Universidad de San Carlos de GuatemalaFacultad de AgronomaMicrobiologa Agrcola Ing. Gustavo lvarez

Evaluacin del efecto de la inoculacin de tres cepas de Rhizobium (Rhizobium leguminosarum) en arveja (pisum sativum L) en el municipio de patzcia, Chimaltenango.

Mara Argueta 201015086Daniel Rodrguez 200923430

Guatemala, 25 de noviembre de 2013DELIMITACIN DEL PROBLEMA

La constante bsqueda de condiciones que hagan posible el incremento del rendimiento y la calidad del cultivo de arveja, conlleva el proporcionarle a la planta las mejores condiciones desde la siembra hasta la cosecha, que incluye una fertilizacin balanceada, prcticas culturales adecuadas y el control de plagas y enfermedades. Es as, por lo que ste cultivo se ha adaptado a diferentes regiones del pas, especialmente en el Municipio de Patzcia del Departamento de Chimaltenango ha adquirido gran importancia, aunque los rendimientos por unidad de rea en relacin con otras zonas productoras del pas es bajo, principalmente por la falta de una tecnologa adecuada, lo que conlleva a la aplicacin innecesaria de fertilizantes qumicos para aumentar los rendimientos por unidad de rea, de esto se obtiene resultados favorables, sin embargo los costos de produccin aumentan considerablemente as como los daos al ambiente.

Los agricultores del rea de Patzcia por muchos aos han utilizado planes de fertilizacin para el cultivo de arveja a base de Nitrgeno qumico el cual es muy voltil y al ser aplicado no es aprovechado en su totalidad por la planta, por lo que se propuso hacer una evaluacin de tres cepas de Rhizobium leguminoarum importantes en la fijacin de nitrgeno atmosfrico para mejorar el rendimiento del cultivo de arveja.

JUSTIFICACIN

El cultivo de arveja china es un cultivo muy importante para agricultores del departamento de Chimaltenango y principalmente en el rea de Patzcia porque adems de tener un fuerte mercado nacional es un producto de exportacin. Para poder tener acceso a mercados nacionales e internacionales se deben cumplir con estrictas normas de manejo agronmico y estndares altos de calidad, con el afn de conseguir productos de mejor calidad y seguridad alimentaria posible; por lo cual los productores necesitan adecuar sus modelos de produccin a las nuevas exigencias del mercado, lo cual involucra nuevos requisitos legales al respecto del medio ambiente, salud de trabajadores agrcolas y calidad de producto comercializado.

Una de las caractersticas ms importantes de este cultivo es su capacidad de asociarse simbiticamente con bacterias del genero Rhizobium. Como producto de esta simbiosis, la planta recibe un aporte significativo de nitrgeno proveniente de la atmsfera. Por lo tanto por poseer una fijacin biolgica importante de nitrgeno, esta planta puede cultivarse sin recurrir a los fertilizantes qumicos nitrogenados (Danso, S.; Esken, D. C. 1980)

La utilizacin de Rhizobium como fuente de fijacin simbitica de nitrgeno en biofertilizacin en arveja, se presenta como una opcin de tratamiento, si se toma en cuenta la situacin actual donde los costos de fertilizantes nitrogenados van en aumento y la proteccin del medio ambiente sugiere el uso de cultivos orgnicos, de esto surge la alternativa de utilizar tcnicamente la fijacin simbitica de nitrgeno, la cual puede contribuir en el incremento de la produccin del cultivo, en la economa familiar, reduciendo los costos de produccin, y al mismo tiempo conducir a la preservacin del ambiente.

MARCO TERICO

MARCO TERICO CONCEPTUAL Generalidades del cultivo

La arveja china se cultiva en Guatemala en los departamentos de Chimaltenango, Sacatepquez y Solol, los cuales comprenden ms de 95% de la produccin nacional (Sandoval, J. 2002; Casaca, A. 2005).

Es una planta originaria del Mediterrneo y de frica Oriental, pertenece a la familia Fabaceae, del orden Fabales. Se cultiva por la produccin de su vaina, que en estado inmaduro constituye el producto comercial (Sandoval, J. 2002; Casaca, A. 2005).

