para el

aislamiento en estudio, la sinergia con APB y el método de Hodge dieron positivos por lo

que se confirma la naturaleza enzimática de la resistencia a cefoxitina, que posteriormente

fue caracterizada por PCR, dando un resultado positivo para el gen cit/cmy

Informe de BLAP

En el aislamiento en estudio se confirmó la presencia de BLAP y la ausencia de BLEE, por lo

que las C3G deberían ser informadas según los halos de inhibición obtenidos (Tabla 2A

M100-S22). Sin embargo se observa un error minor para la interpretación de ceftacidima

frente al método de referencia (dilución en agar) ya que por disco debería interpretarse

como sensible, mientras que por CIM se informaría intermedio. A la fecha no existe

consenso sobre el reporte de las C3G en cepas productoras de AmpC plasmídico. Del

mismo modo, es escasa la bibliografía internacional sobre la utilidad clínica de C3G en

infecciones provocadas por enterobacterias con BLAP. Sin embargo los nuevos puntos de

corte de CLSI para C3G (vigentes en el documento del CLSI desde el año 2010 y

mantenidos en ediciones posteriores: CAZ: R≤17mm, S≥21mm, R≥16μg/ml, S≤4μg/ml y

CTX: R≤22mm, S≥26mm, R≥4μg/ml, S≤1μg/ml) mejoraron significativamente la detección

Foto 1. Sinergia

entre discos de 3-amino

fenil borónico (APB) vs. cefotaxima

(CTX) y ceftacidima

(CAZ).APB CTX CAZ


de BLAPs con respecto a los puntos de corte previos (M100-S19, 2009). Teniendo en

cuenta estos conceptos, a la hora de guiar el tratamiento antimicrobiano, sería prudente

evitar el uso de las C3G en infecciones severas basado en las siguientes certezas: las

resistencias enzimáticas como las BLAP elevan poblacionalmente las CIMs de los sustratos

afectados y a su vez, estos valores son plausibles de ser afectados por inóculos bacterianos

de alta densidad.

Uno de los puntos críticos en este tipo de aislamientos de infecciones severas es descartar

la presencia de BLEE para poder informar correctamente la sensibilidad de las C4G. Ante la

confirmación de ausencia de BLEE, el cefepime debe ser informado como sensible, en el

caso que presentara sensibilidad in vitro.

Conclusiones finales. La búsqueda de este tipo de enzimas es especialmente significativa

en aquellos géneros y especies que carecen naturalmente de β-lactamasas tipo AmpC

cromosómicas, como es el caso de P. mirabilis, Klebsiella spp., y Salmonella y en aquellas

que la producen en forma basal o en pequeñas cantidades, como Escherichia coli y Shigella

spp. Se recomienda la utilización de discos de APB cuando se sospecha la presencia de este

mecanismo en estos géneros bacterianos. Por el contrario, en aquellas especies

productoras de AmpC cromosómico (Enterobacter spp. C. freundii, M. morganii,

P. aeruginosa, Serratia spp., Providencia spp.) no tendría sentido probar el disco

de APB para tal fin.

En Argentina, la emergencia documentada de BLAP se remite a la descripción de una

enzima tipo FOX-1 en un aislamiento de K. pneumoniae en el año 1994 (Gonzalez Leiza M.

y col. AAC 1994; 38:2150). Más recientemente, se describe un brote de Shigella flexneri

productora de CMY-2 del Hospital Materno Infantil de Mar del Plata (Rapoport M. y col.

IJAA 2008; 31:385). Desde el año 2006, han sido confirmados en el INEI-ANLIS Malbrán

un número creciente de casos de BLAP en P. mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella y

Shigella. Estos datos de emergencia nacional establecen la necesidad de estar alertas ante

la aparición de perfiles de resistencia compatibles con el mecanismo aquí descripto. Este

reconocimiento permitirá alertar al cuerpo médico no sólo para la seguridad en la elección

del tratamiento del paciente, sino para el diseño de medidas de control a fin de evitar la

diseminación vertical u horizontal de este mecanismo, ya que cepas con estas

características probaron su habilidad para ocasionar brotes de distinta magnitud.


Cepa Nº 2: Aerococcus urinae

Se trataba de un Aerococcus urinae aislado de orina, cuyo desafío era la identificación

bioquímica.

De los 377 laboratorios que contestaron la encuesta, 265 realizaron la identificación

bacteriana; 26 laboratorios (6,9%) no reportaron dato y 86 la informaron como no viable

(22,8%).

El 84,9% de los laboratorios (225/265) informó correctamente género y especie, el 3,8 %

(10/265) informó género correcto y omitió especie y el 1,5% (4/265) informó género

incorrecto (Tabla 2.a). En la Tabla 2.b se detallan los errores en la identificación

bacteriana.

Tabla 2.a. Cepa 2: Concordancia en la Identificación bioquímica.

Concordancia

Nº Porcentaje

(%) Género y especie correctos 225 84,9 Género correcto 10 3,8 Género correcto y especie incorrecta 4 1,5 Género incorrecto 26 9,8

Tabla 2.b. Cepa 2: Errores en la Identificación

Género y especie Nº laboratorios Aerococcus viridans 4 Streptococcus viridans 8 Streptococcus viridans, alfa hemolíticos 1 Streptococcus mitis 2 Streptococcus sp. 2 Streptococcus acidominimus 1 Streptococcus agalactiae 1 Staphylococcus saprophyticus 1 Staphylococcus aureus 1 Staphylococcus coagulase negative 1 Staphylococcus epidermidis 1 Enterococcus sp. 1 Globicatella sp. 1 Leuconostoc sp. 1 Neisseria gonorrhoeae 1 Oligella urethralis 1 Proteus mirabilis 1 Aeromonas ureae 1


Comentarios Cepa 2 (Dr. Carlos Vay)

La familia Aerococcaceae (definida principalmente sobre la base del análisis filogenético de

las secuencias del ARNr 16S) incluye dos grupos parafiléticos: Uno de ellos contiene

únicamente al género Aerococcus, el otro a los géneros Abiotrophia, Dolosicoccus,

Eremococcus, Facklamia, Globicatella e Ignavigranum.

El género Aerococcus, y la especie Aerococcus viridans fueron propuestos en 1953 para

contener a aquellos cocos gran-positivos catalasa negativos que se diferenciaban de los

estreptococos por su modo de agrupamiento. Mucho más tardíamente, otras especies

fueron incorporándose a ese género: Aerococcus christensenii, Aerococcus sanguinicola,

Aerococcus suis, Aerococcus urinae, Aerococcus urinaeequi y Aerococcus urinaehominis.

