'Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena ... · Visitación Conforti y María del...

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Tesis Doctoral

Prospección biotecnológica deProspección biotecnológica decultivos de Euglena graciliscultivos de Euglena gracilis

(Euglenozoa)(Euglenozoa)

Tolivia, Analía Alejandra

2014

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Tolivia, Analía Alejandra. (2014). Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis(Euglenozoa). Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Tolivia, Analía Alejandra. "Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis(Euglenozoa)". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2014.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental

Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis (Euglenozoa)

Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el

área CIENCIAS BIOLOGICAS

Analía Alejandra Tolivia Directoras de tesis: Dra. Visitación Conforti

Dra. María del Carmen Ríos de Molina Consejero de Estudios: Dra. Visitación Conforti Buenos Aires, 2014.

Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis (Euglenozoa)

En este estudio, extractos libres de paramilon, de dos cepas de Euglena gracilis (Klebs), se sometieron a un cribado químico para detectar metabolitos secundarios. Ambas cepas fueron estudiadas en sus formas fotosintéticas y blanqueadas, en sus fases de crecimiento exponencial y estacionaria. Se realizaron análisis cromatográficos y se estudiaron sus capacidades bioactivas mediante ensayos primarios. Se detectó así la presencia de esteroides, cardenólidos, triterpenos, taninos y flavonoides. En correlación con la presencia de polifenoles, los extractos polares mostraron actividad antioxidante frente al radical estable DPPH� e inhibición de crecimiento in vitro, incluso en ausencia de paramilon, sustancia con propiedades antioxidantes y antitumorales.

También se evaluó la producción de paramilon resultando las cepas blanqueadas cultivadas en medio mineral con exceso de acetato las más eficientes. Por derivatización de este polisacárido se obtuvo un producto con propiedades antivirales frente al Herpes virus tipo I, y su inclusión en la dieta de Cherax quadricarinatus, especie de importancia comercial, tuvo un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores humorales sin afectar su crecimiento.

Finalmente, dado que estas microalgas poseen una película formada por bandas superpuestas que se asemeja a una red de difracción, se investigó desde el punto de vista electromagnético el papel que esta estructura desempeña en la protección frente a la radiación UV. Aplicando el método de Chandezón para resolver el problema de difracción de una red iluminada por una onda plana, se calculó la reflectancia de esta estructura, mostrando que el patrón periódico exhibido por la película podría proporcionar un método de protección frente a los rayos UV.

Palabras claves: Euglena gracilis, metabolitos bioactivos, paramilon, actividad antiviral, inmunoesimulante, respuesta electromagnética de la película.

Prospective biotechnological applications of Euglena gracilis (Euglenozoa) cultures

In this study, Euglena gracilis (Klebs) extracts from two strains were screened for the identification of secondary metabolites. Both strains were studied in their photosynthetic and bleached forms, on their exponential and stationary growth phases. Chromatographic analyses were performed and bioactive capabilities were studied using primary assays. Steroids, cardenolids, triterpenes, tannins, and flavonoids were found. In agreement with the presence of polyphenols, the polar fractions showed antioxidant activity against DPPH� and growth inhibition activity in vitro even in the absence of paramylon, which has been previously reported to have antioxidant and antitumoral properties.

The bleached strain grown in mineral medium with an excess of acetate was the most efficient at paramylon production. By derivatization of this polysaccharide, a product was obtained with antiviral properties against herpes virus type I. Its inclusion in the diet of Cherax quadricarinatus, a commercially important species, had a protective and immunostimulant effect of the humoral effectors without affecting their growth.

Finally, since these microalgae are covered by a typical surface pellicle formed by overlapping bands which resemble a diffraction grating, we investigated from an electromagnetic point of view the role this pellicle might play in the protection against UV radiation. The reflectance of the structure, calculated by applying the C‐method to solve the diffraction problem of a grating illuminated by a plane wave, showed that the periodic pattern exhibited by the pellicle has the potential to provide protection against UV damage.

Key words: Euglena gracilis, bioactive metabolites, paramylon, antiviral activity, immunostimulant, electromagnetic response of the pellicle.

AGRADECIMIENTOS

A la Agencia de Promoción Científica y Tecnológica, al CONICET y a la UBA, por su

financiamiento.

Al departamento de Biodiversidad y Biología Experimental y al departamento de

Química Biológica de la FCEN‐UBA, por permitirme usar instalaciones y equipamiento.

A mis directoras, Dras. Visitación Conforti y María del Carmen Ríos de Molina, por

abrirme sus puertas, por las oportunidades brindadas, por su apoyo, confianza y guía

constante, y por su compromiso con este trabajo, que no habría sido sin ellas.

A mis maestros, Ángela Juárez, Cecilia Rodríguez, Josefina Albergina, Carlos Velez, María

Teresa Wenzel y Nora Maidana, por haber compartido oportunamente sus saberes

conmigo.

A mis compañeros de laboratorio, Cristian Solari, Laura Ruiz, Paula Nannavecchia,

Vanina Galzenati, Maria Luz Padules, Jaun Pablo Basualdo, y Benjamín Basanta (que se

fue lejos), por su apoyo, sus infinitas colaboraciones, y por hacerme reír todos los días.

A la Dra. Iara Rocchetta, por su generosa ayuda, por sus consejos, por compartir su

conocimiento desinteresadamente y asesorarme aún en la distancia.

A las Dras. Julia Pettinari y Nancy López, por las cepas bacterianas.

A la gente de QB81, Dr. Sebastián Sabatini, Dra. Gabriela Chaufan, Lic. Mercedes Iumato,

Lic. Marisol Yusseppone, Lic. Anabella Fassiano, y Lic. Isis Coalova, por su buena

predisposición y ayuda, por hacerme sentir parte del grupo, y por los mates.

A los que de generosamente colaboraron con este trabajo: Dr. Daniel Medesani, Dra.

Verónica Viau, Dra. Cecilia Carmarán, Dra. Diana Skigin, Dra. Marina Inchaussandague,

Dra. Viviana Castilla, Dra. María Cecilia Rodríguez, Isabel Fuertes Vila, Dra. María Luján

Flores y Dr. Osvaldo Córdoba.

A mis compañeros del Colegio de la Ciudad, por mostrarme otras realidades y

enseñarme algo nuevo cada día.

A mis amigas, Cecilia y Marcia Lamela, María Laura Carrevedo, Verónica Viau, Silvina

Rosa, María Solange Vera, Daniela Echazú, Renata Menéndez, Liliana y Analía Martínez,

Laura Carignano, Natalia Benítez, Marina Carpano y Stella Molteni, por acompañarme

siempre en los caminos fáciles y en los difíciles.

A María, Carlos, Facu, Guada, Lucas, Luz, Carly, Laura, Juanita, Román, Marce, Juanita

(bis), Belén, Aída y Juana, por dejarme ser una más de ustedes.

A mi familia; Marta, Mario y Fer, por su apoyo constante e incondicional.

A Martín, por ser mi compañero, por hacer mi vida más linda y por planear conmigo el

futuro.

i

ÍNDICE

Abreviaturas utilizadas en el texto

Capitulo 1‐ Introducción general 1

Capitulo 2‐ Estudio farmacognóstico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

Sección I‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

Introducción 11

Objetivos e Hipótesis de trabajo 25

Materiales y Métodos 29

Resultados y Discusión 43

Conclusiones 69

Sección II‐Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

Introducción 75




Conclusiones 111

Capítulo 3‐ Estudios sobre la producción y potencial bioactivo del paramilon obtenido de Euglena gracilis

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de Euglena gracilis y obtención de un derivado

Introducción 119



ii


Conclusiones 157

Sección II‐ Actividad Antiviral frente al virus Herpes simplex tipo 1

Introducción 163




Conclusiones 201

Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus

Introducción 207




Conclusiones 251

Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis

Introducción 257




Conclusión 291

Capítulo 5‐ Conclusiones 295

Bibliografía

iii

Abreviaturas utilizadas en el texto:

ABAP‐ 2,2'‐azobis 2 dihidrocloruro metilpropionamidina

AG‐P‐ acilguanosina monofosfato

AMF‐ Microscopio de Fuerza atómica

BAW‐ fase móvil formada por n‐butanol:ácido acético:agua (4:1:5)

BBOT‐ bis(5‐tert‐butil‐2‐benzoxazolil)tiofeno

BUE‐ medio Buetow

βGBPs‐ porteínas de unión a β ‐glucanos

CC20‐ concentración citotóxica 20

CC50‐ concentración citotóxica 50

CE50‐ concentración efectiva 50

CEDFINI‐ ciclohexanona‐2,4‐dinitrofenilhidrazona

C&M‐ medio Cramer & Mayers

DCC‐ diciclohexilcarbamida

DCF‐ diclorofluoresceína

DCM‐ diclorometano

DMF‐ dimetiformamida

DMSO‐ dimetilsulfóxido

DOX‐ 1‐desoxi‐D‐xilulosa

DO600‐ densidad óptica medida a 600 nm

DPPH�‐ 1,1‐difenil‐2‐picril hidrazilo

dSRCI‐ receptor scavenger de Drosophila

EBV‐ virus de Epstein‐Barr

EGM ‐ Euglena gracilis medium

EROS‐ especies reactivas de oxígeno

vi

EtOAc‐ Acetato de etilo

EtOH‐ etanol

f‐ cepa fotosintética

Fexp‐ fase de crecimiento exponencial

Fest‐ fase de crecimiento estacionaria

Forestal‐ fase móvil formada por ácido acético:ácido clorhídrico:agua (30:3:10)

GC‐ células granulosas

GNBPs‐ proteínas de unión gram‐negativas

GPI‐ glicosilfosfatidilinositol

h‐ cepa heterotrófica

HC‐ células hialinas

HIV‐ virus de la inmunodeficiencia humana

HSPG‐ proteoglicanos heparán sulfato

HSV‐ virus herpes simplex

HSV‐1‐ herpes virus tipo 1

HSV‐2‐ herpes virus tipo 2

H2DCF‐DA‐ 2',7' diacetato de diclorofluoresceína

IAA‐ indol‐3‐acético

ICL‐ isocitrato liasa

IPP‐ isopirenoide

IS‐ índice de selectividad

LAT‐ latencia

L‐DOPA‐ L‐3,4 dihidroxifenilalanina

LGBP‐ proteínas de unión a lipopolisacáridos

LPS‐ lipopolisacáridos

MAT‐ cepa Matanza

v

MC‐ medio de crecimiento

MEM‐ medio mínimo esencial de Eagle

MEP‐ metileritritolfosfato

MeOH‐ metanol

m.i.‐ multiplicidad de infección

MM‐ medio de mantenimiento

MS‐ malato sintasa

MTT‐ bromuro de 3‐[4,5‐dimetilthiazol‐2yl]‐2,5‐difeniltetrazoilio

MVA‐ ácido mavelónico

PAMPs‐ patrones moleculares asociados a patógenos

PG‐ peptidoglicanos

PGRPs‐ proteínas receptoras de peptidoglicano

PMSF‐ fluoruro de fenilmetilsulfonilo

PO‐ fenoloxidasa

PRPs‐ proteínas de reconocimiento de patrones

proPO‐ sistema profenoloxidasa

RA‐ Resistente a aciclovir

RP‐HPLC‐DAD‐ cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con arreglo de diodos

SAB‐ sero albúmina bovina

SC50‐ capacidad atrapante del 50% de radicales DPPH�

SDS‐ dodecilsulfato de sodio

SDS‐ PAGE‐ Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

SGC‐ célula semigranulosas

SHL‐ sobrenadantes de homogenatos de hemocitos

SIDA‐ síndrome de inmunodeficiencia humana

vi

TGN‐ región trans de Golgi

TK‐ timidin quinasa

TLC‐ cromatografía en capa delgada

UF‐ unidades de fluorescencia

UFP‐ unidades formadoras de placas

UTEX‐ cepa UTEX 753

VZV‐ virus varicela‐zoster

CAPITULOI Introducción general

Capítulo 1: Introducción General ‐ 3 ‐

La producción de biomasa es, probablemente, la mejor alternativa viable frente

a los recursos fósiles para la producción de combustibles y productos químicos. En los

últimos años, el interés en la biomasa obtenida a partir de microalgas ha crecido tanto

en el campo de la investigación básica como aplicada. En cuanto a sus aplicaciones,

éstas van desde la producción de biomasa simple para alimento, hasta la obtención de

productos de alto valor, aunque para la mayoría de ellas el mercado aún está en

desarrollo. Actualmente se busca convertir la biomasa microalgal en productos

químicos de valor agregado y biocombustibles, en biorrefinerías que utilizan diferentes

tecnologías (Uggetti et al., 2014). Teniendo en cuenta la enorme biodiversidad de las

microalgas y el desarrollo de la ingeniería genética, este grupo de organismos

representa una de las fuentes más prometedoras de nuevos productos. Ellas presentan

características únicas, constituyendo un valioso material de estudio para alcanzar un

mayor conocimiento de la diversidad microalgal, a fin de contribuir a preservar el

recurso ficológico y posibilitar una explotación racional.

Los euglenoideos, en particular, son organismos flagelados y poseen por debajo

de la membrana plasmática una estructura proteica denominada película, a menudo

muy flexible, lo que permite que algunas especies presenten lo que se conoce como

movimiento metabólico. Todos ellos son unicelulares, de vida libre, con la excepción

de un único grupo que vive arraigado, el género Colacium. Una particularidad de los

euglenoideos es que pueden presentar desde un metabolismo exclusivamente

autotrófico hasta un metabolismo exclusivamente heterotrófico (quimiorganotrofos a

predadores), pasando por organismos que presentan una combinación de tipos

metabólicos (mixotrofos). Esta diversidad metabólica y morfoestructural, también se

manifiesta en su diversidad ecológica y distribución en la biósfera (Huber‐Pestalozzi,

1955; Tell y Conforti, 1986).

La mayoría de los euglenoideos requieren medios de crecimiento complejos y

son difíciles de cultivar en condiciones axénicas, por lo que si bien se conocen

diferentes aspectos de su biología, poco se sabe sobre su fisiología y requerimientos

ecológicos, como para poder caracterizarlos desde el punto de vista de la producción

de metabolitos y su posible utilidad. Una excepción es Euglena gracilis (figura 1), que

puede cultivarse en medio mineral con éxito y se ha utilizado en cultivos a gran escala

‐ 4 ‐ Capítulo 1: Introducción General

(Siegelman y Guillard, 1971, Friday et al., 2010), dado que puede mantenerse en un

ambiente controlado. Por esta razón, es el euglenoideo más usado en investigaciones

fisiológicas.

Figura 1: Fotografías de Euglena gracilis Klebs. Disponibles en http://botany.natur.cuni.cz

Euglena gracilis presenta cloroplastos particularmente sensibles a diversos

agentes químicos y factores físicos. Estos pueden inducir su pérdida irreversible junto

con el material genético que en ellos se encuentra, en un proceso llamado

blanqueamiento (Mego, 1968; Schiff y Epstein, 1968; Gillham, 1978; Ebringer, 1978;

Kempner, 1982; Ebringer y Krajčovič 1986). Este proceso se manifiesta por la pérdida

permanente de la capacidad de las células para formar cultivos o colonias de color

verde. Los llamados mutantes blanqueados carecen de clorofila y protoclorofila

fototransformable en cantidades detectables con los métodos tradicionales (Parthier y

Neumann, 1977; Bingham y Schiff, 1979; Osafune y Schiff, 1980, 1983). Algunas cepas

mutantes blanqueadas contienen carotenoides mientras que otras carecen de ellos,

hecho indicativo de las variaciones fenotípicas encontradas entre las cepas

blanqueadas (Parthier y Neumann, 1977; Bingham y Schiff, 1979; Fong y Schiff, 1979).

Además de los fármacos antibacterianos como la estreptomicina (Provasoli, 1948), hay

un amplio grupo de sustancias químicas que también son capaces de blanquear

irreversiblemente a E. gracilis por lo que, desde un punto de vista biotecnológico, se

http://botany.natur.cuni.cz/

Capítulo 1: Introducción General ‐ 5 ‐

trata de una especie interesante ya que presentan una serie de vías metabólicas únicas

(Ragan y Chapman, 1978).

Se conocen algunas aplicaciones para esta especie. Ha sido probada como

alimento en aves de corral (Mokady et al., 1980), indicando que puede reemplazar

exitosamente en un 25% las proteínas de soja utilizadas en este tipo de dietas. Se ha

testeado para la producción de biocombustibles acoplado al tratamiento de aguas

residuales (Mahapatra et al., 2013), se ha utilizado como sustrato para producir biogas

renovable (Mussgnug et al., 2010) y para remover el CO2 generado en centrales

eléctricas (Apel et al., 1994), lo que sugiere que es una especie interesante desde el

punto de vista de la biorremediación. En ella se ha logrado la síntesis intracelular de

nanopartículas de ferrihidrita, un material híbrido con un comportamiento

superparamagnético (Brayner et al., 2012); esta síntesis de partículas inorgánicas es

una ruta atractiva para obtener coloides funcionales de forma ambientalmente

amigable y con grandes implicancias, dado que además, posibilita la obtención de

células vivas magnéticas con aplicaciones en detección y terapia (Mandal et al., 2006).

Si bien no se le atribuyen propiedades medicinales a E. gracilis, se sabe que son

productoras de varias moléculas de importancia como vitaminas C y E (Takeyama et

al., 1997; Ogbona et al., 1998; 1999; Fujita et al., 2008), ácidos grasos poliinsaturados

(Barsanti et al., 2000), β –carotenos (Takeyama et al., 1997) y paramilon (un β‐1,3

glucano con propiedades inmunomoduladoras) (Fruehauf et al., 1983; Sugawara et al.,

1984; Skov et al., 2012).

Sobre la base de estos conocimientos previos y teniendo en cuenta la

versatilidad metabólica de E. gracilis, se decidió realizar esta investigación con la

finalidad de poder estudiar a esta especie como potencial productora de metabolitos

de interés y como fuente de bioinspiración. Para el desarrollo de este trabajo se

utilizaron dos cepas de E. gracilis. Una cepa nativa proveniente de un río altamente

contaminado del conurbano bonaerense (Río Matanza, Bs. As.), llamada cepa MAT y

otra proveniente del Centro de Cultivo Algal de la Universidad de Texas (USA), llamada

cepa UTEX 753. Ambas cepas fueron cultivadas en condiciones autotróficas y

heterotróficas, para comparar no sólo la cepa nativa con la proveniente del cepario

sino también para estudiar la influencia de las distintas condiciones de cultivo en la

‐ 6 ‐ Capítulo 1: Introducción General

producción de biomasa, paramilon (su polisacárido de reserva) y metabolitos

secundarios. Para complementar estos análisis se llevaron a cabo estudios sobre

bioactividad de diferentes extractos obtenidos de su biomasa y del paramilon aislado.

Además se realizaron observaciones ultraestructurales como complemento de los

estudios mencionados anteriormente y se utilizaron para analizar el perfil de la película

de E. gracilis y otros dos euglenoideos (P. trichophorum y M. megalopsis) con el fin de

predecir la respuesta de esa estructura ante la luz UV. Esto último tiene un particular

interés dado el potencial desarrollo de nuevas superficies con el fin de fabricar

estructuras similares a las halladas en la naturaleza con un objetivo específico.

CAPITULOIIEstudio farmacognóstico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

SecciónICribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 11 ‐

1. INTRODUCCIÓN

Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.

‐ 12 ‐


1.1 Los productos naturales

Se define como metabolismo al conjunto de reacciones químicas que tienen

lugar en un organismo. En aquellos que son fotosintéticos, la mayor parte del carbono,

y del nitrógeno con el aporte energético de la luz constituyen moléculas comunes a

todas las células, que son esenciales para su funcionamiento. A este tipo de

compuestos se los denomina metabolitos primarios ya que tienen una función

metabólica directa, son intermediarios esenciales en las vías catabólicas y anabólicas y

se encuentran en todas las células. Sin embargo, no todas las moléculas sintetizadas

por las células son metabolitos primarios. Los compuestos obtenidos a partir de

fuentes naturales, pueden ser agrupados en tres grupos (tabla 1):

1) los resultantes del metabolismo primario, también llamados principios inmediatos

por estar definidos por la fotosíntesis, la respiración y la síntesis proteica;

2) los resultantes del metabolismo intermedio, producidos directamente por los ciclos

metabólicos primarios;

3) los obtenidos como producto de un metabolismo secundario específico, los cuales

tienen distribución restringida y una función específica.

Numerosos productos químicos provenientes de fuentes naturales están

asociados con beneficios para la salud y son conocidos desde hace mucho tiempo

(Rouhi, 2003). Si bien muchos de ellos se clasifican como metabolitos secundarios

(también denominados productos naturales) esta terminología indica, a menudo

incorrectamente, que ellos no son esenciales para el crecimiento normal, el desarrollo

o la reproducción del organismo que los produce. Estos productos no presentan una

función definida en los procesos fotosintéticos, respiratorios, de asimilación de

nutrientes, de transporte o de síntesis. Además, muchos de ellos presentan una

distribución restringida, es decir, se sintetizan en pequeñas cantidades, no de forma

generalizada y en general por un determinado grupo taxonómico.

Hasta hace poco la principal fuente de medicamentos comerciales han sido los

productos naturales o bien sus fabricantes se han inspirado en ellos. Sin embargo, a

partir de la década de los 90, el descubrimiento de fármacos a partir de fuentes

naturales fue prácticamente eliminado de la industria farmacéutica. Este hecho se

basó principalmente en las nuevas propuestas del entonces emergente campo de la

química combinatoria (Cseke et al., 2004), donde bibliotecas enormes de pequeñas


‐ 14 ‐

moléculas diseñadas por el hombre podrían ser rápidamente sintetizadas y evaluadas

como posibles fármacos. Hasta el momento, este enfoque no ha dado los resultados

esperados. La gran mayoría de los compuestos combinatorios no se han convertido en

medicamentos aprobados, aunque algunos se encuentran en fase de ensayos clínicos.

Al mismo tiempo, el número de nuevos medicamentos que entran en el mercado se

han reducido y esto ha dado lugar a nuevas consideraciones sobre las estructuras

privilegiadas inherentes a los productos naturales (Desimone et al., 2004).

Productos del metabolismo Primario Intermedio Secundario

Carbohidratos Monosacáridos Glicósidos, Azúcares modificados, Ac. Urónicos, Heparina

Proteínas Aminoácidos Alcaloides, taninos, fenil propanos, cumarinas

Lípidos Ácidos grasos Policétidos, terpenos, esteroles, triterpenos Ácidos nucleicos Bases Tetrapirroles, alcaloides imperfectos

Tabla 1: Principales productos de los distintos tipos de metabolismo.

Un gran porcentaje de los principios bioactivos, comprendidos dentro de los

llamados metabolitos secundarios, han sido estudiados por su valor potencial y por sus

posibles aplicaciones como medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o

colorantes, entre otros. Sin embargo durante la última parte del siglo pasado ha

aumentado la atención sobre sus funciones biológicas y el rol ecológico que

desempeñan en la regulación entre organismos, en cuyo caso se los conoce como

compuestos alelopáticos. El metabolismo secundario tiene sus bases en moléculas

provenientes del metabolismo primario, por lo que su relación es inevitable (Bentley,

1999). La mayoría de los metabolitos secundarios derivan del acetil‐CoA, del ácido

shikimico o del ácido mevalónico que constituyen las tres principales rutas

biosintéticas (figura 1). El estudio de nuevos organismos como fuente de este tipo de

compuestos contribuye a su mejor aprovechamiento y se proponen como una

alternativa frente a los medicamentos de síntesis.


Gliceraldehido 3-Fosfato Ruta del Metileritritol fosfato (MEP)

Figura 1: Principales rutas biosintéticas de metabolitos secundarios.

Dentro de los metabolitos secundarios, los principales grupos reconocidos son:

los compuestos terpénicos, los fenólicos y los nitrogenados, aunque no todos ellos se

ajustan a esta clasificación (por ejemplo las acetogeninas).

Compuestos terpénicos

Ellos forman una muy diversa familia de sustancias naturales producidas por

una gran variedad de organismos. Unos 30.000 terpenos han sido identificados

(Sacchetini y Poulter, 1997). La ruta biosintética de estos compuestos da lugar tanto a

metabolitos primarios como secundarios. Algunos terpenos son muy apreciados por

sus propiedades como aceites esenciales y su uso como fragancias data de más de dos

mil años (Turner, 1970). El grupo de los terpenos incluye hormonas (giberelinas y ácido

abscísico), pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), esteroles (ergosterol,

colesterol), derivados de los esteroles (glicósidos cardíacos), látex y aceites esenciales.

Aunque las citoquininas y las clorofilas no pertenecen a este grupo, contienen en su

Terpenos CO2 Metabolismo Piruvato Ruta del ácido primario mevalónico Compuestos nitrogenados Acetil CoA Ruta del ácido Malónico Ciclo de Krebs Aminoácidos Alifáticos

s Fosfoenolpiruvato Aminoácido aromáticos Eritrosa-4-fosfato uta del ácido sikím R ico Compuestos

fenólicos

Gliceraldehido 3‐Fosfato Ruta del Metileritritol fosfato (MEP) Terpenos CO Metabolismo Piruvato Ruta del ácido 2

primario mevalónico Compuestos nitrogenados Acetil CoA Ruta del ácido Malónico Ciclo de Krebs Aminoácidos Alifáticos Fosfoenolpiruvato Aminoácidos aromáticos mpuestos Eritrosa‐4‐fosfato Ruta del ácido shikimico Co fenólicos


‐ 16 ‐

estructura una cadena lateral que es un terpeno. El término terpenoide hace

referencia a los terpenos modificados por oxidación o por reacomodamiento de su

esqueleto carbonado, como por ejemplo la vitamina A.

Afortunadamente, a pesar de su diversidad, los terpenos tienen una

característica simple y unificadora por la cual se definen y por la que se los puede

clasificar fácilmente. Todos ellos tienen unidades fundamentales (isopreno) de cinco

carbonos que se repiten (Croteau, 1998). Se definen como un grupo único de

productos basados en hidrocarburos naturales que poseen una estructura que deriva

hipotéticamente del isopreno, aunque éste nunca ha sido encontrado como producto

natural. La unidad isoprenoide, el isopentenil difosfato (IPP; Croteau y Loomis, 1975),

es producida por dos rutas biosintéticas diferentes. Se trata de una molécula de alta

capacidad reactiva que se polimeriza formando los distintos grupos de compuestos

terpénicos. La primera ruta biosintética es conocida como la ruta del MEP

(metileritritolfosfato) o vía DOX (1‐desoxi‐D‐xilulosa). En ella, el IPP se forma en el

cloroplasto, principalmente para los mono y diterpenos más volátiles. La segunda vía,

se conoce como la ruta del ácido mevalónico (MVA). Esta ocurre en el citoplasma y se

producen sesquiterpenos (Janses y De Groot, 2004). Los detalles de su biosínteis han

sido estudiados con anterioridad (Kuzuyama, 2002; Dubey et al., 2003; Eisenreich et

al., 2004). Un esquema simplificado de esta vía se muestra en la figura 2.

Figura 2: unidad isopirenoide (IPP) y biogenesis de los terpenos.

Terpenos

-P‐P

-P‐P


Los terpenos se clasifican por lo tanto según el número de unidades de cinco

carbonos (IPP) que contienen en:

C5: hemiterpenos

C10: monoterpenos (Aceites esenciales)

C15: sesquiterpenos (Acido abscísico)

C20: diterpenos (Giberelinas)

C30: triterpenos (Esteroides)

C40: tetraterpenos (Carotenoides)

Cn: politerpenos (Gomas y resinas)

La función de ellos en los organismos fotosintéticos, más precisamente en los

vegetales, se considera generalmente ecológica y fisiológica. Muchos inhiben el

crecimiento de otros vegetales disminuyendo así la competencia (alelopatía). Algunos

son conocidos por su acción insecticida, mientras que otros atraen a los insectos, por

ejemplo, polinizadores. Los ácidos abscísico y el giberélico, hormonas vegetales, son un

sesquiterpeno y un diterpeno respectivamente (Srivastava, 2002). Más de 130

giberelinas fueron identificadas, y nuevas estructuras terpénicas se siguen informando

en la actualidad (Silverstone y Sun, 2000; Al‐Jaberab et al., 2012; Ibrahim, 2012).

Desde el punto de vista de la aplicación farmacéutica, los principios activos más

interesantes de naturaleza terpénica son los monoterpenos y sesquiterpenos volátiles,

constituyentes de los aceites esenciales. En algas, por ejemplo, este tipo de sustancias

ha sido encontrada en el alga roja Laurencia obtusa (Topcu et al., 2003). Entre los 4

sesquiterpenos encontrados en esta especie, uno de ellos resultó tener actividad

frente a Plasmodium falciparum pudiendo considerarse como agente antimalárico.

También se hallaron en el alga Chlorodesmis fastigiata (Rasher et al., 2011) en la que

operan como potentes agentes alelopáticos.

Las giberelinas, reguladoras del crecimiento de las plantas, son un ejemplo de

diterpenos, en general tóxicos para los herbívoros.

Los triterpenos están formados por seis unidades de isopreno y son

biosintéticamente derivados del escualeno, una molécula de cadena lineal de 30 C de

la que todos los triterpenos cíclicos. Hay varios grupos importantes de estos


‐ 18 ‐

compuestos, incluyendo los triterpenos comunes, esteroides, saponinas, esteroles y

glucósidos cardíacos.

En el reino animal, los esteroides tienen gran importancia como hormonas,

coenzimas y provitaminas. En el reino vegetal prácticamente todos los esteroides se

encuentran hidroxilados en C‐3, se conocen como esteroles (fitosteroles) y su papel es

menos conocido. Hay evidencias de que algunos de los fitosteroles son eficaces contra

enfermedades cardiovasculares (Kris‐Etherton et al., 2002), probablemente porque

ellos colaboran en la disminución del colesterol en animales.

Entre los triterpenos se encuentran algunos esteroides en forma de glicósidos

con importantes funciones en medicina y en la industria. Entre estos se encuentran las

saponinas y los cardenólidos (glicósidos cardíacos). Las saponinas, ampliamente

distribuidas (Woitke et al., 1970) son glicósidos esteroidales o triterpénicos que tienen

la capacidad de romper las membranas de los glóbulos rojos y causar hemólisis. Tienen

la propiedad de hacer espuma con el agua, de ahí su nombre, y se pueden utilizar

como detergentes. Por otro lado, son tóxicos para peces y algunos poseen actividad

expectorante (Fenwick et al., 1990), bacteriostática (Bo et al., 2002), antiviral

(Utsunomiya et al., 1997) e inmunoestimulante (Naj et al., 2000).

Los cardenólidos son derivados del núcleo esteroideo general. Pertenecen a

este grupo los glicósidos cardíacos, sustancias que se emplean en casos de insuficiencia

cardiaca congestiva aumentando la fuerza de la contracción del corazón sin acrecentar

significativamente otros parámetros, que resultarían muy tóxicos en altas

concentraciones (Liu et al., 2010; Ho et al., 2011; Taheri et al., 2012). Su mecanismo de

acción generalmente implica la inhibición de las bombas de sodio‐potasio lo que

provoca múltiples efectos en la fisiología y patología cardíaca (Gheorghiade et al.,

2004).

Los carotenoides, estrechamente vinculados con el proceso de fotosíntesis,

pertenecen al grupo de los tetraterpenos y derivan generalmente del licopeno. Forman

dos grupos ampliamente distribuidos: carotenos y xantofilas. La ciclación en un

extremo da origen al γ‐caroteno y en ambos extremos al β‐caroteno, pigmento

prácticamente universal en los organismos fotosintéticos. Por tratarse de polienos,

variaciones en sus dobles enlaces dan lugar a numerosos isómeros, lo cual puede

proporcionar numerosos pigmentos responsables de diferentes colores, desde el


amarillo al rojo, necesarios en la fotosíntesis, donde actuarían protegiendo a los

organismos de la sobreoxidación catalizada por otros pigmentos que absorben la luz,

tales como las clorofilas.

Las gomas o resinas presentan moléculas de entre 1.500‐15.000 unidades

isoprenoides, los politerpenos. Ellos son pequeñas partículas que se encuentran

suspendidas en el látex, el cual solidifica al ponerse en contacto con el aire y constituye

un mecanismo de defensa frente a daños mecánicos.

Compuestos fenólicos.

Muchos organismos sintetizan una amplia variedad de metabolitos secundarios

que comparten la característica de poseer en su estructura varios grupos bencénicos

con sustituyentes hidroxilo. Estos reciben el nombre de compuestos fenólicos,

polifenoles o fenilpropanoides y todos ellos derivan del fenol, un anillo aromático con

un sustituyente hidroxilo. Desde el punto de vista de la estructura química, son un

grupo muy diverso que incluye desde moléculas sencillas, como los ácidos fenólicos,

hasta polímeros complejos, como los taninos.

Los colores vivos de muchos organismos fotosintéticos provienen generalmente

de tres fuentes: los tetrapirroles, principalmente la clorofila; los carotenos, de

naturaleza terpénica, como se mencionara anteriormente, y los compuestos

aromáticos. De estos últimos se conocen varios miles y continuamente se descubren

nuevas estructuras (Kawamura‐Konishi et al., 2012). En algunos casos, sus funciones

son bien conocidas, por ejemplo, las ligninas polifenólicas que son componentes

estructurales de paredes celulares. En otros casos, incluyendo los flavonoides, se han

propuesto una variedad de funciones, muchas de las cuales aún continúan en

investigación.

Los compuestos aromáticos se sintetizan por varias rutas biosintéticas. Estas

incluyen la vía del shikimato, que conduce por la síntesis de aminoácidos aromáticos

(fenilalanina, tirosina y triptófano), a los ácidos cinámicos y sus derivados (fenoles

sencillos, ácidos fenólicos y derivados, cumarinas, lignanos y derivados del

fenilpropano), la ruta de los poliacetatos que originan quinonas, xantona y orcinoles, y

las vías que generan los terpenoides. Algunos polifenoles se originan a través de rutas


‐ 20 ‐

mixtas que combinan la vía del shikimato y del acetato, como el caso de los

flavonoides.

Debido a la acidez de la función hidroxílica (pKa de 8 a 11, dependiendo de los

sustituyentes), las sustancias fenólicas tienden a ser solubles en agua y con frecuencia

forman enlaces con residuos de carbohidratos. La mayoría de los fenoles simples son

componentes monoméricos de los polifenoles e incluyen, por ejemplo, al ácido

salicílico y gálico.

Los polifenoles son un grupo heterogéneo de moléculas. Dentro de esta gran

familia de compuestos se encuentran:

I‐ Los flavonoides: grupo ampliamente distribuido de pigmentos no

nitrogenados. Su esqueleto carbonado contiene 15 carbonos ordenados en dos anillos

aromáticos unidos por un puente de tres carbonos (figura 3). Por lo general son

solubles en agua y se encuentran como glucósidos, hecho que puede complicar su

determinación estructural. Generalmente están presentes en el citoplasma y vacuolas

de las células de los organismos que los producen. Se han reportado como sulfatos,

como dímeros (He et al., 1996; Barron et al., 1988) y como polímeros (Pan y Lubdgren,

1996).

Los flavonoides se clasifican en función del grado de oxidación del puente de

tres carbonos (figura 3) en: chalconas, flavonas, flavonoles, flavanonas, antocianinas e

isoflavonas. Otros grupos comunes incluyen auronas, xantonas y taninos condensados.

Son metabolitos secundarios de origen biosintético mixto, el anillo A proviene de la

ruta de la malonilcoenzima A y el anillo B y la cadena C3 derivan de la ruta del ácido

shikimico (figura 3).

Figura 3: Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración.

Entre las funciones de estos compuestos se encuentra la defensa y la

pigmentación. Las flavonas y flavonoles son los más ampliamente distribuidos de todos


los compuestos fenólicos. Desde el punto de vista de su potencial aplicación, se

conoce que muchos de ellos actúan a nivel circulatorio e inhiben la agregación

plaquetaria (Tzeng et al., 1991; Tsai et al., 1996; Mosa et al., 2011). Se han citado como

antiinflamatorios (Aquila et al., 2009; González Mosquera et al., 2011; Feng et al.,

2012) y antialérgicos (Kawai et al., 2007; Tewtrakul et al., 2008). También existen

estudios que demuestran su acción benéfica en el tratamiento de tumores prostáticos

(Wang et al., 2012; Ni et al., 2012; Khan et al., 2012) así como la relación entre su

estructura y actividad sobre el cáncer de mama (Zhang et al., 2005; Pick et al., 2011).

La galangina, un flavonoide aislado de la falsa acacia (Robinia pseudoacacia) ha

mostrado actividad antimicrobiana contra cepas resistentes a antibióticos de

Staphylococcus aureus (Cushnie et al., 2003). La quercetina, ampliamente distribuida

entre las plantas, posee actividad antioxidante. Actualmente este compuesto es muy

popular en las tiendas naturistas, aunque los beneficios son especulativos (Graefe et

al., 1999). Otros estudios los citan como compuestos con actividad anti HIV y en este

caso también se ha investigado la relación estructura‐actividad (Lameira et al., 2006).

Algunos isoflavonoides tienen acción antimicrobiana (Ortega et al., 1996), antifúngica y

leishmanicida (Cordell, 1995). A estos se les ha atribuido una cantidad de propiedades

farmacológicas incluyendo actividades inhibidoras de las enzimas hidrolasas,

ciclooxigenasas (Noreen et al., 1998; Selvam et al., 2004), fosfatasa alcalina, cAMP

fosfodiesterasa, ATP‐asas, liasas, hidroxilasas, transferasas, oxidoreductasas y quinasas

(Cordell, 1995).

Entre las algas, si bien hasta hace unos años los flavonoides no se habían

aislado ni caracterizado, hoy se conocen varios de ellos en distintas clases de Clorofitas

(Acetabularia ryukyuensis, Monostroma nitidium, y Caulerpa serrulata entre otras),

Feofitas (Undaria pinnatífida, Eisenia bicyclis y Laminaria religiosa entre otras) y

Rodofitas (Porphyra yezoensis, Gracilaria texorii y Chondrus ocellatus entre otras)

(Yoshie‐Stark et al., 2003).

II‐ Los taninos: constituyen otro grupo de compuestos fenólicos poliméricos,

solubles en agua, que al unirse a proteínas las desnaturalizan y las precipitan

(Hagerman y Butler, 1989). Se encuentran en grandes cantidades en alimentos que

tienen sabor muy amargo y resultan astringentes por unirse a las proteínas de la saliva,

por ejemplo el té. Existen dos subclases de estos compuestos; los taninos condensados


‐ 22 ‐

o catequínas y los hidrolizables o gálicos. Los taninos condensados (proantocianidinas)

se forman biosintéticamente por la condensación de flavanoles para formar redes

poliméricas. Estos no pueden ser hidrolizados pero sí oxidados por un ácido fuerte

para originar las antocianidinas. Los taninos hidrolizables son ésteres de un azúcar

(generalmente glucosa) con uno o más ácidos trihidroxibenzencarboxilico (ácido

gálico). Estos materiales dan precipitados insolubles con albúmina o gelatina. Esta

reacción con las proteínas se utiliza industrialmente para convertir las pieles animales

en cuero (durante el proceso de curtido), por su unión al colágeno aumentando su

resistencia al calor, al agua y a la acción de microorganismos. Los taninos hidrolizables

son más pequeños que los condensados y se hidrolizan más fácilmente. Son muy

sensibles a la oxidación, especialmente en medio ácido. Generalmente son toxinas

debido a su capacidad de unirse a proteínas y también actúan como protectores frente

a la herbivoría. Sin embargo, algunos tienen efecto beneficioso en la salud humana,

por ejemplo aquellos presentes en las uvas o el vino tinto, al bloquear la formación de

endotelina‐1, una molécula señal que provoca vasoconstricción (Andriantsitohaina et

al., 2012). Los taninos tienen diversos efectos sobre los sistemas biológicos dado que,

además de precipitar proteínas, son potenciales quelantes de metales y antioxidantes.

Algunos de ellos han mostrado actividad antiviral frente al síndrome de

inmunodeficiencia humana (SIDA) por inhibición de la transcriptasa reversa (Notka et

al., 2004). Los registros de la presencia de taninos en algas son escasos pero más

antiguos que los de flavonoides. En las feofitas la acumulación de estos compuestos

fue asociada a la protección frente a la predación por herbivoría (Hunger, 1902).

Compuestos nitrogenados: aminas y alcaloides

Los compuestos que contienen nitrógeno (estructuralmente derivados del

amoníaco) como parte de su estructura general, se pueden clasificar como aminas o

alcaloides. En las aminas el nitrógeno generalmente, aunque no siempre, se incorpora

en una cadena y no en una estructura cíclica. En los alcaloides, en cambio, el nitrógeno

se incorpora a menudo a una estructura cíclica derivada de un aminoácido. La posición

del nitrógeno imparte la naturaleza química de la molécula, incluyendo cómo se

comporta en un sistema biológico. Los alcaloides son una gran familia de más de

15.000 metabolitos secundarios que tienen en común tres características: son solubles


en agua, contienen al menos un átomo de nitrógeno en la molécula y exhiben

actividad biológica. Muchos de los alcaloides derivan directamente de los aminoácidos

aromáticos fenilalanina, tirosina, y triptófano, aunque algunos como la nicotina y

compuestos relacionados lo hacen a partir de la ornitina. En los organismos que los

producen actúan como agentes antiherbivoría o como reguladores del crecimiento,

como por ejemplo, la hormona vegetal indol‐3‐acético (IAA, un derivado del indol

sintetizado a partir de triptófano, Buchanan et al., 2000).