Es una planta anual herbcea de crecimiento rpido, con tallos huecos, sus hojas son compuestas, con dos o tres pares de foliolos que terminan en sarcillos, de flores sencillas e insertadas en las axilas de las hojas (Sandoval, J. 2002; Casaca, A. 2005).

Es resistente al clima frio y poco resistente a las sequa, se adapta bien al clima templado-clido y se adapta a diversos terrenos con preferencia en aquellos de mediana constitucin, tendientes a ser sueltos, arenosos y de estructura no compacta (Sandoval, J. 2002). Requiere de temperaturas ptimas de 15 a 18 C. Se adapta a una altura de sobre el nivel del mar de 1000 a 3000 metros. Esta planta se adapta a una gran variedad de suelos, prefiriendo los franco arcillosos, frtiles y profundos, bien drenados, pH comprendido entre 5.5 y 6.7. La siembra puede realizarse durante todo el ao con riego (Nolasco, J. 2004).

Botnicamente se denomina Pisum sativum L. y el tipo de arveja con vainas comestibles se identifica como Pisum sativum sacharatum. El fruto es en vaina, algo comprimida y terminada en una pequea curva. Las semillas, nmerosas en cada vaina, son casi esfricas (Domnguez, R. 1990).

Clasificacin botnica

Reino Plantae

Subreino Thallobionta

Divisin Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

SubclaseRosidae

Orden Rosales

Familia Fabce

Subfamilia Papillionidae

Gnero Pisum

Especie Pisum sativum L.

Nombre comn arveja china

Fuente: Gonzalez, C. 1998

Fenologa del cultivo

Las plantas de arveja china germinan entre 5 y 8 das despus de la siembra. Posee una etapa de desarrollo vegetativo comprendido de los 12 a los 55 das llegando a formar hasta doce nudos. Alcanza en la etapa vegetativa, una altura aproximada de 0.5 m (Sandoval, J. 2002)

La floracin comienza a los 56 das despus de la siembra, formando de 12 a 22 nudos, a los das despus de la siembra, alcanzando una altura aproximada de 1.0 m. la formacin de vainas se da entre los 60 y 100 das. El perodo de cosecha comienza a los 65 das despus de la siembra, finalizando a los 100 das despus de la siembra (Sandoval, J. 2002).

Fertilizacin del cultivo de arveja

Las necesidades nutricionales de la arveja son descriptas en la Tabla 1. Como es una especie que produce granos con un alto valor proteico (20 al 24 %), es exigente en nitrgeno (N).Cuadro 1: Requerimientos nutricionales de la arveja (Prieto, 2010).Nutrientekg/ ha

Nitrgeno (N)75

Fsforo (P)70

Potasio (K)65

Magnesio (Mg)25

Azufre (S)20

Fuente: Ferraris, G. 2012Rhizobium

Rhizobium es un gnero de bacterias gram-negativas de perfil de suelo que fijan nitrgeno atmosfrico. Pertenece a un grupo de bacterias fijadoras de nitrgeno que se denominan colectivamente rizobio.

Los microorganismos capaces de establecer simbiosis con leguminosas se conocen con el nombre de rhizobia o rizobios y engloban actualmente a una gran variedad de bacterias. El conocimiento de la existencia de estos microorganismos data de finales del siglo XIX cuando, por primera vez, Frank en 1889 denomin Rhizobium leguminosarum a las bacterias aisladas a partir de ndulos de leguminosas (Moulin et al., 2001).

Rhizobium leguminosarum

Es una bacteria grannegativa. La primera capa de la pared celular se compone de hidratos de carbono y protenas, y la segunda capa est hecha de lpidos e hidratos de carbono. Son bacilos que forman colonias al azar, son bacterias mviles, aerbicas crecen en la mayora de las temperaturas, pero crece mejor a 25 C (Moulin et al., 2001).