Todos ellos son cocos gran-positivos, inmóviles, que forman grupos, tétradas o pares en

medio líquido (la especie A. christensenii forma a menudo cadenas cortas), aerobios y

anaerobios, pero preferentemente, microaerófilos (Aerococcus viridans crece en el primer

centímetro superior del caldo tioglicolato), catalasa negativos en su mayoría, sensibles a

vancomicina, capaces de crecer en caldo hipersalado (ClNa 6,5%). Acidifican la glucosa

(con excepción de Aerococcus suis, especie de importancia en veterinaria) y no poseen

ningún antígeno de grupo de Lancefield. Las reacciones de acidificación de hidratos de

carbono en caldo púrpura de bromocresol suelen demorar algunos días. Con excepción de

algunos aislados de A. viridans, hidrolizan el hipurato.

Es muy importante destacar que para abordar la identificación de los cocos gram-positivos

catalasa negativos se requiere indefectiblemente, de la observación de la morfología que

adoptan en medio líquido (caldo tioglicolato), pues de lo contrario sería imposible identificar

correctamente a los diferentes integrantes de este grupo.

La Tabla 2.c muestra la utilidad de tres características fenotípicas para diferenciar a los

cocos gran-positivos catalasa negativos que forman pares, tétradas o grupos.


Tabla 2.c: Identificación preliminar de cocos gran-positivos catalasa negativos que forman

pares, grupos o tétradas, basada en tres características fenotípicas.

Reacción fenotípica Microorganismo(s) posible

PYR LAP ClNa(6,5%)

+ + + Aerococcus sanguinicola, Dolosigranulum pigrum,

Facklamia languida.

+ + ‐ Gemella haemolysans, Rothia mucilaginosa.

+ ‐ + Aerococcus viridans, Helcococcus kunzii.

‐ + + Aerococcus urinae, Aerococcus christenseniia,

Pediococcus, Tetragenococcusb

‐ ‐ + Aerococcus urinaehominis

Adaptado de Ruoff K. Manual of Clinical Microbiology, 10ª Edición, 2011.

a A. christensenii puede presentar cortas cadenas.

b Tetragenococcus halophilus (Enterococcus solitarius) se diferencia de Aerococcus urinae por las

reacciones positivas de bilis-esculina y de arginina dehidrolasa(ADH) y la incapacidad de hidrolizar

hipurato. En el Manual de Microbiología de la ASM, 10ª Edición, 2001; Ruoff informa que el género

Tetragenococcus es PYR -, sin embargo Facklam et al. describen a Tetragenococcus halophilus como

PYR +; en este caso la reacción positiva de la prueba ADH y de Voges-Proskauer y la ausencia de

hidrólisis del hipurato lo diferencian de A. sanguinicola.

La Figura 2 muestra un esquema dicotómico para abordar la identificación de los cocos

gram-positivos catalasa negativos, aerobios, que se agrupan o forman tetradas.


Figura 2.

PYRa

+ -

+ - R S

+ - γ α - +

+ - + -

- +

+ -

a Abreviaturas: PYR: Pyrrolidonil aril amidasa; LAP: Leucina aminopeptidasa, βGUR: Beta-

glucuronidasa, Va (30 µg): disco de vancomicina de 30 µg; resistencia indica ausencia de halo de

inhibición. b Helcococcus kunzii es exigente, a menudo lipofílico y crece en anaerobiosis. Aerococcus viridans

forma colonias similares a las de los enterococos con un halo marcado de hemólisis alfa. Crece en la

superficie del caldo tioglicolato, pues desarrollan pobremente o no lo hacen en anaerobiosis. c Rothia mucilaginosa (Stomatococcus mucilaginosus) forma colonias grandes blanco grisáceas que

suelen adherirse al medio de cultivo. Son sensibles a bacitracina (0,04UI).

Aerococcus spp. forma parte de la microbiota ambiental: se pueden hallar en el suelo, el

polvo, el agua, la vegetación y por ende también en el ambiente hospitalario. De allí que a

veces son contaminantes del Laboratorio de Microbiología, por lo que su hallazgo debe ser

evaluado en contexto clínico.

LAP Va(30µg)

Pediococcus βGUR HemólisisClNa 6,5%

βGUR

Aerococcus sanguinicola

Esculina

Dolosigranulum

Facklamia languida

Esculina

Rothia mucilaginosac

Gemella haemolysans

Helcococcus kunzii

Aerococcus viridansb

Aerococcus christensenii

LAP

Aerococcus urinae

Aerococcus urinaehominis


Aerococcus viridans, la especie más vieja del género, causa enfermedad mortal en las

langostas marinas (gafkemia) y es oportunista para el hombre. Endocarditis, artritis

séptica, bacteriemia, infección urinaria y espondilodiscitis son las infecciones ocasionadas

por esta especie más descriptas.

Aerococcus urinae fue descripto por Christensen en Dinamarca en 29 pacientes con

sospecha de infecciones urinarias. Se lo denominó “ALO”, es decir microorganismo similar a

los aerococos. En 11 de estos pacientes fue aislado como único microorganismo de la orina

en un recuento superior a 100.000 ufc/ml. El 50 % de los pacientes presentaban trastornos

locales o sistémicos (diabetes, neoplasias del sistema urinario o de otros sitios, litiasis

urinaria). Los pacientes con septicemia o endocarditis por estos microorganismos eran

gerontes con enfermedades subyacentes tales como diabetes, cáncer de próstata e infarto

de miocardio. Luego varias comunicaciones han sido publicadas en la que se demuestra

definitivamente la capacidad de esta especie de causar infecciones urinarias con o sin

bacteriemia y endocarditis.

Recientemente, Senneby et al., han presentado un trabajo que muestra las características

clínicas y microbiológicas de las bacteriemias por Aerococcus urinae. De 16 paciente con

bacteriemia 15 eran hombres de más de 70 años y 12 presentaban condiciones urológicas

subyacentes. El foco urinario fue sospechado en la mayor parte de los casos, sin embargo

el microorganismo fue raramente aislado de la orina en esta serie. Nueve pacientes

presentaron sepsis y uno falleció. Tres pacientes presentaron endocarditis, uno presentó

espondilodiscitis como complicación de la misma y otro paciente embolia cerebral. En esta

revisión los pacientes fueron tratados con antibióticos beta-lactámicos, aunque también

fueron utilizadas quinolonas y clindamicina.