A pesar de la diversidad estructural de los alcaloides, todos exhiben potentes

efectos fisiológicos y toxicológicos fundamentalmente sobre el sistema nervioso

central de los mamíferos. En humanos, las respuestas fisiológicas se deben en su gran

mayoría a su interacción con neurotransmisores (Mulac y Ulrich‐Humpf, 2011; Jursky y

Baliova, 2011). A dosis altas, casi todos los alcaloides son muy tóxicos. Sin embargo

tienen un gran valor terapéutico como relajantes musculares, tranquilizantes y

analgésicos cuando se utilizan dosis bajas, por lo que son de gran interés

farmacológico. Su diversidad estructural y amplio rango de bioactividades, hacen de

ellos uno de los grupos más importantes entre las sustancias naturales de interés

terapéutico. Por ejemplo, la morfina, un potente narcótico analgésico, se usa

extensivamente para el tratamiento del dolor moderado a severo (Bercovitch et al.,

1999). La colchicina se utiliza para tratar la inflamación asociada con la acumulación de

ácido úrico (gota) desde hace 2.000 años e incluso ha sido investigada como

componente activo para el tratamiento del cáncer (Jordan, 2002; Nakagawa‐Goto et

al., 2005) así como la vinblastina. La cocaína es un anestésico local y un potente

estimulante del sistema nervioso central (Flynn, 1991), y la estricnina es un

estimulante nervioso.

Algunos alcaloides se han encontrado en cianobacterias, como los hapalindoles

aislados de Hapalosiphon fontinalis (Moore et al., 1987) y en algas rojas, como el

martefragin A aislado de Martensia fragilis (Takahashi et al., 1998) y los lophocladines,

obtenidos de Lophocladia sp. (Gross et al., 2006).

1.2 El cribado químico

Se estima que alrededor del 80% de todos los medicamentos del mundo

derivan originalmente de fuentes vegetales. Sin embargo, muchas plantas a menudo


‐ 24 ‐

situadas en regiones remotas del mundo, aún no han sido clasificadas

taxonómicamente, ni ha sido examinado su potencial medicinal. Por lo tanto, hay sin

duda, un gran número de posibles medicamentos y otros compuestos útiles derivados

de plantas por descubrir y caracterizar en todo el mundo. Gran parte del conocimiento

sobre las plantas con propiedades útiles, proviene de las poblaciones nativas que viven

en un área determinada. No es de extrañar entonces que las algas, sobre todo las

microalgas, no hayan sido hasta ahora consideradas.

La rama de la investigación, comúnmente conocida como fitoquímica, tiene

como objetivo el estudio de los productos del metabolismo secundario de plantas,

pero este tipo de análisis se puede llevar a cabo en cualquier tipo de organismos. Estos

estudios comprenden las etapas de extracción, aislamiento, purificación y

determinación estructural de esos metabolitos. El cribado químico es una de las etapas

iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los

principales grupos químicos presentes en un organismo, y a partir de allí, orientar la

extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de

mayor interés. Este proceso consiste en la extracción de dichos grupos desde la

biomasa, con solventes apropiados, y la aplicación de reacciones cromogénicas y de

precipitación, para su identificación. Estos procesos deben permitir una rápida

evaluación del producto, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo. Vale

resaltar que en los extractos crudos los constituyentes activos están normalmente

presentes en pequeñas concentraciones, por lo que los procesos de aislamiento y

purificación precisan además ser eficientes. Dentro de los medios de aislamiento, la

cromatografía es uno de los más útiles en la separación de mezclas y es aplicable tanto

como técnica para purificar como para identificar componentes. En trabajos previos

realizados con microalgas se ha demostrado que ellas pueden ser utilizadas como

fuente de compuestos con propiedades farmacológicas. Euglena gracilis es una

especie a la que hasta el momento no ha sido considerada como fuente de

medicamentos, pero dado su amplio rango metabólico, constituye un valioso material

de estudio para el desarrollo de diferentes investigaciones que permitan alcanzar un

mayor conocimiento de su diversidad funcional. Esto motivó a realizar un cribado

químico, cuyos resultados se presentan en esta sección.


2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS


‐ 26 ‐


2.1 Hipótesis

La especie Euglena gracilis, por poseer una gran plasticidad metabólica y por su

capacidad de adaptarse a condiciones ambientales extremadamente variadas,

podría originar, a través de sus diversos patrones fisiológicos, una amplia gama de

metabolitos.

Mediante la caracterización de estos metabolitos se podrían encontrar algunos

que puedan tener interés farmacológico.

2.2 Objetivos Generales

Caracterizar químicamente a dos cepas de Euglena gracilis en dos de sus fases de

desarrollo en cultivo y bajo distintas condiciones nutricionales.

Caracterizar las cepas según su contenido de lípidos, proteínas, pigmentos y

flavonoides.

Comparar el perfil químico de las dos cepas, para establecer cuál de ellas resulta la

más apropiada como fuente de metabolitos de interés.

2.3 Objetivos específicos

Preparar y fraccionar extractos de distintas cepas de Euglena gracilis en dos de sus

fases de desarrollo en cultivo y bajo distintas condiciones nutricionales.

Identificar metabolitos primarios y secundarios a partir de las fracciones

generadas.

Analizar cromatográficamente lípidos, pigmentos, carbohidratos de bajo peso

molecular y flavonoides.

Analizar agregaciones macromoleculares por electroforesis en gel de

poliacrilamida con sodecilsulfato de sodio (SDS‐PAGE).


‐ 28 ‐


3. MATERIALES Y MÉTODOS


‐ 30 ‐


3.1 Cepas microalgales y condiciones de cultivo

En esta primera etapa se trabajó con cultivos axénicos de 2 cepas de Euglena

gracilis. Una de ellas fue aislada del río Matanza (MAT) y la otra proviene de la

Colección de Cultivos de la Universidad de Texas ‐ UTEX 753 (UTEX). En todos los casos

se trabajó además con una variedad fotosintética (f) y otra blanqueada, heterotrófica

(h) que se obtuvo luego de tratar con estreptomicina a la cepa autotrófica (Ruiz et al.,

2004). Dado que las cepas blanqueadas no retomaron su capacidad fotosintética a

pesar de mantenerse sin agregados del antibiótico, pueden ser consideradas como

cultivos estables. Además, las cepas blanqueadas sólo se ensayaron en dos de los

medios (Buetow y EGM) dado su escaso crecimiento en medio mineral con escaso

contenido de una fuente de carbono (Cramer & Mayer).

Las cepas fueron mantenidas bajo luz continua, a 24 2 ºC, en tres medios de

cultivo, Cramer & Mayers, Buetow, EGM (CCPA, 2001). La composición de estos

medios de cultivo se detalla en la tabla 2.

Composición del medio de cultivo

Buetow (mg/l)

Cramer & Myers (mg/l)

EGM (mg/l)

Na Acetato 5000 ‐ 600 Na Citrato 645 800 ‐ (NH4)2SO4 ‐ 1000 KH2PO4 1000 ‐ (NH4)2HPO4 1000 1000 ‐ MgSO4 200 200 ‐ CaCl2 26,5 20 ‐ Fe(SO4)3 3 3 ‐ ZnSO4 0,4 0,4 ‐ MnCl2 1,8 1,8 ‐ Na2MoO4 0,2 0,2 ‐ CoCl2 1,3 1,3 ‐ CuSO4 0,02 0,02 ‐ Tiamina HCl 0,02 0,01 ‐ Vitamina B12 1µg/l 0,5 µg/l ‐ Extracto de carne ‐ ‐ 1000 Extracto de levadura ‐ ‐ 2000 Triptona ‐ ‐ 2000 Cl2Ca (10mg/l) ‐ ‐ 10 ml pH 7 7 7

Tabla 2: Composición de los distintos medios cultivo utilizados para el cultivo de E. gracilis.


‐ 32 ‐

Los cultivos fueron repicados semanalmente en cada uno de los medios

empleados y se determinó en cada caso su curva de crecimiento celular en función del

tiempo. El recuento celular se realizó utilizando una cámara de Neubauer (Venrick,

1978). A partir de dichas curvas se seleccionó el medio que permitió la obtención de

mayores biomasas en lapsos de tiempo más cortos.

La biomasa se obtuvo por centrifugación a los 4 días de realizado el inóculo

(fase exponencial, Fexp) y a los 8 días (fase estacionaria, Fest), en una centrífuga

refrigerada a 4 ºC.

Una vez obtenida, ésta fue sometida a lavados exhaustivos con H2O destilada a

4 ºC para evitar contaminación con el medio de cultivo. Por último, fue secada por

liofilización y pesada (figura 4).

Cultivo de E. gracilis (‐f o ‐h)

Centrifugación a 4 ºC, 15 min, a 5000 x g (Fexp: 4 días; Fest: 8 días) Células Sobrenadante 5‐8 lavados exhaustivos Descarte con H2O destilada a 4 ºC ‐20 ºC Liofilización y almacenamiento en desecador a ºT ambiente

Figura 4. Obtención de la biomasa algal a partir de los cultivos en sus

distintas fases de crecimiento.


3.2 Preparación de extractos y fraccionamiento

3.2.1 Fraccionamiento

El extracto crudo de un producto natural es, literalmente, un cóctel de

compuestos. Es difícil aplicar una técnica de separación única que permita aislar sus

componentes individuales. Por lo tanto, el extracto crudo debe ser dividido en varias

fracciones discretas que contengan, por ejemplo, compuestos de polaridades

similares, mediante una extracción líquido‐líquido.

Para el fraccionamiento inicial de cada extracto crudo, es aconsejable no

generar demasiadas fracciones (ya que un compuesto activo podría quedar distribuido

en cada una de ellas en baja concentración); sino que se trata de generar sólo algunas

fracciones grandes, relativamente crudas, en las que rápidamente se pueda detectar el

compuesto de interés.

Cuando se selecciona un procedimiento de extracción de metabolitos de

microorganismos, debe considerarse que éstos se producen a menudo en bajas

concentraciones y que una cepa puede producir una mezcla compleja de compuestos.

Además, éstos pueden ser completa o parcialmente excretados al medio o pueden

quedar dentro de las células. Si se espera aislar un metabolito de un cierto tipo, es

posible aplicar protocolos previamente publicados. El proceso a elegir se dificulta

cuando las cepas y/o los metabolitos son desconocidos, o cuando el objetivo es extraer

la mayor cantidad posible de metabolitos. Al igual que con los vegetales, se utilizan

solventes miscibles y no miscibles con agua y solventes orgánicos, por ejemplo, acetato

de etilo (EtOAc), diclorometano (DCM), n‐butanol, metanol (MeOH), etc.

Para llevar a cabo el fraccionamiento químico, se efectuó una extracción

general a partir del material cosechado de cada cepa, en sus dos fases de crecimiento.

Los extractos crudos se prepararon con etanol 96° y se fraccionaron por cambios de pH

y extracción con solventes de distinta polaridad (figura 5).

A partir de los residuos de las extracciones alcohólicas, se extrajeron los lípidos con

cloroformo‐metanol (2:1) (Folch et al., 1957).


‐ 34 ‐

Liofilizado de E. gracilis (‐f o ‐h)

Maceración a 65°C por 3 horas con EtOH Filtración Extracto total Residuo I FRACCIÓN A Llevar a seco CHCl3:MeOH

(2:1)

HCl 1%

Filtración FRACCIÓN E

Acetona Residuo II Filtrado ácido FRACCIÓN F H2CCl2 NH3OH FRACCIÓN C (H2CCl2) Filtración H2CCl2 FRACCIÓN D (H2O) FRACCIÓN B

Figura 5. Extracción general realizada para el posterior análisis fitoquímico.

3.2.2 Extracción de pigmentos

Se hizo una segunda extracción exhaustiva de pigmentos utilizando acetona y

carbonato de magnesio a fin de evitar la formación accidental de metabolitos de la

clorofila. Dichos extractos fueron centrifugados a 6.700 x g para eliminar residuos y

poder llevar adelante un análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución en

fase reversa con arreglo de diodos (RP‐HPLC‐DAD) (figura 6).


50 mg de material liofilizado

+

5 ml Acetona + Mg

Agitación en oscuridad a T ambiente por 30 minutos. X 3 Filtración en oscuridad

Residuo III Filtrado

Concentrar a presión reducida

Resuspender en 500 μl Acetona

Centrifugar 10 min a 6700 x g

Sobrenadante Sedimento

RP‐HPLC‐DAD

Figura 6. Extracción de pigmentos a partir del material liofilizado para su posterior análisis por HPLC.

3.2.3 Extracción de carbohidratos de bajo PM

Para obtener extractos enriquecidos en mono y oligosacáridos, la biomasa

liofilizada se extrajo con etanol 80% como se indica en la figura 7. Posteriormente,

cada muestra fue analizada mediante cromatografía planar y electroforesis

monodimensional.


‐ 36 ‐

100 mg de material liofilizado +

20 ml EtOH 80%

Agitación a T ambiente por 6 hs Centrifugación Residuo IV Sobrenadante Reserva para Concentración a presión segunda extracción reducida a 40°C

Cromatografía Planar, y SDS‐PAGE

Figura 7. Extracción de mono y oligosacáridos a partir del material liofilizado.

3.3 Análisis Químico

Las 4 fracciones obtenidas mediante el fraccionamiento del material liofilizado

se analizaron mediante reacciones cualitativas usuales para la determinación de

grupos químicos (Rondina y Coussio, 1969; Domínguez, 1985; Harborne, 1991).

Sobre la fracción A se investigó la presencia de:

Flavonoides: estos se pueden reconocer experimentalmente mediante diferentes

ensayos de coloración. En nuestro trabajo se empleó la reacción de Shinoda,

(1928). Se secan 0,5 ml de la fracción A y el residuo se solubiliza con igual volumen

de agua destilada. Luego se agregan unas granallas de Mg y 0,2 ml de HCl

concentrado. Se deja reaccionar completamente y se observa la aparición de color.

Posteriormente se agregan 0,2 ml de alcohol amílico, se diluye con 2 ml de agua

destilada, y se observa el color que puede variar desde un rosa tenue hasta un tono

guinda en la fase orgánica.

Oxidrilos fenólicos (Reacción con FeCl3): para el reconocimiento preliminar de

polifenoles, se lleva a seco 1 ml de la fracción A. El residuo seco se disuelve en 1ml

de agua destilada y se agregan 3 gotas de FeCl3 1% acuoso. Una coloración amarilla


indica la presencia de 1 OH, el color verde grisáceo la presencia de 2 OH

adyacentes y el color azul a negro indica la presencia de 3 OH adyacentes.

Taninos (Reacción con Gelatina): para su reconocimiento preliminar se seca 1 ml de

la fracción A. El residuo seco se disuelve en 1 ml de agua destilada y se agregan 10

gotas de una solución acuosa de gelatina al 0,5% . La aparición de turbidez hasta un

precipitado abundante indica la presencia de taninos dada la capacidad de estas

sustancias de precipitar proteínas.

Lípidos (Reacción con I2): se siembran unas gotas de la fracción A en papel de filtro,

se deja secar y se expone a vapores de I2. Un resultado positivo se evidencia por la

presencia de manchas color marrón‐naranja.

Hidratos de Carbono (Reacción de Dubois, 1956): a 1 ml de la fracción A seca y

retomada con 0,25 ml de agua destilada se le adicionan 0,25 ml de una solución

acuosa de fenol al 5% y sobre la superficie se agregan 1,25 ml de H2SO4

concentrado. La aparición de color naranja a pardo indica la presencia de mono y

oligosacáridos de bajo peso molecular, dado que los polisacáridos de mayor peso

molecular precipitan en presencia de EtOH, quedando en el residuo de la primera

extracción (figura 5).

Sobre la fracción B se investigó la presencia de:

Esteroides y triterpenos (Reacción de Liebermann‐Burchard; Pinto Coelho y Alves,

1946): para su reconocimiento se mezclan 0,25 ml de anhídrido acético y 0,25 ml

cloroformo. Se enfría a 0°C en baño de hielo. A continuación 0,5 ml de la fracción

B se ponen en contacto con la mezcla de reactivos anterior y el tubo se coloca en

baño de hielo nuevamente. Entonces se agrega por las paredes 1 gota de H2SO4

previamente enfriado a 0°C. Se enfría nuevamente y se observa la coloración. El

desarrollo de un color verde‐azul indica la presencia de esteroides y el de una

coloración rojo‐naranja la de triterpenos.

Antraquinonas y naftoquinonas (Reacción de Bornträger; Auterhoff y Boehme,

1968).

Las antraquinonas, ampliamente distribuidas, se encuentran principalmente en

forma de glicósidos y en menor proporción como agliconas. También se han


‐ 38 ‐

encontrado compuestos sulfatados y diméricos (Alemayehu et al., 1998). Sin

embargo, existen todavía dudas acerca del verdadero estado natural de estas

sustancias, ya que hay evidencias experimentales que muestran que ellas no se

encuentran como tales en los organismos sino que son productos de la degradación

enzimática de las correspondientes formas reducidas (antronas y antranoles). Por esta

razón, debe considerarse esta posibilidad antes de afirmar la presencia de

antraquinonas en una muestra (Robinson, 1983). Las antraquinonas y demás

compuestos antracénicos pueden ser biosintetizadas por la ruta del malonil‐coenzima

A o bien, a partir del ácido shikímico y acido mavelónico. Tanto ellas como sus formas

reducidas pueden reconocerse a través del denominado ensayo de Borntranger

(Auterhoff y Boehme, 1968). Para ello se agitan 0,5 ml de la fracción B con 0,8 ml de

NaOH al 5% y se observa la coloración. Una fase acuosa roja o amarilla con

fluorescencia roja indica la presencia de estos metabolitos.

Sobre la fracción C se investigó la presencia de:

Alcaloides (Reacción de Dragendorff): para su reconocimiento se lleva a seco 0,2ml

de la fracción C, se retoma con 2 ml de HCl al 1% y se le agregan 2 gotas del

reactivo de Dragendorff. La formación de un precipitado pardo anaranjado indica

la presencia de alcaloides en la muestra.

Preparación del reactivo de Dragendorff: se disuelven 8 gr de subnitrato de

bismuto en 20 ml de HNO3 de densidad 1,8 unidades. Se vuelca esta solución

sobre otra que contiene 22,7 gr de ioduro de potasio en 20 ml de agua. Se deja

reposar y se separa el KNO3 decantado. Finalmente se diluye a 100 ml.

Cardenólidos (Reacción de Kedde): para su reconocimiento, a una gota de la

fracción C, llevada previamente a seco y retomada con alcohol, se le agregan 0,1

ml del reactivo de Kedde. Un resultado positivo está indicado por la persistencia

de una coloración púrpura o violeta. Además se realiza un blanco reemplazando el

reactivo de Kedde por una solución de KOH al 5,7 % (solución II) para descartar

colores producidos en medio alcalino por otras sustancias.

Preparación del reactivo de Kedde: se prepara mezclando volúmenes iguales de

las soluciones I y II.


Solución I: Ácido 3,5 dinitrobenzoico al 2% en metanol.

Solución II: KOH al 5,7% en agua destilada.

Esteroides (Reacción de Liebermann‐Burchard): para su detección se procede de

igual manera que con la fracción B.

Leucoantocianinas (Reacción de Rosenheim): 0,5 ml de la fracción C se llevan a

seco y se retomaron con el mismo volumen de HCl al 1% en agua. Se le agregan

0,25 de HCl concentrando, se calienta a baño maría durante 10 minutos y se

observa la aparición de color. Si en la solución aparece una coloración desde

carmesí hasta rosa pálido, la mezcla se enfría y se agrega un pequeño volumen

de alcohol amílico agitando suavemente. La presencia de leucoantocianinas se

evidencia por el paso de la coloración a la fase alcohólica.

Sobre la fracción D se investigó la presencia de alcaloides mediante la reacción

de Dragendorff de la misma manera en que se procedió con la fracción C.

3.4 Análisis cromatográficos

Para cada grupo químico de interés detectado, se efectuaron análisis

cromatográficos en distintos sistemas. Se estudiaron los perfiles de los lípidos,

carbohidratos de bajo peso molecular, flavonoides y pigmentos constituyentes (Mabry

et al., 1970; Hellebust y Craigie, 1978; Wagner et al., 1984; Harborne, 1991; Jeffrey et

al., 1997).

3.4.1 Cromatografía en papel y en placa delgada (TLC).

3.4.1.1 Carbohidratos

En los extractos obtenidos a través del procedimiento mostrado en la figura 5,

se analizaron oligosacáridos mediante sistemas cromatográficos planares en papel

Whatman Nº 1. El primer revelado se hizo con luz UV para verificar la ausencia de

contaminantes. Luego las cromatografías fueron reveladas con AgNO3 40% (Hoton‐

Dorge, 1976). Una vez corridas las cromatografías, se analizaron bajo luz UV para

comprobar que no haya contaminación con otro tipo de metabolitos y una vez


‐ 40 ‐

reveladas con nitrato de plata se dejaron secar en oscuridad durante 36 horas antes de

su análisis.

3.4.1.2 Lípidos

Las fracciones E se analizaron utilizando un sistema monodimensional sobre

cromatoplaca de Sílica gel G60 saturada previamente con sulfato de amonio y

desarrollada con benceno‐acetona‐agua (30:91:8). Se reveló con luz natural, UV y

vapores de iodo.

3.4.1.3 Flavonoides

En la cepa que mostró una mayor coloración en la reacción de Shinoda, es decir

que evidenció mejor la presencia de estos metabolitos, se hizo un análisis mediante

una cromatografía bidimensional planar sobre papel Whatman Nº 1 de la fracción A,

utilizando dos fases móviles (BAW: n‐butanol:ácido acético:agua (4:1:5); Forestal:

ácido acético:ácido clorhídrico:agua (30:3:10)). Los revelados se efectuaron con luz

natural, luz UV a 365 nm, con y sin el agregado previo de vapores de amoníaco (Mabry

et al., 1970; Harborne, 1991).

3.4.1.4 Pigmentos

Mediante dos sistemas cromatográficos, se analizaron las fracciones solubles

en diclorometano (Fracciones B) y los residuos retomados con acetona (Fracción F).

Por un lado, para analizar clorofilas y carotenos se usó papel Whatman Nº 3MN con

éter de petróleo‐acetona‐n‐propanol (90:10:0,45) como fase móvil. Para las xantofilas

se trabajó sobre sílica gel G60‐carbonato de calcio (2:1) con éter de petróleo‐acetona‐

isopropanol (35,5:14:0.5) como fase móvil (Hellebust y Craigie, 1978; Harborne, 1991;

Jeffrey, 1997).

3.4.2 Análisis de pigmentos por RP‐HPLC‐DAD.

Si bien los pigmentos de E. gracilis se hallan descriptos en la bibliografía

(Wolken y Mellon, 1956; Krinsky y Goldsmith, 1960; Epstein y Weiss, 1960; Gross y


Stroz, 1975; Suetsugu y Wada, 2003), la cepa MAT no fue totalmente caracterizada. A

fin de comparar sus pigmentos con los de la cepa UTEX, se realizaron análisis para

ambas, bajo dos condiciones nutricionales y en dos de sus fases de desarrollo en

cultivo. Para esto, los extractos preparados según la sección 3.2.2 (figura 6) se

analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa con

detector de arreglo de diodo (RP‐HPLC‐DAD; Wright et al., 1991). De acuerdo con este

método los pigmentos fueron identificados por co‐cromatografía con estándares

apropiados provistos por la cátedra de Farmacognosia de la Facultad de Ciencias

Naturales San Juan Bosco mediante espectroscopía de diodos durante la elución y por

comparación de sus espectros de absorción con los estándares de referencia.

Estándares y extractos se pasaron a través de una columna C18, usando como eluyente

acetonitrilo:agua (90:10) a un flujo de 1ml/min y lecturas de absorbancia a 436 nm.

3.5 Análisis mediante SDS‐PAGE

El análisis de los glicoconjugados se hizo por electroforesis monodimensional

de los extractos obtenidos según la sección 3.2.3 (figura 7), en SDS‐PAGE, por

duplicado. Uno de los geles fue revelado para poder detectar proteínas con Coumassie

brillant blue y el otro con la base de Schiff, previa oxidación con ácido periódico (PA‐

Schiff), para poder localizar hidratos de carbono de bajo peso molecular. Por

superposición de ambos geles se puede detectar la presencia de ambas

macromoléculas, cuando éstas forman agregaciones macromoleculares.


‐ 42 ‐


4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN


‐ 44 ‐


‐ 45 ‐

4.1 Microorganismos y condiciones de cultivo

Se establecieron las condiciones más adecuadas para alcanzar una biomasa

suficiente para efectuar los estudios químicos y de actividad biológica previstos. Según las

curvas de crecimiento realizadas, se determinó que la mayor biomasa en lapsos de

tiempo más cortos se obtuvo en el medio EGM (figuras 8 y 9). Partiendo de cultivos con

5.104 células/ml, la biomasa en fase exponencial se logró a los 4 días de crecimiento,

mientras que la de fase estacionaria se consiguió a los 8 días. Las cepas heterotróficas no

presentaron crecimiento en el medio Cramer & Mayers en el período de tiempo

analizado.

A)

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

Tiempo (hs)

Den

sida

d ce

lula

r (10

5 cel

ulas

/ml)

B)

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

0 24 48 72 96

120 144 168 192 216

Tiempo (hs)

Den

sida

d ce

lula

r (1

05 c

elul

as/m

l)

EGM

Buetow

Cramer & Mayer

Figura 8. Curvas de crecimiento de E. gracilis fotosintética: A) cepa UTEX, B) cepa MAT, en distintos medios de cultivo


‐ 46 ‐

B)

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

4.000

4.500

0 24 48 72 96

A)

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

4.000

4.500

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

Tiempo (hs)

Den

sida

d ce

lula

r (10

5 cel

ulas

/ml)

EGM

Buetow

120 144 168 192 216

Tiem (hs)

Den

sida

d ce

lula

r (10

5 cel

ulas

/ml)

po

Figura 9. Curvas de crecimiento de E. gracilis heterotrófica: A) cepa UTEX, B) cepa MAT, en distintos medios de cultivo.

Diferentes estudios fisiológicos, tecnológicos y diversos sistemas han sido

propuestos con el fin de maximizar la producción de biomasa en sistemas de cultivo de E.

gracilis (Chaumont 1993; Grobbelaar 2000; Lee 2001; Richmond 1996, 2000, Santek et al.

2012). Esta especie es comúnmente encontrada en cuerpos de agua con alto contenido

de materia orgánica, por lo que no resulta extraño que al comparar las curvas de

crecimiento en los tres medios de cultivo utilizados, tanto las cepas pigmentadas como

incoloras, hayan alcanzado las mayores biomasas en tiempos más cortos al crecer en un


medio rico en materia orgánica (EGM, CCAP 2001). Por este motivo, para la producción

de biomasa destinada a los análisis posteriores seleccionó el medio EGM. Probablemente

alguna forma de materia orgánica diferente al acetato y citrato presentes en los otros

medios sea la responsable de las tasas de crecimiento mayores en el medio EGM. Por

otro lado, la máxima eficiencia de producción de biomasa se registró en las cepas

autotróficas, seguramente debido a su capacidad de utilizar para su crecimiento tanto

compuestos orgánicos del medio como energía lumínica.

4.2 Fraccionamiento y análisis químico

La tabla 3 muestra los rendimientos de biomasas alcanzadas:

CEPA Condición nutricional FASE gr. de liofilizado/10

litros de cultivo Células x105/ml

Exponencial 1,34‐1,67 4,00‐4,97 UTEX Autotrófica

Estacionaria 1,92‐1,94 5,71‐5,77 Exponencial 0,89‐1,01 2,65‐3,01

Heterotrófica Estacionaria 1,19‐1,20 3,55‐3,58 Exponencial 1,37‐1,60 4,07‐4,75

Autotrófica Estacionaria 1,91‐1,97 5,84‐5,87 Exponencial 1,03‐1,16 3,08‐3,46

MAT Heterotrófica

Estacionaria 1,24‐1,26 3,70‐3,76

Tabla 3: Rendimiento de la obtención de biomasas liofilizadas.

Puede observarse que las mayores producciones de biomasa se dan en las

cepas autotróficas, lo cual es congruente con lo observado en las curvas de

crecimiento realizadas (figuras 8 y 9). Respecto a las cepas, las fotosintéticas presentan

rango similares en la producción de biomasa liofilizada. Por el contrario, pueden

observarse diferencias entre las cepas heterotróficas. La cepa MAT heterotrófica,

presenta mayores rendimientos respecto de la cepa UTEX en las mismas condiciones

nutricionales y fases de crecimiento (0,89‐1,01 y 1,19‐1,20 gr. de liofilizado/10 litros de

cultivo para la cepa UTEX en fase exponencial y estacionaria respectivamente, y 1,03‐

1,16 y 1,24‐1,26 gr. de liofilizado/10 litros de cultivo para la cepa MAT en fase

exponencial y estacionaria respectivamente). Estas diferencias entre cepas puede

deberse a que la cepa MAT es una cepa aislada de un cuerpo de agua natural rico en

materia orgánica (río Matanza, Buenos Aires) proveniente de la descarga de efluentes


‐ 48 ‐

de diversos frigoríficos ubicados en sus márgenes principalmente. Esta cepa es

mantenida en cultivo en el laboratorio de Biología Comparada de Protistas de la FCEN‐

UBA desde el año 2004 (Ruiz et al., 2004). En cambio la cepa UTEX que se mantiene en

colecciones de cultivos desde 1950, posiblemente presente una habilidad menor en el

uso de compuestos orgánicos que la cepa MAT.

La tabla 4 muestra los rendimientos de las 4 fracciones (A ‐ D) obtenidas

siguiendo el método explicado en la sección 3.2.1 (no se muestran los rendimientos de

la fracción D debido a que durante su obtención se formó una sal, que su cálculo:

Rendimientos (% ) Cepa Fase

Fracción A Fracción B Fracción C Fracción D Fexp 18,8‐21,6 10,9‐12,4 1,5‐1,52 ‐

UTEX‐f Fest 31,4‐31,5 7,2‐9,5 1,6‐2,3 ‐ Fexp 26,7‐30,8 5,8‐9,5 0,9‐1,4 ‐

MAT‐f Fest 26,4‐27,7 8,1‐11,3 1,1 ‐ Fexp 25,5‐26,8 9,5‐10,8 1,6‐1,9 ‐

UTEX‐h Fest 21,4‐26,6 10,2‐11 4,9‐5,2 ‐ Fexp 11,9‐12,9 4,1‐4,3 0,8‐2,6 ‐

MAT‐h Fest 20‐24 7,1‐8,3 0,5‐0,9 ‐

Tabla 4. Rendimientos obtenidos para las fracciones A ‐ D de cada cepa bajo diferentes condiciones nutricionales y en las dos fases de desarrollo analizadas.

Puede observarse que los mayores rendimientos corresponden a la fracción A,

es decir al extracto crudo. Los rendimientos bajan para las fracciones B y C debido a los

fraccionamientos realizados.

Las cuatro fracciones generadas se analizaron mediante reacciones cualitativas

usuales para la determinación de grupos químicos obteniendo los resultados generales

que se muestran en la tabla 5. Respecto a este tamizado, resulta interesante la

distribución de los grupos químicos encontrados. La presencia de polifenoles,

particularmente de taninos, podría indicar la existencia de un metabolismo activo

relacionado con los fenoles, sustancias comúnmente relacionadas con la defensa y la

protección frente a radicales libres (Céspedes et al., 2008; Rahim et al., 2008; Amorati y

Valgimigli, 2012; Baba et al., 2012). Por otro lado se detectó otro grupo de polifenoles,

los flavonoides, de los cuales hasta el momento había escasas referencias en algas. En

este punto se debe tener en cuenta que el ensayo empleado para la identificación de


polifenoles (FeCl3), es inespecífico ya que se basa en la capacidad del Fe de

complejarse con las estructuras fenólicas. Sin embargo, la identificación de flavonoides

se realizó con el reactivo de Shinoda, un ensayo más específico que involucra el anillo C

(figura 3) donde se encuentra el grupo carbonilo del flavonoide (Farnsworth, 1966) por

lo que una muestra podría presentar polifenoles que no sean del tipo flavonoides. En

este análisis las muestras que resultaron positivas para estructuras fenólicas también

lo fueron para flavonoides, con excepción de la cepa UTEX autotrófica en fase

estacionaria.

Los flavonoides también están fuertemente relacionados con la defensa y la

protección frente a radicales libres. Cuando los nutrientes se vuelven escasos, los

cultivos de E. gracilis entran en una fase de no crecimiento, conocida como

estacionaria, y desarrollan respuestas múltiples de resistencia a ese estrés. La

presencia de flavonoides en la fase estacionaria de crecimiento en cultivo podría estar

asociada a ese tipo de respuesta. La producción de estos compuestos en fase

exponencial sólo se registró en la cepa MAT fotosintética. Ello puede deberse a que,

como se explicó anteriormente, la cepa MAT aislada de un cuerpo de agua natural rico

en materia orgánica y mantenida en cultivo desde hace relativamente poco tiempo.

E. gracilis (cepa MAT) E. gracilis (cepa UTEX) Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica Metabolitos Fracción Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest

Lípidos A + + + + + + + + Carbohidratos (Mono y Oligosacáridos de bajo PM) A + + + + + + + +

Flavonoides A +/‐ + ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ Taninos A ‐ ‐ + ‐ + ‐ + ‐ OH Fenólicos A + (1 OH) + (1 OH) ‐ ‐ + (2 OH) ‐ ‐ ‐ Esteroides B ++ +++ +/‐ ++ + ++ + ++ Triterpenos B ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ + ‐ Antraquinonas B ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Alcaloides C ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Cardenólidos C + ‐ + ‐ + ‐ + ‐ Leucoantocianinas C ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Esteroides C ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Triterpenos C ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Alcaloides NH4

+ D ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Tabla 5. Resultado de la evaluación fitoquímica sobre las 4 cepas de E. gracilis en sus dos fases

de crecimiento: + presencia, ‐ no detectado, +/‐ resultado dudoso.


‐ 50 ‐

La metodología de cribado no incluye cuantificación, pero es un método

ampliamente utilizado como técnica cualitativa, cuando se estudia una nueva fuente de

productos naturales. Numerosos estudios han utilizado este tipo de técnicas mayormente

en plantas medicinales pero también en algas (Scholz y Liebezeit, 2006; Anbarasan et al.,

2010; Ganga Rao et al., 2012; Vetriselvan 2012).

4.3 Análisis Cromatográficos

Los metabolitos secundarios son actualmente objeto de interés e investigación,

pero su extracción como parte de las investigaciones fitoquímicas o biológicas plantea

retos específicos que deben abordarse a partir de los procesos de extracción. Una

extracción exitosa comienza con una cuidadosa selección y preparación de las muestras.

En este trabajo se presentan, tanto metodologías de extracción generalizadas (para la

detección de metabolitos mediante el cribado químico), así como otras de extracción más

específicas, adecuadas para determinados tipos de compuestos.

4.3.1 Cromatografía en papel y en placa delgada (TLC).

4.3.1.1 Carbohidratos

Los extractos obtenidos como se explica en la sección 3.2.3 tuvieron los

rendimientos mostrados en la tabla 6. Todos ellos se analizaron mediante cromatografía

en papel para identificar carbohidratos de bajo peso molecular, como se explica en la

sección 3.4.1.2. Los mono y oligosacáridos detectados se muestran en la figura 10 y en la

tabla 7.

Rendimiento (% ) E. gracilis (cepa UTEX) E. gracilis (cepa MAT)

Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest 39,8 43 53 67 31,6 31,2 52.6 61

Tabla 6. Rendimientos de las extracciones de carbohidratos de bajo peso molecular.


Figura 10. Perfil cromatográfico de carbohidratos de bajo peso molecular. U: Cepa UTEX, M: Cepa MAT, Glu.: glucosa, Gal.: Galactosa, Sac.: Sacarosa, Lac.: Lactosa.

E. gracilis (cepa UTEX) E. gracilis (cepa MAT) Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica

Carbohidrato

Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Sacarosa ‐ ‐ + + + + ‐ ‐ Trehalosa ‐ + ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ Glucosa ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + ‐ Fructosa ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + Trisacárido ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Tabla 7. Carbohidratos de bajo peso molecular detectados por cromatografía en papel.

Los hidratos de carbono producidos por E. gracilis comprenden

fundamentalmente un polisacárido de reserva denominado paramilon (‐1,3 glucano),

sacarosa y trehalosa. En particular los disacáridos no reductores, como la sacarosa y la

trehalosa, son los principales hidratos de carbono involucrados en las funciones

fisiológicas, de reserva y transporte cuya producción depende de la composición del

medio de cultivo utilizado y de las fases de desarrollo. Estos dos disacáridos son los únicos

sintetizados de forma natural como tales y es poco frecuente que coexistan en la

naturaleza. Su distribución en la naturaleza es notoriamente diferente: mientras que la

trehalosa está presente en un rango muy amplio de organismos (bacterias, hongos, algas,


‐ 52 ‐

invertebrados y algunas plantas vasculares), la sacarosa está mayormente restringida a

las plantas, algas verdes y cianobacterias (Elbein, 1974; Avigad, 1982; Avigad y Dey, 1997;

Cumino et al., 2002; Salerno y Curatti, 2003). En E. gracilis se ha descripto la producción

de sacarosa y trehalosa, indicando que la producción de este último es mayor durante la

fase estacionaria, momento en el cual hay estrés nutricional (Porchia et al., 1999). En

nuestro estudio se obtuvieron resultados similares, la trehalosa sólo pudo ser detectada

por cromatografía en las cepas UTEX (cepa a la que hace referencia el trabajo de Porchia

et al., 1999) y MAT fotosintéticas en fase estacionaria, lo que sugiere que la trehalosa

constituye en este alga un metabolito que se acumula en las células ante la limitación de

nutrientes. Por otro lado, la producción de sacarosa, fue detectada tanto en las fases

exponenciales como estacionarias, en cepas fotosintéticas y heterotróficas.

Anteriormente se propuso que la producción de sacarosa parece ser importante en las

etapas de crecimiento activo (Porchia et al., 1999), sin embargo en nuestro estudio

también se detectó este disacárido en las fases estacionarias. Esto sugiere que la sacarosa

también podría estar involucrada en otras funciones, posiblemente de protección celular,

como ocurre con la trehalosa. Existen antecedentes sobre estas funciones para la

sacarosa frente a condiciones de alta salinidad, frio, y sequía en plantas, algas y ciertas

cianobacterias (Levitt, 1980; Salerno y Pontis, 1989; Reed et al., 1984), por lo que es

posible que la protección también se produzca frente a un estrés nutricional.

4.3.1.2 Lípidos

Los lípidos analizados como se indica en la sección 3.4.1.3 se muestran en la figura

11 y en la tabla 8. Puede observarse que predominaron mono‐ y di‐

galactosildiacilglicéridos, sulfolípidos (excepto en las verdes durante las fases

estacionarias), fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina.


Figura 11. Perfil cromatográfico monodimensional de lípidos de E. gracilis.

Los lípidos han sido estudiados en E. gracilis (Rosenberg y Pecker, 1964; Rocchetta

et al., 2006) si bien aún no se ha avanzado en sus posibles aplicaciones. Cabe destacar

que la presencia de galactolípidos en las condiciones de cultivo utilizadas en este trabajo,

coincide con lo descripto por Matson et al. (1970).

E. gracilis (cepa UTEX) E. gracilis (cepa MAT)

Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica Lípido

Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest

Acido fosfatídico + ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐

Fosfatidilcolina ‐ ‐ + + + + ‐ ‐

Fosfatidiletanolamina + + + + + + + +

Sulfolípido + ‐ + + + ‐ + +

Digalactosil‐ diglicérido ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐

Glicósido de esterol ‐ + ‐ ‐ + + ‐ ‐

Monogalactosil‐diglicérido + + ‐ + + + ‐ ‐

Pigmentos y lípidos neutros + + + + + + + +

Tabla 8. Grupos de lípidos detectados en las cepas de E. gracilis fotosintéticas y heterotróficas.


‐ 54 ‐

4.3.1.3 Flavonoides

Los flavonóides analizados, como se indica en la sección 3.4.1.4, se

muestran en la figura 12. Sólo un tipo de flavonoide, la quercetina, pudo identificarse de

acuerdo con los rf en los dos sistemas de solventes utilizados. Posiblemente el resto de

los compuestos que se observan en el perfil cromatográfico sean derivados glicosilados

de la quercetina.

Q

Figura 12: Glicosidos flavonoides detectados cromatográficamente en la cepa UTEX‐

fotosintética en fase estacionaria. Q: Quercetina.

Existen algunos reportes en la bibliografía sobre presencia de flavonoles, entre los

que se incluye a la quercetina, en algas (Nagai y Yukimoto 2003; Goud et al., 2007; García‐

Casal et al., 2009; Vijayavel et al., 2010; Yang et al., 2012) pero sería la primera vez que

este compuesto se registra en euglenoideos. Cabe destacar que sustancias relacionadas

con este tipo de flavonoides son ampliamente descriptas como antioxidantes,

antiinflamatorias, antitumorales, antisépticas, antivirales, entre otras (Saija et al., 1994;

Choi et al., 2002; Heim et al., 2002; Crespo et al., 2008).

4.3.1.1 Pigmentos

Si bien la técnica cromatográfica en papel ya no se utiliza actualmente, sigue

resultando práctica para una exploración preliminar. En este caso nos permitió


asegurar total extracción de los pigmentos, dado que en los residuos obtenidos

(Residuo II, figura 5) no quedaron pigmentos. Los pigmentos identificados por

cromatografía en placa de sílica se muestran en la figuras 14 y la tabla 10. Estos

análisis permitieron comprobar la presencia de aquellos descriptos para los Euglenofitos,

tales como clorofilas a y b, β‐carotenos, diadinoxantinas y neoxantina.