Clasificacin taxonmica

DominioBacteria

FiloProteobacteria

ClaseProteobacteria alfa

OrdenRhizobiales

FamiliaRhizobiaceae

GneroRhizobium

EspecieRhizobium leguminosarum

Fijacin simbitica del nitrgeno

El fenmeno de la fijacin simbitica del nitrgeno es caracterstico de leguminosas, y explica en gran parte la importancia de estas en sistemas de rotacin del cultivo. El nitrgeno constituye casi el 90% de la atmosfera terrestre, aunque es inerte y no puede ser utilizado por la vasta mayora de los organismos vivos, puede participar en los sistemas biolgicos cuando se ha combinado con los elementos como el hidrgeno y el oxgeno, capacidad del a naturaleza reserva a unos cuantos gneros de bacterias. En la actualidad esta fijacin puede realizarse a travs de la fabricacin de amoniaco y de otros fertilizantes qumicos producidos industrialmente (Brill, M. 1978).

Este tipo de fijacin la realizan todas aquellas formas de vida que necesitan de la participacin de otros organismos para fijar el nitrgeno, como es el caso del Rhizobium con las plantas legunimosas (Brill, M. 1978).

Una pequea parte del nitrgeno orgnico, principalmente aminocidos y azucares amnidas pueden ser absorbidas por las races de las plantas, en cuanto que el nitrgeno atmosfrico, precisa ser inicialmente fijado por organismos procariticos (bacterias fijadoras libres, simbiticas y algas cianofceas) (Vidor, C. 1963).

En el caso de fijacin simbitica de nitrgeno atmosfrico, este es colocado inmediatamente a disposicin de la planta hospedera en forma de amonio que se combinar con cidos orgnicos provenientes de la fotosntesis en la formacin de aminocidos (Vidor, C. 1963).

La fijacin de nitrgeno es bsicamente, un proceso de autofertilizacin. Las races de las plantas leguminosas se infectan con bacterias que viven en el suelo. Estas bacterias radiccolas simbiontes de las leguminosa, o rizobios, nombre que toman por pertenecer al gnero Rhizobium, presentan las siguientes caractersticas en su ciclo de vida; cuando viven libres en el suelo, son bacilos flagelados, nmviles, saprfitos, y no fijan nitrgeno. Cuando entran por los pelos absorventes radicales hasta el parnquima central de la raz de las plantas leguminosas, provocan una intensa proliferacin celular y por consiguiente formacin de unas hipertrficas, globosas, llamadas ndulos. A pesar de su distinta forma, todos presentan la misma estructura anatmica (Rothscchild, D.).

Las bacterias de gnero Rhizobium, infectan las races de las leguminosas y producen tumefacciones parecidas a tumores que se denominan ndulos, los cuales estn llenos de miles de bacterias que fijan el nitrgeno molecular. La planta leguminosa proporciona la energa para que se produzca la fijacin del nitgeno molecular, capturando la enrgia de la luz solar por fotosntesis (Danso, S; Esken, D. 1980).

Ningn organismo superior ha desarrollado la capacidad de fijar nitrgeno atmosfrico, aunque algunos lo logran indirectamente formando asociaciones simbiticas con bacterias que fijan el nitrgeno. Todos los organismos fijadores de nitrgeno aparentemente comparten un mecanismo comn para la fijacin y, lo mismo que el proceso industrial, el producto final es el amoniaco (Brill, M. 1978).

La multiplicacin del Rhizobium es estimulada por la planta hospedera, esta emite exudados de la raz que contiene aminocidos azcares y vitaminas. Esto permite que la cepa logre concentrar el nmero de clulas para iniciar la infeccin (Gramam, P. 1980).

Ecologa general del Rhizobium

Segn Ruschel 1980, el rhizobio se encuentra distribuido en diferentes nichos ecolgicos, no solo en la rhizsfera y races de las leguminosas, si no tambien de otras plantas, en agregados y coloides del suelo. Generalmente viven en forma saprfita, utilizando fuentes de energa y sustancias nitrogenadas del medio.

Se estima que este proceso contribuye entre el 60-80% de la fijacin biolgica de nitrgeno, y esta simbiosis aporta una parte considerable del nitrgeno combinado en la tierra y permite a las plantas leguminosas crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos.

Fisiologa de la fijacin del nitrgeno por Rhizobium

El principal producto de la fijacin del nitrgeno es el amoniaco (NH3), el cual es asimilado tan rpido como es formado. Los sistemas biolgicos que fijan nitrgeno utilizan una enzima llamada nitrogenasa, que forma reactiva, la molcula de nitrgeno en condiciones del ambiente (Microbiologiacal 1980).