Aerococcus urinae suele ser sensible a penicilina, amoxicilina y vancomicina. Las

fluorquinolonas muestran moderada o buena actividad y algunas cefalosporinas pobre

actividad, con excepción de cefepima. Cattoir et al., estudiaron la sensibilidad de 30

aislamientos de Aerococcus spp. (A. urinae 20, A. sanguinicola 8 y A. viridans 2) y

demostraron que todos ellos, fueron sensibles a amoxicilina, vancomicina y teicoplanina y

presentaron bajo nivel de resistencia a los aminoglucósidos(gentamicina). En este trabajo

las fluorquinolonas, la fosfomicina y el co-trimoxazol (TMS) tuvieron actividad variable. A.

urinae fue a menudo resistente a TMS y sensible a fosfomicina, en tanto que, A.

sanguinicola fue resistente a fosfomicina y sensible a TMS. Sin embargo, Facklam describe

que 10 de 15 aislados de A. sanguinicola mostraron sensibilidad intermedia a TMS y que la

totalidad fueron muy sensibles a penicilina (CIM ≤ de 0,03 ug/ml ) y cefotaxima (CIM ≤ de

0,25 ug/ml). La resistencia a penicilina puede observase en la especie A. viridans con

relativa frecuencia.


A. christensenii ha sido aislado de vagina humana y A. urinaehominis de sangre y de orina

respectivamente. A. sanguinicola fue aislado principalmente de sangre y de orina.

Bibliografía: Cattoir V, Kobal A, Legrand P. Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola, two

frecuently misidentified uropathogens. Scand J infect Dis. 42:775.780, 2010.

Christensen J, Jensen I, Faerk J et al. Bacteremia/septicemia, due to Aerococcus like

organism: report of seventeen cases. Clin Infect Dis. 21:943-947, 1995.

Christensen J, Vibits H, Ursing J, et al. Aerococcus –like organism, a newly recognized

urinary tract pathogen. J Clin Microbiol.29:1049-1053, 1991.

Facklam R, Lovgren M, Shewmaker P, Tyrell G. Phenotipic description and antimicrobial

susceptibilities of Aerococcus sanguinicola isolated from human clinical samples.

J Clin Microbiol 41:2587-2592, 2003.

Ludwig W, Schleifer K, Whitman W.: Family II. Aerococcaceae fam. nov. In: De Vos P,

Garrity G, Jones D, Krieg N, Ludwig W, Rainey F, Scheleifer K, Whitman W. (eds): Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology, second edition, vol. 3, p.533. (The Firmicutes),

Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, 2009.

Ruoff K. En En Versalovic J, Carroll K, Funke G, Jorgensen J, Landry ML, Warnock D.

Manual of Clinical Microbiology. 10º Edición. Vol 1. Capítulo 22. ASM Press, Washington DC,

2011.

Senneby E, Petersson A, Rasmussen M. Clinical and microbiology features of bacteremia

with Aerococcus urinae. Clin Microbiol Infect. 18:546-550, 2012.


Cepa Nº 3: Pseudomonas aeruginosa

La cepa Nº 3 de esta encuesta provenía de hemocultivos de un paciente con bacteriemia.

Se enviaron dos aislamientos de Pseudomonas aeruginosa productores de carbapenemasa

tipo metalo-beta-lactamasa (MBL), diferentes en cuanto al tipo de enzima involucrada en

dicho mecanismo de resistencia a los antibióticos β-lactámicos y a la

sensibilidad/resistencia al resto de los antibióticos solicitados:

Cepa 3.1. P. aeruginosa MBL tipo IMP

Cepa 3.2. P. aeruginosa tipo VIM

.

La mitad de los participantes del Programa recibió la Cepa 3.1 y la otra mitad, la cepa 3.2.

En la Tabla 3 se muestra un cuadro comparativo con las características fenotípicas y

genotípicas diferenciales de las dos cepas en cuestión: la Cepa 3.1 era resistente de

alto nivel a ceftacidima y ciprofloxacina y sensible a amicacina y la Cepa 3.2 era

resistente de alto nivel a amicacina, resistente de bajo nivel a ceftacidima y

sensible a ciprofloxacina.

Tabla 3: Características fenotípicas/genotípicas de P. aeruginosa 3.1 y 3.2

Cepa 3.1

P. aeruginosa

MBL IMP

Cepa 3.2

P. aeruginosa

MBL VIM

Antibiótico Zona de

inhibición

(mm)/

Interpretación Zona de

inhibición

(mm)/

Interpretación

Imipenem 11 – 18 Resistente 6 – 15 Resistente

Meropenem 12 – 20 Resistente 6 – 17 Resistente

Ceftazidima 6 Resistente 9 – 17 Resistente

Piperacilina/

Tazobactam

20 – 26 Intermedio/Sensible 13 – 20 Resistente/Intermedio

Ciprofloxacina 6 Resistente 24 – 34 Sensible

Amicacina 27 – 33 Sensible 6 Resistente


Epidemiología de las MBL en Pseudomonas aeruginosa: En las últimas décadas se

ha demostrado la emergencia y diseminación de cepas de bacilos gram negativos

productores de carbapenemasas tipo MBL en diferentes partes del mundo. Sin embargo, P.

aeruginosa, continúa siendo el huésped bacteriano más frecuentemente asociado a MBL a

nivel mundial, sólo amenazado en los últimos años por la dispersión de NDM en múltiples

especies de Enterobacterias. Los primeros hallazgos de MBL en P. aeruginosa provienen de

Japón (Wantabe, 1991) y Verona, Italia (Laurenti, 1999), para enzimas de tipo IMP y VIM

respectivamente. Posteriormente otras enzimas han sido reconocidas como parte de la

familia de MBLs en aislamientos clínicos de P. aeruginosa como SPM, GIM, AIM y NDM.

Estas enzimas poseen capacidad hidrolítica sobre penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes

y cefamicinas (cefoxitina). Sólo el monobactam aztreonam (AZT) evade la acción de estas

carbapenemasas, siempre que se encuentre como mecanismo único. Las enzimas de la

familia MBL pertenecen a la clase molecular 3b de la clasificación de Karen Bush. De

manera distintiva, las MBLs requieren de metales divalentes (Zn2+) en su sitio activo,

indispensable para su capacidad hidrolítica. Es por ello que en presencia de EDTA u otros

quelantes de metales divalentes, como la combinación de EDTA+SMA (ácido

etilendiaminotetraacético/mercaptoacetato de sodio), estas enzimas presentan una

inhibición característica.