Figura 14. Esquema del perfil cromatográfico de xantofilas.

E. gracilis (cepa UTEX) Fotosintética

E. gracilis (cepa MAT) Fotosintética Pigmento

Fexp Fest Fexp Fest Β‐carotenos + + + + Clorofila a + + + + Clorofila b + + + + Diadinoxantina ‐ ‐ + + Neoxantina ‐ ‐ + +

Tabla 10. Xantofilas presentes en las 4 cepas de E. gracilis en sus dos fases de crecimiento.

4.3.2 HPLC

4.3.2.1 Pigmentos

Los resultados de los análisis mediante HPLC se muestran en las figuras 15 a 19

y las tablas 11 a 14. La extracción realizada para el análisis de pigmentos mediante HPLC


‐ 56 ‐

permitió obtener rendimientos entre un 33,0% (UTEX‐h‐Fest) y un 68,8% (MAT‐f‐Fest). A

continuación se presentan los espectros obtenidos para todas las cepas, destacándose los

tiempos de retención (Tr) y los máximos de absorción en el solvente de elusión, para cada

caso. Además se muestra el rendimiento de la extracción obtenido para cada cepa en sus

distintas fases de crecimiento y bajo las distintas condiciones nutricionales.

Muestra Rendimiento

de la extracción (% )

Pico Tr (min)

λ Máxima absorción

(nm) Pigmento Porcentaje

1 15,00 410, 508, 538, 608,

664

Compuesto no identificado.

31,12

2 33,50 467, 603, 648 Clorofila b' 8,40

3 39,00 431, 619, 664 Clorofila a 40,53

4 40,00 390, 415, 430, 619,

664 Clorofila a´ 10,72

UTEX‐f‐Fexp

(436 nm)

60,2

5 49,50 408, 504, 535, 606,

664


9,24

Tabla 11: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC, para la cepa UTEX fotosintética en fase exponencial (UTEX‐f‐ Fexp‐436 nm).

Figura 15: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa UTEX fotosintética en fase exponencial (UTEX‐f‐Fexp‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado. Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo

1ml/min, lecturas de absorbancia a 436 nm.


A)

B)

Pico 1: Tr 15,00 min; Máximos de absorción: 410, 508, 538, 608, 664 nm. Compuesto no identificado.

Longitud de onda (nm)

300 400 500 600 700 800

Abs

orba

ncia

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Pico 2: Tr 33,50 min; Máximos de absorción: 467, 603, 648 nm. Clorofila b'.


300 400 500 600 700 800

Abs

orba

ncia

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

Pico 3: Tr 39,00 min; Máximos de absorción: 431, 619, 664 nm. Clorofila a.

38,896 Extracted

430,9

619,0

664,2

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

nm

400,00 450,00 500,00 550,00 600,00 650,00 Pico 4: Tr 40,00 min; Máximos de absorción: 390, 415, 430, 619, 664 nm. Clorofila a’. 300 400 500 600 700 800

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14


Abs

orba

ncia



300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Abs

orba

ncia


‐ 58 ‐

Figura 16: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa UTEX fotosintética en fase estacionaria (UTEX‐f‐Fest‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado.

Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo 1ml/min lecturas de absorbancia a 436 nm.

A)

B) Pico 1: Tr 5,30 min; Máximos de absorción: 402, 498, 516, 615, 665 nm. Compuesto no identificado. 300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30


Abs

orba

ncia

Pico 2: Tr 6,10 min; Máximos de absorción: 410, 467, 502, 535, 608, 666 nm. Compuesto no identificado.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Pico 3: Tr 7,10 min; Máximos de absorción: 409, 464, 504, 535, 608, 665 nm. Neoxantina impura. 300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4


Abs

orba

ncia

Pico 4: Tr 8,80 min; Máximos de absorción: 421, 445, 474, 663 nm. Violoxantina impura.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4


300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Pico 6: Tr 10,50 min; Máximos de absorción: 428, 456 nm. Microxantina.

300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18


Pico 7 : Tr 12.00 min; Máximos de absorción: 452, 479 nm. ‐criptoxantina impura. 300 400 500 600 700 800

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Pico 8 : Tr 23.10 min; Máximos de absorción: 455, 583, 632 nm. Compuesto no identificado.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Pico 9 : Tr 24.50 min; Máximos de absorción: 465, 598, 648 nm. Compuesto no identificado.

300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Pico 10: Tr 30.00 min; Máximos de absorción: 420, 614, 649 nm. Clorofila b impura.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Pico 11: Tr 33.00 min; Máximos de absorción: 337, 386, 415, 432, 616, 663 nm. Compuesto no identificado.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Pico 12: Tr 34.90 min; Máximos de absorción: 390, 415, 430, 617, 664 nm. Clorofila a.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

Pico 13: Tr 36.50 min; Máximos de absorción: 433, 626, 666 nm. Clorofila a impura.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Pico 14: Tr 46.30 min; Máximos de absorción: 412, 451, 476, 527, 604, 663 nm. Clorofila a' impura. Longitud de onda (nm)

Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Pico 15: Tr 54.80 min; Máximos de absorción: 409, 507, 537, 606, 665 nm. Compuesto no identificado.


Abs

orba

ncia

300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25


‐ 60 ‐

Muestra Rendimiento


Pico Tr (min)



1 5,30 402, 498, 516, 615, 665


7,80

2 6,10 4.10, 467, 502, 535, 608, 666


4,79

3 7,10 409, 464, 504, 535, 608, 665

Neoxantina impura. 5,03

4 8,80 421, 445, 474, 663

Violoxantina impura. 8,10

5 10,00 410, 456, 507, 538, 609, 665


5,68

6 10,50 428, 456 Microxantina 3,72

7 12,00 452, 479 α‐

criptoxantina impura

3,96

8 23,10 455, 583, 632 Compuesto no identificado.

6,98

9 24,50 465, 598, 648 Compuesto no identificado.

1,83

10 30,00 420, 614, 649 Clorofila b impura 23,48

11 33,00 337, 386, 415, 432, 616, 663


18,39

12 34,90 390, 415, 430, 617, 664 Clorofila a 5,14

13 36,50 433, 626, 666 Clorofila a impura 1,24

14 46,30 412, 451, 476, 527, 604, 663

Clorofila a’ impura 2,31

UTEX‐f‐Fest (436 nm)

57

15 54,80 409, 507, 537, 606, 665


1,54

Tabla 12: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC para la cepa UTEX

fotosintética en fase estacionaria (UTEX‐Ph‐ Fest‐436 nm).


Figura 17: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa MAT fotosintética en fase exponencial (MAT‐f‐Fexp‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado.

Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo de 1ml/min lecturas de absorbancia a 436 nm

A)

B) Pico 1: Tr 14,80 min; Máximos de absorción: 410, 476, 508, 537, 602, 665 nm. Compuesto no identificado.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Pico 2:Tr 16,00 min; Máximos de absorción: 445, 475 nm. Anteraxantina y micronona‐like.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Pico 3: Tr 18,50 min; Máximos de absorción: 428, 456 nm. ‐criptoxantina.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Pico 4 : Tr 33,00 min; Máximos de absorción: 467, 600, 649 nm. Clorofila b'. A

bsor

banc

ia


300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Pico 5 : Tr 39,00 min; Máximos de absorción: 386, 415, 430, 617, 664 nm. Clorofila a.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Pico 6: Tr 41,00 min; Máximos de absorción: 385, 411, 430, 619, 664 nm. Clorofila a'.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14


‐ 62 ‐

Pico 7: Tr 50,00 min; Máximos de absorción: 409, 536, 606, 661 nm. Compuesto no identificado. A

bsor

banc

ia


300 400 500 600 700 800-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06


Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12


Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Muestra Rendimiento


Pico Tr (min)


(nm)

Pigmento Porcentaje

1 14,80 410, 476, 508, 537, 602, 665


9,84

2 16,00 445, 475 Anteraxantina y micronona‐like.

5,62

3 18,50 428, 456 ‐criptoxantina. 6,47

4 33,00 467, 600, 649 Clorofila b´ 9,56

5 39,00

386, 415, 430, 617, 664 Clorofila a 46,49

6 41,00 385, 411, 430, 619, 664 Clorofila a’ 11,72

7 50,00 409, 536, 606, 661

Compuesto no identificado. 3,84

8 52,50

409, 507, 536, 606, 664

Compuesto no identificado 3,19

MAT‐f‐ Fexp (436 nm)

68,4

9 58,50 409, 505, 537, 606, 664


Tabla 13: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC para la cepa MAT fotosintética en fase exponencial (MAT‐f‐Fexp‐436 nm).


Figura 18: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa MAT fotosintética en fase estacionaria (MAT‐f‐Fest‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado. Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo de 1ml/min lecturas de absorbancia a

436 nm.

A)

B) Pico 1: Tr 7,50 min; Máximos de absorción: 409, 465, 507, 536, 608, 665. Compuesto no identificado.

300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abs

orba

ncia

Longitud de onda (nm) Pico 2: Tr 10,00 min; Máximos de absorción: 414, 445, 475, 537, 609, 665 nm. Violoxantina impura.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Pico 3: Tr 10,50 min; Máximos de absorción: 410, 508, 538, 609, 665 nm.


Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Pico 4: Tr 12,50 min; Máximos de absorción: 428, 456 nm. Fucoxantol impuro.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Pico 5: Tr 14,10 min; Máximos de absorción: 428, 451, 478 nm.

‐criptoxantina‐like.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12


‐ 64 ‐

Pico 6: Tr 29,00 min; Máximos de absorción: 467, 602, 649 nm. Clorofila b impura.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Pico 7: Tr 30,00 min; Máximos de absorción: 467, 602, 649 nm. Clorofila b impura. A

bsor

banc

ia


300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Pico 8: Tr 32,00 min; Máximos de absorción: 420, 614, 660 nm. Compuesto no identificado. A

bsor

banc

ia


300 400 500 600 700 800

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10


Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Pico 10: Tr 36,00 min; Máximos de absorción: 381, 415, 430, 617, 664 nm. Clorofila a.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Pico 11: Tr 47,00 min; Máximos de absorción: 408, 504, 535, 606, 664 nm. Clorofila a' impura.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Pico 12: Tr 54,50 min; Máximos de absorción: 409, 507, 537, 606, 665 nm. Clorofila a' impura.

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30


Muestra

Rendimiento de la

extracción (% )

Pico Tr (min)



1 7,50 409, 465, 507, 536, 608, 665


2 10,00 414, 445, 475, 537, 609, 665

Violoxantina impura. 8,12

3 10,50 410, 508, 538, 609, 665


4 12,50 428, 456 Fucoxantol impuro. 4,59

5 14,10 428, 451, 478 ‐

criptoxantina‐like.

2,99

6 29,00 467, 602, 649 Clorofila b impura. 5,88

7 30,00 467, 602, 649 Clorofila b impura. 1,17

8 32,00 420, 614, 660 Compuesto no identificado. 1,60

9 34,50 337, 385, 414, 430, 617, 664


10 36,00 381, 415, 430, 617, 664 Clorofila a 11,22

11 47,00 408, 504, 535, 606, 664

Clorofila a' impura.

2,35

MAT‐f‐ Fest (436 nm)

68,8

12 54,50 409, 507, 537, 606, 665

Clorofila a' impura. 0,96

Tabla 14: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC para la cepa MAT

fotosintética en fase estacionaria (MAT‐f‐Fest‐436 nm).


‐ 66 ‐

A) B)

Pico 1: Tr 4,00 min Solo se detectó un pico en la zona UV que podría corresponder a proteínas

Abs

orba

ncia


300 400 500 600 700 800-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Figura 19: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa MAT heterotrófica en fase exponencial (MAT‐h‐Fexp‐436 nm). B) Espectro de absorción del pico detectado en el

cromatograma. Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo de 1ml/min lecturas de absorbancia a 436 nm

Las cepas heterotróficas MAT en fase estacionaria y UTEX en sus dos fases de

crecimiento también fueron analizadas mediante esta metodología pero no

presentaron picos en el rango visible, los cromatogramas fueron similares al obtenido

para la cepa MAT heterotrófica en fase exponencial, motivo por el cual no se

muestran.

Un análisis exhaustivo de los pigmentos mediante RP‐HPLC‐DAD, permitió

detectar una mayor cantidad de pigmentos que los detectados por TLC. Varios autores

han descripto los pigmentos de Euglena (Krinsky y Goldsmith, 1960; Suetsugu y Wada,

2003) indicando variaciones según las fases de desarrollo, de la intensidad de luz (Gross y

Stroz, 1975) y de algunos nutrientes del medio de cultivo (Epstein & Weiss, 1960). En

nuestro estudio, en ambas cepas se pudo observar, durante la fase estacionaria de

crecimiento, una disminución en el contenido de clorofila que se acompaña de un

aumento de los carotenoides. La situación inversa puede observarse en la fase de

crecimiento exponencial. Esta relación entre los carotenos, que parecen disminuir con el


aumento de la clorofila sintetizada, sugiere que ellos están implicados en la formación de

clorofilas. Wolken y Mellon (1956) indican que un mismo tipo de porfirinas puede

participar en la síntesis de ambos pigmentos, operando simultáneamente hacia la síntesis

de carotenoides o hacia su eliminación y síntesis de clorofila. También se han descripto

complejos clorofila‐proteínas en cepas normales y blanqueadas de E. gracilis

(Cunningham y Schiff, 1986). Si bien la neoxantina fue descripta hace varios años, no se

ha profundizado en el estudio de sus posibles aplicaciones (Krinsky et al., 1964).

4.4 Análisis de glicoconjugados mediante SDS‐PAGE

Dado que las extracciones de carbohidratos (sección 3.2.3) mostraron altos

rendimientos (tabla 6) y sus cromatografías mostraron poco contenido de carbohidratos

de bajo peso molecular, esto sugiere que en las extracciones se está obteniendo algún

otro metabolito, entre los que se descarta el polisacárido de reserva que precipita en el

proceso de extracción. Ya que las extracciones se llevaron a cabo con etanol 80% es

posible que estos rendimientos tan altos se deban a la presencia de proteínas, por lo que

se realizaron geles para detectar glicoconjugados. Por superposición de los geles

realizados como se describe en la sección 3.5 se detectó su presencia (figuras 20 y 21).

Estos agregados sólo fueron detectados en las cepas UTEX y MAT heterotróficas en sus

dos fases de crecimiento. Estas mismas cepas son las que presentaron los mayores

rendimientos de las extracciones, por lo que puede asociarse tan altos rendimientos a la

presencia de estos glicoconjugados.


‐ 68 ‐

Figura 20: Gel revelado con Coumassie brillant blue para la detección de proteínas.

Figura 21: Gel revelado PA‐Schiff para la detección de carbohidratos.


5. CONCLUSIONES


‐ 70 ‐


En este trabajo de tesis, hemos realizado un cribado químico exploratorio de los

metabolitos primarios y secundarios de E. gracilis. Los resultados muestran que esta

especie puede considerarse una fuente importante de metabolitos con potencial valor

biotecnológico. Este análisis nos brinda además, una base para futuros estudios,

posibilitando una mejor caracterización de los compuestos químicos de interés a partir de

extracciones exhaustivas y específicas, información necesaria para su cuantificación y la

elaboración de planes de desarrollo.

Al analizar los resultados obtenidos con distintas cepas de E. gracilis, hemos

podido comprobar que las cepas pigmentadas son las que mostraron un mayor

rendimiento en cuanto a la producción de biomasa. El estudio de la producción de

metabolitos secundarios nos permite afirmar que estas cepas, crecidas en un medio rico

en materia orgánica, serían potenciales productoras de compuestos polifenólicos como

los flavonoides y taninos, asociados principalmente a actividades antioxidantes, pero

también mencionados como responsables de otras bioactividades que les otorgan valor

farmacológico. Por este motivo las cepas fotosintéticas serían las más apropiadas para

estudios biotecnológicos. Por otra parte este tipo de compuesto sólo se detectó en fase

estacionaria de crecimiento.

Por último, no se puede descartar otras posibles aplicaciones de otros

compuestos detectados en la biomasa de E gracilis como los triterpenos y cardenólidos,

conocidos por ser eficaces en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.


‐ 72 ‐

SecciónIICribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 75 –

INTRODUCCIÓN

‐ 76 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 77 – 1.1 El Cribado Farmacológico

El verdadero objetivo de la investigación farmacognóstica es poder descubrir

nuevos compuestos para usos medicinales o agrícolas. Por esta razón, uno de los

primeros pasos en la investigación de productos naturales es determinar si los

extractos de las especies en estudio son activos (cribado biológico o farmacológico).

Los ensayos biológicos se vuelven entonces ineludibles y se realizan con el fin de

identificar extractos de organismos para determinar si poseen efectos bioquímicos o

celulares, así como también para guiar la separación, aislamiento y la evaluación de los

componentes principales de los extractos analizados. La actividad de los extractos o

compuestos aislados se evalúa mediante ensayos biológicos, que consisten en la

medición de la potencia relativa o la actividad de compuestos. Esto se logra

determinando la cantidad necesaria de ese compuesto o mezcla para producir bajo

condiciones estándares, un efecto en un animal de prueba u órgano apropiado. Sin

embargo, en su sentido más amplio, un ensayo biológico puede implicar observaciones

o mediciones de los efectos obtenidos en cualquier sistema biológico, para la

detección de propiedades de un extracto crudo, fracción cromatográfica, mezcla o

compuesto puro.

La mayoría de los agentes terapéuticos disponibles son sustancias de

composición química conocida que se pueden ensayar mediante análisis químicos o

físicos cuantitativos. Sin embargo, algunas drogas, principalmente las de origen

natural, no pueden ser ensayadas mediante estas técnicas por lo que se usan métodos

biológicos. Los procesos de estandarización biológica son en general menos precisos,

más costosos e insumen más tiempo (Snitkoff, 2000), por lo que se los reserva para

casos en los que:

1. La identidad química del principio activo no ha sido establecida por completo,

2. No se ha desarrollado un ensayo químico adecuado para medir el principio activo,

aunque su estructura química haya sido dilucidada,

3. El principio activo es una mezcla compleja de sustancias de estructura y actividad

variada,


4. La purificación de la droga cruda necesaria para un ensayo químico no es posible o

no es práctica,

5. El ensayo químico no es una indicación válida de la actividad biológica debido a, por

ejemplo, la falta de diferenciación entre isómeros activos e inactivos.

Los bioensayos pueden implicar el uso de sistemas in vivo (ensayos clínicos,

experimentos usando un determinado organismo), sistemas ex vivo (usando tejidos

aislados y órganos) o en sistemas in vitro (utilizando por ejemplo cultivos celulares).

Los estudios in vivo son más relevantes para las condiciones clínicas y a su vez puede

proporcionar datos sobre la toxicidad. Las desventajas de estos estudios son los altos

costos, la necesidad de contar con una gran cantidad de compuesto o fracción a

probar, la complejidad de su diseño y la dificultad para determinar sus mecanismos de

acción. Los bioensayos in vitro son más rápidos y requieren pequeñas cantidades de

compuestos, pero puede que no sean pertinentes a las condiciones clínicas. Pese a

esto, la tendencia actual es la utilización de ensayos in vitro en reemplazo de los in

vivo. Ambos tipos deben procurar una metodología rápida, sencilla, en general

económica, poca cantidad de muestra, y deben tener la capacidad de detectar una

amplia gama de actividades. Los bioensayos disponibles en la actualidad son robustos,

específicos y sensibles incluso utilizando picogramos del compuestos de prueba

(Meyer et al., 1982, McLaughlin, 1991; McLaughlin et al., 1993, Desmarchelier, et al.,

1995).

Para este tipo de ensayos hay que tener en cuenta los siguientes puntos básicos

(Cannell, 1998):

1. Las muestras disueltas o en suspensión, en un solvente distinto al solvente de

extracción original, deben ser filtradas o centrifugadas para eliminar cualquier material

insoluble.

2. Las muestras acidificadas o basificadas se deben reajustar a su pH, para evitar que

interfieran con el ensayo.

3. En todos los análisis, deben ser incorporados controles positivos y negativos.

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 79 – 4. Idealmente, la prueba debe ser al menos semicuantitativa y/o las muestras deben

ser analizadas usando una serie de diluciones, para determinar dónde reside la

mayoría de los compuestos diana.

5. El ensayo debe ser lo suficientemente sensible para detectar componentes activos

en baja concentración.

Las etapas fundamentales son dos: un cribado primario (general o preliminar) y

uno secundario (específico o de orden superior). En cada una de ellas se realizan uno o

más bioensayos, utilizando los extractos y/o los productos purificados.

1.2 Cribado primario

En particular, el cribado biológico primario puede involucrar ensayos de

actividad antibiótica, test de inhibición in vitro, ensayos con invertebrados como

Artemia sp. o insectos y algunos ensayos bioquímicos. No se incluyen en esta etapa los

ensayos biológicos que utilicen animales vertebrados o clínicos humanos.

Actividad antibiótica: El término ensayo microbiano o microbiológico puede

implicar observaciones o mediciones en microorganismos como bacterias, levaduras u

hongos. En general, los principios involucrados en los ensayos microbiológicos son

iguales a los empleados para organismos superiores, sin embargo, una diferencia

destacable es el tamaño poblacional, por lo que los resultados obtenidos en un cultivo

conforman la respuesta promedio de una población extremadamente grande de

microorganismos de prueba. En el caso de los ensayos antimicrobianos se evalúa la

potencia de las sustancias antibióticas. El efecto se mide por la inhibición del

crecimiento de una cepa apropiada de microorganismos, es decir, la prevención de la

multiplicación de los microorganismos de prueba. Los procedimientos empleados en

los ensayos antimicrobianos pueden ser en placa o turbidimétricos. Con los ensayos en

placa se cuantifica la potencia del antibiótico midiendo el halo de inhibición del

crecimiento microbiano que rodea un disco de papel embebido en la sustancia de

prueba. Para ello se usan distintas diluciones de la sustancia a probar, colocándolas

sobre la superficie de un medio nutritivo sólido, inoculado previamente con el

microorganismo de prueba. La inhibición lograda se compara con la producida por


concentraciones conocidas de un estándar de referencia. En cambio, en los ensayos

turbidimétricos la inhibición del crecimiento microbiano se estima por medición de la

turbidez de la suspensión de microorganismos, en un medio líquido al cual se le ha

agregado diferentes cantidades del compuesto a ensayar.

Test de inhibición in vitro: En este tipo de bioensayo se utilizan semillas

(generalmente de trigo -Trit icum sat ivum - de una variedad ident ificada) que se

germinan en condiciones naturales con agua corriente (control negativo), en presencia

de un antitumoral conocido (Vinblastina SO42‐, control positivo) y de distintas

concentraciones de los extractos y/o productos a analizar. Al cabo de 72 horas, se

calcula el porcentaje de inhibición, en base a la longitud de la raíz de mayor longitud

del control negativo (100 % de crecimiento). Se trata de un ensayo muy preciso, fiel,

económico y que además permite inferir la posibilidad de que la muestra contenga un

producto antitumoral (Mongelli et al., 1995). También puede ocurrir que la muestra en

lugar de inhibición del crecimiento provoque estimulación, lo cual permite evaluar la

presencia de sustancias fitoestimulantes.

Test de Artemia sp: las larvas del crustáceo Artemia salina (nauplii) o de otras

especies de igual género fueron sugeridas como una sonda conveniente para evaluar

las actividades farmacológicas de los extractos de productos naturales, ya que ellos

pueden manifestar cierta toxicidad hacia los nauplios recién eclosionados. Este ensayo

tiene la ventaja de ser rápido (24 horas), bajo costo y sencillo ya que no se requieren

técnicas asépticas. Se pueden utilizar fácilmente un gran número de organismos que

pueden estar continuamente disponibles, lo que resulta ventajoso para las

consideraciones estadísticas. Además no requiere ningún equipo o formación especial

y se puede utilizar una cantidad relativamente pequeña de muestra. Los compuestos

activos obtenidos de este modo podrían entonces ser sometido a bioensayos más

específicos (McLaughlin et al., 1998).

Ensayos bioquímicos: Algunos ensayos pueden realizarse sin usar material

biológico, es el caso de la estimación de la capacidad antioxidante por el método del

radical 2,2'‐difenil‐1‐picrilhidrazilo o DPPH�. Un radical libre es cualquier especie

química ya sea atómica o molecular, capaz de existir independientemente y que

contiene un electrón desapareado en el orbital más externo. Este electrón genera un

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 81 – campo eléctrico que no es anulado, lo que ocasiona que la especie química sea

paramagnética y por ende altamente reactiva, capaz de actuar en los sistemas

biológicos dañándolos irreversiblemente (Venereo, 2002).

El estrés oxidativo se produce cuando, por exposición de materia viva a diversas

fuentes, se desencadena una ruptura del equilibrio que debe existir entre las

sustancias o factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de

eliminar dichas especies químicas. Dicho desequilibrio se puede producir por un déficit

de estas defensas o por un incremento exagerado de la producción de especies

reactivas. El estrés oxidativo trae como consecuencia alteraciones en la relación

estructura‐función de biomoléculas de vital importancia, en cualquier órgano, sistema

o grupo celular especializado, ocasionando un daño oxidativo que puede llevar a un

estado patológico y a la muerte celular (Amic et al., 2003).

El radical libre 1,1‐difenil‐2‐picrilhidrazilo (DPPH), es un indicador para medir la

capacidad de secuestro de cualquier compuesto con actividad antioxidante,

especialmente de los compuestos fenólicos.

El fundamento de esta técnica consiste en la medición a 517 nm de la reducción

del radical estable 1,1‐difenil‐2‐picril hidrazilo (DPPH�). Su mecanismo de reacción

consiste en la sustracción de un átomo de hidrógeno proveniente de un donor (AH)

para generar difenilpicrilhidrazina y una especie radicalaria (R�) según la siguiente

reacción:

DPPH� + AH DPPH + A�

DPPH� + R� DPPH‐R

La reacción produce un cambio de color violeta a amarillo, lo que lleva a una

disminución de la absorbancia a 517 nm, de las soluciones alcohólicas de DPPH en

presencia de agentes antioxidantes (ej. compuestos fenólicos). Es un método sensible

y rápido, que no es afectado por la polaridad de la muestra, y además se aplica en


general a todos los fenoles porque sus oxidrilos son muy reactivos y se oxidan

fácilmente.

1.3 Cribado secundario

Los extractos que posean actividad biológica marcada en el cribado primario

pasan a ser analizados en un cribado secundario, en el que se emplean bioensayos más

específicos, que generalmente son de respuesta más lenta y tienen mayor complejidad

y costo que los primarios. En el cribado secundario, suelen estimarse las actividades

antiviral, citotóxica, antitumoral, antineoplásica, inmunosupresora, antimalárica,

amebicida y antimicobacterias, entre otras.

Este cribado farmacológico, ya sea general o específico, produce sólo

probabilidades sobre la actividad que la muestra tendría en, por ejemplo, un ser

humano enfermo.

Cuando la investigación está asociada a ensayos específicos de actividad

biológica, el análisis fitoquímico permite identificar, analizar y caracterizar fracciones o

sustancias bioactivas presentes en una determinada especie. Como se mencionó en la

sección anterior, E. gracilis es una especie a la que no se le atribuyen propiedades

medicinales, pero que sin embargo ha mostrado resultados interesantes en el cribado

químico así como diversos patrones entre cepas y fases de crecimiento en cultivo. Por

este motivo se desarrolló un cribado biológico preliminar (primario) que permitiera

interpretar los resultados del cribado químico. En esta sección se presentan los

resultados del cribado farmacológico de los extractos de dos cepas de E. gracilis libres

de paramilon, en diferentes condiciones nutricionales (heterotrófica y autotrófica) y en

dos de sus fases de desarrollo en cultivo.

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 85 – 2.1 Hipótesis

Sobre la base de los resultados del que cribado químico, se espera que los

extractos alcohólicos de algunas de las cepas de Euglena gracilis en estudio

posean actividad antioxidante frente a radicales libres por ser potencial

productora de polifenoles.

Dado que además de la actividad antioxidante, los polifenoles son compuestos

con propiedades farmacológicas, los extractos alcohólicos de algunas de las cepas

en estudio podrían resultar bioactivos.

Dado que en el cribado químico, las fracciones no alcoholicas mostraron la

presencia de esteroides, triterpenos y cardenólidos (resultados mostrados en la

sección 1 de este capítulo), estas fracciones también podrían resultar bioactivas.


Realizar ensayos biológicos primarios in vitro con los extractos de 2 cepas de

Euglena gracilis, obtenidos bajo distintas condiciones nutricionales y en diferente

etapa de desarrollo en cultivo, para poder evaluar distintos tipos de actividades.


Evaluar la actividad antioxidante total de los extractos metanólicos de E. gracilis.

Evaluar la actividad tóxica en dos sistemas biológicos, un modelo animal (Artemia

salina) y un modelo vegetal (Triticum sativum).

Evaluar la actividad antibacteriana frente a cepas Gram negativas (Escherichia coli

y Pseudomonas putida) y Gram positiva (Bacillus subtilis).

Evaluar la actividad antifúngica frente a cepas fitopatógenas (Oxyporus

latemarginatus, Bjerkandera adusta, Coriolus villosus y Fusarium oxysporum sp.

medicaginis).

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 89 – 3.1 Microorganismos, condiciones de cultivo, obtención de la biomasa y

fraccionamiento

Se trabajó con cultivos axénicos de 2 cepas de Euglena gracilis (MAT y UTEX). En

todos los casos se trabajó además, con una variedad fotosintética (‐f) y otra blanqueada,

heterotrófica (‐h) obtenida por tratamiento con estreptomicina (Ebringer et al., 1970). Las

cepas fueron mantenidas bajo luz continua, a 24±2 °C, en medio EGM (CCPA, 2001). La

biomasa se obtuvo por centrifugación, a 4 °C, a los 4 días de realizado el inóculo (fase

exponencial, Fexp) y a los 8 días (fase estacionaria, Fest). Una vez obtenida, la biomasa

fue sometida a lavados exhaustivos con agua destilada a 4 °C, para evitar la

contaminación con el medio de cultivo. Por último, se secó por liofilización y pesada.

Para llevar a cabo el cribado farmacológico, se efectuó una extracción general y

fraccionamiento de igual modo al utilizado en el cribado fitoquímico (sección 1, 3.2.1).

3.2 Actividad Antioxidante por el método de actividad secuestradora del radical 1,1‐

difenil‐2‐picrilhidrazilo.

Las fracciones A y B, generadas en el fraccionamiento, se ensayaron para

determinar si poseen actividad antioxidante mediante el método de 2,2'‐difenil‐1‐

picrilhidrazilo (DPPH), utilizando como control positivo t‐butil‐hidroxitolueno (BHT, Koleva

et al., 2002). Para ello las fracciones se evaporaron bajo presión reducida y se registró el

peso del residuo generado. Para la cuantificación de la actividad se prepararon las

siguientes soluciones:

a) Blanco de reactivo: muestra la absorbancia del reactivo como tal cuando no se

reduce. Consiste en una mezcla DPPH� y etanol.

b) Blanco de muestra: se realiza para determinar la absorbancia de la muestra sola

y de sus pigmentos en caso de tenerlos. Está compuesto por la muestra y etanol como

diluyente a distintas concentraciones.

c) Muestras: se realiza para determinar la absorbancia del reactivo (DPPH�)

cuando está en contacto con diferentes concentraciones de un agente reductor. Está

compuesta por la muestra, etanol como diluyente a distintas concentraciones y el

reactivo (DPPH�).

Las soluciones alcoholicas de DPPH� 0,3 mM se prepararon de manera diaria y se

reservaron a 4 °C entre mediciones, se mezclaron con diferentes diluciones de cada una


de las fracciones (5 diluciones de cada una) o con una solución de BHT 0,18 mM (control

positivo). Las muestras se incubaron por 30 minutos, en oscuridad, a temperatura

ambiente, y se midió la absorbancia a 517 nm, utilizando etanol como línea de base para

el espectrofotómetro. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. La

capacidad atrapante, es decir la capacidad de remoción de radicales de las muestras

ensayadas se expresó como porcentaje de inhibición del radical DPPH� (% SC) para cada

dilución, de cada muestra, de acuerdo con lo establecido por Yen and Duh (1994), según

la siguiente ecuación:

% SC= 100 ‐ [(Abs517 Muestra‐ Abs517 blanco) x 100]/Abs517 control

La capacidad atrapante del 50% de los radicales DPPH� (SC50) fue calculada

mediante regresión lineal, donde la abscisa representa la concentración del extracto

ensayado y la ordenada al origen el porcentaje de inhibición del radical DPPH�, promedio

de las tres réplicas (% SC, Choi et al., 2002b).

3.3 Toxicidad

3.3.1 Inhibición del crecimiento en raíces de trigo

Todas las fracciones (A a D) generadas en el fraccionamiento se ensayaron para

determinar si poseen actividad inhibitoria del crecimiento radicular en Triticum sativum.

Las fracciones no polares se solubilizaron en DMSO 2% . Para llevar a cabo el ensayo se

seleccionaron semillas de T. sativum, que se colocaron sobre papel de filtro en placas de

petri de 14 cm de diámetro y se les adicionaron 10 ml de agua corriente. Las placas se

colocaron en oscuridad durante 48 horas, a fin de que se produzca la germinación de las

semillas. Una vez germinadas, se tomaron fotografías de las raíces, que luego se midieron

utilizando el software ImageJ (National Institute of Health). Las semillas germinadas se

pasaron a nuevas placas de petri con papel de filtro, en cada una se colocaron 5 semillas y

se trabajó por duplicado. Las placas de petri de 5 cm fueron entonces regadas con 1,5 ml

de las soluciones a ensayar, agua corriente o vinblastina SO42 (0,02% ) en el caso de los

controles negativo y positivo, respectivamente. Las placas fueron selladas con parafilm e

incubadas en oscuridad a 24 °C por 72 horas. Luego se registró la longitud promedio de

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 91 – las raíces y se estimó el porcentaje de inhibición del crecimiento radicular, tomando

como 100% las semillas tratadas con agua de red.

3.3.2 Toxicidad frente a Artemia salina

Se desinfectaron quistes de Artemia salina, colocándolos en una solución de

hipoclorito de sodio al 2% por 45 minutos. Luego se colocaron los quistes sobre un filtro y

se lavaron exhaustivamente, con agua destilada estéril, para la eliminación del cloro.

Los quistes se pasaron entonces a un dispositivo de eclosión, con medio salino 15

‰, previo lavado y enjuague del recipiente con la solución de hipoclorito de sodio al 2% y

agua destilada estéril. Los quistes se mantuvieron en el dispositivo, bajo aireación

constante desde el fondo, para permitir una hidratación pareja, a temperatura ambiente

y bajo iluminación constante por 48 horas. El medio salino fue preparado por disolución

de sal marina comercial “Marinemix professional” en agua destilada. El medio fue filtrado

al vacío y se ajustó el pH a 8,5‐9,0 con buffer Na2CO3 0,5 M (2 ml/l de medio salino).

Luego de la eclosión de los nauplii, estos se recolectaron mediante iluminación

puntual intensa con pipeta Pasteur y se pasaron a placas de petri de 5 cm de diámetro,

con medio salino limpio 28 ‰. Se tomaron al azar los nauplii que se utilizaron en el test,

colocando 20 de ellos en cada placa, con las diferentes fracciones solubilizadas en medio

salino 28 ‰ (las fracciones a ensayar no polares se prepararon con DMSO al 2% ). Las

placas fueron incubadas por 24 horas a 24± 2 °C, con iluminación constante. Al cabo de la

incubación se contaron los naupliis sobrevivientes (Meyer et al., 1982).

3.4 Actividad antibacteriana

Se ensayó la actividad antibacteriana de los extractos sobre tres cepas de

bacterias, provistas por el laboratorio de Microbiología del Departamento de Química

Biológica de la FCEN:

‐Pseudomonas putida (cepa KT2440)

‐Bacillus subtilis (cepa 168)

‐Escherichia coli (cepa JM109)

Las cepas se mantuvieron en agar nutritivo (extracto de carne 3gr; peptona 5gr;

agar 15gr; agua destilada c.s.p. 1000 ml) hasta el momento del ensayo. Una colonia de


cada cepa fue transferida a medio líquido (caldo nutritivo de igual composición al agar

nutritivo, a excepción del agar) e incubada 24 horas a 36 °C. Posteriormente se realizaron

diluciones de los cultivos, bajo flujo laminar, hasta obtener una suspensión bacteriana

equivalente a 0,5 de la escala de Mc Farland (DO600= 0,05 para todas las cepas).

Se prepararon placas de petri estériles con agar Mueller Hinton (MH) y bajo flujo

laminar se embebieron discos para antibiogramas, con 20 μl de cada extracto (Fracciones

A‐D), a diferentes concentraciones y antibiótico según correspondiera. Las fracciones a

ensayar no polares se resuspendieron con DMSO al 2,5% .

Bajo flujo laminar, se inocularon las placas MH con 0,1 ml de una suspensión

bacteriana equivalente a 0,5 de la escala de Mc Farland y se formó un césped usando un

rastrillo.

Sobre las placas inoculadas se apoyaron los discos con los extractos y antibióticos,

sin usar más de 5 discos en la misma placa (NCCL, 2000). Se cerraron las placas, se

sellaron con parafilm y se incubaron por 24 horas a 36 °C. Al cabo de la incubación se

retiraron las placas y se observó la formación de halos de inhibición.

Estos ensayos se repitieron a fin de analizar dicha actividad, pero utilizando los

compuestos extracelulares de Euglena gracilis. Para esto se embebieron discos para

antibiogramas con una suspensión de células de Euglena gracilis. Esta suspensión se

tomó a diferentes tiempos de desarrollo en cultivo, bajo distintas condiciones

nutricionales. Por un lado se analizó el exudado de las células crecidas en un medio

orgánico (EGM; CCPA, 2001) y por otro el de las células crecidas en un medio mineral, con

agregado de una fuente de carbono (Buetow, CCPA, 2001). Como controles se utilizaron

los medios frescos y antibióticos.

3.5 Actividad antifúngica

Bajo flujo laminar, se embebieron discos para antibiogramas con 20 μl de cada

extracto (fracciones A a D). Las fracciones a ensayar no polares se resuspendieron con

DMSO al 6,5% . Los controles fueron DMSO 6,5 al % y discos sin embeber.

Se prepararon placas de petri estériles con medio Agar‐Malta (extracto de malta

20 g, agar 15 g, agua destilada 1000 ml). Para estos estudios se trabajó con hongos

fitopatógenos y degradadores de madera, provistos por el laboratorio de Micología,

Fitopatología y Liquenología (PRHIDEB – CONICET): Fusarium oxysporum sp.medicaginis

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 93 – (cepa 126), Oxyporus latemarginatus (cepa 444) Bjerkandera adusta (cepa 2197) y

Coriolus villosus (cepa 145).

Bajo flujo laminar, se embebieron discos para antibiogramas con 20 μl de cada

extracto, a diferentes concentraciones.

Luego se inocularon placas con agar‐malta con un fragmento de cada uno de los

hongos mencionados y se apoyaron sobre estas placas los discos embebidos en los

extractos. Las placas se cerraron, se sellaron con parafilm y se incubaron una semana a

25°C. Se midieron los radios formados por los hongos cada 24 horas durante esa semana.

Dado que se detectó la formación de una sal, durante la obtención de la fracción

D, se decidió proceder a hacer los procesos de extracción pero sin el agregado de

biomasa algal. También se ensayó la actividad antifúngica de esta sal.

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 97 – 4.1 Actividad Antioxidante por el método de DPPH

Para determinar la actividad antioxidante se aplicó el método del DPPH. Muchas

especies de radicales de diferente reactividad están implicadas en la propagación de la

oxidación y pueden ser utilizadas en la evaluación de la de eliminación de radicales libres.

Sin embargo, se prefiere a menudo el uso de radicales relativamente estables como lo

son el DPPH● o el ABTS●+ (Miller et al., 1993; Brand‐Williams et al., 1995; Fogliano et al.,

1999). El radical estable DPPH● ha sido ampliamente uピlizado en estudios de acピvidad

antioxidante de diversos compuestos aislados (Brand‐Williams et al., 1995; Sánchez‐

Moreno et al., 1998), extractos de plantas (Imai et al., 1994; Yen y Duh, 1994; Duh y Yen,

1997) e incluso en alimentos (Yamaguchi et al., 1998). Esto se debe a que es muy rápido,

no requiere instrumentación especial, es reproducible y sensible. Esto lo hace

particularmente conveniente para el cribado de un gran número de muestras que

además pueden presentar diferente polaridad. El método no discrimina las diferentes

especies de radicales, pero da una idea general acerca de la capacidad de inactivación de

radicales.

En las figuras 1 y 2 pueden observarse las regresiones lineales que permitieron

calcular la capacidad atrapante 50 (SC50), de cada una de las fracciones (A y B), de las

cepas de E. gracilis, obtenidas bajo las condiciones nutricionales analizadas. La tabla 1

muestra las dosis que logran remover el 50% de los radicales DPPH● (SC50) en cada caso.

En nuestro estudio, el método se aplicó a un antioxidante conocido (BHT) y a una serie de

extractos de las diferentes cepas de E. gracilis (tabla 1). Considerando que una muestra

posee buena actividad antioxidante cuando la SC50 es menor a 250 µg/ml de extracto,

puede afirmarse que se detectó actividad antioxidante en las fracciones de mayor

polaridad (fracciones A) de las cepas UTEX‐f‐ Fexp (SC50 = 157,25 µg/ml), UTEX‐f‐ Fest (SC50

= 240,06 µg/ml) y MAT‐f‐ Fest (147,7 µg/ml), todas ellas positivas en el cribado químico

para polifenoles, sugiriendo la presencia de taninos, flavonoides y oxidrilos fenólicos,

quienes podrían ser los responsables de la alta actividad frente al radical DPPH●.