La enzima nitrogenasa es la que cataliza la reduccin de N2 a NH3 se localiza en el interior de la bacteria fijadora de nitrgeno. Esta enzima tiene dos componentes principales, la protena ferrrosa y la protena molibdeno ferrosa. La presencia de molibdeno en esta enzima, al igual que en la enzima nitrato reductasa, explica el requerimiento de molibdeno para la asimilacin de N2 y NO3- (Microbiologiacal 1980).

La energa que se necesita para la reaccin es proveda a travs del ATP formado de carbohidratos como por ejemplo: la glucosa generada por la planta leguminosa y cedida a la bacteria (Microbiologiacal 1980).Proceso de nodulacin

La nodulacin consta de varias etapas, que describen a continuacin:

Reconocimiento de la combinacin adecuada de organismos: En este paso la planta secreta a la rizsfera ciertos compuestos que sirven de seal y como mediadores de la especificidad de las leguminosas. Estos compuestos pueden ser derivados del cido araquidnico flavonoides, siendo estos ltimos los ms estudiados. En respuesta a estos compuestos los rizobios activan una serie de genes implicados en la nodulacin; los cuales se conocen como genes NOD que producen los factores NOD, estos factores son glucosaminas con un cido araquidnico en la parte no reductora del azcar. Los factores NOD inducen la deformacin del pelo radical en la mayora de leguminosas (Martnez E, Martinez J. 1998). Encurvamiento del pelo radical: Para que la nodulacin ocurra son necesarios los factores NOD y los flavonoides. Los factores NOD inducen un flujo de iones Calcio ( Ca+2 ) que provocan la despolarizacin de la membrana y como consecuencia un rearreglo de los filamentos de actina, cambiando as la direccin de los pelos radicales (Aguilar, R. 1974).

Generacin del hilo de infeccin: En este paso participan los compuestos conocidos como lectinas, que son protenas que contienen carbohidratos y cumplen la funcin de adherencia entre la bacteria y la planta. Entonces la bacteria penetra en el pelo radical e induce la formacin, por parte de la planta, de un tubo de composicin similar a la pared celular, conocido como canal de infeccin (Martnez E, Martinez J. 1998).

Formacin de vesculas: esta es inducida por los factores NOD por parte de Rhizobium y por fitohormonas como la auxina que funcionan como mensajeros para sensibilizar las clulas vegetales. Las bacterias son liberadas desde el canal de infeccin al citoplasma de las clulas vegetales por un mecanismo similar al de endocitosis. Los rizobios quedan separados del citoplasma por una membrana derivada de la planta hospedera y que se llama la membrana peribacteroidal (MPB).

Luego ocurren una serie de divisiones hasta obtener los bacteroides que son vesculas de la MPB proporcionada por la planta hospedera que encubren las bacterias. Estos bacteroides pueden llegar a ser hasta cuarenta veces ms grandes que los bacilos a partir de los que se desarrollan. El sistema vascular de la planta se extiende dentro del ndulo y transporta nutrientes hacia y desde el ndulo. Los bacteroides inician el proceso de fijacin de nitrgeno (Martnez E, Martinez J. 1998).

Forma externa de los ndulos: La forma es determinada principalmente por la planta hospedera, puede ser esfrico, cilndrico o circular. Los ndulos que se encuentran activos son de mayor tamao y presentan una coloracin rojiza, que se atribuye a la presencia de la protena leg-hemoglobina. Esta protena se ha estudiado ampliamente, por su relacin con la simbiosis. Actualmente se conoce que el grupo hemo proviene de los bacteroides y la globina de la planta, su principal funcin consiste en facilitar la difusin del oxgeno dentro del ndulo; que es til como transportador de electrones dentro de la fijacin de nitrgeno (Aguilar, R. 1974).

Selectividad y Especificidad

Fuera de las condiciones ambientales necesarias para el buen crecimiento de las leguminosas, el proceso de la fijacin del nitrgeno no aade ningn requerimiento especial al organismo. Una posible excepcin a esta afirmacin podemos encontrarlas en las cantidades de ciertos elementos minerales para una fijacin de nitrgeno ms eficaz (Casas, C. 1982).