P. aeruginosa: Detección de carbapenemasas del tipo MBL

(Grupo 3b de Karen Bush.)

imipenem meropenem

EDTA/SMA

ceftacidima

Ceftacidima + ac clavulanico

aztreonam

cefepima

Pip+tazob.


Las variantes más comúnmente reportadas son IMP-1, IMP-13 y VIM-2, todas ellas

microbiológica y clínicamente similares que han alcanzado proporciones pandémicas debido

a la movilización de clones hiper-epidémicos.

En Argentina, los primeros hallazgos de MBL se produjeron a finales del año 2002. En la

Ciudad Autónoma de Buenos Aires se detecta por primera vez la presencia de una nueva

variante de VIM (VIM-11) en P. aeruginosa recuperada de un paciente pediátrico (Pasterán,

2005). Desde entonces, se ha vigilado activamente en Argentina la aparición de MBL en P.

aeruginosa y también en otros bacilos gram negativos. En la actualidad, se ha podido

identificar la dispersión en Argentina de P. aeruginosa productoras de diversas MBLs con

un patrón regional característico y único en el país. Independientemente de la zona

geográfica y las variantes involucradas, se observa una tendencia sostenida y creciente de

casos reportados durante los últimos dos años. Ello motivó el envío de la presente cepa a

los laboratorios participantes del Programa.

Consecuencias clínicas: Las consecuencias clínicas producto de la emergencia de MBL

han sido exploradas en los últimos años. La mortalidad asociada a infecciones severas por

P. aeruginosa productoras de MBL asciende al 70-95% (Carmeli, 2010; Zavaschi, 2006).

Según estas publicaciones, las únicas variables con capacidad de ser modificadas, en todo

intento por reducir la mortalidad asociada, resultan el inicio precoz del tratamiento

antimicrobiano y la apropiada selección de antibióticos. Es por ello que la detección precoz

de este tipo de resistencia es crítica y debe ser realizada con la mayor precisión diagnóstica

por parte de los laboratorios de microbiología clínica. El régimen antimicrobiano ideal para

el tratamiento de infecciones producidas por P. aeruginosa con MBL aún no se ha

determinado, pero sin lugar a dudas, el uso clínico como monoterapia de sustratos

afectados por la enzima como penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes, no debería ser

considerado de primera elección. Debido a la multiresistencia asociada a cepas productoras

de MBL, colistina resulta el antimicrobiano con mayor actividad in vitro y ha sido utilizado

para el tratamiento de estos gérmenes (Sabuda, 2008). Al igual que para enterobacterias

productoras de carbapenemasa, la terapia combinada se asocia a mayor éxito clínico

(Carmelli 2010). La inclusión de un carbapenem en la combinación no ha sido explorado,

tal vez por los altos valores de CIM a carbapenem frecuentemente asociados a P.

aeruginosa con carbapenemasa, a diferencia de las Enterobacterias que han adquirido

estos mecanismos.

Detección fenotípica: en el Boletín Informativo Nº 3 -2011, en los comentarios de la

Cepa 3-Encuesta Nº42: P. aeruginosa KPC+ (enviado en noviembre de 2011), se incluyó


una actualización sobre la Detección fenotípica de carbapenemasas en

Pseudomonas aeruginosa. Este Boletín contenía: el ALGORITMO DE BÚSQUEDA

DE CARBAPENEMASAS - PAE 2012 con información vigente para el análisis

interpretado del antibiograma de P. aeruginosa. Para más detalles sobre la búsqueda

y confirmación de carbapenemasas en PAE, por favor remitirse a dicho Boletín. De todas

formas, anexamos nuevamente el algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas en P.

aeruginosa.

Con esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios para

detectar carbapenemasas de trascendencia clínica y epidemiológica, como las

MBLs.

Este punto es de suma importancia, porque la presencia de carbapenemasas involucradas

en procesos infecciosos severos, determina alta probabilidad de falla de tratamiento a

aquellas drogas incluidas en el espectro de sustratos de estas enzimas. Mas aún, estas

carbapenemasas tienen una gran capacidad de diseminación, por lo que su hallazgo, debe

acompañarse con los mayores esfuerzos del equipo de salud a fin de contener una posible

diseminación del microorganismo o de la carbapenemasa.

Pruebas de sensibilidad de Cepa 3.1: P. aeruginosa MBL tipo IMP

La identificación bacteriana fue realizada por 187 laboratorios. El 98,9% de los laboratorios

(185/187) informó correctamente género y especie y 1,1% (2 laboratorios) informaron

género correcto pero reportaron especie incorrecta. (Tabla 3.1.a).

Tabla 3.1.a. Cepa 3.1: Concordancia en la Identificación bioquímica.

Concordancia

Nº Porcentaje

(%) Género y especie correctos 185 98,9 Género correcto - - Género correcto y especie incorrecta 2 1,1 Género incorrecto - -

El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi--penicilinas y cefalosporinas

por la portación de MBL y además a ciprofloxacina (CIM ≥4µg/ml) y sensibilidad a


MEROPENEM 4 16 2 4 3 8 12-20IMIPENEM 4 16 8 8 16 16 11-18

Etest (μg/ml)

Sensititre (μg/ml)

Rango LNR (mm) CEPA 3.1

A.dilución (μg/ml)

Microdilución (μg/ml)

Vitek2C (μg/ml)

Phoenix (μg/ml)

SI SI SI SI

Sospecha carbapenemasa según Algoritmo SI SI SI

piperacilina/tazobactam (CIM 16µg/ml), gentamicina (CIM ≤ 4µg/ml), amicacina (CIM ≤

2µg/ml) y colistín (CIM 2µg/ml). Presentaba sensibilidad intermedia a aztreonam (CIM

16µg/ml, halo 19 mm).

CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam, GEN: gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin

La CIM a imipenem y meropenem de este aislamiento por distintas metodologías se

presenta en la Tabla 3.1.c. A pesar de algunas diferencias observadas en los valores

absolutos de las CIMs a los carbapenemes, todas las metodologías fueron capaces de

detectar esta cepa como “sospechosa de carbapenemasa” con las señales de alarma de

cada una de las metodologías propuestas en el algoritmo del LNR. Ver Anexo 3: Algoritmo

para la búsqueda de carbapenemasas.