Dado que el método del DPPH no se ve afectado por la polaridad de la muestra,

ello nos permitió estudiar las fracciones poco polares (fracciones B), que también

resultaron ser antioxidantes, es el caso de las cepas UTEX‐h‐Fest (SC50 = 123,4 µg/ml),

UTEX‐f ‐ Fest (SC50 = 91 µg/ml), UTEX‐f ‐ Fexp (SC50= 195,4 µg/ml), MAT‐f‐Fest (SC50 = 179,3

µg/ml) y MAT‐f‐Fexp (SC50 = 233,6 µg/ml).


FRACCIÓN A FRACCIÓN B

MAT‐f‐Fexp

MAT‐f‐Fest

0 50 100 150 200 2500

20

40

60

80

100R2 = 0,9943SC50= 233,61

Concentración (g/ml)

%SC

0 200 400 6000

20

40

60

80

100R2 = 0,9879SC50= 654,35


%SC

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

R2 = 0,9891SC50= 147,71


%SC

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100R2 = 0,8361SC50= 179,31


%SC

MAT‐h‐Fexp

Figura 1: Regresiones lineales para el cálculo de la capacidad atrapante 50 (SC50) de las fracciones A y B de las cepas MAT fotosintética y heterotrófica en fases de crecimiento exponencial y

estacionaria.

MAT‐h‐Fest

0 200 400 6000

20

40

60

80

100R2 = 0,877

SC50= 1453,69


%SC

100

80

60

40

20

00 200 400 600

R2 = 0,9208SC50= 746,88


%SC

0 200 400 6000

20

40

60

80

100R2 = 0,9711

SC50= 1117,26


%SC

100

80

60

0 200 400 6000

40

20

R2 = 0,934SC50= 555,86


%SC


FRACCIÓN A FRACCIÓN B

UTEX‐f‐Fexp

UTEX‐f‐Fest

UTEX‐h‐Fexp

UTEX‐h‐Fest

0 50 1000

20

40

60

80

100 R² = 0,998SC50=195,37


%SC

0 100 200 3000

20

40

60

80

100 R2 = 0,876SC50= 157,25


%SC

0 100 200 3000

20

40

60

80

100R2 = 0,9995SC50= 240,06


%SC

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100 R² = 0,986SC50= 90,97


%SC

0 200 400 6000

20

40

60

80

100R2 = 0,9751SC50= 454,51


%SC

0 200 400 6000

20

40

60

80

100R2 = 0,8735SC50= 754,23


%SC

0 200 400 6000

20

40

60

80

100

R2 = 0,9895SC50= 123,41


%SC

0 200 400 6000

20

40

60

80

100R2 = 0,8566SC50= 2150,68


%SC

Figura 2: Regresiones lineales para el cálculo de la capacidad atrapante 50 (SC50) de las fracciones A y B de las cepas UTEX fotosintética y heterotrófica en fases de crecimiento exponencial y

estacionaria.


MAT UTEX Fracción Fase

fotosintética heterotrófica fotosintética Heterotrófica

Fexp 654,4 1453,7 157,3 454,5 A

Fest 147,7 1117,3 240,1 2150,7

Fexp 233,6 746,9 195,4 754,2 B

Fest 179,3 555,9 91 123,4

Tabla 1: Resultados de la cuantificación de actividad antioxidante expresados como SC50 (µg/ml) de los extractos A y B de las cepas de E. gracilis fotosintéticas y heterotróficas.

La actividad antioxidante en Euglena gracilis siempre ha sido vinculada a la

presencia de vitamina E y C y ß‐Carotenos (Takeyama et al., 1997), dado que estas

sustancias son poco polares, podrían ser las responsables de esta actividad en la fracción

B. En tanto que los polifenoles y otros compuestos polares estarían relacionados a la

capacidad antioxidante de la fracción A. Hasta el momento no había sido citada esta

asociación en E. gracilis.

4.2 Análisis de toxicidad

4.2.1 Inhibición del crecimiento en raíces de trigo

En las Figuras 3 y 4 se muestran los efectos sobre las longitudes alcanzadas por las

raíces de trigo, de la fracción A obtenida a partir de las diferentes cepas algales testeadas,

en sus diferentes condiciones nutricionales y fases de crecimiento en cultivo, agua de red

y vinblastina como controles negativo y positivo respectivamente.


Figura 3: Longitud de las raíces de T. sativum en presencia del extracto A de la cepa UTEX fotosintética (A) y heterotrófica (B) en fase exponencial y estacionaria de crecimiento. (* P˂0,05).

A partir de la figura 3 puede observarse que la fracción A de las cepas UTEX

fotosintética y heterotrófica en fase estacionaria, mostraron una disminución en la

elongación de las raíces de T. sativum, la cual resultó dependiente de la concentración.

Con la fracción obtenida de las cepas UTEX en fase exponencial, si bien con la menor

concentración ensayada se produjo una disminución en la elongación de las raíces, a la

mayor concentración se revirtió el efecto.

Un comportamiento inverso pudo observarse en las raíces tratadas con las

fracciones A de las cepas MAT (figura 4). Esta fracción obtenida de las cepas MAT en fase

exponencial, mostraron una disminución dependiente de la concentración en la

elongación de las raíces de T. sativum. Al tratar las raíces con la fracción obtenida de las

cepas MAT en fase estacionaria, se observó que con la mayor concentración de extracto

hubo longitudes mayores, similares al control.

A B

0

1

2

3

4

UTEX‐f‐Fexp UTEX‐f‐Fest

*

*

*

Vimblastina0,02 mg/ml

Aguade red

0,05 mg/ml 0,1mg/ml

Longitud

de raices

deT. sativum

(mm)

0

1

2

3

4

UTEX‐h‐Fexp UTEX‐h‐Fes t

*


Aguade red

0,05 mg/ml 0,1mg/ml

Longitud

de raices

deT. sativum

(mm)


Figura 4: Longitud de las raíces de T. sativum en presencia del extracto A de las cepas MAT fotosintética (A) y heterotrófica (B) en fase exponencial y estacionaria de crecimiento. (* P˂0,05).

En la tabla 2 se muestra los porcentajes de inhibición del crecimiento de las raíces

de T. sativum tratadas con los extractos A. Se puede ver que las fracciones A produjeron

variaciones en el crecimiento de la raíz, dependiente de la concentración. En las cepas

UTEX fotosintética y heterotrófica, en fase estacionaria, y en las cepas MAT fotosintética

y heterotrófica en fases exponenciales hubo inhibición del crecimiento. En cambio,

algunas de las concentraciones de las fracciones A de las cepas UTEX fotosintética y

heterotrófica en fases exponenciales, estimularon el crecimiento de las raíces. Idénticos

resultados se obtuvieron con los extractos de las cepas MAT fotosintética y heterotrófica

en fases estacionarias de crecimiento.

0

1

2

3

4

MAT‐f‐Fexp MAT‐f‐Fest Vimblastina0,02 mg/ml

Aguade red

0,05 mg/ml 0,1mg/ml

A

* *

Longitud

de raices

deT. sativum

(mm)

B

0

1

2

3

4

MAT‐h‐Fexp MAT‐h‐Fest

*

*


Aguade red

0,05 mg/ml 0,1mg/ml

Longitud

de raices

deT. sativum

(mm)


Cepa Fase Concentración (mg/ml) Inhibición (% ±SD)

0,05 33,9±10,7 Est

0,1 70,9±2,4 0,05 60,7±1,8

UTEX‐f Exp

0,1 (17,9±7,8) 0,05 48,7±13,6

Est 0,1 (16,9±3,4) 0,05 29,1±3,4

MAT‐f Exp

0,1 45,3±0,6 0,05 17,9±8,8

Est 0,1 41,9±7,7 0,05 20,2±6,1

UTEX‐b Exp

0,1 (17,85) 0,05 95,5±1,5

Est 0,1 (11,4±4,4) 0,05 28,2±2

MAT‐b Exp

0,1 57,3±4,9 Agua de red ‐ 0 Vinblastina 0,02 57,6±2,9

Tabla 2: Porcentaje de inhibición de las raíces de T. sativum.

Los datos entre paréntesis representan % de crecimiento de las raíces por estimulación al ser tratados con las fracciones respectivas.

En una etapa inicial del cribado farmacológico, la actividad antitumoral puede ser

inferida por bioensayos simples, tales como la inhibición del crecimiento de semillas de

trigo (Desmarchelier et al., 1995). Anteriormente el paramilon de Euglena gracilis fue

reportado como agente antitumoral, al ensayarse su efecto sobre ratones balb‐c

(Quesada et al., 1976). En este estudio se muestran evidencias de actividad inhibitoria del

crecimiento con la fracción A que carece de paramilon, ya que éste permanece en el

residuo de la primera extracción. Los resultados del ensayo de inhibición del crecimiento

de las raíces de trigo sugieren que los fenoles, presentes en este extracto, pueden ser los

responsables de la inhibición del crecimiento, pero no son datos concluyentes, ya que

algunas de las concentraciones ensayadas estimularon el crecimiento de las raíces y las

diferencias sólo resultaron significativas en el caso de la cepa UTEX‐f‐Fexp, a una

concentración de 0,1 mg/ml. Posiblemente, a pesar de aplicar el mismo procedimiento de

extracción, haya heterogeneidad en la composición de los distintos extractos obtenidos y

a ello se deba la variabilidad de los resultados.

Existen numerosas citas sobre los efectos biológicos de los compuestos fenólicos.

Ellos pueden desempeñar un doble papel como antioxidantes o prooxidantes

‐ 104 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon dependiendo de la concentración y pH del medio (Yoshino et al., 1999; Yamashita et al.,

1999). Además algunos de ellos como la quercetina, luteonina, kaempferon, apigenina y

genisteína, entre otros, tienen actividad inhibitoria sobre varias quinasas relacionadas con

el ciclo celular (Zi et al., 1998; Choi et al., 2001). En este tipo de acción se podría

fundamentar la inhibición causada en el crecimiento de las raíces de trigo, que

potencialmente, les permitiría también tener efectos antitumorales.

Cepa Fracción Fase Concentración

(mg/ml)

Inhibición

(% ±SD) Cepa Fracción Fase

Concentración

(mg/ml)

Inhibición

(% ±SD)

0,05 93,8±4,5 0,05 99,9±0,8 Est

0,1 92,7±6,6 Est

0,1 95,5±3,5

0,05 97,2±1,8 0,05 92,2±1,6 B

Exp 0,1 98,6±1,3

B

Exp 0,1 80,8±1,8

0,05 90,3±9,3 0,05 91,6±12 Est

0,1 87,4±3,6 Est

0,1 94,4±4

0,05 88,9±2,6 0,05 96,2±2,4 C

Exp 0,1 98,3±13

C

Exp 0,1 88,4±10,2

0,05 98,9±6,2 0,05 96,1±4,6 Est

0,1 97,8±0,1 Est

0,1 97,7±0,1

0,05 99,1±1,3 0,05 97,9±1

UTEX

f

D

Exp 0,1 94,4±1

MAT

f

D

Exp 0,1 94,1±7,9

0,05 93,4±0,1 0,05 94,7±2 Est

0,1 92,6±4,1 Est

0,1 78,2±1,8

0,05 95,9±1,1 0,05 74,7±7,3 B

Exp 0,1 93,5±1,5

B

Exp 0,1 88,7±2,3

0,05 86±0,8 0,05 96,4±4,7 Est

0,1 94,6±1 Est

0,1 96,2±2,5

0,05 90,9±18,4 0,05 93,4±4,6 C

Exp 0,1 89,7±5,1

C

Exp 0,1 88,9±9

0,05 70,3±46 0,05 62,3±34,6 Est

0,1 56,1±13 Est

0,1 79,9±49,3

0,05 69,6±24 0,05 99,7±5,6

UTEX

b

D

Exp 0,1 71±38

MAT

b

D

Exp 0,1 93,4±4,2

Agua de red ‐ 0

Agua de red + DMSO ‐ 95,5±4,5 Vinblastina 0,02 57,6±2,9

Tabla 3: Porcentaje de inhibición de las raíces de T. sativum de las fracciones B, C y D obtenidas.


La tabla 3 muestra las inhibiciones observadas con el resto de las fracciones. Dado

que todas estas fracciones se solubilizaron utilizando DMSO 2% , se incluyó además un

control con este compuesto. Este control presentó inhibiciones similares a las fracciones

en las concentraciones ensayadas, por este motivo puede asumirse que la inhibición se

debió al DMSO y no a las fracciones en sí. De hecho, el control positivo (vinblastina)

presentó inhibiciones menores a las fracciones y al control de DMSO.

4.2.2 Ensayo de toxicidad en Artemia salina

Como se observa en las tablas 4 y 5 ninguno de los extractos ensayados

resultaron tóxicos para A. salina a las concentraciones ensayadas.

Cepa Fracción Fase µg/ml Supervivencia (% ) Cepa Fracción Fase µg/ml Supervivencia

(% ) 1 92,6±10,5 1 87±3,4 5 96,4±0,6 5 91,3±7,9 Est 10 93,7±4,3

Est 10 92,5±4,4

1 100 1 86,9±1,6 5 93,1±0,3 5 95,5±6,4

A

Exp 10 97,8±3

A

Exp 10 92,8±10,1

1 95 1 100 5 91,2±12,5 5 100 Est 10 96,7±4,7

Est 10 100

1 97,6±3,4 1 100 5 97,5±3,5 5 100

B

Exp 10 100

B

Exp 10 100

1 100 1 97,5±3,5 5 100 5 100 Est 10 94,7

Est 10 97,5±3,5

1 97,6±3,4 1 97,5±3,5 5 97,5±3,5 5 100

C

Exp 10 97,5±3,5

C

Exp 10 100

1 95,2±0,2 1 100 5 100 5 97,4±3,8 Est 10 100

Est 10 100

1 100 1 100 5 100 5 100

UTEX f

D

Exp 10 100

MAT f

D

Exp 10 100

Control Agua de Mar 97,5±3,5 Control Agua de Mar + DMSO 96,3±5,2

Tabla 4: Porcentaje de supervivencia de Artemia salina en presencia de los extractos A a D de las cepas UTEX y MAT fotosintéticas en fases exponenciales y estacionarias.


Cepa Fracción Fase µg/ml Supervivencia

(% ) Cepa Fracción Fase µg/ml

Supervivencia (% )

1 91±3,6 1 100 5 96,8±1,9 5 94,3±1,7 Est 10 97,5±3,4

Est 10 96,2±1,1

1 95,3±0,5 1 94±3,4 5 97,7±3,2 5 95,2±0,3

A

Exp 10 97,5±3,5

A

Exp 10 97±4,3

1 97,5±3,5 1 100 5 100 5 97,7±3,2 Est 10 100

Est 10 100

1 100 1 97,6±3,4 5 97,5±3,5 5 94,7±0,4

B

Exp 10 95,7±0,4

B

Exp 10 100

1 100 1 97,5±3,5 5 97,4±3,8 5 95±0,4 Est 10 100

Est 10 100

1 97,5±3,5 1 100 5 97,6±3,4 5 92,1±11,2

C

Exp 10 97,7±3,2

C

Exp 10 100

1 100 1 100 5 100 5 94,3±0,2 Est 10 89,7±0,4

Est 10 100

1 100 1 95 5 100 5 94,4±7,9

UTEX‐h

D

Exp 10 100

MAT‐h

D

Exp 10 100

Control Agua de Mar 97,5±3,5 Control Agua de Mar + DMSO 96,3±5,2

Tabla 5: Porcentaje de supervivencia de Artemia salina en presencia de los extractos A a D de las cepas UTEX y MAT heterotróficas en fases exponenciales y estacionarias.

4.3 Actividad antibacteriana

Las diferentes fracciones ensayadas no mostraron actividad antibacteriana frente

a ninguna de las cepas bacterianas testeadas. Sin embargo, los ensayos realizados con los

productos extracelulares evidenciaron algo de actividad frente a la única cepa Gram +

empleada. Estos resultados se muestran en la Tabla 6 y se indican mediante el diámetro

de los halos de crecimiento. En particular, los productos extracelulares de las cepas

blanqueadas por tratamiento con estreptomicina mostraron mayor actividad frente a

Bacillus subtilis. La cepa MAT fue la única que sostuvo esta actividad hasta las 168 horas

Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 107 – de crecimiento al ser cultivada en medio EGM. En medio mineral (Buetow), tampoco se

observó actividad antibacteriana.

Diámetro del halo de inhibición (cm)

Medio de

Cultivo

Cepa Condición Nutricional

Tiempo (horas)

Células/ml

B. subtilis 168

P. putida KT

2440

E. coli 169

24 4,29x105 < 7 mm ‐ ‐ 72 ‐ ‐ ‐ ‐ 120 ‐ ‐ ‐ ‐

Fotosintética

168 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 2,67x105 < 8 mm ‐ ‐ 72 3,99x105 11 mm ‐ ‐ 120 ‐ ‐ ‐ ‐

Utex Heterotrófica

168 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 2,8x105 < 7 mm ‐ ‐ 72 ‐ ‐ ‐ ‐ 120 ‐ ‐ ‐ ‐

Fotosintética

168 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 1,12x105 27 mm ‐ ‐ 72 1,94x105 14 mm ‐ ‐ 120 2,55x105 14 mm ‐ ‐

EGM

Mat Heterotrófica

168 3,15x105 11 mm ‐ ‐ Estreptomicina (2 µg) 35 mm 40 mm 56 mm Ampicilina (2 µg) 40 mm 20 mm 50 mm

Tabla 6: Actividad antimicrobiana de los productos extracelulares de dos cepas de E. gracilis (MAT y UTEX) en dos condiciones nutricionales heterotrófica y fotosintética. Los recuentos celulares

sólo se llevaron a cabo cuando fue detectado inhibición del crecimiento bacteriano.

Hasta las actualidad, se creyó que E. gracilis no era productora de compuestos

alelopáticos (Rice, 1984), posiblemente debido a que la amplia mayoría de los estudios se

realizaron con las cepas naturales, es decir, fotosintéticas. Sin embargo los resultados

obtenidos en este trabajo indicarían que las cepas blanqueadas si son capaces de

producir sustancias alelopáticas.

4.4 Actividad Antifúngica

Las fracciones A, B y C no mostraron actividad antifúngica frente a ninguna de las

cepas ensayadas. La fracción D, tampoco mostró actividad frente a Oxyporus

latemarginatus (444), Bjerkandera adusta (2197) y Coriolus villosus (145), pero, como se

muestra en las figuras 5 y 6, los resultados parecían indicar que poseía actividad contra

Fusarium oxysporum sp. medicaginis (cepa 126 M). Sin embargo, como, durante la

‐ 108 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon obtención de la fracción D se detectó la formación de una sal (capítulo 1 sección 1), ésta

también fue ensayada frente a F. oxysporum sp. medicaginis. Así se pudo comprobar que

la actividad antifúngica se debía a la presencia de estas sales y no a algún metabolito en la

fracción D proveniente de las cepas de E. gracilis ensayadas.

0 24 48 72 96 120

144

168

192

216

240

0

2

4

6

8

10MAT‐f‐FexpMAT‐f‐FestMAT‐b‐Fex

p

MAT‐b‐FestUTEX‐f‐Fex

p

UTEX‐f‐Fex p

UTEX‐b‐Fes

t

DMSO

Disco

Sal

Horas

Rad

io de crecim

iento

deFusarium

oxysporum

sp.m

edicaginis

(cm)

Figura 5: Actividad antifúngica de los distintos extractos D provenientes de las diferentes cepas de

E. gracilis en distintas condiciones de estudio (concentraciones entre 4,08 y 6,4 mg/ml). Los controles fueron el solvente en el que se resolubilizó la fracción D, discos sin ningún contenido y la

sal formada durante el proceso de obtención de la fracción.


Figura 6: Imágenes de Fusarium oxysporum en presencia de los controles (disco sin contenido y DMSO 6.5% ) y en presencia de la fracción D de una de las cepas a modo de ejemplo y de la sal

formada durante el fraccionamiento sin haber incluido biomasa algal.

La recuperación del hongo al inocular la biomasa fúngica en medio fresco luego de

la exposición a la sal fue completa al cabo de 10 días (figura 7).

Figura 7: crecimiento de Fusarium oxysporum a los 10 días de inoculado en medio fresco y post‐tratamiento con la sal formada durante el fraccionamiento sin haber incluido biomasa algal.


5. CONCLUSIONES


Nuestro estudio mostró que las fracciones polares (etanólicas) son las que tienen

la mayor actividad atrapante de radicales libres, lo cual podría estar asociado con la

presencia de polifenoles. Éstas también resultaron activas inhibiendo el crecimiento de

las raíces de T. sativum para la mayoría de los casos. Los resultados de estos dos ensayos

sugieren que los fenoles serían los responsables del efecto antioxidante y de la inhibición

del crecimiento detectada en raíces de trigo. Los compuestos fenólicos pueden

desempeñar un doble papel como antioxidantes o prooxidantes y algunos tienen

actividad inhibitoria sobre varias quinasas relacionadas con el ciclo celular. La inhibición

sobre el crecimiento de las raíces de trigo observada en este trabajo, podría

fundamentarse en este tipo de acción y les permitiría tener potencialmente efectos

antitumorales.

Por otro lado, la eliminación de cloroplastos por tratamiento con estreptomicina

parece estimular la producción de sustancias extracelulares (posiblemente

exopolisacáridos) que resultaron ser levemente bioactivos frente a B. subtilis.

Las pruebas primarias de actividad biológica llevadas a cabo complementan la

caracterización química y permite una primera evaluación del potencial de E. gracilis

como una fuente de productos bioactivos.

CAPITULOIIIEstudios sobre la producción y el potencial bioactivo del paramilon obtenido de Euglena gracilis

SecciónIEstudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 119 ‐

1. INTRODUCCIÓN

‐ 120 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 121 ‐ 1.1 Mixotrofia en Euglena gracilis.

La plasticidad nutricional de Euglena gracilis le permite crecer en condiciones

fototróficas, heterotróficas o fotoheterotróficas dependiendo del medio de cultivo y

las condiciones de luz (Barsanti et al., 2000). Esto hace que la especie sea un modelo

interesante para el estudio de diferentes vías metabólicas. Cuando E. gracilis crece

heterotróficamente, en la oscuridad constante, las células pierden sus cloroplastos

quedando sólo los proplástidos indiferenciados (Epstein & Schiff, 1961). Esta condición

puede ser revertida (Schiff & Schwartzbach, 1982) dado que si las células se exponen

nuevamente a la luz, los proplástidos comienzan a diferenciarse en cloroplastos y

después de 1 a 3 días pueden verse células fotosintéticamente activas con cloroplastos

maduros (Vannini, 1983). Los cloroplastos de Euglena gracilis (Figura 1a) poseen tres

membranas que los delimitan (Gibbs, 1981). Los euglenoideos adquirieron sus

cloroplastos por endosimbiosis con algas clorofílicas y de estas tres membranas, las

dos más internas corresponderían a la envoltura propia del cloroplasto, mientras que

la más externa, que carece de ribosomas, se relacionaría con la membrana fagocítica

del euglenoideo incoloro ancestral (Leedale, 1968). En algunos cloroplastos de los

pigmentados se puede diferenciar el pirenoide, que es la región de la matriz plastidial

que posee material más denso e incoloro. Esta estructura está compuesta

principalmente por proteínas, puede ser atravesado por uno o más tilacoides (Zakrys &

Walne, 1998) y en algunas especies puede estar recubierto de paramilon

extraplastidial (Figura 1b). En E. gracilis los cloroplastos poseen diplopirenoides

ubicados a ambos lados del cloroplasto y comúnmente pueden encontrarse rodeando

al pirenoide y por fuera de la membrana plastidial dos calotas del polisacárido de

reserva del grupo.

La estreptomicina es un antibiótico que no inhibe la división celular o la

viabilidad de E. gracilis, pero actúa como "blanqueador" de las células, dado que

provoca la pérdida permanente de los cloroplastos, junto con su ADN, en las células

fotosintéticas en activa división y a la vez bloquea el desarrollo de los cloroplastos en

las células que no se dividen (Schiff y Schwartzbach, 1982). Mientras que los

cloroplastos son muy susceptibles a la estreptomicina, las células no. Una posible

explicación a este fenómeno es que los cloroplastos de Euglena gracilis poseen

‐ 122 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ribosomas diferentes a los citoplasmáticos, lo que implica independencia en la síntesis

de alguna de sus proteínas (Drown y Galloway, 1969). Por otra parte, la síntesis de las

clorofilas a y b y de los carotenoides se inhibe por altas concentraciones de

estreptomicina. Se cree que este antibiótico tiene un efecto quelante del magnesio

que compone a la clorofila; de hecho, su acción se vuelve parcialmente reversible con

la adición de cationes divalentes (Kirk, 1962).

Tanto en cultivos fotoheterotróficos como heterótroficos, de E. gracilis, el

acetato puede ser usado como única fuente de carbono. Este puede seguir dos vías

metabólicas (Wiessner y French, 1979) y se incorporará sólo en lípidos e hidratos de

carbono, pero no en proteínas, ya que en éstas el carbono proviene casi enteramente

del que es fijado por la fotosíntesis (Cook, 1965). La adición de acetato en cultivos

expuestos a la luz inhibe la síntesis de clorofila y el desarrollo de cloroplastos y reduce

la actividad fotosintética respecto de los medios de minerales (Ternetz, 1912; App &

Jagendorf, 1963; Buetow, 1967). Tanto en condiciones de luz como de oscuridad, la

estreptomicina inhibe la incorporación de carbono a partir del acetato a las proteínas y

ácidos nucleicos. En cambio, este antibiótico estimula notablemente su incorporación

en polisacáridos en condiciones autotróficas (Kirk, 1961).

Euglena gracilis puede asimilar acetato y etanol a través del ciclo del glioxilato y

por lo tanto presumiblemente deben metabolizar acetato derivado por β‐oxidación de

ácidos grasos y alcoholes en una forma similar (Haigh y Beevers 1964; Danforth, 1968).

La asimilación de acetato se puede llevar a cabo por el ciclo del glioxilato, una

derivación de las reacciones de descarboxilación del ciclo del ácido cítrico, que permite

a los organismos sintetizar carbohidratos a partir de compuestos de dos átomos de

carbono, como fue propuesto por primera vez por Kornberg y Krebs (1957). La

ubicación de este ciclo en E. gracilis difiere según los distintos autores. Estaría presente

o bien en unos corpúsculos llamados glioxisomas (Graves et al., 1972) o bien en las

mitocondrias (Ono et al., 2003). El sistema mitocondrial de Euglena gracilis consiste en

un único retículo (Leedale & Buetow, 1970) que se ramifica a lo largo de toda la célula

(Figura 1c y d), formando una especie de malla que constituye aproximadamente un

6% del volumen celular (Pellegrini, 1980). Pringsheim y Hovasse (1948) encontraron

que el desarrollo de las mitocondrias de numerosas especies depende de la fase de

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 123 ‐ crecimiento o de la privación de fuentes de carbono, lo que se correspondería con la

plasticidad nutricional del género.

Figura 1. Micrografías obtenida por MET de Euglena gracilis de: A‐ Cloroplasto (cl), modificado de Leedale (1968), escala: 1µm. B‐ diplopirenoide (pi) con dos calotas de paramilon (p), fuente: Roccheta et al., 2006 Escala: 1µm. C‐ Modelo tridimensional de la red mitocondrial de Euglena gracilis, D‐ Sección de una mitocondria mostrando

las crestas mitocondriales (X 50.000). C y D‐ fuente: Buetow (1982).

La asimilación del acetato requiere de dos enzimas claves: la isocitrato liasa

(ICL; EC 4.1.3.1) y la malato sintasa (MS; EC 2.3.3.9), específicas del ciclo del glioxilato.

Se ha informado de que Euglena gracilis tiene tanto actividades ICL como MS (Reeves

et al., 1962; Heinrich y Cook, 1967) y que estas actividades enzimáticas se incrementan

considerablemente cuando se utiliza etanol como una única fuente de carbono (Inui et

al., 1992). La isocitrato liasa cataliza la escisión de d‐isocitrato en glioxilato y succinato.

El glioxilato liberado se condensa con acetil‐CoA para producir L‐malato por acción de

la malato sintasa. Estas dos enzimas aseguran una alternativa a dos de los pasos de

descarboxilación del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (figura 2) en la síntesis de

D

A B

cl

p

ppi

C

‐ 124 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis succinato. Así, el ciclo del glioxilato es especialmente importante bajo condiciones

limitantes de carbono. En ciertas plantas superiores y en las algas, el ciclo del glioxilato

se ha informado que desempeña un papel fundamental en la síntesis de hidratos de

carbono a partir de lípidos de almacenamiento, en los primeros estadíos de desarrollo

(Eastmond y Graham, 2001; Bedhomme et al., 2009).

A glucosa

ácidos grasos Gluconeogénesis

β‐oxidación fosfoenolpirubato

2 acetil‐CoA oxalacetato

2 CoA

Ciclo del Ciclo

Glioxilato succinato de Krebs

NADH + H+

B

Figura 2: A‐ Esquema simplificado del ciclo del glioxilato y su relación con el ciclo de Krebs. B‐ Ciclo del glioxilato. Fuente: A) Modificado de Nelson y Cox, 2008; B) Berg et al., 2008.

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 125 ‐ En E. gracilis, las actividades de las enzimas clave del ciclo del glioxilato, ICL y

MS, son conferidas por una sola proteína bifuncional llamada enzima del ciclo del

glioxilato de Euglena gracilis (EgGCE). Esta enzima consiste en una única cadena

polipeptídica con un dominio N‐terminal con actividad MS y un dominio C‐terminal con

actividad ICL (Nakazawa et al., 2005; 2011).

El acetato como única fuente de carbono en un medio mineral tiende a

estimular la respiración en E. gracilis. El consumo de O2 en este tipo de medios con

acetato es 4 veces mayor que el consumo endógeno de las células. Además, las células

que crecen en un medio con acetato como fuente de carbono, tienen un 50% más de

ARN que las células que crecen en cultivos con glucosa (Cook y Heinrich, 1965). Por

otro lado, en cultivos fotosintéticos de E. gracilis y sincronizados expuestos a períodos

de luz/oscuridad puede inducirse la actividad ICL después de la adición de acetato,

Woodward y Merret (1975).

1.2 Producción de paramilon de Euglena gracilis y antecedentes sobre sus

aplicaciones.

Los β‐glucanos son homopolímeros de glucosa de estructura compleja que

pueden aislarse de las paredes celulares de bacterias, hongos, algas, cereales y

levaduras (Stone y Clarke, 1992; Zekovic y Kwiatowski, 2005). El número de β‐glucanos

es casi tan grande como el número de fuentes utilizadas para su aislamiento (Vetvicka

y Sima, 2004). Mientras que muchos β‐glucanos tienen uniones del tipo β‐(1 6), dos

son las fuentes más conocidas por producir β‐glucanos lineales con uniones β‐(1 3),

las bacterias del género Alcaligenes, que sintetizan este polisacárido extracelular,

conocido como curdlan, y los euglenoideos entre los que se encuentra E. gracilis, que

sintetiza el polisacárido con ubicación siempre extraplastidial, en forma de gránulos

citoplasmáticos o sobre los pirenoides (Figura 1b) y que es conocido como paramilon.

Los β‐glucanos han tenido hasta la actualidad variadas aplicaciones. Cuando se

incorporó en la dieta de algunos animales y humanos, se detectó un efecto de

descenso del colesterol, una moderación de la glucosa sanguínea postprandial y

respuesta insulínica en humanos (Kogan, 2000). Activa el sistema inmune, la

producción de plaquetas y modifica procesos sépticos (Czop, 2008; Bacic, 2009). Se usa

‐ 126 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis en el tratamiento de queratosis solar y protege contra las irradiaciones (Donzis, 1995 y

1998). Tiene propiedades antitumorales (Quesada et al., 1976; DiLuzio, 1983; Ohno et

al., 2001; Hong et al., 2003, Gu et al., 2005) e inhibe la producción de peróxido de

hidrógeno por macrófagos in vitro (Adachi et al., 1993). Derivados sulfatados del

paramilon de Euglena gracilis, han mostrado actividad anti‐HIV (Koizumi et al. 1993) y

se encontró tanto actividad antibacteriana como estimulación de macrófagos de

derivados de este polisacárido mediante la introducción de cargas positivas en la

molécula (Sakagami et al., 1989; Sakagami et al., 1991). Este tipo de compuestos

también ha sido utilizado como inmunoestimulante para reforzar los sistemas de

defensa no específicos de especies de importancia comercial (López et al., 2003;

Vismara et al., 2004; Skov et al., 2012; Yogeeswaran et al., 2012; Chang et al. 2013).

Existen otros organismos que producen este polisacárido, entre ellos se

encuentra Saccharomyces cerevisiae quien posee de un 85 a un 90% de polisacáridos

en su pared celular, uno de los cuales es un β‐glucano. A escala estructural la pared

celular de Saccharomyces cerevisiae está constituida por 3 grupos de polisacáridos:

manano‐proteínas, polímeros de glucosa o β‐glucanos y en menor proporción

polímeros de N‐acetil glucosamina o quitina (Klis et al., 2002; Aguilar‐Uscanga y

François, 2003; Jouany et al., 2005). En estas células los β‐(1,3)‐D‐glucanos se

encuentran unidos a polisacáridos con uniones de tipo β‐(1,6). A diferencia de las

levaduras, los euglenoideos acumulan grandes cantidades de paramilon intracelular,

pudiendo llegar a producir hasta más del 50% de su peso seco (Barsanti et al., 2001;

Rodríguez Zabala et al., 2010). Se conoce además, tanto por observaciones de especies

en la naturaleza como por ensayos in vitro, que la producción de éste polisacárido es

sumamente variable con las condiciones ambientales (Conforti, 1998). La alta

producción así como su relativa pureza facilitan extracción del polisacárido,

pudiéndose obtener un producto libre de contaminantes celulares.

Como se mencionara anteriormente, en ciertas plantas superiores y las algas, el

ciclo del glioxilato desempeña un papel fundamental en la síntesis de hidratos de

carbono. Esto llevó a estudiar de qué modo se relaciona la cantidad de acetato

presente en el medio, la actividad isocitrato liasa, la producción de paramilon y las

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 127 ‐ variaciones ultraestructurales que los diferentes metabolismos expresados provocan

en las células de E. gracilis. En esta sección se presentan los resultados de este estudio.

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 131 ‐ 2.1 Hipótesis

Debido a su capacidad de incorporar acetato como fuente de carbono, Euglena

gracilis es capaz de producir cantidades variable de su polisacárido de reserva en

función de la cantidad de acetato presente en el medio de cultivo. Esta variabilidad

en la producción de paramilon implicaría una mayor actividad de la enzima isocitrato

liasa y una variabilidad morfológica asociada al tipo de metabolismo expresado.

2.2 Objetivo General

Evaluar la producción de paramilon en distintas cepas de E. gracilis bajo distintas

condiciones nutricionales en los medios típicamente utilizados para su cultivo, los

cuales poseen diferentes fuentes de carbono.

Relacionar la actividad isocitrato liasa con la producción de paramilon, lípidos,

pigmentos y la ultraestructura de las organelas de dos cepas de E. gracilis,

cultivadas bajo distintas condiciones nutricionales por variación de fuentes de

carbono.


Cuantificar la producción de paramilon de dos cepas de Euglena gracilis, en

condiciones heterotróficas y autotróficas, en los medios típicamente utilizados en su

cultivo, los cuales poseen diferentes fuentes de carbono.

Evaluar la pureza del paramilon extraído.

Cuantificar las reservas metabólicas en dos cepas de Euglena gracilis, en condiciones

heterotróficas y autotróficas, en los medios típicamente utilizados en su cultivo.

Cuantificar la actividad isocitrato liasa en dos cepas de Euglena gracilis, en

condiciones heterotróficas y autotróficas, en los medios típicamente utilizados en su

cultivo.

Evaluar cambios ultraestructurales en dos cepas de Euglena gracilis, en condiciones

heterotróficas y autotróficas, crecidas en los medios típicamente utilizados para su

cultivo, los cuales poseen diferentes fuentes de carbono.

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 135 ‐ 3.1 Microorganismos y condiciones de cultivo.

Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en cultivos axénicos de dos

cepas de Euglena gracilis, UTEX 753 (Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de

Texas, EE.UU.) y MAT (aislada del río Matanza, Buenos Aires, Argentina, Ruiz et al., 2004).

Se trabajó con ambas cepas fotosintéticas (MAT‐f y UTEX‐f) y sus variantes, blanqueadas

con estreptomicina, heterotróficas, (MAT‐h y UTEX‐h). Los cultivos se desarrollaron en

tres medios de cultivo: dos medios minerales con pH 7, uno con citrato y el otro con

citrato y exceso de acetato de sodio como fuentes de carbono. Se ensayó además un

tercer medio con exceso de materia orgánica (EGM, tabla 1). Las cepas blanqueadas sólo

se ensayaron en dos de los medios (Buetow y EGM), dado su escaso crecimiento en

medio mineral con bajo contenido de una fuente de carbono (Cramer y Mayer). Las algas

se cultivaron en erlenmeyers de vidrio de 250 ml a 24 ± 1 °C y la irradiación fue

proporcionada por tubos fluorescentes blancos de luz diurna (20 mmol m‐2 s‐1) con un

fotoperíodo de luz‐oscuridad 12:12.

Se inocularon alícuotas de cultivos en crecimiento exponencial conteniendo 5 x

104 células/ml en cada erlenmeyer, para los ensayos enzimáticos, siguiendo las

condiciones de cultivo mencionadas anteriormente. La densidad celular se determinó por

recuento en cámara de Neubauer, con menos del 10% de error, 0,05 (Venrick, 1978).

Las muestras para las diferentes mediciones se recogieron a las 96 horas de haber

realizado el inóculo.


Composición del medio de cultivo

Buetow (mg/l)

Cramer y Myers (mg/l)

EGM (mg/l)

Na Acetato 5000 ‐ 600 Na Citrato 645 800 ‐ (NH4)2SO4 ‐ 1000 KH2PO4 1000 ‐ (NH4)2HPO4 1000 1000 ‐ MgSO4 200 200 ‐ CaCl2 26,5 20 ‐ Fe(SO4)3 3 3 ‐ ZnSO4 0,4 0,4 ‐ MnCl2 1,8 1,8 ‐ Na2MoO4 0,2 0,2 ‐ CoCl2 1,3 1,3 ‐ CuSO4 0,02 0,02 ‐ Tiamina HCl 0,02 0,01 ‐ Vitamina B12 1µg/l 1µg/l ‐ Extracto de carne ‐ ‐ 1000 Extracto de levadura ‐ ‐ 2000 Triptona ‐ ‐ 2000 Cl2Ca (10mg/l) ‐ ‐ 10 ml pH 7 7 7

Tabla 1: Composición de los medios de cultivo utilizados típicamente en el cultivo de E. gracilis y durante los ensayos.

3.2 Cuantificación de paramilon.

Para la extracción de paramilon se modificó el protocolo de Kiss et al. (1988). Se

centrifugaron 100 ml de cultivo, se lavaron las células tres veces con solución

fisiológica y se mantuvieron a ‐20°C durante toda la noche. Luego se agregó una

solución de SDS al 2% (p/v) y buffer Tris‐HCl 0,125 M, la suspensión se sonicó por 15

segundos utilizando un sonicador de vastago. Los granos de paramilon se

sedimentaron por centrifugación, durante 20 minutos a 1.000 x g. Este tratamiento se

realizó repetidas veces hasta obtener una solución translúcida. Luego los granos se

lavaron tres veces con agua destilada a 70°C y se filtraron, utilizando filtros tipo APFC

millippore que se secaron en estufa a 60°C para su cuantificación. Esta determinación

se llevo a cabo por triplicado y los resultados se expresan como µg/105 células.

La calidad de los cuerpos de paramilon se analizó mediante la observación bajo

un microscopio óptico Olympus BX 50.

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 137 ‐ 3.3 Cuantificación de proteínas totales.

Se evaluó el contenido de proteínas totales, a las 96 horas, mediante la técnica

de Bradford (1976), utilizando sero albúmina bovina (SAB) como estándar.

3.4 Cuantificación de lípidos totales.

Los lípidos se cuantificaron de acuerdo al método de Bligh y Dyer (1959). Para

esto se tomó 1 ml de cultivo, se cosecharon las células por centrifugación y se lavaron

3 veces con agua destilada. A continuación se agregaron 4 ml de una mezcla de

cloroformo:metanol (2:1 v/v), luego otros 2 ml de la misma mezcla y finalmente 2 ml

de H2O agitando en vortex después de cada adición. Posteriormente se centrifugó a

300 x g durante 15 minutos, a temperatura ambiente, para acelerar la separación de

las fases y se retiró la fase inferior con pipeta Pasteur de vidrio. Esta fase se colocó en

cristalizadores limpios, secos y tarados, que se llevaron a estufa hasta evaporación

total del solvente. El contenido de lípidos se calculó como la diferencia entre el peso

del recipiente con y sin la muestra seca.

3.5 Cuantificación del contenido de clorofila

El contenido de clorofila se determinó siguiendo el procedimiento descripto por

Wellburn (1994). Se recogieron las células de 5 ml de cultivo por centrifugación a 1.500

x g durante 15 minutos a 4 °C. Las células se congelaron a ‐22 °C y los pigmentos se

extrajeron con una solución de acetona al 80% (v/v). Los extractos se generaron

colocando las muestras en la solución de acetona durante 1 hora a 4 °C y luego fueron

sonicados, manteniéndolos en baño de hielo. Los pigmentos se separaron de los restos

celulares por centrifugación a 1.500 x g durante 15 minutos a 4 °C y las absorbancias

de los sobrenadantes se midieron en un espectrofotómetro UV/Vis (T80 Spectrometer

PG Instruments) a 646 y 663 nm. Para la cuantificación de las clorofilas se utilizaron las

siguientes fórmulas:

Clorofila a = 12,21 x A663 ‐ 2,81 x A646

Clorofila b = 20,13 x A646 ‐ 5,03 x A663

‐ 138 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis 3.6 Determinación de los azucares componentes y microanalisis elemental del

paramilon obtenido.