La aportacin de la simbiosis Rhizobium leguminosa es bioqumica y gentica pro parte de la planta, esta desempea un papel de primera importancia y al eficiencia del proceso se encuentra tambin influida por factores ecolgicos (6).Por consiguiente, la gentica d la leguminosa husped y de las bacterias son sumamente importantes, al igual que la modalidad de su interaccin. As mismo, todo factor nutritivo ambiental que afecte a una de las partes afecta la eficiencia global de la simbiosis (Danso, S; Esken, D. 1980).

La invasin, nodulacin y fijacin de nitrgeno por las especies de Rhizobium depende de las relaciones especificas o la compatibilidad que existe entre la planta hospedera y la bacteria. Esta relacin parece ser extermadamente compleja y depende mucho de la consutitucion gentica de la planta hospedera y tambien del la bacteria, asi como de los distintos factores ambientales que incluyen la rhizosfera (Brose, E. 1979). La selectividad puede enfocar en direccin bacteria planta y planta bacteria, por tanto no solo son las caractersticas fisiolgicas propias de cada cepa o especie de Rhizobium las que definen la seleccin de la planta a nodular, si no tambin el gnero, especie y variedad del leguminosa (Graham, P. 1980). Ciertas especies de leguminosas solo forman ndulos con un rango limitado de cepas de Rhizobium. Estas se denominan especficas. Otras forman ndulos con un rango amplio de rhizobium y se denomina promiscuas (Bradley, R. 1985).

Cepas de Rhizobium a evaluar

CIAT 632: aislada por Rolando Aguilera en Guatemala, identificada como cepa 21 en 1974. Se prob repetidamente por su respuesta simbitica entre los aos 1974 1979, siendo altamente efectiva. Se incluy en los ensayos de pruebas internacionales de inoculacin en leguminosas en 1979.

CIAT 151: aislada como Z 121 cerca de Medellin, Colombia en 1972 probada por su infectividad en 1979 con buenos resultados.

CIAT 166: aislada como Z 151 en Buga, Colombia en 1972. Probada para infectividad e 1979, es altamente efectiva, incluida en los ensayos de pruebas internacionales de inoculacin de frijol en 1980.

MARCO REFERENCIAL

Estudios realizados en la inoculacin de cepas de Rhizobium en arveja

Carrillo, H. 1990 en un estudio realizado para determinar la eficiencia de cepas de Rhizobium en leguminosas concluyeron que la inoculacin de la cepa CIAT 151 a una concetracion de 5 cm de suspensin aproximadamente de bacteria de 1x109 clulas/ml del inoculantes presento incrementos en el porcentaje de nitrgeno fijado.

Ballesteros, M. y Lozano, A 1994 en la evaluacin de siete cepas CIAT de Rhizobium en el incremento en el rendimiento en leguminosas concluyeron que las cepas CIAT 632 y CIAT 151 a una dosis de 2 ml/0.5 kg de semilla afectan el rendimiento en leguminosas.

Lidieth, O 1996 en un ensayo realizado para la evaluacin de tres cepas de Rhizobium concluy que la cepa CIAT 151 a una dosis de 1 g del inoculante por metro lineal present los valores ms bajos respecto a la variable peso seco de la parte area en las leguminosas.

Ubicacin y Localizacin

Patzica se encuentra ubicado a una distancia de 14 kilmetros de la cabecera Departamental de Chimaltenango sobre la carretera interamericana a la altura del Kilmetro 68 de la capital guatemalteca. Su altura sobre el nivel del mar es de 2,400 mts. Con una latitud de 14 37' 54; y longitud de 9055'30.

Imagen 1. Municipio de Chimaltenango

Fuente: http://www.inforpressca.com/patzicia/ubicacion.php Se marcan dos estaciones: Invierno y verano, debido a su altura de 2400 metros sobre el nivel del mar su clima es fro, acentundose en los meses de diciembre a marzo. Se registra una temperatura promedio de 27 mximos y 14 mnimos.

Humedad relativa de 80-90%, el invierno se inicia en mayo y termina en octubre, mientras que el verano comienza en noviembre y finaliza en abril, la precipitacin pluvial est dentro del orden de 24 das equivalentes a 280.0 milmetros cbicos. Aproximadamente 1,000 a 2,000 milmetros cbicos por ao. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN

General

Evaluar el efecto en la produccion de arveja (Pisum sativum) a la inoculacin de cepas de Rizobium leguminosarum en el Municipio de Patzcia, Chimaltenango.