Tabla 3.1.c. Cepa 3.1: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas metodologías

La presencia de MBL también se confirmó fenotípicamente con el Método de discos

combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos (Póster ICAAC 2011, Pasterán y

cols. http://cl.ly/290u3s3d0O22):

Meropenem: 19 mm Meropenem + APB (600ug/disco): 19 mm Delta: 0 mm Interpretación: Negativo (<=3). Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 19 mm Delta: 0 mm Interpretación: Negativo (<=2) Meropenem + EDTA (750ug/disco): 32 mm Delta: +13 mm Interpretación: Positivo (>= 8)


sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretación fue 92,7 %. Se

CAZ FEP TAZ ATM GEN AKN CIP COL CIM (µg/ml) ≥64 (R) ≥64 (R) 16(S) 16 (I) 4 (S) ≤ 2(S) ≥4 (R) 2(S)


detectaron 7,2% de errores en la interpretación (n=80), de los cuales 46 fueron errores

menores (57,5%), 9 graves (11,3%) y 25 muy graves (31,2%). La mayoría de los errores

menores estuvieron asociados a piperacilina/tazobactam (36/46), los graves estuvieron

asociados a amicacina (9/9) y los muy graves se distribuyeron principalmente entre

imipenem (8 errores), meropenem (8 errores) y ciprofloxacina (7 errores). Se detectó que

siete laboratorios cometieron error muy grave en la interpretación de ciprofloxacina y error

grave en amicacina, simultáneamente. Esto podría deberse a que si bien se les envió la

cepa 3.1, informaron resultados compatibles con el fenotipo de la cepa 3.2. Más del 90%

de los laboratorios interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima

(92,5, 94,6% y 98,4 respectivamente). (Tabla 3.1.d)

Para piperacilina/tazobactam el rango de referencia fue 20-26 mm correspondiéndose con

la categoría de I o S del CLSI. De los 175 laboratorios que reportaron zonas de inhibición

para este antibiótico, 148 (84.6%) informaron este antimicrobiano dentro del rango de

referencia. 125 laboratorios (69,8%) lo interpretaron como S, 18 (10,1%) I y 36 (20,1%)

R. La cepa presentó un valor de CIM de 16 ug/ml cuando se ensayó por los métodos de

referencia, correspondiéndose con la categoría “sensible” del CLSI (la CIM “borderline” que

presenta este antibiótico sería responsable del comportamiento descripto en el método de

difusión). Piperacilina/tazobactam podría ser una opción terapeútica (alta dosis) en cepas

de P. aeruginosa con MBL que presenten sensibilidad a esta droga (Zavaschi, 2006).

Tabla 3.1.d. Cepa 3.1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre

los labs. del PCC-NAC y el LNR.

S I R


Imipenem 187 8 4,3 6 3,2 173 92,5 Meropenem 186 8 4,3 2 1,1 176 94,6 Ceftacidima 186 2 1,1 1 0,5 183 98,4 Piperacilina/Tazobactam 179 125 69,8 18 10,1 36 20,1 Ciprofloxacina 187 7 3,8 1 0,5 179 95,7 Amicacina 186 177 95,2 - 9 4,8





establecidos por el LNR con una concordancia entre 79% y 94% para todos los antibióticos

solicitados. La concordancia global en las zonas de inhibición fue 85,4% (Tabla 3.1.e)

Tabla 3.1.e. Cepa 3.1: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-

NAC y el rango calculado por el LNR.



Imipenem 177 146 82,5 31 17,5 Meropenem 177 141 79,7 36 20,3 Ceftacidima 176 165 93,8 11 6,2 Piperacilina/ Tazobactam 175 148 84,6 27 15,4 Ciprofloxacina 176 164 93,2 12 6,8 Amicacina 178 140 78,7 38 21,3

Con respecto al item “Mecanismo de resistencia sugerido” fue respondido por 180/187

laboratorios (96,3%). Se consideraron como respuestas correctas el informe de

“carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL)” o “carbapenemasa”. 147 laboratorios

(87,1%) informaron correctamente alguna de estas opciones. La cepa no poseía BLEE

como mecanismo adicional.

Tabla 3.1.f. Cepa 3.1: Mecanismo de resistencia sugerido.


Respuestas % CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) 139 77,2 CARBAPENEMASA 8 4,5 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE 27 15,0 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras) 2 1,1 BLEE+ IMPERMEABILIDAD 1 0,5 MLSb INDUCIBLE + RESISTENCIA A FQ 1 0,5 SENSIBILIDAD DISMINUIDA A FLUORQUINOLONAS 1 0,5 NO APLICA 1 0,5

Llama la atención la alta proporción de laboratorios (n=27) que reportó la coexistencia de

BLEE en esta cepa. La caracterización molecular permitió demostrar que la cepa 3.1

presentó sólo una beta-lactamasa adquirida, la carbapenemasa tipo IMP. La disociación de

la sensibilidad a PIPERACILINA (dentro de la categoría S) contrastando con la resistencia a

ceftacidima que presentó la cepa 3.1, también es una característica frecuentemente

asociada a MBL del tipo IMP. Recordamos a los participantes que la detección de BLEE en

cepas con MBL requiere de métodos fenotípicos muchas veces no disponibles en la rutina


como el agregado de EDTA al medio de cultivo y posterior repetición del antibiograma

estratégico. Los intentos de inhibir la MBL con el disco de EDTA como reemplazo al medio

suplementado para posterior examinación de los discos de IMP-CAZ bajo el gradiente de

EDTA, son poco reproducibles y en extremo subjetivos.

Cepa 3.2: P. aeruginosa MBL tipo VIM

La identificación bacteriana fue realizada por 189 laboratorios. El 98,4% de los laboratorios

(186/189) informó correctamente género y especie, el 1,1% (2 laboratorios) informó

género correcto pero omitió especie. Un laboratorio informó género incorrecto. (Tabla

3.2.a).

Tabla 3.2.a. Cepa 3.2: Concordancia en la Identificación bioquímica.

Concordancia

Nº Porcentaje

(%)

Género y especie correctos 186 98,4 Género correcto 2 1,1 Género correcto y especie incorrecta - - Género incorrecto 1 0,5

El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi-, ureido-penicilinas y

cefalosporinas por la portación de MBL y además a amicacina (CIM ≥64 µg/ml),

gentamicina (CIM ≥16 µg/ml) y sensibilidad a aztreonam (CIM 8 µg/ml), ciprofloxacina

(CIM 1 µg/ml) y colistín (CIM 2 µg/ml).

CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam, GEN: gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin

La CIM a imipenem y meropenem de este aislamiento por distintas metodologías se

presenta en la Tabla 3.2.c. Al igual que en la cepa 3.1, todas las metodologías detectaron

este aislamiento como “sospechoso de carbapenemasa” a pesar de las diferencias en los

valores absolutos de las CIMs a carbapenemes

CAZ FEP TAZ ATM GEN AKN CIP COLCIM (µg/ml) ≥64 (R) ≥64 (R) 64(I) 8 (S) ≥16 (R) ≥64 (R) 1 (S) 2(S)


Tabla 3.2.c. Cepa 3. 2: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas metodologías

MEROPENEM 16 ND >16 8 8 8 6-17IMIPENEM 32 ND 8 >8 >32 16 6-15

Sensititre (μg/ml)

Rango LNR (mm)

Sospecha carbapenemasa según Algoritmo SI SI SI SI SI

Etest (μg/ml) CEPA 3.2

A.dilución (μg/ml)

Vitek2C (μg/ml)

Phoenix (μg/ml)

Microdilución (μg/ml)

ND ND: no determinado

La presencia de MBL también se confirmó en este aislamiento con el método de discos

combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos (Póster ICAAC 2011, Pasterán y

cols. http://cl.ly/290u3s3d0O22):

Meropenem: 15 mm

Meropenem + APB (600ug/disco): 15 mm Delta: 0 mm Interpretación: Negativo (<=3). Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 17 mm Delta: +2 mm Interpretación: Negativo (<=2) Meropenem + EDTA (750ug/disco): 34 mm Delta: +19 mm Interpretación: Positivo (>=8)


sensibilidad de esta cepa. La concordancia global fue 91,8%. Se detectó 8,2 % de errores

en la interpretación (n=91), de los cuales 65 fueron errores menores (71,4%), 5 graves

(5,5%) y 21 muy graves (23,1%). La mayoría de los errores menores estuvieron asociados

a piperacilina/tazobactam (48/65), los graves estuvieron asociados a ciprofloxacina (5/5) y

los muy graves se distribuyeron de manera uniforme entre imipenem (7 errores),

meropenem (4 errores), ceftacidima (5) y amicacina (5 errores). Más del 92 % de los

laboratorios interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima (94,6%,

97.3% y 92,4 respectivamente). (Tabla 3.2.d.) Se detectó que los cinco laboratorios

cometieron error muy grave en la interpretación de amicacina y error grave en

ciprofloxacina, simultáneamente. Esto podría deberse a que si bien se les envió la cepa 3.2,

informaron resultados compatibles con el fenotipo de la cepa 3.1. Para

piperacilina/tazobactam el rango de referencia fue 13 - 20 mm correspondiéndose con la

categoría de I o R del CLSI. De los 184 laboratorios que reportaron zonas de inhibición


para este antibiótico, 135 (75.8%) informaron este antimicrobiano dentro del rango de

referencia. 48 laboratorios (26,1%) lo interpretaron como S, 36 (19,6%) I y 100 (54,3%)

R. La cepa presentó un valor de CIM de 64 ug/ml cuando se ensayó por los métodos de

referencia, correspondiéndose con la categoría intermedio del CLSI (la CIM “borderline”

que presenta piperacilina/tazobactam sería responsable del comportamiento descripto en el

método de difusión).

Tabla 3.2.d. Cepa 3.2: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre

los labs. del PCC-NAC y el LNR.

S I R


Imipenem 184 7 3,8 3 1,6 174 94,6 Meropenem 184 4 2,2 1 0,5 179 97,3 Ceftacidima 185 5 2,7 9 4,9 171 92,4 Piperacilina/Tazobactam 184 48 26,1 36 19,6 100 54,3 Ciprofloxacina 184 175 95,1 4 2,2 5 2,7 Amicacina 183 5 2,7 - 178 97,3




establecidos por el LNR con una concordancia entre 80 y 92% para ciprofloxacina,

imipenem, amicacina y meropenem y entre 76% y 78% para piperacilina/ tazobactam y

ceftacidima. La concordancia global fue 83,2% (Tabla 3.2.d).

Tabla 3.2.e. Cepa 3.2: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-

NAC y el rango calculado por el LNR



Imipenem 176 149 84,7 27 15.3 Meropenem 176 162 92,0 14 8.0 Ceftacidima 176 138 78,4 38 21.6 Piperacilina/ Tazobactam 178 135 75,8 43 24.1 Ciprofloxacina 177 143 80,8 34 19.2 Amicacina 173 151 87,3 22 12.7


Con respecto al item “Mecanismo de resistencia sugerido” fue respondido por 184/190

laboratorios (96.8%). Se consideraron como respuestas correctas el informe de

“carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL)” y “carbapenemasa”. 159 laboratorios

(86.4%) informaron correctamente alguna de estas opciones.

Tabla 3.2.f. Cepa 3.2: Mecanismo de resistencia sugerido.


Respuestas % CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) 154 83.7 CARBAPENEMASA 5 2.7 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE 15 8.2 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras) 2 1.1 BLEE+ IMPERMEABILIDAD 1 0.5 BLEE 1 0.5 MLSb INDUCIBLE 2 1.1 MLSb CONSTITUTIVO 1 0.5 RESISTENCIA NO ENZIMATICA A CARBAPENEMES 1 0.5 NO APLICA 2 1.2

Llama nuevamente la atención la alta proporción de laboratorios (n=15) que reportó la

coexistencia de BLEE en esta cepa. La cepa 3.2 por PCR presentó solamente una beta-

lactamasa adquirida, la carbapenemasa tipo VIM. Además en esta cepa no se observó

disociación entre PIPERACILINA y ceftacidima (ambas dentro de la categoría R) que

frecuentemente se asocia con BLEE en P. aeruginosa, pero como vimos en la cepa anterior,

también con MBL tipo IMP. Recordamos a los participantes que la detección de BLEE en

cepas con MBL requiere de métodos fenotípicos muchas veces no disponibles en la rutina

(agregado de EDTA al medio de cultivo y posterior repetición del antibiograma estratégico).