3.6.1 Hidrólisis ácida

El paramilon, extraído como se indica en el punto 3.2, fue sometido a una

hidrólisis ácida (Albersheim et al., 1967). Para esto 3,8 mg del polisacárido se

sometieron a hidrólisis con 1 ml de ácido tricloroacético 1N, en un vial con tapa de

teflón, a 120 °C, durante 3 hs. Luego los hidrolizados se llevaron a sequedad con

agregados sucesivos de agua destilada bajo corriente de nitrógeno hasta la eliminación

total del ácido.

3.6.2 Obtención de derivados acetilados para cromatografía gaseosa

La reducción a alcohol se llevó a cabo agregando 1 ml de agua destilada y una

punta de espátula de borohidruro de sodio como agente reductor. Se dejó reaccionar

durante 3 horas y luego se eliminó el agente reductor agregando ácido acético glacial,

gota a gota, hasta la desaparición de efervescencia. La mezcla se llevó a seco y se lavó

5 veces con metanol anhidro. Luego se incorporaron 0,5 ml de anhídrido acético y 0,5

ml de piridina (catalizador) y se llevó a 80‐100 °C, en estufa, durante 30 minutos, para

lograr la acetilación. Los alcoholes acetilados se extrajeron con cloroformo y se lavaron

2 veces son bicarbonato de sodio y 3 veces con agua destilada. La fase clorofórmica se

filtró sobre sulfato de sodio anhidro, se evaporó el cloroformo y el residuo se congeló a

‐22 °C, para evitar su degradación, hasta el momento de su análisis por cromatógrafía

gaseosa en columna capilar SP‐2330 (Supelco).

3.6.4 Microanálisis elemental

Por otro lado el paramilon extraído se sometió a un microanálisis elemental de

C, H y N, en un equipo Carlo Erba EA 1108 (CHNS‐O), a fin de verificar la pureza y

calidad del producto. Para dicho análisis se llevó a cabo la combustión de la muestra

en un tubo reactor donde fue transformada a CO2, H2O, N2 y SO2. La separación de los

gases se realizó en un cromatógrafo gaseoso, con detector de conductividad térmica y

una columna de porapac. El método requiere la calibración con sustancias patrón de

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 139 ‐ composición conocida, en este caso se utilizó Sulfamida como patrón para la

determinación de C, H y N (datos experimentales) y 2,5 bis(5‐tert‐butil‐2‐

benzoxazolil)tiofeno (BBOT) y ciclohexanona‐2,4‐dinitrofenilhidrazona (CEDFINI) como

sustancias patrones para el ensayo de control de C, H y N (datos teóricos). El análisis se

llevó a cabo por corrida simple.

3.7 Cuantificación de la actividad isocitrato liasa.

3.7.1 Preparación del homogenato celular.

Las células se cosecharon por centrifugación a 3.000 x g durante 15 minutos, a

4 °C, y el pellet se resuspendió en 1 ml de buffer fosfato 50 mM, pH 7, conteniendo

inhibidores de proteasas (PMSF 0,5 mM y benzamidina 10 mM) y se mantuvieron en

baño de hielo. La ruptura de las células se llevó a cabo por ultrasonicación, en baño de

hielo, mediante 3 ciclos de 10 segundos, a una frecuencia de 20 KHz y con intervalos

de 15 segundos, con el fin de evitar el sobrecalentamiento.

El homogenato celular se centrifugó a 15.000 x g durante 20 minutos, a 4°C , y

se mantuvo a esa temperatura, para su inmediata utilización. El resto del

sobrenadante, se guardó a ‐20ºC, para la posterior determinación de proteínas como

se indicó en la sección 3.3).

3.7.2 Actividad isocitrato liasa.

La medición de la actividad isocitrato liasa (EC 4.1.3.1) se basa en el aumento

de la densidad óptica medida a 324 nm como consecuencia de la formación de un

compuesto coloreado, fenilhidrazona del glioxilato, a partir de fenilhidrazina (Cooper &

Beevers, 1969; Martínez Rivas & Vega, 1993; Sabatini et al., 2011; Sztrum et al., 2012).

La actividad ICL se midió usando ácido treo‐DSLS‐isocítrico como sustrato

(Cooper y Beevers, 1969). Para ello en una cubeta de cuarzo se colocó la mezcla de

reacción (1 ml) conteniendo 860 µl de buffer fosfato de potasio 100 mM, pH 6,8; 9 µl

de mercaptoetanol 4,6 mM y 44 µl de MgCl2 87 mM. Se agregaron 40 µl de

fenilhidracina 10 mM y 35 µl de homogenato celular. Se tomó la lectura del blanco a

‐ 140 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis 324 nm. La reacción se inició con el agregado de 13 µl de sustrato (ácido treo‐DSLS‐

isocítrico 13 mM, Sigma), como se muestra en el siguiente esquema:

Succinato

ICL

fenilhidrazina

Glioxilato Fenilhidrazona del glioxilato (324)

Se registró el aumento de absorbancia entre los 240 y los 360 segundos (tiempo

en el que la pendiente es estable) tomando lecturas cada 30 segundos a 30 °C.

Para la cuantificación de la actividad enzimática se utilizaron las siguientes

ecuaciones:

K= 2,3

Isocitrato

x log A inicial (A) Δt A final

Donde:

A: densidad óptica a 324 nm

Δt: 120 segundos

La unidad enzimática cataliza la formación de 1 µmol de glioxilato por minuto a

pH 6,9 y 30°C. La actividad específica se expresó por miligramos de proteínas totales

según:

Unidades enzimáticas/mg de proteína= K*x fd.

ɛ x proteínas totales

Donde:

K*: valor calculado experimentalmente por (A)

ɛ: coeficiente de extinción= 17 x 10 ‐3 M‐1 s‐1

fd: factor de dilución (volumen de homogenato/volumen total de mezcla de reacción).

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 141 ‐ 3.8 Microscopía electrónica de transmisión (MET).

Se compararon distintas organelas a nivel ultraestructural en ambas cepas, en

las diferentes condiciones nutricionales ensayadas. Para ello, las células fueron

recolectadas mediante centrifugación durante 20 minutos a 3.500 x g. Se descartó el

sobrenadante y las células se fijaron con glutaraldehído al 2,5% preparado en buffer

cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4; durante toda la noche a 4°C. Luego fueron post‐

fijadas en tetróxido de Osmio 1% preparado en buffer fosfato 0,1M; pH 7,4 durante 2

horas, se centrifugó a baja velocidad, se descartó el sobrenadante y las células se

lavaron durante 10 minutos con buffer fosfato 0,1M; pH 7,4 tres veces. Se cosecharon

las células fijadas por centrifugación durante 5 minutos y se deshidrataron las

muestras utilizando una serie de concentraciones crecientes de acetona. Luego de la

deshidratación se realizaron inclusiones en resina Spurr de baja densidad (Reymond y

Pickett‐Heaps, 1983). Los preparados se seccionaron con un ultramicrótomo con

cuchilla de diamante (1 µm de espesor) y se tiñeron con acetato de uranilo 2% por 5

minutos y citrato de plomo 5% durante 5 minutos (Reynolds, 1963). Las secciones

fueron examinadas utilizando un microscopio electrónico de transmisión de alta

resolución, Zeiss EM 10 A/B, en el centro de microscopía avanzada de la Facultad de

Ciencias Exactas y Naturales (CMA‐FCEN).

3.9 Análisis estadístico.

Cada tratamiento se realizó por triplicado y los datos se expresaron como

promedio ± error estándar. Para los gráficos y el análisis estadístico de los datos se

utilizó el programa GraphPad Prism 5. Se calcularon las medias, los desvíos y los

errores estándares de las réplicas. La significación estadística de la diferencia entre los

resultados obtenidos en los medios de cultivo (Cramer y Mayer, EGM y Buetow), las

condiciones nutricionales (fotosintética y heterotrófica) y las cepas (MAT y UTEX) se

determinaron mediante un análisis de varianza de un factor (ANOVA). En todos los

casos se consideraron significativas las diferencias con p<0,05.

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 145 ‐ 4.1 Microorganismos, condiciones de cultivo y cuantificación de la producción de

paramilon.

La mayor producción de paramilon se produjo en los cultivos de las cepas

blanqueadas, en particular cuando fueron cultivadas en medio mineral con exceso de

acetato (figura 3). De las dos cepas blanqueadas cultivadas en estas condiciones, la cepa

UTEX es el que tuvo mayor contenido del polisacárido (12,6 ± 0,8 mg/105 células y 10,0 ±

0,5 mg/105 células para las cepas UTEX y MAT respectivamente). Estas dos cepas

disminuyeron significativamente la producción de paramilon cuando se cultivaron en

medio con exceso de materia orgánica (5,7 ± 0,3 mg/105 células y 7,4 ± 0,3 mg/105 células

para las cepas UTEX y MAT respectivamente). Como se puede ver en la figura 3, las

diferencias en la producción de paramilon son mayores en la cepa UTEX que las

observadas en la cepa MAT (55% y 26% respectivamente).

Las cepas fotosintéticas muestran un comportamiento similar, el mayor contenido

de polisacáridos de reserva se produjo en los cultivos crecidos en exceso de acetato (7,5 ±

0,8 mg/105 células y 7,6 ± 0,3 mg/105 células para las cepas UTEX y MAT

respectivamente, figura 3) y la producción de paramilon disminuyó significativamente

tanto al crecer en medio orgánico (4,4 ± 0,3 mg/105 células y 4,9 ± 0,5 mg/105 células

para las cepas UTEX y MAT respectivamente) como en medio mineral sin exceso de

acetato (4,9 ± 0,4 mg/105 células y 4,8 ± 0,4 mg/105 células para las cepas UTEX y MAT

Figura 3: Producción de paramilon de las diferentes cepas en las dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).

respectivamente).

UTEX f UTEX h MAT f MAT h0

5

10

15

EGM BUE

**

*

*

Cepa y Condición nutricional

Param

ilon

( g/105

células)

C&M

‐ 146 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis Estos resultados concuerdan con observaciones previas realizadas en la cepa

UTEX sobre la estimulación de la producción de polisacáridos de reserva tanto en las

cepas fotosintéticas como blanqueadas en presencia de altas concentraciones de acetato

en el medio de cultivo (Barsanti et al., 2001). Particularmente estos autores indican que E.

gracilis puede acumular paramilon en más del 90% del peso seco celular, bajo

condiciones de oscuridad (heterotrofia) y en presencia de glucosa como única fuente de

carbono. En nuestro estudio no se analizó el comportamiento de las cepas en presencia

de glucosa, pero si se analizó el comportamiento de una cepa autóctona (MAT) que no

presentó diferencias en su comportamiento con respecto a la cepa UTEX.

4.2 Contenidos de proteínas y lípidos bajo distintas condiciones de cultivo.

En las cepas fotosintéticas el contenido de proteínas fue significativamente mayor

en los cultivos crecidos en medio mineral con fuente adicional de carbono (Buetow,

figura 4). Sin embargo no se observaron diferencias en el contenido proteico en los otros

cepas en las dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).

Como se mencionara anteriormente, el acetato del medio puede ser

incorporado sólo en lípidos e hidratos de carbono, pero no en proteínas, que

contienen, casi enteramente, carbono fijado por fotosíntesis. En nuestro caso se

observa que los mayores contenidos proteicos ocurrieron en las cepas fotosintéticas

cuando crecieron en un medio con exceso de acetato. Esto podría explicarse porque,

medios de cultivos ni en las cepas blanqueadas.

Figura 4: Producción de proteínas totales de las diferentes

UTEX f UTEX h MAT f MAT h0

2

4

6

8

EGM BUE

*

C&M

*

Cepa y Condición nutriciona

Proteínas

(mg/106 células)

l

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 147 ‐ en presencia de una fuente externa de carbono (acetato), todo el carbono obtenido

por fotosíntesis sería utilizado para la síntesis proteica, incrementando sus niveles

respecto de los obtenidos en otros medios empleados.

Por otro lado, la estreptomicina también inhibe la incorporación de acetato en

proteínas y ácidos nucleicos de las células (Cook, 1965), esto explicaría los bajos

contenidos proteicos observados en las cepas blanqueadas, cultivadas tanto en medio

orgánico como en medio mineral con exceso de acetato.

Respecto a los lípidos, se observa un incremento en su contenido cuando las

cepas fotosintéticas y heterotróficas crecen en medio con exceso de acetato respecto del

medio orgánico (figura 5). En el caso de las cepas fotosintéticas los niveles intermedios

de lípidos ocurrieron en medio mineral sin fuente adicional de carbono (Cramer y Mayer: 5 s cepas UTEX y MAT

Figura 5: Producción de lípidos totales de las diferentes cepas en las

dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).

Cuando hay lípidos de reserva y no hay una fuente de carbono en el medio, E.

gracilis puede utilizar esos lípidos para la síntesis de carbohidratos gracias a la presencia

del ciclo del glioxilato (Schnarrenberger y Martin, 2002). Esto concuerda con nuestras

observaciones (menores contenidos de lípidos en medios sin acetato), lo que indicaría

que estas reservas lipídicas pueden estar siendo utilizadas en la síntesis de carbohidratos.

23,7 ± 1,8 y 24,3 ± 6,4 µg lípidos/1.10 células para la

respectivamente).

UTEX f UTEx h MAT f MAT h0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

EGM BUE C&M

*

*

*

*

Cepa y Condición nutricional

Lípidos ( g

/105

células)

*

‐ 148 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis Por el contrario, en medios con acetato los lípidos parecen no utilizarse por lo que los

contenidos son mayores.

4.3 Contenido de pigmentos en las cepas fotosintéticas

La cepa UTEX mostró los mayores contenidos de clorofila en los tres medios

ensayados (3,2 ± 0,2 mg/105 células, 2,5 ± 0,3 mg/105 células y ± 4,6 ± 0,5 mg/105 células,

para los medios con exceso de materia orgánica, minerales con y sin exceso de acetato

respectivamente, figura 7). La cepa MAT mostró un comportamiento similar a la cepa

UTEX pero sus contenidos de pigmentos fueron inferiores (1,9 ± 0,3 mg/105, 1,2 ± 0,1

mg/105 y 3,8 ± 0,2 mg/105 para los medios con exceso de materia orgánica, minerales con

y sin exceso de acetato respectivamente). En las dos cepas el contenido de pigmentos fue

significativamente mayor en medio mineral sin fuente adicional de acetato (Cramer y

las diferentes cepas en las dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).

Como se mencionara anteriormente, en presencia de una fuente de carbono

externa, como el acetato, la fotosíntesis puede verse afectada debido a la inhibición en la

síntesis de clorofila y por lo tanto en el desarrollo de cloroplastos (App & Jagendorf,

1963; Buetow, 1967). Esto concuerda con nuestras observaciones, ya que los mayores

contenidos de pigmentos (clorofilas a+b) se encontraron en los cultivos crecido en

medio mineral sin fuente adicional de acetato.

Mayer) en relación a los otros dos medios de cultivo ensayados.

Figura 7: Contenido de pigmentos (Clorofila a+b) de

UTEX f MAT f0

1

2

3

4

5

6

EGM BUE

*

C&M

*

Cepa

Chl a

+ Chl b

( g/105

células)

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 149 ‐ 4.4 Actividad Isocitrato liasa

Ambas cepas blanqueadas, cuando se cultivan en un medio mineral con la adición

de acetato, presentan los mayores niveles de actividad ICL (figura 8). En líneas generales

puede observarse que frente al aumento de acetato hay mayor actividad ICL, pero este

aumento es mayor en las cepas blanqueadas que en las cepas autotróficas. Este

comportamiento se debería a que las células que son heterotróficas sólo pueden crecer a

expensas de alguna fuente de carbono externo (como el acetato), en cambio las células

fotosintéticas pueden o no usar esta fuente de carbono, ya que cuentan con el proceso

fotosintético para la asimilación del carbono. En particular la actividad ICL de la cepa

UTEX‐h es significativamente mayor (0,82 ± 0,1 nmol/mg prot) cuando se cultiva en un

medio mineral con exceso de acetato. Si bien la cepa MAT heterotrófica muestra un

comportamiento similar, en este caso las diferencias no resultaron significativas.

Figura 8: Actividad ICL de las diferentes cepas en las diferentes condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).

Las dos cepas fotosintéticas tienen un comportamiento similar, presentan mayor

actividad ICL en medio orgánico (0,5 ± 0,1 nmol/mg prot para las cepas UTEX y MAT) que

en medio mineral con exceso de acetato (0,5 ± 0,1 nmol/mg prot y 0,4 ± 0,1 nmol/mg

prot para las cepas UTEX y MAT respectivamente) y en medio mineral sin exceso de

acetato (0,4 ± 0,1 nmol/mg prot y 0,3 ± 0,1 nmol/mg prot para las cepas UTEX y MAT

respectivamente), sin embargo estas diferencias no resultaron significativas. Por otro lado

no hay diferencias entre las cepas fotosintéticas.

UTEX f UTEX h MAT f MAT h0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

EGM BUE C&M

*

Cepa y Condición nutriciona

Actividad

(nmol/mg prot)

l

‐ 150 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis La enzima isocitrato liasa cataliza las escisión de isocitrato en glioxilato y

succinato. Esto permite que las células que poseen el ciclo del glioxilato, en el que

participa ésta entre otras enzimas, puedan vivir a expensas del acetato. Por este motivo

es de esperar que en presencia de acetato la actividad de esta enzima aumente. En

concordancia con esto último, nuestros resultados muestran un aumento de la actividad

ICL en presencia de acetato (medios EGM y Buetow). Sin embargo, para las cepas

fotosintéticas parece que el exceso de materia orgánica por si sola también aumenta la

actividad ICL. Posiblemente alguno de los componentes de los hidrolizados utilizados para

la preparación del medio enriquecido en materia orgánica (EGM) sea el responsable del

aumento en la actividad de esta enzima en condiciones autotróficas.

4.5 Diferencias ultraestructurales (Análisis mediante MET)

En las figuras 9 a 12 se muestra la ultraestructura de cloroplastos y

mitocondrias observadas en las cepas fotosintéticas y heterotróficas en las diferentes

condiciones de cultivo analizadas.

Figura 9: Cepas fotosintéticas crecidas en medio orgánico (EGM). A) Cepa MAT, B) Cepa UTEX, detalle de los cloroplastos (Cl) y nucleo (Nu). Escalas: A= 10 µm; B= 5 µm; C= 1 µm.

A B

Cl

Cl

Nu Nu


Cl

Nu

Mi

B

Cl

C

Mi

A

Las cepas fotosintéticas cultivadas en medio con exceso de acetato

mostraron cloroplastos menos desarrollados (figura 10 a) que los observados en

las células cultivadas en medios orgánico (figura 9 b) o mineral (figura 11 a y b),

algunos de ellos incluso se vieron desorganizados (figura 10 b). Como se

mencionara anteriormente esto se debe a que a en presencia de acetato hay una

inhibición en la síntesis de clorofila y en el desarrollo de cloroplastos (App &

Jagendorf, 1963; Buetow, 1967).

Figura 10: E. gracilis fotosintética cultivadas en medio mineral con un exceso de acetato (BUE). A) Cepa MAT‐f, B) Detalle de un cloroplasto (Cl) de la cepa UTEX, C) Detalle de la

red mitocondrial (Mi) de la cepa UTEX‐h. Escalas: A= 10 µm; B= 1 µm; C= 0,1 µm.

Tanto en condiciones autotróficas como heterotróficas, se puede observar que

bajo condiciones de exceso de acetato (figura 10 A y C) y en medio orgánico (figura 12

A y B) hubo un gran desarrollo mitocondrial. Esto responde a un metabolismo

heterotrófico producto de la asimilación del acetato del medio en el primer caso y en

el segundo a la asimilación de alguna fuente de carbono presente en el medio que

además podría ser responsable de las altas actividades ICL observadas en las cepas

‐ 152 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis fotosintéticas cultivadas en medio orgánico. Además se observó que las mitocondrias

presentaron una ultraestructura inusual (figuras 10 C y 12 B) para lo que no se ha

encontrado explicación en la bibiografía conocida.

Figura 11: Detalles de los cloroplastos (Cl) de E. gracilis crecidas en medio mineral sin exceso de acetato (C&M). A) Cepa UTEX, B) Cepa MAT. Escala= 10 µm.

Figura 12: Detalles de las mitocondrias (Mi) en las cepas UTEX‐h (A) y MAT‐h (B) crecidas en medio orgánico (EGM). Escala = 1 µm.

También puede observarse el alto contenido de gránulos de paramilon que se

producen en las células blanqueadas cuando crecen en medio mineral con exceso de

acetato (figura 13) en relación al contenido del polisacárido de reserva de la misma

cepa cultivada en un medio rico en materia orgánica.

A B

Cl Cl

Nu

Nu

Mi

A

Mi

B


A B

Figura 13: Cepa UTEX‐h cultiva en medio A) Buetow, B) EGM. Escala = 10 µm.

4.6 Composición general y microanalisis elemental del paramilon obtenido.

El análisis de los monosacáridos componentes reveló que la totalidad de la

muestra está compuesta por el monosacárido glucosa.

La tabla 3 muestra los resultados obtenidos mediante el microanálisis elemental

del glucano obtenido (figuras 14 y 15) por el método de extracción descripto en el ítem

3.2. Puede apreciarse que no hubo contenido de nitrógeno por lo que se puede decir que

el producto obtenido estuvo libre de otros compuestos celulares (como por ejemplo

proteínas) que en este caso actuarían como contaminantes del producto final.

Muestra N (% ) C (% ) H (% )

Paramilon ‐ 39,1 5,8

Patrón de BBOT 6,51 72,53 6,09

Ensayo de control de BBOT 6,47 72,49 6,03

Patrón de CEDFNI 20,14 51,79 5,07

Ensayo de control de CEDFNI 20,19 51,74 5,03

Tabla 3: Análisis elemental orgánico del paramilon obtenido.

‐ 154 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis La caracterización química de los compuestos orgánicos de carbono, hidrógeno

y nitrógeno juega un papel muy importante en todos los procesos de síntesis,

separación, purificación e identificación estructural, tanto con fines de investigación y

control de calidad, en el ámbito de los productos farmacéuticos, la química orgánica y

muchos otros. En este caso, la caracterización química llevada a cabo sobre muestras

de paramilon, obtenidas por este método, mostró el grado de pureza del polisacárido

(0% de N) indicando que se trata de un método eficiente para su separación y

purificación de otros componentes celulares. Por otro lado, el examen microscópico

del material obtenido de esta manera no mostró células intactas o restos celulares

(figura 14).

Figura 14: Aspecto del paramilon paramilon extraído de Euglena gracilis al

microscopio óptico (X 400). Se pueden apreciar los gránulos de paramilon y la ausencia de restos celulares.

Pese a esto, la formula molecular del paramilon (C6H10O5)n requiere los valores

teóricos C: 44,4% , O: 49,3% e H: 6,2% de lo que se desprende que el método degradó

en parte al polisacárido, por lo que dismiuye la cantidad relativa de C. Clarke y Stone

(1960), mediante una separación previa de los pigmentos y una degradación de

proteínas, logran extraer los gránulos utilizando urea. Estos autores obtienen mejores

Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 155 ‐ resultados que los presentados aquí respecto de los porcentajes de C, H y O, sin

embargo ellos registran una pequeña pérdida de C (42,4 % ) y un contenido, aunque

mínimo, de N y P (0,5 y 0,05 % respectivamente). En el método original de extracción

de Kiss et al. (1988) no se presentan resultados sobre microanálisis elemental ni se

reportan los niveles de producción de este polisacárido.

Figura 15: Aspecto del paramilon de Euglena gracilis obtenido por el

método de Kiss et al. (1998)


CONCLUSIONES


En este trabajo de tesis, hemos analizado la producción de paramilon en distintas

cepas de E. gracilis bajo diferentes condiciones nutricionales, utilizando los medios de

cultivo más populares para la especie.

Del análisis de la actividad ICL, hemos podido comprobar que la mayor actividad de

esta enzima se obtiene en condiciones heterotróficas, cuando las células crecen en un

medio mineral con exceso de acetato. Esta actividad le permite a las células

incrementar sus niveles de paramilon, manteniendo altos los niveles lipídicos y

protéicos. En el caso de las cepas fotosintéticas, cuando crecen en estas condiciones, el

acetato se incorpora en los carbohidratos (lo que se observa como un aumento en el

paramilon) y lípidos, mientras que la fotosíntesis se aprovecharía para la síntesis de

proteínas, que en las condiciones mencionadas presenta los mayores niveles. En estas

cepas además hay una disminución del contenido de pigmentos, lo que indicaría un

desplazamiento hacia el metabolismo heterotrófico.

Los estudios ultraestructurales nos han permitido verificar que, en un medio

mineral con exceso de acetato, las cepas heterotróficas acumulan gran cantidad de

paramilon a la vez que presentan mitocondrias muy desarrolladas. En estas

condiciones las cepas fotosintéticas presentan una disminución en el tamaño de sus

cloroplastos, incluso algunos pueden presentarse desorganizados, y también muestran

mitocondrias muy desarrolladas, lo cual se condice con ese desplazamiento hacia un

metabolismo heterotrófico. Cuando las células crecen en un medio sin exceso de

acetato (Cramer y Mayer) sólo pueden valerse de la fotosíntesis por lo que

ultraestructuralmente se observan cloroplastos muy desarrollados y mitocondrias

pequeñas, a la vez que los contenidos de pigmentos son los más elevados.

En base al análisis aquí presentado, se concluye que las mejores condiciones para

la producción del polisacárido de reserva de esta especie, corresponde a cultivos con

una fuente adicional de carbono en exceso (acetato en este caso). Esta condición es

válida para la obtención de los mejores rendimientos en la producción de paramilon,

tanto en las cepas blanqueadas como fotosintéticas, aunque las blanqueadas

resultaron ser las que producen mayor cantidad de este polisacárido de reserva. Al

analizar los resultados obtenidos con las distintas cepas de E. gracilis, hemos podido

comprobar que la cepa con mejores rendimientos, en la producción de paramilon, es la

‐ 160 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis UTEX‐h en las condiciones anteriormente citadas, por lo que sería la cepa de elección

para la producción de este polisacárido.

SecciónIIActividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1

Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1

‐ 163 ‐

1. INTRODUCCIÓN


‐ 164 ‐


‐ 165 ‐

1.1 Antivirales

Las infecciones virales son causa de daño, muerte y pérdidas en la población.

Para combatirlas, las vacunas cumplen un rol esencial ya que pueden prevenir distintas

enfermedades virales, aunque esto no siempre es posible. En esos casos surge la

necesidad del uso de drogas con actividad antiviral, es decir, utilizar compuestos con la

capacidad de inhibir una o varias etapas del ciclo de multiplicación de un virus.

Para que un antiviral resulte efectivo, debe ser selectivo, es decir, se debe

procurar que la droga inhiba la replicación viral a concentraciones que no resulten

tóxicas para la célula huésped. En este contexto, el hecho de que los virus utilicen la

maquinaria intracelular para su replicación representa una dificultad, por lo que una

quimioterapia exitosa se logra cuando la inhibición de la replicación viral no afecta el

funcionamiento celular, minimizando así la aparición de efectos adversos. A pesar de

que existe una gran cantidad de compuestos ensayados, la mayoría resultan tóxicos

para las células y a este inconveniente se le suma el surgimiento de cepas resistentes

debido a tratamientos prolongados (Damonte, 1996; Field y Biswas, 2011). Una

alternativa frente a este problema es la aplicación de terapias combinadas, así como

una búsqueda activa y diversificada de nuevos compuestos bioactivos que eliminen o

atenúen la enfermedad viral evitando la aparición de resistencias. Esta última es una

opción que cobra mayor relevancia si se tiene en cuenta que el número de antibióticos

disponibles en el mercado supera ampliamente a la cantidad de drogas antivirales de

las que se dispone (Andrei y De Clerq, 1996).

Entre los productos naturales, los polisacáridos sulfatados obtenidos a partir de

fuentes naturales resultan promisorios. Existe variada bibliografía que describe la

actividad antiviral de este tipo de compuestos frente al virus dengue (Talarico et al.,

2005; Pujol et al., 2012), herpes virus (Lee et al., 2004; López et al., 2013), virus

influenza (Makarenkova et al., 2010; Kim et al., 2013), virus de la hepatitis A (Girond et

al., 1991) y virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Hayashi et al., 1996). En

cuanto a los β‐glucanos, derivados sulfatados de este tipo de compuestos, obtenidos

de diversas fuentes, han mostrado actividad frente a varios virus (Zhang et al., 2004;


‐ 166 ‐

de Souza Cardozo et al., 2011) y en el caso particular de Euglena gracilis, derivados

sulfatados del paramilon han mostrado actividad anti‐HIV (Koizumi et al. 1993).

1.1.1 Mecanismo de acción de los antivirales

Muchos antivirales interfieren con alguna de las etapas de la replicación viral,

pero otros provocan respuestas en la célula huésped de tipo antiproliferativa e

inmunomoduladora, éste es el caso de los interferones y citoquinas. De acuerdo a su

perfil específico de actividad, un compuesto antiviral puede interactuar de forma

directa con su blanco de acción (como la amantadina, la rimantadina y el foscarnet) o

puede necesitar primero una activación intracelular (como el aciclovir, un análogo de

nucleósido que debe ser fosforilado por quinasas celulares o virales) (tabla 1).

Tabla 1: Mecanismo de acción y actividad de algunos antivirales sobre la infección vírica. (RA): Resistente a aciclovir.

Antiviral Activación Mecanismo de acción Virus afectado Cita

Aciclovir Fosforilado Metabolizado a aciclovir trifosfato que inhibe a la ADN polimerasa viral.

herpes simplex, varicella zoster, citomegalovirus

Elion et al., 1977 Elion, 1983

Foscarnet Ninguna Inhibición de la ADN polimerasa viral

citomegalovirus, herpes simplex (RA), varicela zoster (RA)

Safrin et al., 1990 Crumpacker, 1992

Rimantadina Amantadina

Ninguna

Obstrucción de una proteína de membrana y su habilidad para variar el

pH intracelular.

influenza A Hoffman et al., 1965 Pfau et al., 1972

Ribavirina Fosforilada Interferencia con ARNm

viral.

Lassa, hantavirus, hepatitis C

Browne, 1979 McCormick et al., 1986

Interferón alfa

Ninguna Inducción de enzimas

celulares que interfieren en la síntesis proteica.

hepatitis D Issacs y Lindermann, 1957

Farci et al., 1994

Oseltamivir Ninguna inhibe actividad de la

enzima viral neuroaminidasa

influenza A y B Jackson et al., 2011

Nevirapina Ninguna inhibe a la transcriptasa

reversa viral HIV Arribas y Eron, 2013

Saquinavir Ninguna inhibe la actividad de la

proteasa viral HIV Arribas y Eron, 2013


‐ 167 ‐

Como se mencionó anteriormente, el mecanismo de acción de un antiviral

tiene como blanco la inhibición de alguna etapa de la replicación viral sin alterar el

metabolismo celular. Tanto la adsorción de la partícula viral a la superficie celular,

como la penetración y el desnudamiento viral (liberación del genoma viral en el

interior de la célula) son eventos que sólo ocurren en células infectadas, por lo que son

los principales blancos de acción de los antivirales. Otros posibles blancos son la

transcripción y traducción de los ARNm virales, la replicación del genoma viral y el

clivaje de proteínas precursoras mediadas por enzimas virales.

1.2 Virus Herpes Simplex.

1.2.1 Características.

El virus herpes simplex (HSV) pertenece a la familia Herpesviridae, subfamilia

Alphaherpesvirinae. Numerosos virus patógenos para el hombre pertenecen a esta

familia. Entre ellos se encuentran HSV, tipo 1 y 2, responsables de las lesiones

herpéticas orofaciales y genitales respectivamente; el virus varicela‐zoster (VZV) que

produce la varicela y la enfermedad conocida como culebrilla; el virus de Epstein‐Barr

(EBV, subfamilia Gammaherpesvirinae) que provoca la mononucleosis infecciosa, el

linfoma de Burkitt y puede ser el agente causal de carcinoma nasofaríngeo; y el

citomegalovirus (subfamilia Betaherpesvirinae) que también provoca mononucleosis,

retinitis, hepatitis y otras enfermedades sobre todo en inmunodeprimidos (De

Cristófano et al., 1996).

El virión del HSV, de unos 150nm de diámetro, es esférico y cubierto por una

envoltura con espículas en su superficie. En su interior contiene una cápside

icosaédrica con 162 capsómeros, rodeados por un tegumento amorfo. Dentro de la

cápside se encuentra un core electrodenso que contiene al genoma viral constituido

por ADN bicatenario y que codifica para más de 70 proteínas en la célula infectada

(Landy, 1989; McGeoch, 1989; figura 1).


‐ 168 ‐

Figura 1: A) esquema del herpes virus (sec. Bleasdale, 2013), B) Micrografía del Herpes virus (por J.C. Brown, Univ. de Virginia). C) Cápside del Herpes virus tipo

1. Fuente: Rochat et al., 2011. Escala: 200 Å.

El huésped natural del HSV es el hombre, la infección primaria en seres

humanos por lo general se produce en la mucosa orofacial durante la infancia. Allí, el

virus se replica dentro de las células epiteliales y sufre su ciclo de vida lítico que

termina con la producción de viriones infecciosos y la lisis de la célula huésped. Existen

dos tipos de HSV, 1 y 2. El HSV‐1 está asociado mayormente con lesiones orales y

oculares y se transmite a través de secreciones orales y respiratorias. En cambio, el

HSV‐2 está mayormente asociado a lesiones genitales y su transmisión es

fundamentalmente sexual. Hoy se conoce que el HSV‐1 también puede causar

infección de los genitales debido a prácticas sexuales, aun cuando una úlcera bucal no

es evidente. El HSV‐1 genital está aumentando su prevalencia en la población (Mertz et

al., 2003; Celum et al., 2010), sin embargo, la mayoría de los casos de herpes genitales

son aún causados por el HSV‐2.

En ambos casos la infección se produce a través de una mucosa erosionada

(labios, boca, ojos, genitales) o de la piel, donde comienza la multiplicación del virus,

quien luego difunde a los ganglios linfáticos donde se produce una multiplicación

secundaria. El HSV es un ejemplo de una interesante propiedad de ciertos virus ya que

puede presentarse en una forma activa y otra latente. Durante la fase activa, el virus

interfiere con el metabolismo normal de la célula, causando los síntomas asociados

con la enfermedad. En la fase latente, si bien la célula huésped permanece infectada,

el hospedador es un portador asintomático de la enfermedad (Schiffer et al., 2009).

CA

ADN viral

Tegumento

Envoltura viral

Glicoproteína

Cápside

B


‐ 169 ‐

Las lesiones recurrentes que presenta esta enfermedad se deben a esa latencia viral

que se produce, en el caso del HSV‐1, en los ganglios del nervio trigémino que

comunica la cara con el sistema nervioso central, y en los ganglios del nervio sacro que

se encuentra cerca de la base de la médula espinal en el caso del HSV‐2. Dado que el

virus alcanza otras células epiteliales, o bien por fusión de membranas de dos células

contiguas o bien por transmisión célula a célula, a través de las uniones estrechas

entre células vecinas, no entra en contacto con el medio extracelular evitando así a los

anticuerpos. A su vez, el hecho de que haya anticuerpos evita la diseminación viral, por

lo que las reincidencias de las lesiones se llevan a cabo en el lugar de la infección

original (Garcia‐Blanco y Cullen, 1991; De Cristófano et al., 1996). Estas recurrencias en

las lesiones están generalmente relacionadas a factores tanto emocionales (por

ejemplo estrés), como a factores físicos (por ejemplo irradiación solar). Comúnmente

estas recurrencias suelen ser de evolución corta y sintomatología moderada, con

completa regeneración del epitelio. La prevalencia de la infección por virus HSV es

aproximadamente del 100% en la edad adulta. Esto se debe a que existe liberación de

virus infeccioso en mucosas y/o epitelios sin lesiones evidentes, por lo que el virus se

transmitiría entre personas aparentemente sanas (Celum et al., 2010).

Desafortunadamente, todavía no existe ninguna vacuna aprobada para la

prevención de HSV, aunque algunas se encuentran en fases de desarrollo (Senzer et

al., 2009; Bernstein 2010; Belshe et al. 2012; Skoverne et al., 2013). Por este motivo, el

aciclovir (9‐(2‐hidroxietoximetil) guanina), un derivado de guanina con una cadena

lateral acíclica (White y Fenner, 1994) es el tratamiento de elección para esta viremia.

Este derivado requiere de la enzima viral, timidin quinasa (TK) para su fosforilación

intracelular a acilguanosina monofosfato (AG‐P). Luego, la AG‐P necesita de una

quinasa celular dependiente de GMP para ser activada completamente a acilguanosina

trifosfato (AG‐PPP). Este último, inhibe a la ADN polimerasa viral competitivamente y

es incorporado al ADN. Dado que este derivado carece del grupo hidroxilo en el

extremo 3´ causa la interrupción en la elongación de la cadena de ADN. Debido a que

la pro‐droga requiere de la activación de una enzima viral, el aciclovir no es tóxico para

las células no infectadas por lo que además puede ser administrado tópicamente o por

vía oral o intravenosa. Dada la prevalencia de la infección y el hecho de que se han


‐ 170 ‐

registrado mutantes resistentes al aciclovir in vivo y en cultivos celulares se torna

importante la búsqueda de nuevos compuestos antiherpéticos.

1.2.2 Ciclo de multiplicación viral.

La entrada del HSV en la célula huésped requiere de la interacción secuencial

de glicoproteínas de membrana específicas virales (gB, gC, gD, gH y gL) con los

receptores celulares. Se ha descripto una primera interacción con proteoglicanos

heparán sulfato (HSPG), y una segunda interacción que implica la unión a diferentes

moléculas (nectina1, el mediador de la entrada del herpes virus (HVEM) o el 3‐O

heparán sulfato sulfatados, 3‐OS HS) en diferentes tipos celulares (O’Donnell et al.,

2008). Durante el ciclo de multiplicación de HSV (Figura 2), una glicoproteína de la

envoltura (gC) se une a los residuos heparán sulfato que se encuentran en la superficie

celular, quien además es mediador de la unión a otros receptores celulares, por lo que

promueve la penetración viral por fusión de la envoltura viral con la membrana

plasmática. Durante este proceso además estarían involucradas otras dos

glicoproteínas (gB y gH). Luego, las proteínas del tegumento se liberan y una de ellas

suprime la síntesis de proteínas celulares. La cápside, que también es liberada al

citoplasma, se transporta hacia un poro nuclear donde el ADN viral es liberado y

circularizado (Belshe, 1991; Eisenberg et al., 2011).

Otra proteína del tegumento se libera y activa la transcripción de los 5 genes α.

Esta proteína viral se asocia a otras dos proteínas celulares para formar un complejo

multiproteico, que reconoce la secuencia en la región promotora del ADN viral,

disparando la transcripción mediante la polimerasa celular. Los ARNm son

transportados al citoplasma donde son traducidos a proteínas regulatorias de la

expresión de los genes tardíos. Una proteína inicia la transcripción de los genes , que codifican para enzimas requeridas para incrementar la reserva de nucleótidos y de

otras proteínas necesarias para la replicación viral. El genoma viral se replica

circularmente. Siguiendo el ciclo de replicación, algunas proteínas β inducen la

transcripción de genes llamados , que codifican para las proteínas requeridas para la

formación de nuevos viriones (Belshe, 1991). Durante el ensamblaje se forma una

cápside vacía donde luego se empaqueta el ADN viral en el núcleo celular (Metteleiter,


‐ 171 ‐

2002, Hollinshead et al., 2012). Algunas evidencias experimentales señalan que la

cápside dejaría el núcleo recubierto con la membrana nuclear interna, y dicha cubierta

se perdería por fusión con la envoltura nuclear externa, dejando las cápsides rodeadas

únicamente por el tegumento, libres en el citoplasma. La nueva adquisición de una

envoltura se produciría a partir de membranas tubulares citoplasmáticas (Hollinshead

et al., 2012). Esta adquisición puede explicarse de dos formas (Bleasdale, 2013; figura

3):

a‐La cápside y tegumento se unen a la región trans de Golgi (TGN) adquiriendo una

nueva envoltura en su lumen. El virión envuelto pasa entonces a la vía secretora hasta

la fusión de la vesícula con la membrana plasmática liberando el virión.

b‐ Por endocitosis de la membrana plasmática se forman vesículas tubulares que se

unen y envuelven las cápsides y sus tegumentos. Los viriones envueltos son luego

llevados a la superficie donde ocurre la fusión de la vesícula con la membrana

plasmática liberando el virión.

Figura 2: Ciclo de multiplicación de HSV (de Chiara et al., 2012).


‐ 172 ‐

Figura 3: Modelo para la adquisición de la envoltura viral (Hollinshead et al., 2012): (1)

Glicoproteínas virales se procesan en el aparato de Golgi (TGN) y se exportan a la

superficie celular. (2) La membrana plasmática con glicoproteínas se invagina y es

transportada a través del endosoma temprano para producir envolturas tubulares. (3)

Los túbulos con las glicoproteínas envuelven las cápsides en el citoplasma celular

formando viriones con una doble membrana. La fusión de las membranas produce la

liberación de un virión rodeado de tegumento. (EE) endosoma temprano; (ER) retículo

endoplásmico; (GA) el aparato de Golgi; (PM) membrana plasmática; (TGN) región

trans de Golgi.

El HSV‐1 es capaz de establecer una infección latente durante toda la vida del

huésped en los cuerpos celulares de las neuronas que alimentan el sitio de la infección

primaria (Baringer y Swoveland, 1973). Esta latencia se caracteriza por la presencia de un

genoma viral funcional sin la producción de virus infeccioso. Durante este tiempo, las

transcripciones asociadas a latencia (LAT) son las únicas transcripciones prominentes

(Stevens et al., 1987), cuyo papel en la generación de péptidos funcionales o proteínas es

todavía una cuestión de debate (Henderson et al., 2009). La reactivación de la latencia

puede ser desencadenada por varios estímulos externos (estrés, inmunosupresión, etc.)


‐ 173 ‐

que activan la expresión de los genes virales. Los viriones recién producidos son

transportados a los sitios de infección primaria donde causan lesiones herpéticas

recurrentes (figura 4).

Figura 4: Ciclo de mantenimiento (latencia) del HSV y su reactivación

(sec. Penkert y Kalejta, 2012).

En los últimos años, se han encontrado numerosos compuestos procedentes de

fuentes naturales que han mostrado actividad antiherpética al interferir con los

primeros eventos del ciclo viral, incluida la unión del virus a y/o la entrada a la célula

huésped (Ghosh et al., 2009). Se han encontrado varios polisacáridos con

características antivirales tales como los ramnanos sulfatados obtenidos del alga verde

Monostroma nitidum (Lee at al., 2010), fucoidanos de alga parda Undaria pinnatifida

(Lee et al., 2004; Hayashi et al., 2008), polisacáridos ácidos sin grupos sulfato aislados

de las cianobacterias Nostoc flagelliforme (Kanekiyo et al., 2007) y polisacáridos

neutros aislados de Basella rubra (Dong et al., 2012), una planta popular en varios

países por sus hojas comestibles, extensamente usada en la cocina asiática. Con


‐ 174 ‐

respecto a los polisacáridos sulfatados, su mecanismo de acción es incierto, aunque

algunos autores han atribuido su acción a la inhibición de la adsorción del virus a la

célula huésped y su internalización (Baba et al., 1988; Eo et al., 2000; Talarico et al.,

2005). Esto se debería a que los polisacáridos sulfatados presentan una estructura

química muy similar al heparán sulfato, por lo cual podrían bloquear la infección viral

al competir con el heparán sulfato por la interacción con el virus.

Eliminado: í


‐ 175 ‐



‐ 176 ‐


‐ 177 ‐

2.1 Hipótesis

Dado los efectos antivirales de muchos polisacáridos sulfatados, si se modifica

mediante sulfatación el paramilon, polisacárido de reserva de Euglena gracilis, éste

podría ser capaz de inhibir al virus herpes simplex tipo 1 (HSV‐1) in vitro.


Evaluar la actividad antiviral frente a HSV‐1 de un derivado obtenido mediante un

proceso de sulfatación del paramilon de E. gracilis.


Someter al paramilon obtenido de E. gracilis a un proceso de derivatización con el

objetivo de producir un derivado sulfatado.

Evaluar la actividad citotóxica en células Vero del paramilon y del derivado

obtenido de E. gracilis.

Evaluar la actividad antiviral frente a HSV‐1 del derivadoobtenido de E. gracilis.


‐ 178 ‐


‐ 179 ‐



‐ 180 ‐


‐ 181 ‐

3.1 Preparación de un derivado sulfatado del paramilon.

El paramilon obtenido como se describe en el punto 3.2 del capítulo 3 sección 1

se sometió a un proceso de sulfatación de acuerdo con la técnica descripta por Takano

et al. (1996). Para esto se tomaron 100 mg de paramilon y se homogeneizaron en 9,5

ml de dimetiformamida (DMF) durante 3 horas con agitación y calor, sin superar los

40°C. Una vez homogeneizado, se añadieron 640 mg de diciclohexilcarbamida (DCC)

disuelta en 8,2 ml de DMF. La mezcla se llevó a 0°C con baño de hielo y agua y se

añadió una solución 0,30 M de H2SO4 en DMF. La mezcla se agitó durante 15 minutos a

0°C, bajo corriente de nitrógeno, luego se volcó sobre 50 gr de hielo molido y se

neutralizó con una solución de NaOH. Una vez neutralizada, la mezcla se dializó

durante 5 días con agua corriente y 2 días con agua destilada. Una vez dializada, la

mezcla se filtró utilizando papel de filtro, a fin de remover la diciclohexilurea derivada

de la DCC. La muestra se mantuvo durante 3 días en heladera y, tras la formación de

un precipitado color blanco, se volvió a repetir el proceso de filtrado, esta vez

utilizando un papel más grueso. El filtrado se concentró a presión reducida, se congeló

a ‐24°C, se liofilizó y se mantuvo en desecador hasta su posterior utilización.

3.2 Actividad citotóxica y antiviral del paramilon y su derivado. 3.2.1 Medios de cultivo. Medio de crecimiento (MC): Medio mínimo esencial de Eagle (MEM), carbonato de

sodio 26 mM suplementado con 5% de suero fetal bobino inactivado y gentamicina

(50g/ml).

Medio de mantenimiento (MM): Medio mínimo esencial de Eagle (MEM), carbonato de

sodio 26 mM suplementado con 1,5% de suero fetal bobino inactivado y gentamicina

(50g/ml).

Medio de plaqueo: Medio mínimo esencial de Eagle doblemente concentrado (MEM

2X) suplementado con 4% de suero de ternera inactivado y 100 g/ml de gentamicina.


‐ 182 ‐

En el momento de utilizarse se mezcla con igual volumen de metilcelulosa 1,4% para

obtener un medio semisólido.

3.2.2 Células.

Se utilizó la línea celular Vero (figura 5). Esta línea celular fue obtenida en 1952

a partir de un riñón de un mono verde africano (Cercopithecus aethiops) adulto normal

(ATCC‐CCL, 1992). Las células fueron crecidas en monocapa en MC a 37°C y

mantenidas en MM. Los cultivos que se incubaron en estufa con 4% de CO2, se

suplementaron con buffer ácido N‐[2‐hidroxietil] piperazin‐N´‐[2‐etansulfónico]

(HEPES) 20mM y bicarbonato de sodio 26 mM.

Figura5: Línea celular Vero utilizada en los ensayos antivirales. Fuente: American Type Culture Collection (ATCC), www.atcc.org

3.2.3 Virus.

Se utilizó la cepa F de HSV‐1 obtenida de la American Type Culture Collection

(ATCC, Rockville, USA). Los stocks virales provistos por el laboratorio de Virología del

Departamento de Química Biológica se conservaron a ‐70°C y se titularon por el

método de formación de placas de lisis (UFP).


‐ 183 ‐

3.2.4 Ensayo de viabilidad celular.

Previamente al estudio de la actividad antiviral de un compuesto, se debe

evaluar el efecto tóxico de éste sobre las células en ausencia del virus. Con el fin de

determinar si el derivado, obtenido según la metodología descripta en la sección 3.3,

tiene algún grado de citotoxicidad, se evaluó la viabilidad de células Vero mediante el

método de MTT en presencia del derivado y en presencia del paramilon sin derivatizar.

El MTT, bromuro de (3‐[4,5‐dimetilthiazol‐2yl]‐2,5‐difeniltetrazoilio, Sigma

Chemical Co. St. Louis), es un compuesto que se reduce por acción de la enzima

mitocondrial succinato deshidrogenasa, generando un producto de color azul

(formazan) (Denizot y Lang, 1986). La medida de la absorbancia a 595 nm permite

detectar alteraciones en el metabolismo oxidativo celular, en los cultivos tratados con

droga respecto a los no tratados.

Monocapas de células Vero crecidas en microplacas de 96 pocillos durante 48

horas se incubaron con 100 µl de MM, conteniendo diferentes concentraciones de los

dos compuestos a analizar, el polisacárido derivatizado y el polisacárido sin derivatizar,

durante 48 horas a 37 ºC y en atmósfera de CO2. Luego se retiró el medio y se

colocaron en cada pocillo 100 µl de una solución de MTT a una concentración final de

0,5 mg/ml en el medio. Las placas se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37 °C, en

atmósfera de CO2. Luego se les retiró el medio y se agregaron 200 µl de etanol 96°,

homogeneizando bien la mezcla en cada cavidad. Se leyeron las absorbancias a 595 nm

en un lector de placa. El porcentaje de viabilidad celular se calculó como:

% de viabilidad celular = 100 x densidad óptica 595nm tratado

densidad óptica 595nm control

A partir de los gráficos de regresión lineal, del porcentaje de viabilidad celular

en función de la concentración del compuesto, se determinó la concentración del

polisacárido derivatizado y sin derivatizar, que provoca una reducción del 50% en la

viabilidad celular (CC50).


‐ 184 ‐

3.2.5 Ensayos antivirales del derivado obtenido.

Luego de realizados los estudios de toxicidad, se llevó a cabo la evaluación de la

actividad antiviral frente a HSV‐1 del derivado obtenido (sección 3.1), en la línea

celular Vero. Está reportado que esta línea es sensible a poliovirus tipo 3, virus

SemlikiForest, paramarixovirus, herpesvirus y adenovirus tipo 3 y 7 entre muchos otros

(Horwitz, 1990).

3.2.5.1 Ensayo de inhibición del rendimiento viral.

La actividad antiviral fue evaluada mediante el ensayo de inhibición del

rendimiento viral. Para esto, monocapas de células Vero crecidas en microplacas de 24

cavidades se inocularon con 0,2 ml de una suspensión de virus a una multiplicidad de

infección (m.i.) de 1, a fin de infectar la mayoría de las células del cultivo. Luego de una

hora de adsorción a 37°C, en atmósfera de CO2, se retiró el inóculo viral y las células se

cubrieron con 0,5 ml de MM, conteniendo diluciones seriadas del compuesto. Los

cultivos controles se cubrieron con MM, pero sin el compuesto. Posteriormente, los

sobrenadantes se cosecharon manteniéndolos en baño de hielo, a fin de que no

perdiesen infectividad y se titularon por el método de UFP (ver la sección 3.2.5.2). La

actividad antiviral se calculó como el porcentaje de inhibición del título viral en los

cultivos tratados respecto al control, utilizando la siguiente fórmula:

% inhibición = 100 – título de la muestra x 100

título del control de virus

La concentración efectiva 50 (CE50) se estimó como la concentración del

compuesto que redujo el título viral en un 50% respecto al control sin tratamiento.

Este valor se calculó a partir de la recta de regresión lineal obtenida del gráfico del

título en función de la concentración.


‐ 185 ‐

3.2.5.2 Titulación de la infectividad viral

La titulación de la infectividad viral se determinó por recuento de UFP,

utilizando células Vero. Para esto, las células se inocularon con diluciones seriadas al

décimo (por duplicado) de las suspensiones a testear y luego de 1 hora de adsorción a

37°C se retiró el inóculo y se cubrió cada cavidad con 0,5 ml de medio de plaqueo. Las

placas se incubaron nuevamente por 96 horas en las mismas condiciones, luego se

fijaron las células con formol al 10% durante 15 minutos y se revelaron las placas por

tinción con cristal violeta al 1% durante 20 minutos. El título viral se determinó según

la siguiente ecuación:

Titulo viral = promedio del número de placas de lisis

(UFP/ml) vol. de inóculo X dilución

3.2.5.3 Ensayo de reducción del número de placas.

Las monocapas de células Vero, crecidas en microplacas de 24 pocillos, se

infectaron con una dilución del stock viral de manera tal de contar con un inóculo de

0,2 ml conteniendo 50 UFP. Luego de 1 hora de adsorción a 37°C, se retiró el inoculo,

se cubrió cada cavidad con 0,5 ml de medio de plaqueo y las microplacas se incubaron

a 37°C en estufa de CO2. Al cabo de 4 días las células se fijaron y se tiñeron para poder

revelar la presencia de placas lisis (descripto en 3.2.5.2). El tratamiento con el derivado

de paramilon se realizó incubando en etapas diferentes:

1) únicamente durante la adsorción viral,

2) durante la adsorción y se mantuvo en el medio de plaqueo,

3) el polisacárido se agregó luego de la adsorción y se mantuvo en el plaqueo.

La CE50 se estimó como la concentración del compuesto que redujo el número

de placas en un 50% respecto al control sin tratamiento. Este valor se calculó a partir

de la recta de regresión lineal obtenida del gráfico del número de placas en función de


‐ 186 ‐

la concentración. En todos los casos se calculó el índice de selectividad (IS) como el

cociente CC50/CE50 y se calculó el porcentaje de inhibición del número de placas como:

% inhibición = 100 – número de placas de la muestra x 100

número de placas del control de virus


Cada tratamiento se realizó por triplicado y los datos se expresaron como

promedio ± desvío estándar. Para los gráficos y el análisis estadístico de los datos se

utilizó el programa GraphPad Prism 5. Se calcularon las medias y los desvíos

estándares de las réplicas. Para comparar los controles con las distintas

concentraciones del polisacárido en estudio se realizaron análisis de varianza (ANOVA)

de un factor considerando a las concentraciones como variables independientes. En

todos los casos se consideraron significativas las diferencias con p<0,05.


‐ 187 ‐



‐ 188 ‐


‐ 189 ‐

4.1 Actividad citotóxica y antiviral del paramilon y su derivado.

4.1.1 Efecto del paramilon y su derivado sobre la viabilidad de las células Vero.

La figura 6 muestra la reacción de las células Vero tratadas con el derivado

obtenido frente al MTT. La observación mediante microscopía óptica de las cavidades

tratadas con el compuesto a concentraciones que resultaron tóxicas para las células,

nos permitió detectar el redondeamiento de su contorno y el desprendimiento de

algunas células al sobrenadante de los cultivos (datos no mostrados).

Figura 6: Reacción de las células Vero tratadas con diferentes concentraciones del derivado obtenido frente al MTT.

En este estudio se pudo observar una marcada disminución de la viabilidad

celular con el aumento de las concentraciones del derivado obtenido (figura 7A). Este

comportamiento no se detectó cuando se trató a las células con concentraciones

crecientes de polisacárido sin derivatizar (figura 7B). El polisacárido sin activar no sólo

no presentó efectos citotóxicos, sino que por el contrario, parece haber estimulado

significativamente la actividad enzimática de las células al ser tratadas con altas

concentraciones del compuesto.


‐ 190 ‐

Por otro lado, se observó que a muy bajas concentraciones del derivado

obtenido (7 a 14 µg/ml, figura 7A), parece haber una estimulación de la actividad

enzimática celular, sin embardo esta estimulación no resultó significativa.

Figura 7: Efecto citotóxico del paramilon derivatizado (A) y sin derivatizar (B)

sobre células Vero (pг0,05).

A partir de los datos de viabilidad obtenidos por tratamiento de las células Vero

con el derivado obtenido, y mediante regresión lineal (figura 8) surge que la

concentración citotóxica 50 (CC50) para este derivado es de 400 µg/ml. También se

estimó la concentración que permitió una supervivencia del 80% o superior de las

células Vero. La concentración citotóxica 20 (CC20) fue de 108 µg/ml. Para este análisis

0,000 3,7 7,5 15 30 60 120 230 4600

100

200

300

400

500 *

B


% Viabilidad

0 7 14 29 58 115 230 460 9200

50

100

150

*

A


% V

iabi

lidad


‐ 191 ‐

no se consideraron los valores en los que hubo estimulación de las células ya que no

resultaron significativos (datos no incluidos en la regresión lineal).

Figura 8: Regresión lineal de la viabilidad de las células Vero en función de las

diferentes concentraciones del derivado obtenido.

Considerando los valores de citotoxicidad obtenidos, se procedió a valorar el

efecto de uno de estos compuestos, el paramilon derivatizado, sobre la multiplicación

viral, utilizando un rango de concentraciones similar o menor a la CC20 para asegurar

por lo menos un 80% de viabilidad celular.

4.1.2 Evaluación de la actividad antiviral del derivado obtenido.

4.1.2.1 Ensayo de inhibición del rendimiento viral.

En este ensayo se infectaron células Vero con HSV‐1 y luego de una hora de

adsorción del inóculo viral, los cultivos se cubrieron con medio de cultivo conteniendo

distintas concentraciones del derivado. A las 72 horas post‐infección se cuantificó el

rendimiento viral. Los títulos infecciosos obtenidos por recuento de placas de lisis de

los sobrenadantesse muestran en la figura 9.

0 200 400 600 800 10000

25

50

75

100

125

y = ‐0,103 x + 91,17R2 = 0,906


% Viabilidad


‐ 192 ‐

Figura 9: Respuesta del rendimiento viral a diferentes dosis del derivado obtenido. Los resultados se expresan como título del virus liberado al sobrenadante (* significancia respecto del control,

** significancia respecto de 7 µg/ml de paramilon derivatizado, en ambos casos pг0,05).

La figura 10 muestra el porcentaje de inhibición del rendimiento viral, tomando

como un 100 % de rendimiento, al título obtenido de los controles. Si bien se

observaron diferencias estadísticamente significativas a partir de los 7 µg/ml del

compuesto respecto de los controles, los resultados obtenidos indicarían que el HSV‐1

muestra una moderada susceptibilidad al compuesto si se lo adiciona luego de la

adsorción del virus a las células. Si bien con una concentración de 7 µg/ml se observó

un 70% de inhibición, con concentraciones mayores se detectó un menor grado de

inhibición (figura 10).

Figura 10: Porcentaje de inhibición del rendimiento viral respecto de los controles (0% de inhibición). (* significancia respecto del control, ** significancia respecto de 7 µg/ml del

derivado obtenido, en ambos casos pг0,05).

0 3,5 7 14 29 580

500000

1000000

1500000

2000000

*

**


Titu

lo v

iral

(U

FP

/ml)

0 3,5 7 14 29 580

20

40

60

80

100 **

*


% I

nhib

ició

n


‐ 193 ‐

4.1.2.2 Ensayo de reducción del número de placas

En la figura 11 se muestran las placas de lisis obtenidas cuando se incubó en

forma conjunta el virus con diferentes concentraciones del derivado durante la adsorción

como se indica en la sección 3.2.5.3.

Figura 11: Placas de lisis reveladas por tinción con cristal violeta al 1% .

El número de placas de lisis obtenido en función de la concentración del

compuesto en estudio se muestra en la figura 12 A. En ella puede observarse que a bajas

dosis de compuesto la efectividad de la infección descendió pero no significativamente.

En cambio el número de placas se redujo significativamente cuando se utilizaron

concentraciones superiores a los 14 µg/ml. En la figura 12 B se muestra la regresión lineal

del número de placas en función de la concentración del derivado obtenido, mediante

esta regresión se calculó la concentración efectiva 50 (CE50), que es la concentración de

compuesto que puede reducir en un 50% el número de placas respecto de los controles.

La concentración correspondiente a la CE50 fue de 27µg/ml.


‐ 194 ‐

Figura 12: A) Número de placas en función de la dosis del derivado obtenido cuando se incorporó en forma conjunta a las partículas virales durante la etapa

de adsorción (pг0,05). B) regresión lineal.

En la figura 13 se puede observar el efecto dosis‐dependiente del compuesto en

estudio sobre la inhibición del número de placas de lisis. Las diferencias sólo resultaron

significativas respecto de los controles en dosis superiores a los 14 µg/ml.

Figura 13: Porcentaje de inhibición del número de placas virales respecto de los controles (0% de inhibición) cuando se incorporó el derivado obtenido en forma conjunta a las partículas virales (pг0,05).

A B

0 3,5 7 14 29 580

10

20

30

40

*


Núm

ero

de p

laca

s

0 20 40 600

10

20

30

40

y = ‐0,4x + 25,68R2 = 0,879


Núm

ero

de p

laca

s

0 3,5 7 14 29 580

20

40

60

80

100 *


% I

nhib

ició

n


‐ 195 ‐

En la figura 14 A se muestran los resultados obtenidos en función de la

concentración del compuesto en estudio, cuando estuvo presente tanto durante la

adsorción como durante la etapa de internalización y replicación (en el medio de

plaqueo). En esta figura puede observarse que a bajas dosis la efectividad de la infección

descendió aunque no resultó significativo. Las diferencias significativas respecto de los

controles se observan a partir de la incubación con 14 µg/ml o concentraciones de

compuesto superiores, de manera similar a lo que ocurrió cuando se incubó a las células

con el compuesto en estudio sólo durante la adsorción viral. En la figura 14 B se muestra

la regresión lineal del número de placas en función de la concentración del derivado

obtenido. Con esta regresión se calculó la concentración efectiva 50 (CE50) que fue de 34

µg/ml.

Figura 14: A) Número de placas de lisis en función de la dosis del derivado obtenido cuando se incorporó en forma conjunta a las partículas virales durante la etapa de

adsorción y en el medio de plaqueo (pг0,05). B) regresión lineal.

A B

0 3,5 7 14 29 580

10

20

30

*


Núm

ero

de p

laca

s

0 20 40 600

5

10

15

20

25

y = ‐0,196x + 16,68R2 = 0,799


Núm

ero

de p

laca

s


‐ 196 ‐

En la figura 15 se puede observar el efecto dosis‐dependiente del compuesto en

estudio sobre la inhibición del número de placas de lisis. Nuevamente se observa un

efecto dosis dependiente con diferencias significativas respecto a los controles a partir de

la incubación con 14 µg/ml o superiores.

Figura 15: Porcentaje de inhibición del número de placas respecto de los controles (0% de inhibición) cuando se incorporó el derivado obtenido en forma conjunta a las partículas virales y en el medio de plaqueo (pг0,05).

En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos en función de la

concentración del compuesto en estudio cuando éste se incorporó sólo en el medio de

plaqueo. En este caso no se observó una reducción significativa en el número de placas

dentro del rango de concentraciones de compuesto ensayadas. En la figura 17 se

muestra la regresión lineal del número de placas en función de la concentración del

derivado. En todos los casos se detectó una reducción del número de placas inferior a

50% respecto a los controles.

Figura 16: Número de placas en función de la dosis del derivado obtenido cuando se incorporó en el medio de plaqueo (pг0,05).

0 3,5 7 14 29 580

20

40

60

80

100

*


% I

nhib

ició

n

0 3,5 7 14 29 580

10

20

30


Núm

ero

de p

laca

s


‐ 197 ‐

Figura 17: Regresión lineal del número de placas en función de la dosis de derivado cuando se incorporó en el medio de plaqueo.

En los resultados mostrados en la figura 18 no se evidencia un efecto inhibitorio

dosis‐dependiente sobre el número de placas de lisis, a diferencia de los ensayos en los

cuales el compuesto en estudio se incorporó en la etapa de adsorción.

Figura 18: Porcentaje de inhibición del número de placas respecto de los controles (0% de inhibición) cuando se incorporó el derivado sólo en el medio de plaqueo (pг0,05).

A continuación se resumen los resultados obtenidos en los ensayos de reducción

del número de placas. La tabla 2 muestra los valores de la CC50, de la CE50 y del índice de

selectividad (IS) para cada ensayo (CC50/CE50). El mayor índice de selectividad se obtuvo

cuando se incubó el polisacárido derivarizado junto con las partículas virales durante la

0 3,5 7 14 29 580

20

40

60

80

100


% I

nhib

ició

n

0 20 40 600

10

20

30y = ‐0,091x + 17,78

R2 = 0,56


Núm

ero

de p

laca

s


‐ 198 ‐

etapa de adsorción. La presencia del compuesto luego de la adsorción no afectó la

multiplicación viral.

+/‐ +/+ ‐/+

CC50 400µg/ml

CE50 27µg/ml 34µg/ml >58 µg/ml

IS 14,8 11,7 inactivo

Tabla 2: Concentraciones citotóxica 50 (CC50) y efectiva 50 (CE50) del derivado obtenido e índices de selectividad (IS) cuando se adicionó el derivado en forma conjunta a las partículas virales

durante la etapa de adsorción solamente (+/‐), cuando se lo adicionó durante la adsorción y en el medio de plaqueo (+/+) y cuando se lo adicionó sólo en el medio de plaqueo (‐/+).

Dados los valores de CE50 e IS observados se puede afirmar que el producto

obtenido en este trabajo es capaz de inhibir la adsorción de HSV‐1 de manera

competitiva in vitro. Esta inhibición suponemos que podría lograrse por dos posibles

mecanismos.

1. Dado que durante el ciclo de multiplicación de HSV‐1, una glicoproteína de la

envoltura viral se une a residuos heparán sulfato de la superficie celular

promoviendo la penetración viral por fusión de esta envoltura con la

membrana plasmática, es posible que si nuestro derivado incorporó grupos

sulfatos, compita con esos residuos de la superficie celular. Sin embargo, al no

haber analizado si efectivamente el derivado obtenido incorporó el sulfato, no

podemos afirmar nada al respecto.

2. También podría ocurrir que durante el proceso de derivatización se haya

reducido el peso molecular del polisacárido de 270000 (Tamura et al., 2009) a

valores mucho menores y que éstos posean actividad antiherpética. Existen

citas en la bibliografía sobre polisacáridos neutros de pesos moleculares entre

140 y 23700 con actividad antiherpética (HSV‐2) con índices de selectividad

entre 3 y 42 (Dong et al., 2012).

Tabla con formato


‐ 199 ‐

Queda claro que se necesitaría una mayor cantidad de estudios para definir el

mecanismo de acción de este compuesto y una vez que se conozca, se podrían

hacer combinaciones con otros antivirales aprobados en clínica, a fin de establecer

la existencia o no de sinergismo.


‐ 200 ‐


‐ 201 ‐

5. CONCLUSIONES


‐ 202 ‐


‐ 203 ‐

En este estudio se realizó una descripción de la actividad antiviral frente al virus

Herpes simplex tipo 1 del paramilon, compuesto aislado de una fuente natural, con

reportes previos de este tipo de actividad frente al HIV. A partir de los ensayos

realizados se propone que el derivado obtenido es capaz de inhibir la adsorción del

Herpes virus in vitro, dado que su IS fue mayor de 10, condición necesaria para ser

considerada con potencial antiviral.

Mediante la derivatización se obtuvo un producto bioactivo, pero con una pérdida

del 80% de la masa inicial por lo que resultaría útil también, que se lleven a cabo

estudios de relación estructura‐actividad para producir compuestos que además de

tener los parámetros deseados (CC50, CE50 e IS), muestren una interesante razón costo‐

beneficio. Por otro lado, logrado esto último, será importante también estudiar el

mecanismo de acción de este compuesto, con potencial valor biotecnológico.


‐ 204 ‐

SecciónIIISuplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus

Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.

‐ 207 ‐

1. INTRODUCCIÓN


‐ 208 ‐


‐ 209 ‐

1.1 Cherax quadricarinatus y su cultivo.

Cherax quadricarinatus (VON MARTENS) (Artropoda: Crustacea: Decapoda:

Parastacidae, Brusca & Brusca, 1990) es una langosta de agua dulce nativa del norte de

Australia conocida popularmente como “red claw” debido a la presencia de una

mancha roja (red patch) en la cara externa de las quelas de los machos (Figura 1). Se

trata de una especie que presenta características que la hacen propicia para el cultivo.

Presenta un rápido crecimiento, tolera altas temperaturas y bajas concentraciones de

oxigeno disuelto y se la puede cultivar a densidades relativamente altas en

comparación con otras especies del mismo género (Morrissy, 1990). Actualmente el

cultivo de esta especie se ha extendido hacia varios países de Sudamérica (Ecuador,

Argentina y Uruguay, entre otros, García‐Guerrero et al., 2003). En Argentina, su

cultivo ha sido introducido con explotaciones a baja y mediana escala en las provincias

con clima cálido (como Corrientes, Misiones, Chaco, Formosa, Salta, Tucumán y

Santiago del Estero), mientras que en aquellas de clima templado (como Santa Fe,

Córdoba, Entre Ríos y Buenos Aires) no ha prosperado debido a las bajas temperaturas

de otoño e invierno, resultando desfavorables para el cultivo de la especie

(Luchini, 2004).

Figura 1: Ejemplar macho de C. quadricarinatus en el que se puede observar la mancha roja o “red patch” en sus quelas. Disponible en http://www.ittiofauna.org

http://www.ittiofauna.org/


‐ 210 ‐

Entre las características más importantes que hacen de C. quadricarinatus una

especie cultivable (Jones, 1990) se destaca su rápido crecimiento anual que le permite

alcanzar la talla comercial (50 a 100 g) en aproximadamente 6 a 8 meses. Presenta un

alto rendimiento de carne útil, con un elevado porcentaje del cuerpo comestible,

concentrado en la cola (abdomen) y quelas (Thompson et al., 2004). En condiciones

favorables de cultivo, alcanza la madurez sexual en el primer año de vida. Su capacidad

reproductiva es relativamente alta dado que una hembra puede presentar múltiples

desoves durante los meses más cálidos del año, consiguiendo una producción de hasta

tres ó cuatro camadas por hembra por año. La fecundación es elevada comparada con

otros crustáceos de la misma familia; cada hembra produce entre 100 a 1000 huevos

por desove, dependiendo de su talla, edad y estado sanitario (Sagi et al., 1996, Tropea

et al., 2012). En general, los primeros desoves en las hembras jóvenes son de unas

pocas decenas de huevos, incrementándose el tamaño del desove con el tamaño de la

hembra, aunque la frecuencia de desoves tiende a disminuir con la edad (Tropea et

al., 2012). La incubación de los huevos puede comprender de 4 a 8 semanas,

dependiendo de la temperatura del agua de cultivo (a menor temperatura mayor

tiempo de incubación).

Otra ventaja de la especie es su desarrollo directo, donde el estadio larval

ocurre enteramente dentro del huevo. Al eclosionar nace el primer juvenil (semejante

morfológicamente al adulto, pero sin madurez sexual). Posteriormente a la eclosión,

los juveniles reciben cuidado parental durante los primeros 10 a 15 días por parte de la

hembra, hecho que minimiza las pérdidas por predación durante este período.

Comparada con otras especies del mismo género, C. quadricarinatus posee baja

agresividad, aunque puede observarse canibalismo desde sus primeras fases de vida,

particularmente si hay superpoblación o escasez de recursos (Masser & Rouse, 1997;

Jones & Ruscoe, 2001; Barki et al., 2006; Viau & Rodríguez, 2010, entre otros).

Presenta un hábito alimentario omnívoro‐detritívoro, esto hace que, bajo condiciones

de cultivo, la especie acepte rápidamente una amplia variedad de alimentos (Loya‐

Javellana et al., 1994; Jones, 1995; Campaña‐Torres et al., 2006). Existe una tendencia

hacia el suministro de alimentos formulados de alta calidad nutricional (Cortés‐Jacinto


‐ 211 ‐

et al., 2003; Thompson et al., 2005; Campaña‐Torres et al., 2006; Gutiérrez &

Rodríguez, 2010, entre otros), que llevan al productor a incluir dietas generalmente

diseñadas para peces o camarones. Actualmente, algunos investigadores se

encuentran analizando el potencial de los biofilms naturales como fuente alternativa

de alimentación, y agente regulador de la calidad del agua de cultivo, con el fin de

disminuir los costos operacionales generados por las costosas dietas balanceadas

(Jones & Thanuthong, 2002; Viau et al., 2012).

No se han encontrado enfermedades potencialmente serias para el cultivo de

la especie, al menos en nuestro país (Luchini, 2004). Los agentes causantes de

enfermedad que se han encontrado para C. quadricarinatus se muestran en la tabla 1.

Estos organismos han sido implicados en algún momento en episodios de mortalidad o

de escasa producción del cultivo de la especie. Sin embargo, se ha demostrado que no

tienen impacto sobre el ser humano.


‐ 212 ‐

Agente de enfermedad Tipo Síntomas Medidas Cita

Rickettsia sp. Bacteria

Letargo, alimentación escasa y baja tasa de

crecimiento. Mortalidad significativa.

Descarte del stock y

esterilización de los

estanques.

Tan y Owens, 2000; Romero et al., 2000

Coxiella cheraxi Bacteria

Afecta principalmente branquias, aunque el

hepatopáncreas también se ve afectado.

Sin medidas concretas.

Tan y Owens,

2000

Psorospermium sp.

Ictiofonida (Opistokonta)

Afecta las branquias, tejido conectivo y neural;

membranas de ovario, músculo cardíaco y

esquelético. Sin patología.


Herbert, 1987; Edgerton y Owens, 1999

Thelohania sp. Microsporidia Músculo abdominal opaco, de baja prevalencia, pero

alta mortalidad.

Poco común, sin medidas concretas.

Herbert, 1987 y 1988

Virus baciliforme de Cherax

quadricarinatus (CqBV)

Virus

Prevalencia alta, pero baja patogenicidad; asociado a animales aletargados y

moribundos.


Anderson y Prior, 1992;

Edgerton, 1996

Cherax quadricarinatus

parvovirus Virus

Animales moribundos, exoesqueletos suaves. De baja prevalencia pero alta

mortalidad.


Bowater et al., 2002

Cherax quadricarinatus reovirus‐like

(CqRV)

Virus Baja mortalidad.

Infecciones relativamente benignas.


Edgerton et al., 2000

Cherax quadricarinatus

Totivirus‐like (CGV)

Virus Más prevalente en juveniles, con baja

mortalidad.


Edgerton et al., 1994; Poulos et

al., 2006

Virus del síndrome de

mancha blanca (WSSV)

Virus

Depósitos anormales de calcio en la epidermis cuticular (manchas

blancas)

Sin medidas concretas

Shi et al., 2000; Wang et al.,

2012

Tabla 1: Organismos identificados causantes de enfermedades en C. quadricarinatus. (www.fao.org; Longshaw 2011)

http://www.fao.org/


‐ 213 ‐

En todos los casos, los riesgos de transmisión de estas enfermedades se

minimizan mediante la vigilancia de la salud de las langostas por parte de los

productores, así como la eventual puesta en cuarentena de los animales afectados.

1.2 Los polisacáridos como fuente de inmunoestimulación.

Una amplia variedad de polisacáridos obtenidos a partir de una gran variedad

de fuentes, tienen la capacidad de estimular el sistema inmunológico, por lo que se

comportan como inmunomoduladores. El interés en los glucanos se ha incrementado

después de los experimentos llevados a cabo con Zymosan, un glucano con repetición

de unidades de glucosa unidas por enlaces β‐1,3 que se prepara a partir de la pared

celular de levaduras y que estimula los macrófagos a través de la activación del sistema

del complemento (Fitzpatrick y & Di Carlo, 1964). Farmacológicamente, este tipo de

compuestos se clasifican como modificadores de la respuesta biológica y diferentes

parámetros físico‐químicos, como la solubilidad, la estructura primaria, el peso

molecular, las ramificaciones y la carga del polímero influyen en su actividad (Bohn y

Be Miller, 1995).

Los estudios originales sobre los efectos de los β‐1,3‐glucanos sobre el

sistema inmunológico se han centrado en ratones (Suzuki et al., 1990; Kournikakis et

al., 2003; Vetvicka y Sima, 2004). Pero estudios posteriores demostraron que los β‐1,3‐

glucanos tienen una fuerte actividad inmunoestimulante en una amplia variedad de

otros organismos, incluyendo las lombrices de tierra (Beschin et al., 1998), camarones

(Duvic y Söderhäll, 1990), peces (Anderson,1992), ratas (Feletti et al., 1992), conejos

(Kennedy et al., 1995), coballos (Drandarska et al., 2005), ovinos (Waller y Colditz,

1999), cerdos (Hiss et al., 2003) y humanos (Kougias et al., 2001). En base a estos

resultados Soltanian et al. (2009) propone que los β‐1,3‐glucanos representan un tipo

de inmunoestimulante que es activo a través del espectro evolutivo y, probablemente,

esto represente una respuesta inmune innata altamente conservada contra patógenos

fúngicos.

Los crustáceos no poseen un sistema inmunitario específico ni con capacidad

de memoria (Berger, 2000), lo que impide el uso de vacunas en cultivo. Por este


‐ 214 ‐

motivo, el empleo de inmunoestimulantes como agentes preventivos es en la

actualidad materia de investigación y tiene como fin determinar los mecanismos de

acción involucrados así como cuantificar sus efectos.

1.4 El sistema inmune de los crustáceos.

En la respuesta inmune de los crustáceos se distinguen efectores celulares y

humorales, que actúan en conjunto para eliminar los agentes extraños. A pesar de la

ausencia de un sistema inmune adaptativo basado en linfocitos y anticuerpos, los

invertebrados han desarrollado una amplia variedad de mecanismos de defensa que

les permite utilizar sus vías innatas, cruciales como primera línea de defensa y

altamente eficaces para protegerse de patógenos invasores (Vetvika et al., 2004).

Recientemente, datos experimentales sobre estos mecanismos en invertebrados

indicarían que la experiencia pasada con patógenos puede proporcionar individuos o

descendientes con una inmunidad mejorada (Kurtz, 2005). Esto proporcionaría

evidencia de que la especificidad y la memoria podrían existir en algunos

invertebrados, aunque faltan estudios que lo confirmen.

La inmunidad innata se creía que producía respuestas inmunes no específicas

caracterizadas por eventos de fagocitosis, pero luego se demostró que tiene una

especificidad considerable y que es capaz de distinguir lo propio de los extraño. El

sistema inmune innato reconoce lo extraño a través de una serie de proteínas de

reconocimiento de patrones (PRPs), altamente conservados a lo largo de la evolución

(Janeway, 1992; Hoffmann et al., 1999; Janeway y Medzhitov, 2002). Estos receptores

reconocen moléculas conservadas del metabolismo microbiano producidas por

microorganismos patógenos y que el anfitrión no produce. Este reconocimiento

permite que el sistema inmunológico pueda distinguir células infecciosas no propias de

las células propias. Las estructuras moleculares reconocidas por estos receptores son

llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Estos patrones no se

encuentran en los metazoos y se cree que son esenciales para la supervivencia de los

patógenos microbianos. Los ejemplos más conocidos de PAMPs son los

lipopolisacáridos bacterianos (LPS), los peptidoglicanos (PG), los ácidos lipoteicoicos,


‐ 215 ‐

los mananos, el ADN bacteriano, el ARN de doble cadena y los β‐glucano de hongos

(Medzhitov y Janeway, 2000). El reconocimiento de estas estructuras provoca

respuestas diseñadas para proteger al huésped del patógeno invasor, y forman parte

del sistema inmune innato en todos los organismos superiores (Brown y Gordon,

2003). En los vertebrados, el reconocimiento y la respuesta a estas estructuras tienen

lugar en receptores de la superficie celular, mientras que en los invertebrados tiene

lugar principalmente en la hemolinfa (Brown y Gordon, 2005).

1.4.1 Proteínas de reconocimiento de β‐glucanos y vías de activación.

En los vertebrados, aunque la opsonización contribuye al reconocimiento de las

partículas de β‐glucanos, no se han identificado moléculas en el plasma involucradas

en su reconocimiento (Brown y Gordon, 2005). Por el contrario, en los invertebrados el

reconocimiento de estos carbohidratos parece ocurrir principalmente en la hemolinfa

gracias a una serie de proteínas. Sólo un receptor celular se ha demostrado que

reconoce los β‐glucanos en los invertebrados, el receptor scavenger de Drosophila

(dSRCI) (Soltanian et al., 2009). A pesar de estas diferencias, el reconocimiento de los

β‐glucanos en ambos sistemas tiene por resultado el desencadenamiento de la

respuesta inmune, actuando principalmente en el control de hongos patógenos.

Las dos familias de proteínas de reconocimiento mejor caracterizadas en

invertebrados son las de unión a peptidoglicanos (PGBPs) y las de unión a β‐glucanos

(βGBPs) (Chen et al., 2004; Goncalves et al., 2012). Éstas contienen un dominio similar

a las β‐glucanasas bacterianas, pero carecen de actividad enzimática, debido a una

serie de sustituciones de aminoácidos en el sitio activo (Royet, 2004). La mayoría de

ellas se segregan en la hemolinfa, pero al menos una puede estar unida a membranas

a través de un anclaje vía glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Kim et al., 2000). La expresión

de algunas de estas proteínas puede ser inducida tras la infección con bacterias o

levaduras (Jiang et al., 2004). A pesar de que estas proteínas fueron relacionadas con

una variedad de respuestas inmunes en invertebrados, incluyendo la activación de las

cascadas de profenoloxidasas (proPO) y la producción de péptidos anti‐microbianos

(Ferrandon et al., 2004; Royet, 2004), el mecanismo por el cual la unión de los β‐


‐ 216 ‐

glucano provoca tales respuestas es aún desconocido. Las proteínas receptoras de

peptidoglicanos son las principales implicadas en su reconocimiento, pero dos PGBPs

del plasma de Holotrichia diomphalia (Hd‐PGRP‐1 y Hd‐PGRP‐2) han demostrado ser

capaces también de reconocer a los β‐glucano (Brown et al., 2005). Hd‐PGRP‐1 es

capaz de inducir la cascada profenoloxidasa en presencia de β‐glucano, lo que sugiere

que puede jugar un papel directo en la respuesta inmune frente a una infección con

hongos (Lee et al., 2004). Otra proteína de reconocimiento presente en la hemolinfa

de los cangrejos cacerola es el factor G, un heterodímero compuesto de dos

subunidades, que responde específicamente a β‐glucano (Muta et al., 1995). La

subunidad α contiene dominios similares a glucanasas bacterianas y proteínas de

unión a carbohidratos e interviene en el reconocimiento de los β‐glucanos; mientras

que la subunidad β es un zimógeno de proteasa (Takaki et al., 2002). En respuesta a los

β‐glucano, el factor G se activa al someterse a proteolisis autocatalítica y se inicia la

activación de la cascada de coagulación (Muta et al., 1995).

Varias proteínas de unión a glucanos han sido identificadas en los artrópodos, y

su actividad usualmente es la activación de la cascada ProPO. Algunas de las βGBPs

aisladas son capaces de unir tanto glucanos lineales como ramificados (Lee et al.,

2000); mientras que otras sólo unen glucanos ramificados con enlaces 1,6 (Fabrick et

al., 2004). Estas βGBPs se encuentran comúnmente en los crustáceos; por lo general

tienen tamaños de aproximadamente 100 kDa, y además unen glucanos, bacterias y

hemocitos actuando como opsoninas (Cerenius et al., 1994).

Los β‐glucanos pueden inducir todos los mecanismos inmunes anti‐microbianos

de los invertebrados, incluyendo la fagocitosis, la nodulación y encapsulación y la

síntesis de péptidos antimicrobianos (AMPs) (Brennan y Anderson, 2004; Brown y

Gordon, 2005). La mayoría de estas respuestas se basan en cascadas proteolíticas que

conducen a la melanización, la coagulación de la sangre, la liberación de péptidos

antimicrobianos y proteínas responsables de estrés que se cree que participan en la

opsonización y en el secuestro de hierro (Jiravanichpaisal et al., 2006).


‐ 217 ‐

1.4.2 Hemocitos: efectores de la respuesta.

Las células circulantes de los invertebrados se llaman hemocitos y su rol más

importante es la protección de los animales contra los microorganismos

potencialmente infecciosos. Ellos participan en el reconocimiento, la fagocitosis, la

citotoxicidad y la melanización (Söderhäll y Cerenius, 1992; Tzou et al., 2002; Cerenius

y Söderhäll, 2004). Las células implicadas en la respuesta inmune derivan de células

hematopoyéticas indiferenciadas (HPC) y se cree que se diferencian en los diversos

linajes celulares bajo la influencia de diferentes factores (Jiravanichpaisal et al., 2006).

En los crustáceos las reacciones inmunes celulares involucran tres tipos de hemocitos

circulantes: las células hialinas (HC), las semigranulosas (SGC) y las granulosas (GC)

(Johansson et al., 2000). Esta clasificación se basa principalmente en la morfología. Los

hemocitos hialinos son pequeños, esféricos y no contienen gránulos o tienen pocos y

son capaces de fagocitar (Smith y Söderhäll, 1983; Raa, 1996). Los hemocitos

semigranulosos tienen número variable de pequeños gránulos eosinófilos que

encierran el sistema de activación de ProPO, una serie de enzimas que se activan

mediante proteólisis (Vázquez et al., 1998). Ellos son responsables de la encapsulación

y tienen participación limitada en la fagocitosis. Los hemocitos granulosos poseen

grandes gránulos eosinófilos en gran cantidad, son las células que tienen la principal

reserva del sistema ProPO y carecen de función fagocítica (Smith y Söderhäll, 1983;

Persson et al., 1987). Ambos, GC y SGC, pueden participar de eventos de degranulación

frente a moléculas extrañas tales como lipopolisacáridos o β‐glucanos. Los SGC son el

primer tipo de hemocitos que reacciona ante partículas extrañas in vivo y responden

mediante degranulación liberando el sistema ProPO al plasma (Johansson et al., 2000).

El número de hemocitos circulantes puede ser afectado por diversos factores.

En los crustáceos y otros invertebrados, los hemocitos se reducen durante la infección

por microorganismos. En cambio no disminuyen durante una infección por virus

(Jiravanichpaisal et al., 2001). En los cangrejos de río la inyección de β‐1,3‐glucanos

reduce rápidamente el número de hemocitos, pero este evento es seguido por una

lenta recuperación hasta alcanzar su nivel normal luego de 4‐6 hs (Smith y Sörderhäll,

1983). La pérdida de hemocitos circulantes después de la inyección con β‐1,3‐glucanos


‐ 218 ‐

podría deberse a la agregación de células, indicando un papel importante en la defensa

del organismo.

Las respuestas principales de defensa, con la participación de hemocitos frente

a PAMPs son: la fagocitosis, la nodulación y la encapsulación, aunque los hemocitos

también responden frente a lesiones externas participando en la reacción de

coagulación.

a‐ Fagocitosis: Se trata de una respuesta celular primaria frente a pequeñas

partículas como bacterias, levaduras y células apoptóticas, que está ampliamente

conservada (Sörderhäll y Sörderhäll, 2001). Constituye la primera línea de defensa

inmunitaria cuando una partícula atraviesa la primera barrera de defensa que

constituye la cutícula (Söderhäll y Cerenius, 1992). La fagocitosis se inicia mediante el

reconocimiento y unión de una partícula a la célula fagocítica, seguido por la absorción

a través de la modificación del citoesqueleto y el transporte vesicular intracelular hacia

los fagosomas donde se destruye aquello que se envolvió. El reconocimiento de la

partícula diana puede ser directo, por la unión de receptores a la superficie del

objetivo o por opsonización mediada a través de factores que marcan a la partícula

para la ulterior fagocitosis (Bayne, 1990).

La fagocitosis ha sido poco estudiada en los crustáceos decápodos. Sin

embargo, dos proteínas multi‐funcionales han sido aisladas, purificadas y

caracterizadas a partir de hemocitos del cangrejo de agua dulce Pacifastacus.

leniusculus (Johansson et al., 1999; Huang et al., 2000). Ambas desempeñan un papel

como proteínas inmunes innatas y poseen actividades de adhesión celular y

opsonización. En otros crustáceos decápodos, como los camarones peneidos, la

eliminación de material extraño del hemocele involucra a células fagocíticas fijas. Se

sabe que proteínas y posiblemente virus menores a 30 nm de diámetro, pueden ser

retirados por los podocitos branquiales, que son células especializadas situadas en las

branquias (Rodríguez, 1996). Los hemocitos, es decir, las células libres en suspensión

en la hemolinfa son los más abundantes y comunes entre las células fagocíticas. Sin

embargo, los fagocitos fijos son muy importantes en la eliminación de algunas


‐ 219 ‐

sustancias. Estas células se encuentran en las superficies de arteriolas y en los espacios

hemales del hepatopáncreas (Johnson, 1987).

b‐ Nodulación y encapsulación: La encapsulación o nodulación es una

respuesta inmune celular que se limita a la defensa contra cuerpos extraños

demasiado grandes como para ser fagocitados por los hemocitos de manera individual

(Vázquez et al., 1998). El término nodulación se refiere a la formación de agregados

multicelulares hemocíticos, que atrapan, por ejemplo, un gran número de bacterias en

un determinado espacio extracelular. Como los agregados pueden adherirse a los

tejidos o a nódulos más grandes pueden eventualmente ser encapsulados (Lackie,

1988). A diferencia de la fagocitosis, la nodulación y la encapsulación tienen por

resultado la formación de multicapas de hemocitos alrededor del organismo invasor.

Estos procesos se acompañan de la melanización a través de la actividad fenoloxidasa

(Söderhäll y Cerenius, 1992), que le confiere colores oscuros a las cápsulas y dentro de

las cuales finalmente el parásito muere. Se han sugerido varios factores como agentes

responsables de la muerte de los parásitos dentro de estas cápsulas incluyendo la

asfixia, la producción local de quinonas citotóxicas a través de la cascada de activación

del sistema ProPO, la producción local de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y

la producción de péptidos antibacterianos (Gillespie et al., 1997; Nappi et al., 1995;

2000).

1.4.3 Sistema de activación profenoloxidasa (ProPO).

En los invertebrados, las lesiones mecánicas o la presencia de objetos extraños

como parásitos y microorganismos tienen como resultado la deposición de melanina

en el tejido dañado o en el organismo intruso. La melanina físicamente aísla al

organismo extraño y por lo tanto previene la infección por retardar su crecimiento.

Pero quizás aún más importante es que, durante la formación de melanina, se originan

quinonas intermediarias altamente reactivas y tóxicas. La forma activa de la enzima

fenoloxidasa (PO) es la responsable de estas actividades. La activación de esta enzima

está cuidadosamente regulada y es provocada por el sistema de activación ProPO que

se compone de proteínas capaces de unirse a polisacáridos y a otros compuestos


‐ 220 ‐

asociados con microorganismos. El sistema ProPO está presente en muchos grupos de

invertebrados y consta de varias proteínas que están implicadas en la melanización, las

reacciones citotóxicas, la encapsulación y adhesión celular y la fagocitosis (Söderhäll et

al., 1994; Vázquez et al., 1998; Cannon et al., 2004).

La activación y la regulación del sistema ProPO han sido parcialmente

elucidados en crustáceos (principalmente en cangrejos de agua dulce y en camarones)

así como en varios insectos, mediante estudios bioquímicos y el uso de proteínas

recombinantes (Sung et al., 1994, 1996; Kwon et al., 2000; Wang et al., 2001 (a); Lee et

al., 2002; Kim et al., 2002; Jiang et al., 2003; Ji et al., 2003; Yu et al., 2003). Este

sistema se desencadena por la presencia de pequeñas cantidades de los componentes

de las paredes celulares microbianas (figura 2), lo que asegura que el sistema se active

en presencia de agentes potencialmente patógenos. El sistema ProPO se compone de

proteínas de reconocimiento de patrones (PRPs) incluyendo proteínas de unión a LPS

(LPSBPs), proteínas de unión a peptidoglicanos (PGBPs), proteínas de unión de β‐1,3

glucano (βGBP), varias serinproteasas y sus zimógenos (Söderhäll y Cerenius, 1992;

Vargas et al., 1996; Vargas y Yepiz, 2000).

Los inhibidores de proteasas, son importantes factores de regulación del

sistema ProPO ya que evitan la activación del sistema si éste no es apropiado (Cerenius

y Söderhäll, 2004).


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Lipopolisacáridos LPSBP

Homologos de serinproteasas

Peptidoglicanos β‐1,3 glucanos

Quinonas Melanina

Cascada Serinproteasa

PGBP βGBP

Proforma de la enzima activadora de profenoloxidasa (pro‐PPA)

Enzima activadora de profenoloxidasa (PPA)

Fenoloxidasa (PO)

Profenoloxidasa (ProPO)

O Fenoles2

Figura 2: Vista general del sistema de activación ProPO de artrópodos (Cerenius y Söderhäll, 2004). El sistema es activado por PRPs que se unen a β‐1,3 glucanos, LPS y PGN (es decir por βGBPs, LPSBPs o PGBPs que pueden ser proteínas separadas o proteínas con varios sitios de unión, dependiendo de la especie y de la proteína) o por factores endógenos producidos después de un daño tisular. Una cascada de serinproteasas, aún no caracterizadas, da como resultado la escisión de una proforma de la enzima activadora de profenoloxidasa (pro‐PPA) en PPA activa (Vargas y Yepiz, 1998). Algunas PPAs requieren homólogos de serinproteasas y algunas PPAs son capaces de escindir ProPO directamente en PO. Finalmente la PO activa oxida compuestos fenólicos y se produce la melanina que protege físicamente al animal del agente extraño. Durante su formación se producen productos intermediarios (quinonas) altamente reactivos y tóxicos.


‐ 222 ‐

1.4.4 El sistema de coagulación.

Una de las principales diferencias entre vertebrados e invertebrados es el

hecho de que los fluidos corporales de los vertebrados se limitan principalmente a los

vasos sanguíneos y linfáticos, mientras que los invertebrados poseen un sistema

circulatorio abierto en el cual la hemolinfa baña los tejidos, denominándose hemocele

a los sitios donde ésta circula. Por lo tanto, luego de una lesión, los invertebrados

(particularmente los crustáceos) se valen de mecanismos eficientes que permiten el

rápido sellado de las heridas de la cutícula previniendo rápidamente la pérdida de

hemolinfa y el ingreso de microorganismos al hemocele (Söderhäll y Cerenius, 1992).

La coagulación de la hemolinfa es una parte importante del sistema inmune innato,

implicando una combinación de factores solubles y derivados celulares (Johansson et

al., 1999; Theopold et al., 2002). En los cangrejos cacerola, el proceso está regulado

por una cascada proteolítica que se activa por elicitores bacterianos a través de

proteínas específicas de reconocimiento. En cambio, en cangrejos de río, la

coagulación se produce a través de la polimerización de una proteína de coagulación

plasmática y es catalizada por una transglutaminasa (TGasa) calcio dependiente (Hall

et al., 1999; Yeh et al., 1999; Wang et al., 2001 (b)).

Actualmente las enfermedades causadas por virus y bacterias siguen siendo un

problema mundial en acuicultura causando pérdidas significativas en la producción,

por lo que su control se vuelve un problema a resolver. En años recientes se han

utilizado diversos inmunoestimulantes para aumentar la resistencia de los camarones

Penaeus monodon y Penaeus vannamei contra bacterias e infecciones virales (Sung et

al., 1994, 1996; Otero et al., 2000; Chang et al., 2003; Cornejo, 2001). Dado que la

especie Cherax quadricarinatus es otra especie de importancia comercial en nuestro

país, en esta sección se presentan los resultados de la evaluación del paramilon como

suplemento alimenticio con potenciales propiedades inmunomoduladoras en este

crustáceo.


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‐ 225 ‐

2.1 Hipótesis

El paramilon producido por Euglena gracilis, por ser un β‐(1→3) glucano, podría

tener efectos sobre los sistemas de defensa en los juveniles tempranos de la

especie con importancia comercial Cherax quadricarinatus, actuando como un

inmunomodulador al ser administrado como suplemento dietario.

2.2 Objetivo General

Evaluar al paramilon como suplemento alimenticio inmunoestimulante en una

especie de importancia comercial, Cherax quadricarinatus.


Analizar las variaciones en el crecimiento de animales alimentados con y sin

paramilon como suplemento inmunoestimulante.

Cuantificar la producción de radicales peróxidos en hemocitos obtenidos de

animales alimentados con y sin paramilon como suplemento inmunoestimulante.

Cuantificar la capacidad antioxidante de los hemocitos obtenidos de animales

alimentados con y sin paramilon como suplemento inmunoestimulante.

Cuantificar las actividades fenoloxidasas libre y en hemocitos obtenidos de

animales alimentados con y sin paramilon como suplemento inmunoestimulante.

Cuantificar el sistema profenoloxidasa en animales alimentados con y sin

paramilon como suplemento inmunoestimulante.


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3.1 Mantenimiento y condiciones de experimentación. Hasta que los juveniles alcanzaron la talla requerida y durante los 30 días de

experimentación se establecieron las siguientes condiciones:

El fotoperiodo se mantuvo en 14:10 (luz:oscuridad) y la temperatura en

27±1 ºC en laboratorio climatizado.

A fin de evitar el canibalismo, durante el periodo de mantenimiento los

estanques se suplementaron con refugios, mientras que durante el

periodo de experimentación los animales se aislaron en recipientes

plásticos pequeños de 500 ml perforados para permitir la libre

circulación de agua.

Los recambios totales de agua (dulce y sin cloro) se realizaron una vez a

la semana durante el periodo de mantenimiento y 3 veces por semana

durante el periodo de experimentación. Para quitarle el cloro al agua se

utilizo un filtro de carbón activado.

Durante el periodo de mantenimiento a los animales se les suministró

alimento balanceado en forma diaria. Durante la experimentación los

juveniles se alimentaron ad limitum con una cantidad equivalente al 5%

de su peso aproximadamente.

3.2 Grupos experimentales

Se utilizaron 10 juveniles tempranos en cada grupo experimental con un peso

promedio de 8 ± 2 g. Los grupos experimentales definidos fueron:

Juveniles alimentados con balanceado no comercial cuyo aporte

proteico se debe principalmente a harina de pescado.

Juveniles alimentados con balanceado no comercial cuyo aporte

proteico se debe principalmente a harina de pescado suplementado con

un 5% de paramilon obtenido de E. gracilis.


‐ 230 ‐

Los ingredientes que componen cada una de las dietas utilizadas en el ensayo

se muestran en la tabla 2, su análisis proximal se muestra en la tabla 3 y en la tabla 4

se expone la composición del suplemento vitamínico mencionado en la tabla 1.

Balanceado Balanceado + Paramilon 5%

Harina de pescado 280 280

Exp. de soja 390 390

Paramilon ‐ 50

Aceite de soja* 60 60

Glutagel 190 140

Bentonita 60 60

Vitafac Super Aqua 20 20

Astaxantina 15 15

Tabla 2: Composición (g/Kg de alimento balanceado) de las dietas utilizadas durante el ensayo (* ml/kg de alimento balanceado).

Balanceado Balanceado + Paramilon 5%

Proteinas 35,19 35,19

Lipidos 11,12 11,12

Carbohidratos 20,84 20,91

Tabla 3: Análisis aproximado de las dietas utilizadas durante el ensayo. Cada componente se indica como porcentaje del total.


‐ 231 ‐

Vitamínico

Liposolubles

Vit A 3000 µI/Kg

Vit D 600 µI/Kg

Vit E (alfa‐tocoferol/antioxidante) 60 mg/Kg

Vit K 5 mg/Kg

Hidrosolubles

Vit C (acido ascorbico) 150 mg/Kg

Vit B1 (tiamina) 10 mg/Kg

Vit B2 (rivoflavina) 10 mg/Kg

Vit B6 (piridoxina) 7 mg/Kg

Vit B12 0,02 mg/Kg

Biotina 0,4 mg/Kg

Acido Pantoténico 35 mg/Kg

Acido Fólico 6 mg/Kg

Niacina 80 mg/Kg

Colina 500 mg/Kg

Inositol 100 mg/Kg

Mineral

Zinc 50 mg/Kg

Magnesio 35 mg/Kg

Manganeso 15 mg/Kg

Hierro 12 mg/Kg

Yodo 3 mg/Kg

Tabla 4: Composición del Vitafac Super Aqua (Roche®) mencionados en la tabla 1.


‐ 232 ‐

3.3 Parametros medidos durante el ensayo

A lo largo del ensayo se midieron las siguientes variables:

Supervivencia, como porcentaje acumulado de individuos muertos en cada grupo

experimental, retirando diariamente a los organismos muertos.

Crecimiento, se determinó el peso de los animales en todos los grupos

experimentales cada semana en una balanza de precisión (± 0,1 mg). A partir del dato

del peso corporal, se calcularon los siguientes parámetros de crecimiento:

Ganancia de peso (GP):

GP (% )= (peso final‐peso inicial) x 100 peso inicial

Tasa especifica de crecimiento diario (TECD):

TECD (% )= ((Ln peso final‐Ln peso inicial)) x 100 tiempo de ensayo

3.3 Parámetros cuantificados al finalizar el ensayo.

3.3.1 Determinación de los efectores de la respuesta inmune

3.3.1.1 Obtención de la hemolinfa

Se colocaron los animales con la cara ventral hacia arriba dejando expuesta la

zona de unión entre cefalotórax y abdomen (seno hemolinfático ventral), luego se

extrajeron en esterilidad 600 µl de hemolinfa de cada animal con una jeringa de

insulina (1 ml) con una aguja hipodérminca de grosor 27G. Para las sucesivas

determinaciones la hemolinfa fue dividida en 5 alícuotas (Figura 3):

Una fracción de 4 µl se utilizó para realizar extendidos.

Otra fracción de 200 µl se suplementó con una solución de oxalacetato al 10%

en proporción 1:10. Se separaron los hemocitos del plasma por centrifugación a


‐ 233 ‐

500 x g durante 20 minutos y a 4 ºC. El plasma fue reservado para la realización

de ensayos de actividad antibacteriana y los hemocitos se resuspendieron en

Buffer Hepes (Composición: Hepes, 30 mM; KCl, 200 mM; MgCl2, 1 mM)

suplementado con una solución de oxalacetato al 10% en proporción 1:10 para

la determinación de la capacidad antioxidante total (TOSC) y la cuantificación

de radicales peróxidos (EROS).

Una tercera fracción de 300 µl se suplementó con una solución de oxalacetato

al 10% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM en proporción 1:10 para

la cuantificación de las actividades ProPO y PO.

En todos los casos en los que la hemolinfa se suplementó con anticoagulante

(oxalacetato), la mezcla se homogeneizó inmediatamente para evitar la

coagulación de la hemolinfa. Las muestras se mantuvieron a 4°C hasta el momento

de las determinaciones a excepción de los 3 µl de los extendidos.

3.3.1.2 Cuantificación de hemocitos

Para llevar a cabo la cuantificación de los diferentes tipos de hemocitos se

utilizó la coloración de Wright‐Giemsa. A partir de 4µl de hemolinfa fresca sin

anticoagulante se realizaron extendidos sobre porta objetos limpios. Estos se dejaron

secar y se fijaron en metanol. Posteriormente se cubrieron con la solución de Wright‐

Giemsa dejando actuar por 2 minutos y se agregó buffer Giordano (fosfato 8,3 mM; pH

7,2) durante otros 2 minutos. Luego los extendidos se aclararon con agua de red y se

lavaron con ácido acético al 5% hasta obtener preparados rosados. Finalmente los

extendidos se cubrieron con medio de montaje anhidro para microscopía (DPX‐Merck)

y se analizaron bajo microscopio óptico con contraste de fase, a 1000X de

magnificación, clasificando a los hemocitos en hialinos, semigranulosos y granulosos.

Las frecuencias relativas de cada uno se estimó sobre un total de 300 células contadas.


‐ 234 ‐

300 µl 600 µl de hemolinfa 200 µl

+ oxalacetato 10% + oxalacetato 10%

+ PMSF 0,1 mM 4 µl

Centrifugación 800 x g Cuantificación de Centrifugación 800 x g

15 min., 4 ºC Hemocitos 15 min., 4 ºC

Hemocitos* Plasma* Hemocitos* Plasma

Lisis Actividad EROS/TOSC Actividad

+ elicitor (SHL) fenoloxidasa antibacteriana

libre

Actividad

Actividad Profenoloxidasa

fenoloxidasa

total

* 20 µl Determinación de proteínas

Figura 3: Marcha general de toma y preparación de las muestras de hemolinfa para las sucesivas determinaciones.


‐ 235 ‐

3.3.1.3 Determinación de Especies reactivas de Oxígeno (EROS).

Para cuantificar las EROS se realizó una curva de calibración con H2O2 en buffer

de reacción. Las muestras se adicionaron con la sonda fluorescente H2DCF‐DA y se

incubaron una hora en oscuridad. Posteriormente se procedió a la lectura con un

lector de fluorescencia a 488 nm de emisión y 525 nm de excitación.

3.3.1.4 Determinación de la capacidad antioxidante frente a radicales

peróxidos.

La capacidad antioxidante total contra radicales peróxidos (TOSC) se evaluó

mediante la determinación de EROS en muestras de hemolinfa de animales tratados y

controles usando un generador de radicales peróxido (modificado de Amado et al.,

2009). Para estas determinaciones, en 6 pocillos de una microplaca de 96 pocillos

blanca se colocaron 30 µl de la suspensión de hemocitos (preparado como se describe

en la Sección 3.3.1.1) y 152 µl de buffer de reacción conteniendo 30 mM de HEPES (pH

7,2), 200 mM KCl y 1 mM MgCl2. En tres de los seis pocillos de cada muestra se

agregaron 10 µl de 2,2'‐azobis 2 dihidrocloruro metilpropionamidina (ABAP; 4 mM). En

los otros tres pocillos se agregó igual volumen de agua mili Q. La placa se incubó en

oscuridad por 5 minutos a 35 °C. A esta temperatura, los radicales peróxidos se

producen por descomposición térmica de ABAP (Winston et al., 1998).

Inmediatamente antes de la lectura de las microplacas, se añadió en todos los pocillos

8 µl de la sonda fluorescente 2',7' diacetato de diclorofluoresceína (H2DCF‐DA) a una

concentración final de 4 mM. La H2DCF‐DA, un compuesto no fluorescente, se escinde

por las esterasas presentes en la muestra y se oxida por las especies reactivas de

oxígeno (EROS) generadas por el ABAP a diclorofluoresceína (DCF), un compuesto

fluorescente que puede ser detectado a 488 nm de emisión y 525 nm de excitación

con un lector de fluorescencia (Figura 4). La descomposición térmica del ABAP y la

formación de EROS y se monitoreó durante 60 minutos, realizando lecturas cada 5

min.


‐ 236 ‐

A) H2DCF‐DA

ABAP

Termólisis (д35°C)

DCF

Acetato (DA) ERO

Fluorescencia

H2DCF DCF‐

B)

Figura 4: A) Diagrama de flujo de la metodología empleada para la medición de la capacidad antioxidante total frente a radicales peróxido, mediante la determinación de esta ERO en ausencia y en presencia de ABAP (2,2'‐azobis 2 dihidrocloruro metilpropionamidina). H2DCF‐DA: 2 ', 7'‐ diacetato de diclorofluoresceína. H2DCF: 2 ', 7'‐diclorofluoresceína. DCF: H2DCF oxidada. B) Resultados de una corrida típica que muestra los registros de fluorescencia con y sin ABAP en función del tiempo.

De acuerdo con los trabajos de Regoli y Winston (1999) y Regoli (2000) los

antioxidantes no enzimáticos de bajo peso molecular (como GSH, ácido ascórbico,

ácido úrico y vitamina E) en general son responsables del 70% de la capacidad

Sin ABAP

Unidades

de Fluorescen

cia

Con ABAP

Tiempo


‐ 237 ‐

antioxidante total frente a radicales peróxidos, por lo que de existir inhibición

enzimática debido a la alta temperatura requerida para la descomposición ABAP en

radicales peróxidos (35 °C), la reducción de la capacidad antioxidante debería ser un

problema menor.

La producción total de fluorescencia se calculó integrando las unidades de

fluorescencia (UF) a lo largo del tiempo de medición, ajustando los datos a una función

polinómica de segundo orden. Los resultados se expresaron como diferencia de área

UF × minuto en la misma muestra, con y sin adición ABAP y normalizados a la zona de

EROS sin ABAP. La diferencia relativa entre las áreas de EROS con y sin ABAP se

consideró como una medida de la capacidad antioxidante. Los cálculos de la capacidad

antioxidante se determinaron como:

Capacidad antioxidante= Área EROS con ABAP‐ Área EROS sin ABAP

Área EROS sin ABAP

3.3.1.4 Obtención de homogenatos de hemocitos.

Los hemocitos separados por centrifugación se sometieron a disrupción celular

mediante 4 pulsos de 5 segundos a 20 Hz de frecuencia, con un sonicador de vástago.

El procedimiento se llevó a cabo en baño de hielo con períodos de 10 segundos entre

pulsos. El homogenato se centrifugó a 4 °C por 20 minutos, a 800 x g.

3.3.1.5 Cuantificación de la actividad Fenoloxidasa (PO) y Profenoloxidasa

(ProPO).

La actividad PO se midió sobre las muestras de hemolinfa de animales tratados

y controles, tanto en plasma (enzima libre), como en los sobrenadantes de los

homogenatos de hemocitos (SHL, preparados como se indica en la sección 3.3.1.5 y

elicitados con tripsina, modificado de Asokan et al., 1997). Las mediciones se

realizaron espectrofotométricamente mediante la detección de la formación de


‐ 238 ‐

dopacromo, detectable a 490 nm, a partir de L‐3,4 dihidroxifenilalanina (L‐DOPA),

usando un lector de placas. La reacción se monitoreó cada 5 minutos durante 15

minutos. Para estas determinaciones, realizadas por triplicado, 50 µl de plasma o SHL

se colocaron en placas de 96 pocillos transparentes. A las muestras de SHL se les

agregaron 50 µl de tripsina (1 mg/ml, elicitor) y todas se llevaron a volumen con Buffer

Hepes (30 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM KCl y 1 mM MgCl2). Las muestras se

incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente y luego se adicionaron 75 µl de L‐

DOPA 5 mM. Para asegurar que la oxidación del reactivo (L‐DOPA) se deba a las

enzimas (PO) plasmáticas y del SHL de C. quadricarinatus, y no a peroxidasas, se

realizaron mediciones de PO en presencia 16 mM de un inhibidor de esta enzima, el 2‐

hidroxi‐2,4,6‐cicloheptatrien‐1‐uno (tropolone).

3.3.1.6 Ensayo de actividad antibactariana del plasma.

La actividad antibacteriana se ensayó utilizando el plasma de muestras de

hemolinfa, de animales tratados y controles, frente a 3 cepas bacterinas: E. coli

(JM109), P. putida (KT2440) y B. subtilis (168). Las cepas bacterianas se mantuvieron

en agar nutritivo (Composición: Extracto de carne, 3gr, peptona 5gr, agar 15 gr, agua

destilada c.s.p. 1000 ml) hasta el momento del ensayo.

Una colonia de cada cepa fue transferida a un medio líquido (caldo nutritivo,

composición: extracto de carne 3gr, peptona 5gr, agua destilada c.s.p. 1000 ml) y se

incubó a 36 °C durante 24 hs. A partir de estos cultivos se realizaron diluciones de los

cultivos en PBS bajo flujo laminar, hasta obtener suspensiones bacterianas equivalente

a 0,5 de la escala de Mc Farland (DO600 para las 3 cepas: 0,05). Se sembraron 10 µl de

cada suspensión en placas con agar Mueller‐Hinton formando un césped bacteriano,

estas siembras se realizaron por triplicado.

Se embebieron discos para antibiogramas estériles con 10 µl de plasma o PBS

(control positivo). Cuando la superficie del agar se secó, se apoyaron sobre ella discos

de antibiograma usando una pinza estéril. Todas las placas se incubaron a 36 °C

durante 24 hs al término de las cuales se observó la formación de halos de inhibición.


‐ 239 ‐

3.3.1.7 Cuantificación de proteínas.

La determinación del contenido proteico tanto en plasma como en hemocitos

de muestras de hemolinfa de animales tratados y controles se realizó por el método de

Bradford (1976) usando seroalbúmina bovina como estándar. Para ello, de cada

muestra u homogenato se utilizaron 3 µl para la determinación espectrofotométrica,

llevándolo a un volumen de 100 µl con agua destilada, agregando 1 ml de reactivo de

Bradford y leyendo la absorbancia a 595nm.


Los datos se expresaron como promedio ± error estándar. Para los gráficos y el

análisis estadístico de los datos se utilizó el programa GraphPad Prism 5. Para

comparar las muestras de hemolinfa, de los animales controles con las de los

alimentados con suplemento de paramilon, se realizó un ANOVA de un factor. En

todos los casos se consideraron significativas las diferencias con p<0,05.


‐ 240 ‐


‐ 241 ‐



‐ 242 ‐


‐ 243 ‐

4.1 Supervivencia y crecimiento

Al cabo del ensayo, sólo se detectó un individuo control muerto, por lo que no

puede afirmarse que hubo diferencias entre la mortalidad de animales tratados y

controles. Respecto del crecimiento de los animales, no se observaron diferencias

entre tratamientos (figura 5). La figura 6 muestra la ganancia de peso evaluada

periódicamente, en ella puede observarse una tendencia no significativa (p出0,05) a

una mayor ganancia de peso en los animales alimentados con el balanceado sin

suplementar. El suplemento con paramilon en el alimento tampoco produjo

diferencias significativas (p出0,05) en cuanto a la ganancia de peso al final del

tratamiento.

Figura 5: Curvas de crecimiento estimadas como peso de animales controles y en los alimentados con 5% de paramilon como suplemento. Los datos están

expresados como media ± SE (n= 10).

Figura 6: Curvas de ganancia de peso en animales controles y en los alimentados con 5% de paramilon como suplemento. Los datos están

expresados como media ± SE (n= 10).

0 10 20 306

7

8

9

10

11

12

Control 5% paramilon

Dias

Pes

o (g

)

0 10 20 300

10

20

30

40


*

Dias

Gan

anci

a de

pes

o (%

)


‐ 244 ‐

Las tasas de crecimiento específico tampoco muestran diferencias significativas

entre animales controles y tratados, aunque todos parecen presentar un incremento

hacia la mitad del tratamiento y luego un descenso (figura 7). Esto también se evidencia

en la ganancia en peso que resultó significativa (p˂0,05) a partir de la segunda semana de

tratamiento respecto de la primera tanto en animales tratados como en los controles

(figura 6).

Figura 7: Tasa de crecimiento específico en animales controles y en los alimentados con parmilon como suplemento. Los datos están expresados

como media ± SE (n= 10).

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


Dias

Tas

a de

cre

cim

ient

oesp

ecífi

co (

%)

Estos resultados ponen en evidencia que la formulación de un alimento

suplementado con paramilon, sin modificar los porcentajes de carbohidratos, lípidos y

proteínas totales de la dieta, no altera el crecimiento de los animales por lo que se puede

asumir que cubre los requerimientos nutricionales de la especie en el estadio de

desarrollo ensayado.

4.2 Efectores de la respuesta inmune.

Puede observarse que en ambos grupos experimentales no hubo diferencias en las

frecuencias relativas de los tipos de hemocitos (Tabla 5).

Tipo de hemocitos Control (% ± DE) Tratados (% ± DE)

Hialinos 29,3 ± 14,5 29,8 ± 13,3 Granulosos 66,5 ± 15,1 66,6 ± 12,4

Semigranulosos 4,2 ± 1,9 6,6 ± 3,3

Tabla 5: Frecuencia de tipos de hemocitos presentes en animales tratados y controles (n=10).


‐ 245 ‐

En la hemolinfa del cangrejo de río, las células hialinas están involucradas

principalmente en la fagocitosis. Las células semigranulares son las activas en la

encapsulación ya que reconocen y responden a partículas extrañas (Johansson y

Söderhäll, 1985). Junto con las células granulosas, las semigranulosas también participan

en la citotoxicidad, el almacenamiento y la liberación del sistema de activación ProPO

(Jackson, 1994; Johansson et al., 2000). En los crustáceos, el número de hemocitos o la

proporción de los diferentes tipos de células se ve afectada por factores tales como el

sexo, el crecimiento, la etapa de la vida, ciclo de muda, el estado nutricional, factores de

estrés y la infección por bacterias (Fotedar et al., 2001). En este estudio se observa que la

adición de glucano no altera el número de hemocitos circulantes, ni su proporción en C.

quadricarinatus.

4.3 Determinación de EROS y actividad antioxidante.

Contro

l

5% p

arami lo

n0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

M H

2O2

Figura 9: Niveles basales de EROS en hemocitos de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento. Los datos se expresan como media ± SE (n = 10).

Control

5% p

aram

ilon

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 *

Are

a re

lativ

a

Figura 10: Capacidad antioxidante total contra los radicales peróxidos en hemocitos de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento. Los datos se expresan como media ± SE (n = 10). Las áreas relativas fueron calculadas como el cociente entre la diferencia de áreas (con y sin ABAP) normalizado al área sin ABAP (área

basal).


‐ 246 ‐

Los niveles basales de EROS no mostraron diferencias significativas entre

tratamientos (figura 9). Sin embargo, el alimento suplementado con un 5% del β‐1,3

glucano provocó una mejora significativa en la capacidad antioxidante de los hemocitos

frente a los radicales peróxidos generados por el ABAP (figura 10).

Se conoce que los β‐glucanos mejoran la actividad de fagocitosis mediante el

aumento de la actividad de una serie de sustancias microbicidas, incluyendo

fenoloxidasas, aniones superóxido, peróxido de hidrógeno, oxígeno singulete y diversas

enzimas lisosomales (Ma et al., 1999; Misra et al., 2004). Sin embargo, en este estudio se

observó que la presencia de este tipo de polisacáridos en la dieta mejora la respuesta

antioxidante de la hemolinfa.

4.4 Sistema profenoloxidasa.

Al analizar las actividades PO libre, total y ProPO, puede verse que, mientras que la

actividad PO en plasma aumentó significativamente (p˂0,05) en los animales alimentados

con paramilon como suplemento (figura 11), la actividad PO total y ProPO parecen

disminuir con el tratamiento (figuras 12 y 13) aunque estas diferencias resultaron no

significativas (p出0,05).

Contro

l

5% pa

ramilo

n

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025 *

DO

490/

mg

prot

eina

s

Figura 11: Actividad PO libre en plasma de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento (p<0.05). Los datos están expresados como media ± SE (n= 10). La actividad fue calculada por diferencia en las pendientes durante la oxidación del L‐DOPA en presencia y ausencia de un inhibidor (TROPOLONE) por mg de proteína.


‐ 247 ‐

Cont ro

l

5% pa

rami lo

n

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

DO

490/

mg

prot

eina

s

Figura 12: Actividad PO total en SHL de Cherax quadricarinatus alimentados con

paramilon como suplemento (p<0.05). Los datos están expresados como media ± SE (n= 10). La actividad fue calculada por diferencia en las pendientes durante la

oxidación del L‐DOPA en presencia de un elicitor (TRIPSINA), en presencia y ausencia de un inhibidor (TROPOLONE) por mg de proteína.

Cont ro

l

5% pa

rami lo

n

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

DO

490/

mg

prot

eina

s

Figura 13: Actividad ProPO en SHL de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento. Los datos están expresados como media ± SE (n= 10). La actividad fue

calculada por diferencia entre la actividad PO total y la actividad PO libre.

Los β‐glucanos están involucrados directamente en la activación de la respuesta

inmune. Una serinproteasa está implicada en la activación del sistema ProPO (Söderhäll,

1983), el cual puede conducir a la producción de melanina, adhesión celular,

encapsulación y fagocitosis cuando es activado por β‐glucanos (Söderhäll, 1983). Las

células granulosas, previamente activadas por este tipo de polisacárido, pueden sufrir una

exocitosis liberando el sistema ProPO a partir de los gránulos, mediante dos proteínas

endógenas que están asociadas a dicho sistema, conocidas como factor de 76 kD y las


‐ 248 ‐

proteínas de unión a β‐1,3‐glucano. Así, los β‐glucanos contribuyen a activar el sistema

ProPO que conduce a la formación de las enzimas PO (Söderhäll y Cerenius 1992). En

nuestro estudio se observó un aumento significativo de la actividad PO libre (en plasma)

mientras que las actividades PO y ProPO de hemocitos disminuye. Este resultado estaría

indicando que el paramilon provocaría la liberación y activación del sistema ProPO. Sin

embargo, los recuentos de hemocitos no reflejan este accionar, dado que no se detectó

una disminución en el número de células granulosas y semigranulosas. Posiblemente, por

hematopoyesis, nuevos hemocitos compensen las pérdidas por degranulación. Esto se

opone a lo sugerido por Smith et al. (2003), quienes sugieren posibles consecuencias

negativas de la inmunoestimulación por reducción en el número de hemocitos

circulantes. Estudios realizados en los cangrejos de río que involucran la inyección de β‐

1,3‐glucanos, mostraron que el número de hemocitos se reduce rápidamente, pero luego

hay una lenta recuperación hasta alcanzar los niveles normales tras 4‐6 hs (Smith y

Sörderhäll, 1983). Zhu et al. (2010) han informado que ejemplares de Procambarus clarkii

alimentados con quitosan mostraron un aumento significativo en el número de hemocitos

totales. Estos estudios apoyarían que la administración de PAMPs no produce una

reducción en los hemocitos circulantes sino todo lo contrario. En nuestro caso, más

estudios deberán realizarse para terminar de dilucidar el mecanismo de la respuesta

total.

4.5 Actividad antibacteriana y contenido proteico plasmático.

No se observó actividad antibacteriana del plasma en ninguno de los dos grupos

experimentales, así como no se vieron diferencias (p出0.05) en el contenido proteico del

plasma (figura 14) ni de los hemocitos (figura 15). Esto indicaría que el tratamiento

aplicado no tuvo efectos sobre la síntesis de péptidos antimicrobianos.


‐ 249 ‐

Contro

l

5% pa

ramilo

n

0

20

40

60

80m

g pr

otei

na/m

l pla

sma

Figura 14: Contenido proteico del plasma de Cherax quadricarinatus alimentado con paramilon como suplemento. Los datos están expresados como media ± SE (n= 10).

Contro

l

5% p

aram

ilon

0

2

4

6

8

10

mg

prot

eina

/ml S

HL

d ax

Figura 15: Contenido proteico del SLH e Cher quadricarinatus alimentado con paramilon como suplemento. Los datos están expresados como media ± SE (n= 10).

Numerosos estudios han focalizado sus esfuerzos en comprender las vías de

activación de los sistemas de defensa en animales invertebrados (Asokan et al., 1997;

Medzhitov y Janeway, 2000; Cerenius y Söderhäll, 2004). Algunos de estos estudios se

han centrado en la administración oral de PAMPs (patrones moleculares asociados a

patógenos) como paredes de levaduras (Devaraja et al., 1998; Suphantharika et al., 2003),

hongos (Chang et al., 2003), o microorganismos probióticos (Rengpipat et al., 2000). En C.

quadricarinatus, no hay suficientes antecedentes sobre este tipo de técnicas, aunque se

ha reportado que la inyección de amilosa aumenta la supervivencia de ejemplares

infectados con el virus del síndrome de mancha blanca (WSSV) uno de los patógenos más

importantes que afecta a crustáceos (Wang et al., 2012). Esta técnica resulta poco

conveniente cuando se piensa en estos animales como un recurso con producciones a

mediana y gran escala, por lo que la incorporación de este moléculas como el paramilon

en el alimento parece ser una forma de administración viable para los productores.


‐ 250 ‐

Considerando los resultados de crecimiento y actividades PO y antioxidante, el paramilon

puede ser incorporado en las dietas de estos animales, dado que ha mejorado los niveles

de PO libres (en plasma) y ha aumentado la capacidad antioxidante de los hemocitos sin

pérdidas de biomasa animal.

Por otro lado, el polisacárido de reserva de E. gracilis nunca se había probado en

esta especie de importancia comercial. Dada la capacidad de esta cepa de producir

grandes cantidades de este polisacárido, sería interesante probarla de manera directa

como alimento para éste u otros crustáceos cultivables, dado que se trata de una

microalga con alto contenido proteico en comparación con otras microalgas comúnmente

utilizadas en el cultivo de especies de interés comercial (Nannavecchia, 2006). Además es

una especie productora de ácidos grasos poliinsaturados (Regnault 1995, Barsanti et al.

2000, Meyer et al. 2003, Rocchetta et al. 2006), lo que la hace potencialmente

interesante para la alimentación de hembras pre adultas y ovígeras (Li et al., 2010; 2011).

Otros objetivos para futuros estudios podrían focalizarse en el tiempo que duran los

efectos de la inmuestimulación, así como los efectos de estos parámetros indicadores del

estado inmunológico en tratamientos más prolongados.


‐ 251 ‐

5. CONCLUSIONES


‐ 252 ‐


‐ 253 ‐

Este estudio es el primero en evaluar los efectos del polisacárido de reserva de E.

gracilis sobre la especie de importancia comercial C. quadricarinatus. Los resultados de

esta investigación indican que la inclusión de paramilon en la dieta puede mejorar la

respuesta inmune de la especie. La diferencia significativa en la capacidad antioxidante

total de la hemolinfa, así como en la actividad PO libre, muestran que el polisacárido tuvo

un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores humorales (sistema ProPO) en

los animales que recibieron el polisacárido como suplemento durante 30 días. A su vez, el

agregado de glucano en el alimento no afectó su crecimiento, por lo que el paramilon

podría resultar un potencial suplemento para ser incorporado en dietas de alta calidad,

como agente preventivo en los sistemas de cultivos comerciales de Cherax

quadricarinatus y otros crustáceos.


‐ 254 ‐

CAPITULOIVEstudios sobre la respuesta electromagnética de la película de Euglena gracilis

Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 257 ‐

1.INTRODUCCIÓN

Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 258 ‐


1.1 Bioinspiración, biomimética y biorreplicación

La bioinspiración, la biomimética y la bioreplicación constituyen una progresión

de los enfoques de la ingeniería biomimética, que incorpora la idea de que podemos

pensar en las funciones que exhiben los seres vivos para el diseño de nuevas

estructuras y dispositivos (Pulsifer y Lakhtakia, 2011). De estos tres enfoques, la

bioinspiración es el más antiguo y el más frecuentemente aplicado. La inspiración se

basa en una estructura biológica que cumple una función específica y luego se fabrica

un dispositivo con una funcionalidad similar sin tener necesariamente la misma

geometría. Un ejemplo de esto, es el uso de sensores de gas para la prevención de

incendios forestales durante el secado de madera y sus productos, inspirados en los

sistemas de detección altamente diferenciados de los escarabajos de fuego (Merimna

atrata) para distinguir diferentes compuestos liberados durante las diversas etapas de

un incendio (Paczkowski et al., 2011). La biomimética constituye el paso siguiente en

la progresión. Se intenta replicar la funcionalidad de una estructura biológica

reproduciendo aproximadamente una de sus características estructurales esenciales.

Un excelente ejemplo es la estructura de Velcro que emula las púas en forma de

gancho de una semilla de bardana (Arctium sp.). Un ejemplo más reciente es el diseño

de sistemas de corte y limpieza por acción del agua imitando las características

estructurales de los canales del veneno de las cobras (Balmert et al., 2011). La tercera

forma en que los ingenieros son capaces de extraer ideas a partir de los seres vivos

para producir nuevos dispositivos, es la biorreplicación. Esta implica la replicación

directa de una estructura presente en un organismo. Si bien hasta la fecha no existen

dispositivos bioreplicados comerciales, diferentes grupos de trabajo han sido capaces

de replicar estructuras tales como el ala de la mariposa (Pulsifer et al., 2010; Figura 1),

la capa córnea del ojo de un insecto (Pulsifer et al., 2011) o el frústulo de una diatomea

(Losic et al., 2007).


Figura 1: (a) Fotografía del ala de una mariposa (Danaus plexippus). (b) Una réplica negativa del ala. (c) Detalle de la microestructura del ala. (d) Micrografía de una réplica positiva de las microestructuras del ala hechas de níquel.

A lo largo de la evolución, en la naturaleza se han desarrollado una notable

variedad de estructuras muy complejas. Algunas de ellas poseen detalles

sorprendentes y exhiben propiedades electromagnéticas singulares. La interacción de

la luz con estas microestructuras puede producir diferentes efectos, como los colores

iridiscentes o la apariencia metálica, dependiendo de los mecanismos ópticos

involucrados (Srinivasarao, 1999; Parker, 2000; Vukusic y Sambles, 2003; Berthier,

2007; Kinoshita, 2008). Estas estructuras no sólo generan efectos visuales,

dependiendo del tamaño que posean y de los materiales que las compongan se

pueden obtener características interesantes también en otras regiones del espectro,

tales como las regiones ultravioleta e infrarroja. Las especies que poseen este tipo de

microestructuras pueden hacer uso de ellas para diferentes funciones biológicas como

la regulación térmica y la protección frente a diferentes radiaciones como el UV. Por

ejemplo, la flor de las nieves (Leontopodium alpinum) que crece en las praderas

alpinas, tiene un mecanismo de protección frente a la radiación UV. Éste se basa en el

uso de nodos a lo largo de fibras que contienen material absorbente de la radiación UV

perjudicial, constituido por estructuras fotónicas nanométricas que actúan como

acopladores selectivos de longitud de onda (Kertész, 2006). Estos mecanismos

estructurales son la base de sistemas artificiales biomiméticos que actualmente se

diseñan y desarrollan con diversas aplicaciones (Saito, 2011). Además, este tipo de

estructuras se pueden combinar con pigmentos adecuados para cumplir con una

función prediseñada. Por ejemplo, diferentes tipos de telas tejidas con fibras de

celulosa se han estudiado estructuralmente con el fin de lograr con ellas, protección

frente a la radiación UV (Riva y Algaba, 2006).


1.2 Periplasto y metabolia en euglenoideos

Todos los euglenoideos presentan inmediatamente por debajo de la membrana

plasmática un periplasto (figura 2) también llamado película o complejo pelicular

(Preisig et al., 1994).

e

dc

b

a

Figura 2: Micrografías obtenidas mediante MET de secciones transversales celulares mostrando el complejo pelicular. a. Las flechas indican los microtúbulos de la película. Se observan los cuerpos mucíferos (m), el mucílago (mc) y el plasmalema (Pl) de una especie metabólica. Escala = 1µm. b. Las flechas indican la zona de articulación de una especie muy metabólica sin presentar proyecciones articulares en la película. Escala: 1µm. c. La punta de flecha muestra el marco aplanado en forma de “S” de cada banda de una especie metabólica. Escala: 0,5 µm. d. La punta de flecha muestra el marco en forma de “S”, zona de enganche con la próxima banda (ho) y la zona de solapamineto (O). Escala: 0,5 µm. e. Las flechas indican los microtúbulos de la película de una especie rígida. Se observa el canal mucífero (c), el surco de una banda (g), cresta de la próxima banda (r), cuerpos mucíferos (m), plasmalema (Pl). Escala = 1 µm. Fuentes: b, c, d Leander et al. (2001); a, e Buetow (1982).


El complejo pelicular está formado por una superposición de un número

invariable, según la especie, de unidades corticales o bandas, por ejemplo 40 para

Euglena gracilis. Estas bandas son acintadas, más o menos helicoidales o longitudinales

y de disposición anteroposterior. Cada una de estas unidades corticales está a su vez

constituida por un pliegue y un surco anexo. El área donde estas bandas se articulan

puede observarse al microscopio óptico como una estría que será más o menos visible

dependiendo de la especie (figura 3).

Figura 3: Euglena helicoideus fotografiada al microcopio óptico. Pueden observarse las estrías características del grupo. Fuente: Leander (2004).

Las bandas peliculares están compuestas por al menos dos glicoproteínas unidas

por puentes disulfuros formando el epiplasma o esqueleto celular (Bricheux y

Brugerolle, 1986). La figura 4 muestra un esquema generalizado de la estructura de la

película con sus componentes básicos. Este complejo pelicular comprende la

membrana plasmática y el glicocalix o epiplasma; un estrato subyacente a la

membrana. A nivel de cada interbanda presenta fibrilllas o microtúbulos que se

disponen alineados longitudinalmente en el área de solapamiento.


a

b c d

ef g

Figura 4: Esquema generalizado de la estructura de la película con sus componentes básicos (a) e ilustraciones de la serie de transformación asociado a la evolución de las proyecciones de la banda pelicular desde especies más metabólicas a especies más rígidas (b a g). a. configuración de tres bandas con sus zonas de articulación y los microtúbulos asociados posicionados debajo de la membrana plasmática y subtendido por cisternas tubulares del retículo endoplásmico. b. Una banda pelicular que carece de proyecciones articulares presente en algunos euglenoideos bacterivoros, eucarivoros y osmotroficos primarios. c. Una banda pelicular con proyecciones prearticulares filamentosas y proyecciones postarticulares en forma de peine presente por ejemplo en Eutreptiales y muchas especies del género Euglena. d. Una banda pelicular con proyecciones prearticulares lineales y proyecciones postarticulares en forma de peine presente por ejemplo en Discoplastis y algunas especies del género Euglena. e. Una banda pelicular con proyecciones robustas en forma de dientes y proyecciones postarticulares en forma de peine presente por ejemplo en los géneros Phacus y Lepocinclis. f‐g. Una banda pelicular con proyecciones prearticulares en forma de placa y proyecciones postarticulares robustas presentes por ejemplo en algunas especies del género Lepocinclis. (Fuente: Leander et al., 2007)


En la zona de articulación suelen observarse además un conjunto de fibras

transversales de unión; vesículas del retículo endoplasmático y de la red mitocondrial;

y cuerpos mucíferos que conectan con el exterior mediante poros (figura 5). Hacia

cada uno de los extremos de la célula las bandas se fusionan reduciendo su número

(Buetow, 1968) y el patrón de reducción de las estrías también es característico de

taxones vinculados evolutivamente (Leander y Farmer, 2000; Leander et al., 2001;

Esson y Leander, 2008)

a b

Figura 5: Microfotografías mediante SEM (a) y TEM (b) de Euglena cantabrica mostrando los cuerpos muciferos (flechas). Escalas: a. 4 µm, b. 2 µm. Fuente:

Leander y Farmer, 2000.

El grado de movimiento de la célula es el resultado de la organización de la

película, pudiendo ser lo suficientemente flexible como para variar la forma

deformándose rápidamente, como sucede en el caso de Euglena gracilis (figura 6 a y

b) o Peranema trichophorum (figura 6 c). En aquellas especies con bandas más anchas

y gruesas se ve minimizado dicho movimiento metabólico (Leedale, 1968). Como

resultado, las especies pueden ser ligeramente flexibles o bien, rígidas, como es el caso

del género Monomorphyna (figura 7). El movimiento metabólico no está siempre

relacionado con la locomoción, provoca además que las células se redondeen en una

reacción rápida o se contorsionen en una variedad de formas de tipo ameboide. Esto

suele ocurrir cuando se somete a la célula a situaciones de estrés pudiendo ser el

comienzo del enquistamiento.


Figura 6: Micrografías obtenida por SEM de la región anterior de E. gracilis (a) y de Peranema trichophorum (c). Micrografías obtenida por AFM de E. gracilis. Fuente: a.

Vismara et al., 2000. b. Gruenberguer et al., 2007. c. Leander 2004.

Figura 7: Micrografías obtenidas por SEM (a) y TEM (b) de Monomorphyna ovata. Las flechas señalan las zonas de articulación, Escalas: 10 µm (a) y 1 µm (b). Fuente: Leander y Farmer,

2001.

a

b

c

a b


1.3 Radiación ultravioleta

Entre los principales acontecimientos de la evolución biológica, la oxigenación de

la atmósfera fue un proceso gradual producido a lo largo de un período aproximado de

mil quinientos millones años, con la consiguiente formación de la capa de ozono. Esta

capa impide que la radiación UV‐C, altamente perjudicial para cualquier molécula

biológica, llegue a la Tierra. Sin embargo, todos los organismos terrestres, así como

aquellos acuáticos que viven en la superficie de los cuerpos de agua, están expuestos a

la radiación UV‐A y UV‐B. Esta radiación es potencialmente dañina para la vida y, como

penetra hasta 12 metros en el agua, puede reducir la supervivencia, el crecimiento y la

producción del fitoplancton (Skerratt et al., 1998; Bischof et al., 2011). En las especies

fotosintéticas, las condiciones ambientales altamente estresantes limitan su capacidad

para utilizar la energía de la luz absorbida, produciéndose sobreexcitación de los

fotosistemas (Demmig‐Adams y Winter, 1988). Las alteraciones en su normal

desarrollo, crecimiento y supervivencia debido al estrés provocado por altas

temperaturas o irradiancias se deben al desbalance entre los procesos de fotosíntesis y

respiración (Mohanty, 2003). Sin embargo, estos organismos han desarrollado

numerosos mecanismos de protección con tendencia a evitar o disminuir estos daños.

En particular, la recuperación de la exposición a la radiación UV no sólo depende de la

duración y el grado de radiación recibida, sino también de la capacidad de los

organismos para protegerse de la radiación UV. Los mecanismos de protección más

estudiados son por un lado, aquel basado en la cantidad de los pigmentos sintetizados

y por el otro los de reparación (Franklin & Forster, 1997; Ekelund, 2000). Hasta el

momento nunca se ha tenido en cuenta la posible protección que podría ejercer la

superficie celular. Por esta razón resulta de gran importancia evaluar si la película

junto con la membrana plasmática que lo recubre, se comportan como protectores

estructurales frente a la radiación UV.

1.3 Método de Chandezón

Las variaciones en la velocidad de propagación de la luz en diferentes medios,

dependen del índice de refracción del material y hacen que, para frecuencias

diferentes, la luz se refracte de manera diferente.


En el caso de los euglenoideos, su película se asemeja a una red de difracción,

por lo que para calcular la respuesta óptica de la película, el método diferencial

desarrollado por Chandezon et al. (1982), generalmente denominado método C, es

apropiado. Éste se basa en un cambio de coordenadas que transforma un perfil

corrugado en una superficie plana. Es un método que ha demostrado ser muy versátil y

eficaz para resolver el problema de la difracción de la luz en redes de difracción (Li,

1999; Li et al., 1999; Inchaussandague y Depine, 1996; Inchaussandague y Depine,

1997). El método C reduce la solución numérica al problema matricial de encontrar los

autovalores y autovectores de una matriz en cada medio, simplificando el manejo de

las condiciones de contorno.

En este capítulo se investiga el rol de la película como protectora de la célula

frente a la radiación UV. Se presentan aquí los resultados obtenidos del análisis de la

respuesta electromagnética de la película de Euglena gracilis en comparación con

otras dos especies de euglenoideos, Peranema trichophorum y Monomorphyna

megalopsis frente a la radiación UV, al comparar la respuesta electromagnética de una

superficie rugosa periódica (E. gracilis y P. trichophorum) con una superficie lisa (M.

megalopsis) en especies que difieren en su susceptibilidad frente a la radiación, entre

otras cosas, por ser organismos fotosintéticos (E. gracilis y M. megalopsis) y

heterotrófico (P. trichophorum).


2.OBJETIVOS E HIPÓTESIS


2.1 Hipótesis

E. gracilis presenta una superficie incolora conformada por bandas

proteicas. De acuerdo con esta característica, esta estructura podría actuar

como una red de difracción reflejando la luz UV y disminuyendo su entrada

a la célula.

Dada la semejanza de la película a una red de difracción, ella podría servir

como modelo para construir una estructura con propiedades

electromagnéticas capaz de actuar como protección frente a la radiación

UV.

2.2 Objetivo general

Analizar mediante el método de Chandezón si la estructura periódica de la

película influye en la respuesta electromagnética a la radiación UV.


Someter cultivos de E. gracilis, M. megalopsis y P. trichoforum a radiación

UV.

Verificar la viabilidad de estas especies sometidas a la radiación.

Analizar mediante microscopía electrónica de transmisión la ultraestructura

de las células y medir parámetros geométricos relevantes, como espesor,

ancho de banda, ancho de interbanda y profundidad del surco.

Aplicar el método de Chandezón para simplificar las condiciones de

contorno y predecir la respuesta reflejada de la película ante la luz UV.


3.MATERIALES Y MÉTODOS


1.1 Microorganismos y Condiciones de cultivo

Se utilizaron tres especies de euglenoideos: Euglena gracilis (UTEX 753),

Peranema trichophorum y Monomorphyna megalopsis. E. gracilis fue obtenida de la

colección de cultivo de la Universidad de Texas (USA), P. trichophorum proviene de la

colección de cultivos de Carollina suplies (USA) y M. megalopsis fue aislada del río

Matanza, Buenos Aires, Argentina a partir de una muestra extraída utilizando una red

de fitoplancton de 20 µm de poro. Los cultivos de E. gracilis y P. trichophorum eran

cultivos axénicos y estables, en el caso de M. megalopsis, los cultivos unialgales se

obtuvieron a partir de células aisladas y lavadas dos veces con solución fisiológica

(0,9% NaCl, pH 7) que fueron sembradas en extracto de suelo (SWM, Pringsheim,

1946) estabilizado con CaCO3. Todos ellos fueron mantenidos bajo fotoperíodo 12:12,

con una irradiancia de 25‐35 µE/ m2 seg, provista por tubos de 40 watt de potencia, a

24 ± 1 ºC en SWM. Los cultivos fueron repicados cada 10 días. En el caso de P.

trichophorum además se agregó al medio Chlamydomonas reinhardtii como alimento

dado que se trata de una especie heterótrofica. Esta especie de euglenoideo se utilizó

en los ensayos de radiación luego de haber ingerido la totalidad del alimento.

1.2 Ensayo de radiación

Cuando se verificó el crecimiento de algas, se prepararon 18 placas de Petri con

5 ml de medio SWM estabilizado con CaCO3. Seis placas se inocularon con 104cell/mL

de Euglena gracilis, 6 con P. trichophorum sin alimento y 6 con M. megalopsis. Tres

réplicas de cada especie fueron cubiertas con las correspondientes tapas de las placas

de Petri como control. Todas las muestras fueron irradiadas durante 8 horas con tubos

fluorescentes (ReptiSun 5.0) cuyo espectro de emisión se muestra en la figura 8. En las

placas irradiadas, el volumen se mantuvo por adición de medio de cultivo.


‐ 276 ‐

Figura 8: Espectro de emisión de la lámpara ReptiSun 5.0 (20‐watt) utilizada durante los ensayos.

1.3 Viabilidad

La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de exclusión de trypan blue

(Freshney, 1987). Una alícuota (1 ml) de la suspensión celular se mezcló con 0,1 ml de

0,4% de trypan blue preparado en buffer fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,4). Se

realizaron recuentos de células teñidas utilizando cámaras Neubahuer en un

microscopio Olympus BX50. Las células se examinaron dentro de 5 minutos posteriores

al agregado del trypan blue con el fin de evitar una posible citotoxicidad fotodinámica

(Hathaway et al., 1964). Otra alícuota (1 ml) de la suspensión de células se fijó con una

solución de formaldehído al 3% y las células totales se determinaron utilizando

cámaras Neubahuer. El porcentaje de células no teñidas (células viables) se determinó

en los cultivos tratados y controles. Se contaron suficientes células para tener un error

inferior al 10% (Venrick, 1978).

1.4 Microscopía electrónica de transmisión

Se comparó la ultraestructura de la película de los organismos tratados y

controles utilizando MET. Para ello, las células fueron recolectadas mediante

centrifugación durante 20 minutos a 3.500 x g. Se descartó el sobrenadante y el

“pellet” se fijó con glutaraldehído al 2,5 % preparado en buffer cacodilato de sodio 0,1

M (pH 7,4) durante toda la noche a 4°C. Luego fueron post‐fijadas en de tetróxido de

Osmio 1% preparado en buffer fosfato durante 2 horas, se centrifugó a baja velocidad,

se descartó el sobrenadante y el “pellet” se lavó durante 10 minutos con buffer fosfato

tres veces. Se cosecharon las células fijadas por centrifugación durante 5 minutos y se


deshidrataron las muestras utilizando una serie de concentraciones crecientes de

acetona (30% , 50% , 70% , 95% , y 2 x 100% ). Luego de la deshidratación se realizaron

inclusiones en resina Spurr de baja densidad (Reymond y Pickett‐Heaps, 1983). Los

preparados se seccionaron con un ultramicrótomo con cuchilla de diamante (1 µm de

espesor) y se tiñeron con acetato de uranilo 2% por 5 min y citrato de plomo 5%

durante 5 min (Reynolds, 1963). Las secciones fueron examinadas utilizando un

microscopio electrónico de transmisión de alta resolución Zeiss EM 10 A/B en el centro

de microscopía avanzada de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (CMA‐FCEN).

1.4 Parámetros determinados

Para cada una de las especies analizadas se midieron parámetros de la película

en organismos tratados y controles. Para esto se utilizó el software Imagen. Los

parámetros medidos fueron espesor, ancho de banda, ancho de interbanda,

profundidad del surco. Con esos valores se determinaron el período y altura de la

película para cada muestra. Se hicieron al menos 200 mediciones de cada parámetro

para cada tratamiento y especie.

1.5 Análisis teórico‐numérico

Dado que la película de estos organismos es una estructura periódica que

asemeja una red de difracción, para evaluar su respuesta electromagnética se realizó

un análisis teórico‐numérico. Este análisis fue realizado por el grupo de

electromagnetismo aplicado del departamento de Física de la FCEyN‐UBA. Los

períodos y alturas determinados como se indica en la sección 1.4 se utilizaron para

predecir la respuesta reflejada de película ante la luz UV utilizando el método

electromagnético de Chandezon (Chandezon et al., 1980) para el cálculo de la

respuesta electromagnética de redes de difracción.

En la figura 9 se puede observar la geometría del problema de difracción donde

se muestra una interfaz periódica corrugada, invariante en la dirección z, que se

describe como una función continua y = a (x) y por ser periódica, se cumple que:

a (x ± d) = a (x) donde d es el período.


h

Figura 9: Perfil de forma sinusoidal que simula la película de E. gracilis y P. trichophorum

El límite corrugado periódicamente divide el espacio en dos regiones con

materiales con permitividades diferentes Ɛ1 (región y>a(x)) y Ɛ2 (y<a(x)),

respectivamente. Ambos medios son isótropos, homogéneos, y no magnéticos. Se

considera que una onda electromagnética plana, linealmente polarizada y de

frecuencia angular ω incide desde la región y>a(x) con un ángulo Ɵ0 con respecto al eje

y, cuyo plano de incidencia es el plano xy. El campo electromagnético se describe

clásicamente en términos de dos campos vectoriales: el campo eléctrico y el campo

magnético. La onda puede incidir con el vector campo eléctrico perpendicular al eje z

(modo TE), o con el vector campo magnético perpendicular al eje z (modo TM).

Para resolver el problema electromagnético se utilizó un código computacional

basado en el método C, cuyos detalles están disponibles en varios trabajos (Chandezon

et al., 1982; Li, 1999; Li et al., 1999). La idea principal del método C es simplificar las

condiciones de contorno usando una transformación muy simple de coordenadas

curvilíneas no ortogonales, que convierte la interfaz corrugada de la red, en un plano.

El método C permitió obtener las eficiencias de los órdenes de difracción reflejados y

transmitidos. Si bien el método es adecuado para redes de forma arbitraria, para el

propósito de este trabajo en las simulaciones numéricas se consideró un perfil de

forma sinusoidal, es decir:

a (x)=0,5 h cos (2πx/d), donde h es la profundidad de la red.


Así el perfil real de la película de E. gracilis y P. trichophorum se asemeja a una

interfaz sinusoidal que separa los medios dentro y fuera de la célula. Dado que el

hábitat de estas especies es el agua, se tomó el índice de refracción del medio externo

(incidente) como 1,33. De acuerdo con Nakano et al. (1987), los principales

componentes químicos de la membrana plasmática y la película de E. gracilis son

proteínas, lípidos polares como la fosfatidiletanolamina, e hidratos de carbono como

xilosa, fucosa, y ramnosa. Estos componentes tienen índices de refracción entre 1,46 y

1,6. Por otro lado, dado que la película es un carácter altamente conservado en

euglenoideos, se puede considerar que M. megalopsis y P. trichophorum poseen una

película con una composición similar, por lo que para los cálculos se consideró el

interior de la célula como un medio homogéneo con un índice de refracción promedio

de 1,5.

También se analizó si los pigmentos presentes en E. gracilis contribuyen a su

protección contra la radiación UV ya que en este caso, el grado de absorción de la

célula también podría ser un mecanismo de protección. Para explorar este aspecto, se

introdujo una pequeña parte imaginaria del índice de refracción de la célula, que

representa las pérdidas por absorción.

A partir de los datos hallados con el método de Chandezon, con el programa

Origin se graficaron las curvas de potencia total reflejada normalizada al plano y

absorbida normalizada al plano en función de la radiación incidente.

1.6 Análisis estadístico

La significación estadística de las diferencias entre los controles y los cultivos

tratados y entre las especies se determinó por análisis de varianza (ANOVA) de dos

factores, con el fin de evaluar las diferencias entre los tratamientos y la viabilidad de

las especies. Las comparaciones se realizaron utilizando GraphPad Prism 5 y los valores

p<0,05 se consideraron significativos.


4.RESULTADOS Y DISCUCIÓN


4.1 Viabilidad de las algas y observaciones ultraestructurales

El tratamiento con radiación UV mostró diferencias significativas en la

viabilidad de las especies M. megalopsis y P. trichophorum respecto a sus respectivos

controles (Figura 10). Sin embargo, E. gracilis no evidenció diferencias significativas

entre tratamientos. Al comparar la viabilidad de las células irradiadas no se observaron

diferencias significativas entre E. gracilis y P. trichophorum, mientras que la viabilidad

de M. megalopsis irradiada resultó significativamente menor a la de las otras dos

especies en iguales condiciones.

E. gracilis

P. trichophorum

M. megalopsis

0

20

40

60

80

100

Control

Irradiadas

*

*

Células viab

les (%

)

Figure 10: Porcentaje de células viables en cultivos control e irradiados de E. gracilis, P. trichophorum y M. megalopsis. Los resultados se expresan como media ± desvío estándar de

tres experimentos diferentes. (* pг0,05).

La radiación aplicada no afectó la ultraestructura de la película en E. gracilis y P.

trichophorum (figuras 11 y 12), pero al comparar las micrografías de M. megalopsis,

observamos diferencias ultraestructurales entre el control (Figura 13 A y B) y las

células expuestas (Figura 13 C). Se pudo observar un aumento en el contenido de

paramilon en M. megalopsis, el cual produjo cambios en la película. Si bien no se

observó replicación de bandas, algunas mostraron un ligero ensanchamiento (Figura

13 C). Tampoco hubo cambios en los cloroplastos de M. megalopsis y E. gracilis, los

cuales mantuvieron su estructura (figuras 11 C y 13 C).


De acuerdo a las figuras 11 y 12, la película de E. gracilis y P. trichophorum se

asemeja a una red de difracción con períodos que varían entre 0,155 y 0,384 µm para

E. gracilis y entre 0,256 y 0,521 µm para P. trichophorum. Por otro lado, la película de

M. megalopsis no presenta un patrón tan regular, esta muestra regiones casi planas,

con longitudes que varían entre 1,6 y 4 µm (figura 13). Por este motivo y dadas las

longitudes de onda de la radiación UV, puede considerarse como una superficie plana.

Por este motivo se analizó la respuesta electromagnética de las estructuras corrugadas

en comparación con la de una interfaz plana, que representa la respuesta de M.

megalopsis.

Pa Cl Cl Nu Pe

Figura 11: micrografías de E. gracilis. A) Célula del grupo control. B) Detalle de la película (Pe) y C) de cloroplasto (Cl) del grupo irradiado. Pa: paramilon, Nu: núcleo. Escalas: A) 5

µm; B) 0.5 µm; C) 1 µm.


Nu Pe

Figura 12: micrografías de P. trichophorum. A) Célula del grupo control B) detalle de la película (Pe) del grupo irradiado. Nu: núcleo. Escalas: A) 4 µm; B) 1 µm.

Pe Cl Nu Cl Nu Nu Pa Pa

Figura 13: micrografías de M. megalopsis. Célula del grupo control (A) e irradiado (C). B) Detalle de la película (Pe) del grupo control. Nu: núcleo, Pa: paramilon, Cl: cloroplasto.

Escalas: A) 5 µm; B) 1 µm; C) 5 µm.

4.2 Respuesta electromagnética

En esta sección se muestra los resultados de la reflectancia total normalizada

como una función de la longitud de onda incidente y de la relación entre la

profundidad y el período (h/d), para diferentes valores de período. Se define R

(reflectancia total normalizada) como la reflectancia total de la red periódica

normalizada a la reflectancia de una interfaz plana entre los mismos medios, y se

calcula como:


R = Σn (enTE + en

TM)/(ǀrTEǀ2 + ǀrTMǀ2)

donde enTE (en

TM) es la eficiencia del enésimo orden de difracción reflejado cuando el

campo eléctrico es perpendicular al eje z (TE) o lo es el campo magnético (TM) y rTE

(rTM) es el coeficiente de reflexión de Fresnel en iguales condiciones (TE y TM) (Jackson,

1999).

En todos los casos se observó la reflectancia de la superficie corrugada

(películas de E. gracilis y P. trychophorum) normalizada a la reflectancia del plano

(películas de M. megalopsis) entre los mismos materiales. Esto puso de manifiesto las

diferencia entre E. gracilis y P. trychophorum (ambas resistentes a la radiación UV) y

M. megalopsis (sensible). Para los resultados mostrados en la figura 14 se consideró

una interfaz sinusoidal que separa dos medios con índices de refracción de 1,33 (n1) y

1,5 (n2) con incidencia normal. En esta figura se muestran los gráficos de la reflectancia

total normalizada (R) para redes de diferentes periodos. Se consideraron ciertos

valores de períodos que se encuentran en los rangos típicos de las películas de estas

microalgas: 0,256 μm; 0,276 μm; 0,315 μm y 0,495 μm. Los tres primeros valores son

característicos de E. gracilis y P. trichophorum, mientras que el período mayor (0,495

μm) sólo se encontró en P. trichophorum.

Figura 14: Reflectancia de la superficie corrugada que separa dos medios con índices de refracción de 1,33 y 1,5 con incidencia normal. La barra de la

derecha indica la escala de valores de reflectancia.


Teniendo en cuenta la definición de R, los valores mayores que 1 representan

un conjunto de parámetros (profundidad y longitud de onda) para los que la

reflectancia de la estructura periódica es mayor que la interfaz plana. En los tres

primeros períodos considerados (Figuras 14A ‐ 14C), se puede observar que dentro de

la región UV (゜<380 nm) hay un rango de valores h/d para el que la reflectancia de la

red sinusoidal es mayor que la de la interfaz plana. Si se aumenta aún más el período

(d = 0,495μm) la región de alta reflectancia se mueve hacia la región roja del espectro

(datos no mostrados), hasta que otra región de alta reflectancia aparece (Figura 14D).

Estos resultados sugieren que para los tamaños de período típicos que se encuentran

en la película de E. gracilis y P. trichophorum, el patrón sinusoidal aumenta la

reflectancia UV y por lo tanto, menos radiación UV penetra en las células.

En el caso de P. trichophorum (incolora), un aumento de la reflectancia

implicaría necesariamente una reducción de la transmitancia. Sin embargo, también

resulta interesante investigar si los pigmentos presentes en E. gracilis contribuyen a su

protección contra la radiación UV ya que en este caso, el grado de absorción de la

célula también podría ser un mecanismo de protección. En la figura 15 se muestran las

absorbancias normalizadas para los tres valores de período más pequeños

considerados en la figura 14. En este caso, el índice de refracción que representa el

interior de la célula es n2 = 1,5 + i 0,1; mientras que el resto de los parámetros se

mantienen como los de la figura 14. En estos gráficos, los valores inferiores a 1

representan un grado de absorción inferior al de la interfaz plana entre los mismos dos

medios. Se observa que en los tres casos (figuras 15A‐15C) hay regiones para las cuales

la absorción es menor que la correspondiente a una interfaz plana. La reflectancia en

estas regiones también es más alta que la de una interfaz plana (datos no mostrados).

Esto sugiere que el perfil sinusoidal de la película contribuye a disminuir la absorción

de la radiación UV y por lo tanto, proporciona un mecanismo de protección para las

células frente a la radiación UV.


‐ 288 ‐

Figura 15: Absorbancias de la

superficie corrugada que separa

dos medios con índices de

refracción de 1,33 y 1,5 con

incidencia normal para los tres

períodos más pequeños

considerados (0,23 µm; 0,276 µm

y 0,315 µm). La barra de la

derecha indica la escala de

valores de absorbancia.

En la especie incolora (índice de refracción real), la reflectancia en el UV es

mayor que la de una interfaz plana para un amplio rango de parámetros. En la especie

pigmentada (índice de refracción complejo) el medio celular absorbe menos radiación

UV cuando la película posee un perfil corrugado y, al mismo tiempo, la reflectancia se

incrementa. Este comportamiento podría explicar por qué E. gracilis y P. trichophorum

tuvieron mayor viabilidad al ser expuestas a la radiación UV, mientras que la mayoría

de las células de M. megalopsis no resultaron viables luego del ensayo.

Los resultados obtenidos sugieren que las primeras barreras de la célula

podrían desempeñar un papel importante en la protección contra la radiación UV. Por

otra parte, la profundidad y el periodo parecen ser parámetros críticos para obtener el

rendimiento deseado de la respuesta electromagnética. Sin embargo, aún hay varios


aspectos que deben ser investigados. Por un lado, para simplificar el modelo y el

tratamiento electromagnético, se consideró un perfil sinusoidal de la rejilla, sin

embargo, se ha observado en las imágenes de corte transversales que los perfiles no

son exactamente sinusoidales, y también varían de una muestra a otra. Dado que la

respuesta electromagnética depende de la geometría de la rejilla, los cálculos de

reflectancia que tengan en cuenta una representación más exacta del perfil real,

podrían proporcionar una visión más detallada del problema. Otro aspecto que se

podría mejorar es la determinación de las partes real e imaginaria de los valores de

índice de refracción. Aunque nuestras estimaciones se basan en los componentes

químicos, las células no son homogéneas y por lo tanto el índice de refracción varía de

un punto a otro y el modelo simplificado utilizado aquí no tiene en cuenta estas

heterogeneidades. Otros métodos esencialmente numéricos tales como FDTD (Finite‐

difference time‐domain, Taflove y Hagness, 2005) o un método de simulación fotónica

(Dolinko y Skigin, 2013) podría dar cuenta de esta falta de homogeneidad.

Los euglenoideos se encuentran en la base del árbol evolutivo de los eucariotas

y se estima que se originaron hace unos 1.400 a 1.200 millones de años atrás, por lo

que su aparición ocurrió poco después de que se formara la capa de ozono que data de

hace unos 1.600 a 1.400 millones de años. En particular la especie P. trichophorum

suele aparecer en los árboles evolutivos del grupo como la especie más ancestral

(Preisfeld et al., 2000; Heyden et al., 2004; Marin et al., 2003; Nudelman et al., 2003),

que además se caracteriza por ser una especie incolora y metabólica. La rigidez

observable en algunas especies de euglenoideos, como Monomorphyna sp., se debe a

la fusión de bandas peliculares y es un carácter que ha aparecido,

independientemente, muchas veces a partir de un ancestro con movimiento

metabólico (Leander et al., 2001). La presencia de películas rígidas en euglenoideos

autótrofos sería un mecanismo para impedir la metabolia, y se presume que la

plasticidad en algunas células, como es el caso de E. gracilis, es una propiedad

prescindible en especies capaces de fotosintetizar, mientras que ésta sería necesaria

para las especies de nutrición heterótrofa (Leander et al., 2001).

Si consideramos entonces a P. trichophorum (incolora y metabólica) como la

especie más ancestral y a M. megalopsis (fotosintética y rígida) como la especie menos


ancestral, la presencia de películas con patrones periódicos que resultaron protectoras

para dos de las especies en estudio (P. trichophorum y E. gracilis) podría ser un

carácter adaptativo para poder soportar las condiciones atmosféricas existentes en el

momento en que se originaron.


5.CONCLUSIONES


Los resultados obtenidos en esta sección muestran que el perfil que presenta la

película de E. gracilis podría contribuir a aumentar la reflectancia de la radiación UV y a

disminuir su absorbancia debido al patrón de estriación que se asemeja a una red de

difracción. Esto llevaría a disminuir la penetración de la radiación UV en el interior de

la célula, minimizando los daños y aumentando en consecuencia la supervivencia de

aquellas que poseen este patrón.

Este estudio permitió detectar propiedades ópticas en las películas de las

especies E. gracilis y P. trychophorum, las cuales podrían resultar de interés en el

campo de la biomimética y biorreplicación. Se podrían reproducir las estructuras de las

películas analizadas para cumplir con la función de protección frente a la radiación UV.


‐ 294 ‐

CAPITULOVConclusiones finales

Capítulo 5‐ Conclusiones finales

‐ 297 ‐

Las conclusiones que derivan de este trabajo de tesis son las siguientes:

Las cepas de E. gracilis pigmentadas, al ser cultivadas en medio rico en materia

orgánica, muestran un mayor rendimiento en cuanto a la producción de biomasa,

que las cepas blanqueadas.

Las cepas de E. gracilis fotosintéticas, en fase estacionaria de crecimiento,

resultaron potenciales productoras de polifenoles al ser cultivadas en medio rico

en materia orgánica.

Los extractos etanólicos de las cepas fotosintéticas en fase estacionaria

mostraron actividad atrapante de radicales libres e inhibieron el crecimiento de

raíces de trigo. Esta capacidad puede estar relacionada con la presencia de

polifenoles como los flavonoides o taninos, detectados en los extractos de estas

cepas.

Han sido detectados otros metabolitos secundarios, que serían eficaces en el

tratamiento de enfermedades cardiovasculares, cardenólidos (en las fases

exponenciales de todas las cepas) y triterpenos (en las fases exponenciales de

las cepas blanqueadas).

Las cepas de E. gracilis blanqueadas resultaron las mejores productoras de

paramilon, cuando se las cultivó en medio mineral con exceso de acetato.

La cepa con mejor rendimiento en la producción de paramilon resultó ser la

UTEX‐h, cuando fue cultivada en un medio mineral con exceso de acetato, por lo

que sería la cepa a seleccionar para la producción de este polisacárido.

La mayor producción de paramilon en medio mineral con exceso de acetato se ve

acompañada de una mayor actividad de la enzima isocitrato liasa, la cual le

permite a las células incrementar sus niveles de paramilon, manteniendo altos

los niveles lipídicos y proteicos.

En las cepas fotosintéticas el exceso de acetato provoca una disminución en el

contenido de pigmentos y en el tamaño de los cloroplastos, así como un

aumento en el desarrollo de las mitocondrias, lo que indicaría un

desplazamiento hacia un metabolismo heterotrófico.

Capítulo 5‐ Conclusiones finales ‐ 298 ‐

Mediante una modificación química del paramilon puede obtenerse un producto

con propiedades antivirales (ensayada in vitro), aunque la derivatización

realizada en este trabajo mostró un bajo rendimiento.

La inclusión de paramilon en la dieta de C. quadricarinatus puede mejorar la

respuesta inmune de la especie sin afectar su crecimiento.

El paramilon tiene un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores

humorales (sistema ProPO) en los animales que reciben este polisacárido como

suplemento alimentario.

La película de E. gracilis presenta un patrón regular con propiedades ópticas. Este

patrón, que se asemeja a una red de difracción, aumenta la reflectancia de la

radiación UV y contribuye a disminuir su absorbancia, resultando, por lo tanto

un elemento protector frente a la radiación UV. La menor penetración de

radiación UV en el interior de la célula, minimizaría los daños aumentando en

consecuencia la supervivencia de las mismas.

Por las características ópticas detectadas en E. gracilis y P. trichophorum frente a

la radiación UV, la estructura de sus películas podrían ser utilizada como modelo

para la producción de nuevos materiales con estas propiedades.

A partir de los resultados del presente trabajo, investigaciones adicionales deberían

centrarse en los siguientes aspectos:

Caracterizar los compuestos químicos de interés, detectados en el cribado

químico y evaluar su actividad biológica mediante pruebas específicas.

Estudiar la relación estructura‐actividad del paramilon derivatizado, así como

otros mecanismos de derivatización, para producir compuestos con mayores

rendimientos y que por lo tanto muestren una mejor relación costo‐beneficio.

Estudiar los mecanismos de acción antiviral del paramilon derivatizado.

Evaluar el rendimiento en términos de crecimiento, supervivencia, fisiología e

inmunología de especies de interés comercial (como C. quadricarinatus u otros

crustáceos) al aplicar paramilon en el alimento a lo largo de todo el ciclo de

cultivo.


‐ 299 ‐

Evaluar el papel del paramilon en la absorción de nutrientes cuando se lo aplica

como suplemento alimenticio.

Evaluar la especie E. gracilis como suplemento alimentario con efectos

inmunoestimulantes, ya que es productora de una gran cantidad de paramilon y

niveles protéicos elevados.

Incorporar la determinación de otros parámetros, indicadores inmunológicos

(proceso hematopoyético, producción de aglutinantes, fagocitosis y adhesión

celular) para evaluar la eficiencia del paramilon como inmunoestimulante en

crustáceos.

Evaluar la respuesta de la película de E. gracilis mejorando la determinación de

las partes reales e imaginarias de los valores de índice de refracción y

considerando las heterogeneidades que presentan las células.

Reproducir las características estructurales esenciales de la película de E. gracilis

para poder replicar la funcionalidad de esta estructura biológica con propiedades

electromagnéticas.


‐ 300 ‐

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