Especficos

1. Determinar el incremento en el rendimiento en la produccin en arveja (Pisum sativum). para los distintos tratamientos.

2. Identificar la cepa de Rizobium leguminosarum que genere el mayor incremento en la produccin de arveja (Pisum sativum). HIPTESIS DE TRABAJO

La inoculacin de cepas de Rhizobium leguminosarum tiene un efecto superior en el rendimiento de la produccin de arveja (Pisum sativum) al de la fertilizacin qumica.METODOLOGA

Diseo experimental

El diseo experimental que se utilizara es bloques completos al azar debido a que la investigacin se realizara en un cultivo a campo abierto, en el cual no se conoce la homogeneidad del suelo por esto se corre riesgo que en algunas partes del suelo el cultivo se desarrolle en su optimo incidiendo este en los resultados.Hiptesis

Hiptesis NulaTodas los tratamientos presentan el mismo efecto en el rendimiento de la produccin del cultivo de arveja (Pinsum sativa).Hiptesis alternativaAl menos uno de los tratamientos presenta diferencia significativa en el rendimiento de la produccin del cultivo de arveja (Pinsum sativa).

Tratamientos

T1 = Testigo absoluto, no se aplicar inoculo de Rhizobium leguminosarum.T2 = Comparador qumico, se aplicar 80 kg N/ha en tres dosis de 50 kg/ha cada una a los 15, 30 y 45 das despus de la siembra, no se aplicar inoculo.T3 = Aplicacin del inoculo de la cepa CIAT 632 proporcionada por el Instituto de Ciencia y Tecnologa Agrcola (ICTA) a una dosis de 20 ml de la suspensin inoculante para 720 semillas.T4 = Aplicacin del inoculo de la cepa CIAT 151 proporcionada por el el Instituto de Ciencia y Tecnologa Agrcola (ICTA) a una dosis de 20 ml de la suspensin inoculante para 720 semillas.T5 = Aplicacin del inoculo de la cepa CIAT 166 a una dosis de proporcionada por el Instituto de Ciencia y Tecnologa Agrcola (ICTA) a una dosis de 20 ml de la suspensin inoculante para 720 semillas.Unidad experimental

El experimento se llevara a cabo en una parcela de 6 surcos de 4 m de largo por 1 m de ancho separados 0.5 m con un distanciamiento entre planta de 0.2 m.Cuadro 1. Distribucin terica aleatoria de los tratamientos y las repeticiones

R3T3T4T1T3T2

R1T1T2T5T4T5

R2T3T5T4T2T1

Modelo estadstico

El modelo estadstico que se aplicara en el anlisis es el siguiente:

Diseo de bloques al azar, con un nivel de confianza del 95%, el cual se presenta a continuacin:

Yij = + Ti +Bj +Eij

Donde:

Yij = cantidad de produccin = cantidad promedio de produccin Ti = efecto del i-simo inoculanteBj = efecto del j-simo bloqueEij = efecto del error experimental asociado al i-simo inoculante y el j-simo bloque.

Variables de respuesta

Rendimiento

Una de las variables de respuesta a evaluar es el efecto de las cepas de Rhizobium leguminosarum en el rendimiento de la produccin del cultivo de arveja, para esto se tomara el peso fresco total de las vainas producidas con caractersticas de exportacin, realizando de 1 a 2 cortes semanales durante cinco semanas a partir de los 70 das despus de la siembra, se pesaran las vainas cosechadas en una balanza analtica, y se acumularan los pesos de cada muestreo para as obtener el total de kg/ha producidos por tratamiento.Numero de ndulos Al final de la cosecha se seleccionaran tres plantas al azar de cada repeticin para tener un total de 9 plantas por tratamiento, para esto se contaran los ndulos que presenten una coloracin purpura ya que los ndulos que presentan esta coloracin son los que efectivamente estn realizando simbiosis con la planta.Anlisis de informacin El anlisis de la investigacin se realizar con una prueba de hiptesis para la estimacin de un total, posteriormente con los datos obtenidos se realizar un anlisis de varianza para comprobar cual tratamiento es el ms eficiente y un anlisis de regresin lineal para establecer un modelo de produccin. Manejo del experimento

Preparacin del medio de cultivo 1. En un erlenmeyer de 250 cc, se agregaran 150 cc de agua destilada.1. Calentar el agua, y agregar los ingredientes.1. Esperar que los ingredientes se homogenicen.1. Ajustar el volumen a 150 cc.1. Ajustar el pH a 7.5 utilizando NaCl 1N, agregndolo gota a gota y verificndolo con papel pH .1. Colocar un tapn de algodn y papel aluminio; esterilizar en el autoclave a 120 C durante 30 min.