Conclusiones finales

Debido a la persistente diseminación de MBL en Argentina y el elevado impacto en la

morbi/mortalidad de las infecciones asociadas a estos gérmenes, alentamos a los

laboratorios a realizar un esfuerzo y confirmar fenotípicamente los mecanismos de

resistencia en aquellos aislamientos sospechosos de carbapenemasa según los puntos de

corte epidemiológicos propuestos en el algoritmo (o remitir a Centros Centinela en caso de

no poder efectuar estos pasos confirmatorios). La dinámica de diseminación de los

mecanismos descriptos y la emergencia de nuevos, hacen imprescindible la confirmación


molecular por parte del Centro Nacional de Referencia frente a todo hallazgo confirmado

fenotípicamente de carbapenemasa en P. aeruginosa.

Anexo 3

Algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas. Actualización 2012.


Pregunta Nº 21

Marque el microorganismo más probable que presenta las siguientes características

fenotípicas: No invade, no fermenta lactosa, TSI A/A (SH2 negativo), LIA desaminada,

ureasa +, citrato+, fenilalanina +, Indol+, ODC-, fermentación manosa-, presenta

resistencia a: cefalotina, ampicilina, colistina y nitrofurantoína.

a- Providencia stuartii

b- Providencia rettgeri

c- Proteus vulgaris

d- Proteus penneri

Recibimos 375 respuestas. 221 (58,9%) laboratorios informaron la opción correcta: c)

Proteus vulgaris, 110 (29,3%) optaron por la Rta “b”, 37 (9,9%) laboratorios respondieron

“a” y 7 (1,9%) respondieron “d”. Dos laboratorios no enviaron respuesta a la pregunta.

Proteus vulgaris es una de las 5 especies que poseen nombre, que integran el género

Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris, P. penneri, P. hauseri y P. myxofaciens), puesto que

existen además, tres especies genéticas que aún no han sido nomencladas (Proteus

genoespecies 4, 5 y 6). Es la segunda especie en frecuencia de aislamiento, de las 4 que

pueden infectar al hombre (la especie P. myxofaciens no ha sido aún reconocida en

especímenes clínicos humanos). Dado que no existen diferencias fenotípicas entre P.

vulgaris “sensu stricto”, y las especies genéticas 4, 5 y 6 se considera que las 4 especies

forman el Complejo Proteus vulgaris. Asimismo, desde un punto de vista práctico a este

S/D: sin dato

Nº

de L

abor

ator

ios

221 (58,9%)

110 (29,3%)

37 (9,9%) 7

(1,9%)

Rta


complejo podría incluirse la especie P. hauseri pues sus características fenotípicas son

idénticas a las del Complejo P. vulgaris.

Junto con Providencia y Morganella, el género Proteus, conforma la conocida tribu Proteae.

Este grupo (Tribu Proteae) de la familia Enterobacteriaceae presenta las siguientes

características diferenciales con el resto de los integrantes de esta familia:

Móviles (la mayor parte de los aislamientos)

Ausencia de fermentación de lactosa

ONPG ( β galactosidasa): Ausente

Decarboxilación de lisina e hidrólisis de L-arginina: Ausente

Deasaminación de fenilalanina o triptófano

Para aquellos laboratorios que utilizan el medio Agar Hierro Lisina (Agar LIA) la

desaminación de este aminoácido sólo se presenta en los géneros Proteus y Providencia y

está ausente en el género Morganella.

Cabe mencionar que unas pocas Enterobacteriacea que infectan con mucha menor

frecuencia al hombre que las pertenecientes a la tribu Proteae pueden desaminar la

fenilalanina. A continuación, la Tabla 1, enumera las pruebas de primera línea utilizadas en

la identificación fenotípica en los laboratorios de microbiología clínica, que excluyen a estas

Enterobacteriacea infrecuente, de la Tribu Proteae:

Especie / fenilalanina deaminasa(%)a Prueba diferencial b

Rahnella aquatilis (95%) lactosa +, ONPG+, malonato+, urea‐, β Glu +,

inmóvil a 35ºC

Butiaxella noackiae (100%) ONPG+, urea –, malonato+

Complejo Enterobacter agglomerans(20%) ONPG +, Pig amarillo (75%), urea (20%)

Cronobacter(Enterobacter)sakasakii (50%) lactosa+,ONPG+, ODC+, ADH+, Pig amarillo+

Pragia fontium (20%)c urea –

Tatumella ptyseos (90%) urea ‐, inmóvil a 35ºC

a Adaptado de Farmer JJ III, Wright K, Janda M. Enterobacteriaceae. Manual of Clinical Microbiology. 2007. b +: indica más del 90 % de los aislados producen la reacción positiva; -: indica menos del 10% de los aislados producen la reacción positiva. Pig: pigmento, ONPG: o-nitro fenil β- galactosidasa, ODC: ornitina decarboxilasa, ADH: arginina dehidrolasa, β Glu: β- glucosidasa. c No se ha encontrado en muestras de origen humano.


Como corolario se puede resumir que las especies raras de Enterobacteriaceae que

desaminan fenilalanina a diferencia de la tribu Proteae producen ONPG con excepción de

Pragia y Tatumella. Estas últimas no desaminan lisina.

Los aislamientos pertenecientes al género Proteus se identifican presuntivamente por su

olor típico desagradable, la invasión en medios no selectivos y la producción de sulfuro de

hidrógeno en agar TSI. Sin embargo, el olor desagradable también está presente en los

cultivos de Morganella y Providencia; el fenómeno de la invasión puede estar ausente en

los aislados clínicos y la producción de gas sulfídrico también. Si bien en las tablas del

manual de la ASM se consigna con un porcentaje de positividad del 98, 95 y 30% a la

prueba de SH2 en agar TSI para P. mirabilis, P. vulgaris y P. penneri, respectivamente,

estos porcentajes suelen diferir de los observados por otros microbiológos. De hecho en la

última edición de Manual de Microbiología de ASM (Versalovic J. et al., 10ª edición, 2011)

en la tablas de diferenciación de Proteus, Providencia y Morganella y sus respectivas

especies, la prueba de SH2 en P. vulgaris se consigna como V (11-89% de positividad para

la prueba). Al parecer, el porcentaje del 98% para las producción de SH2 en P. mirabilis es

excesivamente alto, pues en nuestro medio es bastante habitual encontrar la ausencia de

tal característica en esta especie. De hecho, Castro et al. describieron sobre un total de 87

P. mirabilis aislados de muestras clínicas que la producción de SH2 fue detectada en el

67%. Algo similar sucedió con P. vulgaris puesto que de 103 aislados la producción de SH2

fue del 76%. La Tabla 2 muestra las principales características fenotípicas diferenciales

entre los géneros que integran la tribu Protege

Tabla 2. Características fenotípicas diferenciales de los géneros que integran la Tribu Proteae.