Preparacin del inoculo Se tomara 1 gramo de las cepas proporcionadas por el Instituto de Ciencia y Tecnologa Agrcola (ICTA) a las cuales se les agregar 10 ml de agua estril.Reproduccin masiva del inoculo De la solucin del inoculo preparado con la ayuda de un asa estril se realizar un rayo en la supericie de 10 cajas petr con medios de cultivo Agar rojo, estas sern incubadas a 30 C, por un perodo de 7 das. De estas 10 cajas de petri se seleccionaran para realizar la suspensin tres que presenten las caractersticas ms homogneas descritas para las colonias de rhizobium. Se llevara a una solucin 1:10,000.Preparacin de la semilla Previo a efectuar la siembra se lavar y desinfectar las semillas de la siguiente forma.1. Se tomaran las semillas y colocarlas en un vidrio de reloj con alcohol etlico al 95% y sumergirn durante 30 segundos.2. Con pinzas estriles, (flamear las pinzas en cada uno de los pasos), decantar el alcohol y transferir las semillas a otro vidrio de reloj con hipoclorito de sodio al 0.05%; mantenerlas all por 2 minutos. 3. Con pinzas estriles, trasladar las semillas a una caja de Petri que contenga 20 ml de agua estril para lavar el exceso de los reactivos.4. Repetir el paso anterior 2 veces ms.

Inoculacin de la semillaSe tomaran 20 ml de la solucin de Rhizobium para aplicar a 720 semillas en bolsas plsticas desinfectadas.Preparacin del terrenoSe cuenta con rea estimada 540 m2. Los cuales se deben desinfectar antes de realizar la siembra de las semillas para lo cual se utilizar metan sodio, limpiar adecuadamente para poder tener un acceso adecuado y un ptimo desarrollo del cultivo. Se proceder a la elaboracin de las sub-parcelas y a la delimitacin del mismo.Siembra Se sembraran dos semillas por postura debidamente inoculadas con las cepas. La distancia entre surcos ser de 0.5 m y entre plantas de 0.2 m. Esta se realizara con forme al diseo de bloques al azar.Desmalezado y RiegoEl desmalezado se realizara dos desmalezados manuales en el ciclo del cultivo, para lograr evitar que estas alteren los resultados; y lograr evitar la competencia dada entre el desarrollo del cultivo y de la maleza.Debido a que el experimento se realizara en poca de riego no ser necesario aplicar.Tutorado Se realizar mediante la colocacin de estacas de madera de 2 metros de altura aproximadamente colocndose la primera pita a 10 cm de distancia y la segunda a 20 cm de distancia.Manejo de plagas y enfermedadesSe aplicarn insecticidas en las diferentes etapas fisiolgicas. Para el control de trips, mosca minadora, Spodoptera sp., araa roja y aphydo. Los productos autorizados son: Imidacloprid, Lambda cyhalothrin y Deltnametrin..Para el control de manchas foliares se utilizaran los fungicidas, captan, cobre, azufre, chlorotalonil y azoxystrobina. Y para el control de hongos del suelo se utilizaran los ingredientes activos, carbendazim y propamocarb.FertilizacinSe realizaran aplicaciones foliares de fertilizantes para aportar microelementos al cultivo.CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ActividadAgostoSeptiembre Octubre Noviembre

1234123412341234

Preparacin del terreno

Preparacin del inoculo

Inoculacin de la semilla

Siembra

Fertilizacin

Desmalezado

Tutoreo

Control de plagas y enfermedades

Cosecha

Recoleccin de datos

Interpretacin y anlisis de datos

Presentacin de los resultados

Fuente: elaboracin propia

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