Prueba Proteus Morganella Providencia

Ureasa + + Va

SH2 (TSI) V ‐b ‐

Invasión( 35ºC) V ‐ ‐

Citrato(Simmons) V ‐ + c

Des lis(LIA) d +d ‐ ‐

ODC V e +f ‐

Manosa/xilosa ‐/+ +/‐ +/‐

Gelatinasa +g ‐ ‐

Manitol,arabitol, inostol,adonitol ‐ ‐ + (al menos uno de

ellos según especie)


a Providencia rettgeri +, Providencia stuartii V, Providencia alcalifaciens – b Algunos biotipos pueden producir una pequeña cantidad de SH2 en agar TSI c Algunos aislamientos pueden ser negativos d Des Lis: Lisina deaminasa. P penneri puede no desaminar la lisina o producir la reacción después de las 24 hs incubación. e P mirabilis +, P. vulgaris P. hauseri y P penneri-. P mirabilis puede producir la reacción negativa. f Algunos aislados puede producir la reacción negativa. g Uno de cada dos P. penneri producen la reacción positiva. Si se utiliza el método de Frazier sólo es válido para las cepas que no producen invasión.

La Tabla 3 muestra las características diferenciales de las especies del género Proteus Tabla 3: Características diferenciales de las especies del género Proteus que infectan humanos.

Característica a P. mirabilis Complejo P. vulgaris P. penneri

(Incluye P. hauseri)

TSI alcalino/ácido b ácido/ácido ácido/ácido

SH2 (TSI) V V V c

Citrato(Simmons) V V ‐

ODC + d ‐ ‐

Indol ‐ + ‐

Sacarosa ‐ e + +

Maltosa ‐ + +

a TSI: agar hierro tres azúcares, ODC: ornitina decarboxilsa. Sacarosa y maltosa: fermentación de, preferentemente en medio base de Andrade. b Sólo un pequeño porcentaje de P. mirabilis puede fermentar sacarosa y producir un TSI ácido/ácido. c La mayoría de los aislados no generan SH2 en TSI. d Algunos aislados no decarboxilan la ornitina. En el esquema de identificación la diferenciación se puede hacer a través de las reacciones obtenidas en agar TSI. La prueba confirmatoria es la fermentación de la maltosa. e Un pequeño porcentaje fermenta sacarosa.

Para tener en cuenta:

Existen aislamientos de P. vulgaris que no invaden y no producen SH2. Estos aislamientos

presentan muchas similitudes fenotípicas con los aislamientos de Providencia spp ureasa+

(P. rettgeri o P. stuartii). La Tabla 4 muestra las similitudes y las diferencias fenótipicas

entre ambos.


Tabla 4: Características diferenciales y similitudes entre P. vulgaris SH2‐ y no invasivo y

Providencia spp ureasa+.

Prueba Proteus vulgaris Providencia spp

(SH2‐, No invasivo) (ureasa +)

Agar TSI ácido/ ácido alclino/ácido a

Citrato(Simmons)b V +

LIA c desaminada desaminada

Indol c + +

ODC c ‐ ‐

Manosa d ‐ +

Xilosa d + ‐

Gelatinasa d + ‐

Maltosa + ‐

a Es posible que aislamientos que fermentan la sacarosa (más frecuentemente se observan en P. stuartii) produzcan un TSI ácido/ ácido, es decir idéntico al que produce P. vulgaris. b Citrato + 20%, en Farmer JJ et al. Manual of Clinical Microbiology, 2007. Aislados de Providencia spp pueden no crecer en citrato. c Características fenotípicas idénticas entre Providencia spp y P. vulgaris d Características diferenciales de género. Con referencia al perfil de sensibilidad P vulgaris es portador de una β lactamasa de clase A

de Ambler (grupo 2e de Karen Bush), tipo cefuroximasa, que se inhibe con ácido

clavulánico. Esta β-lactamasa confiere a los aislados salvajes resistencia a las

aminopenicilinas, a las cefalosporinas de primera generación, como la cefalotina, pero no a

la combinación de aminopenicilinas con ihnibidores de β-lactamasas (como ampicilina con

sulbactama y amoxicilina con ácido clavulánico).

En cambio, Providencia rettgeri y P. stuartii son portadoras de una cefalosporinasa de clase

C de Ambler (grupo 1 de Karen Bush), de tipo AmpC. De ello se deduce que posee

resistencia a las cefalosporinas de primera generación y de acuerdo a la capacidad de

inducción a las aminopenicilinas y a la combinación de las mismas con inhibidores de β

lactamasa. No obstante, Cornaglia et al. han descripto aislados de Providencia de origen

urinario, sensibles a amoxicilina-ácido clavulánico. Providencia stuartii (también lo puede

ser P. rettgeri) es resistente a gentamicina.


Bibliografía:

Abbot S. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other

Enterobacteriaceae. En Versalovic J, Carroll K, Funke G, Jorgensen J, Landry ML, Warnock

D. Manual of Clinical Microbiology. 10º Edición. Vol 1. Capítulo 37. ASM Press, Washington

DC, 2011.

Farmer JJ III, Wright K, Janda M. Enterobacteriaceae. En Murray P, Baron H, Jorgensen J,

Landry ML, Pfäller M. Manual of Clinical Microbiology. 9ª Edición. Vol 1. Capítulo 42. ASM

Press, Washington DC, 2007.

Castro S., Rodríguez CR, Perazzi B, Radice, M, Paz Sticotti M, MuzioH, Juárez J, Gutkind G,

Famiglietti A, Santini P, Vay,C. Comparación de diferentes métodos para identificar las

especies del género Proteus. Rev Argent Microbiol. 38: 119-124, 2006.

O´Hara C, Brenner F, Miller J. Classification, identification, and clinical significance of

Proteus, Providencia, and Morganella. Clin Microbiol Rev. 13:534-546, 2000.

Cornaglia G, Frugoni S, Mazzariol A, Piacentini E, Berlusconi A, Fontana R. Activities of oral

antibiotics on Providencia strains isolated from institutionalized elderly patients with urinary

tract infections. Antimicrob. Agents Chemother. 39:2819–282. 1995.

PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN...

Documents

Transcript of PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN...