DESARROLLO TECNICO DE LA INVESTIGACIÓN

PROYECTO. ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD EN ALIMENTOS Y BIODISPONIBILIDAD DE CAROTENOIDES OBTENIDOS A PARTIR DE

CEMPAXÚCHIL (TAGETES ERECTA)

RESUMEN

El cempaxúchil (Tagetes erecta L.) es una planta herbácea anual originaria de México, comercialmente cultivada en diferentes zonas para la producción de carotenoides alcanzando producciones de hasta 30 t/ha. Los carotenoides son compuestos de importancia económica, principalmente como una fuente industrial de pigmentos para la industria avícola y la industria alimentaria. Así mismo, tienen importancia por el efecto antioxidante protector de la visión (Combs, 1998).Con fines ceremoniales e industriales, el cultivo del cempaxúchil en el país está asociado a los meses de Julio a Octubre, durante los cuales se presentan condiciones ambientales (de luz, humedad relativa y temperatura) muy particulares; no obstante, también puede ser cultivada durante cualquier otro periodo del año, bajo condiciones diferentes, que pueden jugar un papel muy importante en el desarrollo vegetativo de la planta y la biosíntesis de los pigmentos (carotenoides) en las inflorescencias. Con respecto a esto último, la cantidad y calidad de la luz que recibe la planta en ese tiempo, puede influir en la biosíntesis de estos pigmentos, además de que pueden ocurrir cambios en las estructuras celulares relacionadas con la síntesis y almacenamiento.Por otra parte, en términos de disponibilidad, aunque se tenga una buen rendimiento a través de su producción en campo, los carotenoides son compuestos estables en su medio natural, pero debido a los dobles enlaces conjugados, resultan muy sensibles a la oxidación, especialmente en reacciones de fotooxidación y al efecto de factores como la temperatura, la luz y el pH que provocan la perdida de color y de sus características funcionales por cambios en la estructura, lo cual puede ocurrir por las condiciones de procesamiento.Existen diversas maneras de tratar a los carotenoides y otros metabolitos para incrementar su estabilidad y vida útil, uno de ellos es la encapsulación, mediante la cual, sustancias bioactivas se introducen en una matriz para protegerlas de reacciones con otros compuestos. En este sentido son diversos los materiales que se utilizan considerando su resistencia, permeabilidad, facilidad de aplicación y la naturaleza hidrofobica o hidrofilita, las maltodextrinas son algunos de ellos; sin embargo considerando las características de la inulina que es un fructano, compuesto principalmente por fructosa y escasos residuos de glucosa, se ha considerado la utilización de la inulina derivada de agave con este fin.Con este entorno, en este trabajo se llevó a cabo el seguimiento del efecto que sobre la producción de carotenoides, tiene la fecha de transplante realizada en diferentes etapas del año, así como de los cambios ultraestructurales que a nivel celular pueden ocurrir bajo estas condiciones, por microscopía electrónica de

barrido. En paralelo, y con la finalidad de incrementar su estabilidad se trabajó en el encapsulamiento de los carotenoides obtenidos de T. erecta cultivado en el campo experimental, usando inulina extraída de agave, cuyo cultivo ocupa ya una superficie importante del estado de Morelos.

INTRODUCCIÓN

El cempaxúchil (Tagetes erecta L.) y carotenoides.

Cempaxuchil (Tagetes erecta L.) es un vocablo de origen náhuatl utilizado en la época prehispánica para referirse de forma genérica a un grupo de plantas con características comunes: flores vistosas por su forma y tamaño, diversidad aromática y colores llamativos como el amarillo y del anaranjado al rojo. Los usos actuales y potenciales de esta planta por su composición son numerosos, entre otros se mencionan los siguientes: para la obtención de compuestos bioactivos antioxidantes, pigmentos utilizados en la industria alimentaria, saborizantes y resinas; además de su utilización como ornamental (flor de corte, jardín y maceta), insecticida, nematicida, larvicida, atrayente o repelente de insectos, abono verde y para el control de malezas. En México, adicionalmente es relevante su empleo en la medicina tradicional y en algunas festividades religiosas. El cempaxúchil, es una planta que por la amplia diversidad de variedades presentes en nuestro país, ha generado la iniciativa de proponer a México como su centro de origen (Serrato-Cruz, 2004). Esta es una planta herbácea anual, cuyo cultivo está asociado a los meses de Julio a Octubre, durante los cuales se presentan condiciones ambientales muy particulares, no obstante, también puede ser cultivada durante cualquier otro periodo del año, bajo condiciones diferentes, que pueden jugar un papel muy importante en el desarrollo vegetativo de la planta y la biosíntesis de los pigmentos (carotenoides), en las inflorescencias. La superficie sembrada para la producción de cempaxúchil de temporal en México es de aproximadamente 740 hectáreas y de riego de 8849 ha en el 2006, con una producción de hasta 10.93 t/ha (SAGARPA, 2006). En la naturaleza el ciclo, de vida de las plantas en general, está sincronizado con los cambios estacionales los cuales afectan la transición en su desarrollo y la floración entre otros aspectos. Las fluctuaciones en la humedad y la temperatura proporcionan información que utilizan las plantas para la sincronización, con las estaciones, de muchas de las respuestas fisiológicas relacionadas con el desarrollo (Searle y Coupland, 2004). En este sentido, Dorais y col. (2001) reportaron que la temperatura y la intensidad de la luz ejercen una influencia directa sobre los atributos en la calidad de las flores de cempaxúchil.En la actualidad, un entendimiento detallado de la influencia de los factores ambientales y su interacción con las prácticas agronómicas, que afectan la acumulación de metabolitos secundarios durante el periodo de floración es aún poco estudiado y en el caso de T. erecta no hay estudios relacionados.

Benk y col., (1976), reportaron que un extracto de Tagetes erecta contiene aproximadamente 27% de carotenoides con 4% de β-caroteno, 1.5% esteres de criptoxantina y 86.1% de esteres de xantófilas. Este último es el principal carotenoide constituyente de los pétalos de T. erecta donde se encuentran en mayor cantidad que en las semillas o los sépalos, y 200 veces más que el maíz amarillo. Su gran diversidad de tonalidades está relacionada con un mayor contenido de carotenoides, debido a esto, es importante conocer si la tonalidad de las flores de Tagetes cambia con respecto al tiempo de siembra de las plantas y si esto esta relacionado con la producción de carotenoides.

La acumulación de carotenoides en tejidos específicos abundantes en cromoplastos como los de las flores está relacionada con las características fisiológicas, genéticas y bioquímicas de cada especie, así como con los factores ambientales, como son la luz (el fotoperíodo y la irradiación), la temperatura y la fertilidad de los suelos, de tal manera que la composición de los carotenoides contenidos en los vegetales puede ser afectada por factores como la variedad o el cultivar, la parte de la planta utilizada, el clima o la geografía del sitio de producción, la cosecha, el manejo poscosecha, el proceso y el almacenamiento (Rodríguez-Amaya 1993). La biosíntesis de carotenoides en Tagetes erecta puede entonces ser afectada drásticamente por la cantidad y calidad de la luz y por el tiempo de exposición, ya que se afecta la estructura de las especies químicas favoreciendo formación de carotenoides del tipo cis. En las plantas los carotenoides se acumulan en los cromoplastos en altos niveles, específicamente carotenoides apolares, xantofilas y otros carotenoides secundarios tales como xantofilas aciclados que forman parte de sus estructuras (Emter, et al., 1990). Estos tienen un metabolismo activo y poseen la capacidad de sintetizar algunos de sus componentes estructurales como los ácidos, además de que son especialmente activos en la síntesis y acumulación de los carotenoides responsables de los colores amarillo, anaranjado y rojo de muchas flores, frutas y raíces. Los cromoplastos pueden multiplicarse, por lo menos en los primeros tiempos de la maduración, a partir de los cloroplastos jóvenes y raramente de proplastidios. Estas estructuras especializadas pueden ser clasificadas por su morfología como: globulares, membranosos, reticulotubulares, cristalinos y tubulares (Emter, et al., 1990), que están constituidos además de los carotenoides, por lípidos y proteínas. Adicionalmente pueden estar acompañados de estructuras globulosas generalmente llamadas plastoglobulos, que son gotitas esféricas de lípidos, cuyo diámetro puede tener desde 0.1 µm a 1.0µm ó más. Las dimensiones y el número de plastoglobulos aumentan generalmente durante la maduración de los cromoplastos. El estudio de la formación de los cromoplastos en el desarrollo de las frutas o flores ha sido el centro de interés de investigadores por las implicaciones que puede tener sobre el manejo de la síntesis de los carotenoides.Por otra parte y con relación a las características de los carotenoides, estos son terpenoides que se encuentran presentes en muchas plantas, frutas y flores, en los cuales desempeñan actividades metabólicas importantes por formar parte de

los Complejos Cosechadores de Luz en tejidos fotosintéticos. En dieta humana los carotenoides (provitamina A y no provitamina A) son nutrimentos fundamentales porque dan colorido y buena presentación a los alimentos y bebidas pero también ejercen una actividad biológica que incide sobre la visión, la reproducción y el funcionamiento inmune, además del efecto protector para la salud, atribuido a su capacidad antioxidante, en función de su contenido de vitamina A.Los carotenoides en su ambiente natural son estables, pero debido a su estructura, cuando se extraen y disuelven en aceites o disolventes orgánicos se vuelven lábiles y están sujetos a cambios químicos inducidos por las condiciones de preparación o procesamiento en la industria alimentaria; además de que los procesos de oxidación y modificación química de la molécula se acentúan cuando los tejidos son sometidos a procedimientos de trituración celular y se pierde la compartamentalización, permitiendo que las sustancias que promueven estos cambios se pongan en contacto. Adicionalmente factores como: La presencia de los agentes oxidantes (enzimáticos o no); la energía suficiente (luz o calor) para que ocurran las reacciones de degradación y modificaciónes en la configuración cis o trans; La actividad acuosa y el pH, constituyen factores de riesgo para la estabilidad de lo carotenoides.Por otra parte, la biodisponibilidad de los carotenoides provitamínicos o no, también depende de una serie de factores como son: tipo de carotenoide, el procesado del alimento, interacción con otros carotenoides, con la grasa o fibras y de la matriz en que se encuentran. Microencapsulación e inulina.

La microencapsulación, es una opción que ayuda a evitar la pérdida de compuestos lábiles durante el proceso de elaboración hasta el producto final. La microencapsulación es un proceso mediante el cual algunas sustancias bioactivas se introducen en una matriz para protegerlas de reacciones con otros compuestos o para frenar reacciones de oxidación a causa de la luz o del oxígeno, con el fin de mejorar su estabilidad y aumentar su vida útil. (Yánez- Fernández y col, 2002).Son diversos los materiales que se utilizan para el recubrimiento; sin embargo, se debe considerar la resistencia, la permeabilidad, la facilidad de aplicación y a naturaleza hidrofobica o hidrofilica (Arancibia, 1981).Además de que tendrá influencia en el tamaño de partícula, en las propiedades de flujo, en las mecánicas y en la vida útil del material deshidratado. Los encapsulantes o materiales formadores de pared más utilizados para este método han sido: Carbohidratos (almidón y derivados, maltodextrinas, jarabes de maíz, ciclodextrinas, carboximetilcelulosa y derivados); gomas (arábiga, mezquite, alginato de sodio); lípidos (ceras, parafinas, grasas) y proteínas (gelatina, proteína de soya, caseinatos, suero de leche, zeína).

Inulina

Es un oligofructosácarido, compuesto principalmente por fructosa y escasos residuos de glucosa (Yun 2003).La estructura esta compuesta por unidades de 2-1-β- fructosa con un grado de polimerización de entre 3 y 70 monómeros. Esta estructura es la responsable de que no sea digerible, pero adicionalmente la inulina presenta un bajo valor calórico y una funcion nutricional como fibra dietética (Chacón- Villalobos, 2006).La configuración de las cadenas de inulina es primordialmente lineal y por eso presenta alta solubilidad. Esta característica le otorga propiedades humectantes cuando es empleado como aditivo en la industria de alimentos, así como la capacidad de formar geles cremosos cuando se calientan en medios acuosos (Chacón- Villalobos, 2006). De todos los polisacáridos y oligosacáridos no digeribles, solamente los oligofructosacáridos son actualmente reconocidos y utilizados enalimentos como prebióticos al cumplir con todos los criterios de clasificación y seguridad alimentaria . La función de la inulina para la salud es muy importante debido a que se emplea como edulcorantes para diabéticos, además, ayuda a la prevención de arteriosclerosis, enfermedades cardiovasculares y hipertrigliceridemia, las cuales están asociadas a las dietas hipercalóricas. Paralelamente al disminuir la ingesta calórica disminuye el riesgo de obesidad y de padecer de diabetes tipo II.Considerando los aspectos anteriores en el presente trabajo se consideró importante evaluar la producción de carotenoides por T. erecta transplantada en diferentes etapas del año, en las cuales se evaluó el crecimiento, la acumulación de carotenoides y luteína, así como los cambios estructurales y morfológicos ocurridos en los cromoplastos en este mismo período.Así mismo, los carotenoides generados en estos cultivos fueron extraídos y encapsulados con inulina derivada de agave cultivado en el estado de Morelos.

OBJETIVOS

Determinar el efecto de la época de transplante a campo sobre el desarrollo de la planta y acumulación de luteína en inflorescencias de cempaxúchil (Tagetes erecta L.).

Evaluar el efecto que algunos factores ambientales tienen sobre el desarrollo y morfología de estructuras acumuladoras de carotenoides en lígulas de Tagetes erecta L.

Extraer, secar y analizar características fisicoquímicas de un extracto rico en fructooligosacáridos (FOS) obtenidos a partir del Agave (A. Angustifolia Haw), a nivel de laboratorio.

Encapsular carotenoides del cempaxuchil (Tagetes erecta) con Inulina.

MATERIALES Y METODOS

1. Cempaxúchil Tagetes erecta y carotenoides

Obtención de las plantas:El material utilizado en el presente estudio, fueron semillas de Tagetes erecta

del fenotipo porte bajo con dos retrocruzamientos, proporcionadas por el Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz Profesor Investigador de la Universidad Autónoma Chapingo.

Para determinar el efecto de la época de transplante sobre la altura, número de primordios florales, diámetro, peso fresco, seco y en la acumulación de los carotenoides en inflorescencias se germinaron semillas cada mes, obteniendo plántulas que fueron trasplantadas a maceta a los diez días después de la germinación y mantenidas en invernadero por 20 días; posteriormente se pasaron a campo obteniendo cultivos a los que se les dio seguimiento a través de su crecimiento y desarrollo.

El experimento se realizó en el campo experimental Emiliano Zapata del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos ubicado en la población de San Isidro, municipio de Yautepec, Morelos. El municipio se localiza en la parte norte del estado, colinda con los municipios de Cuautla y Atlatlahucan al este, al sur con los municipios de Ayala, Tlaltizapán y Emiliano Zapata; al oeste colinda con los municipios de Jiutepec y Tepoztlán y finalmente al norte colinda con el municipio de Tlayacapan. Su localización geográfica es 18° 53´ de latitud norte y 99° 04´ de longitud este con una altura a nivel del mar de 1,210 metros, donde la temperatura media anual es de 22.7 °C y el tipo de clima es cálido sub-húmedo con lluvias en verano; la precipitación pluvial es de 945.7 milímetros anuales (INEGI, 2007).

El estudio general fue realizado durante el periodo comprendido del 25 de junio de 2007 al 25 marzo de 2008, en los laboratorios de Biotecnología del CEPROBI y la cuantificación de los pigmentos se realizó en el Laboratorio de Enzimas del Departamento de Alimentos en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional Unidad Santo Tomás.

Germinación de semillas:La germinación de semillas se llevó a cabo por el método descrito por Ubaldo (2007), evaluando el efecto de la calidad de la luz en el porcentaje de germinación en semillas de cempaxúchil y salud de los brotes. Desinfestación y germinación de las semillasSe lavaron las charolas utilizando hipoclorito de sodio al 10% para su desinfestación y se dejaron secar. El área de trabajo se limpió con una solución de hipoclorito de sodio al 2%. Se escogieron las semillas que tuvieron las siguientes características: tamaño uniforme, estructura rígida y que no estuvieran pálidas o con color amarillento; después se procedió a la desinfestación, para lo cual: primero se sumergieron las semillas en etanol al 100% durante un minuto, después en etanol al 75% durante cinco minutos, posteriormente en hipoclorito de sodio al 2% durante 15 y por último se sumergieron en hipoclorito de sodio al 1% durante 15 minutos. Entre cada etapa se realizaron lavados de un minuto con agua desionizada estéril, para que no quedaran remanentes de etanol o de hipoclorito, todo se realizo manteniendo siempre agitación constante. Una vez lavadas las semillas se pusieron a germinar en cámara húmeda. Las charolas se etiquetaron y mantuvieron a: humedad 80+10% y temperatura 25+4° C, en un cuarto de cultivo (Ubaldo, 2007).

Aclimatación de las plántulasLa aclimatación de las plántulas, se realizó en invernadero de vidrio, en donde se utilizaron una mezcla de turba para su trasplante a maceta el cual favorece el desarrollo de las plántulas en invernadero (Serrato-Cruz, 2004).

Preparación de sustrato.El material utilizado como sustrato consistió en una mezcla de sustratos que como son: turba, vermiculita y agrolita en una relación 3:1:1. Para su preparación, primero se tomaron 100 ml de agua en un recipiente, para posteriormente mezclarlos con 100 g de la combinación de sustratos; después Evaluación del desarrollo vegetativo.

Altura de las plantasLa altura de las plantas, se determinó midiendo (cm) desde el cuello del tallo hasta la última yema terminal con una cinta métrica esta medición se inició cuando los cultivos comenzaron la floración (apertura de los primeros primordios florales) (Ubaldo, 2007).

Transplante a maceta:Las plántulas se pasaron a macetas con sustrato orgánico estéril a los 10 días después de haber germinado, posteriormente las macetas fueron llevadas al invernadero en donde se mantuvieron hasta los 30 días de edad, para posterior traspaso a campo.

Trasplante a campo y mediciones de las condiciones ambientales:Las plántulas se traspasaron a campo con un tamaño de 12±2.0 cm y con más de tres hojas verdaderas, a una distancia de 40 cm entre plantas, dándole seguimiento durante su periodo de crecimiento y desarrollo, en donde se evaluaron las condiciones ambientales imperantes en los meses del desarrollo del cultivo, las condiciones ambientales evaluadas fueron la temperatura (T °C) y humedad relativa (% HR) con un higrotermómetro de la marca Taylor modelo 06A00, la Radiación solar (RadS µmol/mes m2) se midió con un cuantómetro de la marca Apogee Instruments Inc. Modelo QMSW-55 de la serie 1232 y el fotoperíodo (F h) horas de luz disponible durante el día, estas condiciones se registraron diariamente durante todo el ciclo de los cultivos.Evaluación del número de primordios florales:Se registró la fecha en que aparecieron los primordios florales después del transplante a campo y se contabilizó el número de primordios florales; así también, comenzando el periodo de floración, una vez que las inflorescencias abrieron completamente se registró el diámetro (cm) de estas y se pesaron (g); este último dato se utilizó para conocer el peso fresco y peso seco de las flores, el peso seco de las flores so obtuvo deshidratándolas en una estufa eléctrica marca SQUAROID (LAB-Line) estufa al vacio Modelo 3608. se homogenizaron los componentes de la mezcla, se ajustó el pH a 5.8±0.2 con una porosidad al 86% . Colecta de las inflorescencias:

Las inflorescencias fueron colectadas mediante un muestreo completamente al azar con tres repeticiones, en el día 12 después de haber iniciado la floración (apertura de los primeros primordios florales), ya que en este día es cuando se presenta una floración más uniforme en los cultivos (Serrato-Cruz, comunicación personal). Las inflorescencias fueron cortadas al nivel del borde del receptáculo, en las primeras horas de la mañana y colocadas en bolsas polietileno de 15x25 cm, para su posterior análisis.

Determinación del índice de colorEl color se evaluó por el Sistema CIELAB, mediante la determinación del índice de color IC* obtenido por la expresión (1) donde “L” proporciona un valor de la iluminación o brillo de la muestra “a” indica la zona de variación entre el rojo y el verde del espectro y el parámetro “b” se refiere a la zona de variación entre el amarillo y el azul del espectro.Las flores frescas fueron analizadas mediante un colorímetro (Milton Roy (Diano

Una vez colectadas las flores se pulverizaron para realizar la extracción de los pigmentos. En matraces de 250 ml se pesaron 0.2 g de tejido fresco y se adicionaron 15 ml de una mezcla de disolventes compuesta por hexano:etanol:acetona:tolueno (10:6:7:7 v/v/v/v) y se agregaron 2 ml de KOH al 40% en metanol al 80%. Los matraces se cubrieron con papel aluminio y se incubaron a 20 °C, a 200 rpm durante 16 horas en oscuridad. La mezcla se transfirió a un matraz volumétrico de 100 ml y se adicionaron 15 ml de hexano, se agitaron los matraces y se aforaron a 100 ml con Na2SO4 al 10% y se dejaron reposar por una hora. Se separó la fase orgánica y se pasó por una columna preparada con Na2SO4 anhidro y en la parte terminal se colocó una membrana de 0.2 µm (Millipore, Molsheim, Francia) (Anexo II). El volumen recuperado se concentró a sequedad bajo una atmósfera de nitrógeno y las muestras se almacenaron a -70° C hasta el momento de ser analizadas .Cuantificación de xantófilas totales por espectrofotometría UV-VisibleUna vez secas las muestras se resuspendieron en 2.5 ml de acetona para leer las absorbancias de cada una de las muestras en el espectrofotómetro UV/ Visible de la marca Lobomed Modelo UVD-3500 previamente calibrado, a una longitud de 474 nm usando acetona como blanco. Finalmente se reportó el contenido en g de xantófilas por kg de peso fresco (AOAC, 1984).

g de xantófilas totales/ Kg de peso fresco = (2)Donde: Abs: Absorbancia a 474 nm F: Factor de extinción de la luteínaD: Factor de dilución gM: Gramos de la muestra

Identificación y cuantificación de carotenoides por HPLCLos extractos (oleorresinas) de las flores de los cultivos fueron analizados mediante el uso de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Perkin Elmer de la serie 200), equipado con una bomba Binaria (Perkin Elmer Binary LC pump 250) y un detector UV-Vis con arreglo de diodos, el programa utilizado fue el

Turbochrom Navigator versión 4.1. <2F12> Copyrigh Perkin Elmer Corp. 1987-1995. La fase estacionaria fue una columna C18 de la marca Supelcosil LC-18-DB de 5µ con 250 mm de longitud con un diámetro interno de 4.6 mm; para la fase móvil se emplearon dos tipos disolventes constituyentes:

Disolvente A: Acetato de etilo al 100 % Disolvente B: Acetonitrilo-Metanol 90:10 (v/v).

La elusión fue en gradiente, teniendo un tiempo total de corrida de 30 min, con un flujo constante de 1.0 mL/min inyectándose 40 μl de muestra. La detección de los pigmentos se realizó mediante con un detector de arreglo de diodos con un intervalo de 360 a 800 nm, con un registro fijo a 450 nm.

La identificación de los pigmentos se realizó considerando los picos de cada uno de los gráficos y el tiempo de retención de cada pigmento en el cromatograma comparado con un estándar (luteína), además por las absorciones máximas de los espectros con tablas de absorción reportados por diferentes autores. La cuantificación se realizó integrando el área bajo la curva del pico correspondiente al pigmento en el cromatograma.

Estudio de la ultraestructura por microscopia electrónica de transmisión.

El análisis de las lígulas se realizó a través del Microscopio Óptico del Microscopio electrónico de Transmisión (MET).La colecta de las flores de T. erecta se realizo por las mañanas, tomando 4 lígulas de cada flor la fijación de los tejidos de acuerdo a la metodología descrita por Bozzola y Russell (1992) las lígulas fueron cortadas en tamaños de 0.5 cm x 1 cm se sumergieron en una solución de glutaraldehido (C5H8O2) al 3% (Anexo 1) por 2 horas preparado en solución amortiguadora (Anexo 2), pasado este tiempo se realizaron 3 lavados de 10 min con una solución lavadora de PBS (Anexo 3). La post-fijación se realizó con una solución de tetraóxido de osmio (OsO4) al 1% durante 2 h., seguida de 3 lavados de 10 min cada uno con PBS. La deshidratación se llevo a cabo con alcohol etílico en diluciones seriadas del 10 al 90%, con lapsos de 10 min en cada cambio de concentración y 3 cambios con alcohol al 100% de 30 min cada uno. Así mimo las muestras fueron sumergidas en mezclas de alcohol:oxido de propileno con las proporciones de 2:1, 1:1, 1:2 consecuentemente así como en oxido de propileno puro durante 20 min cada cambio. Este procedimiento fue seguido de una pre-inclusión la cual se realizo con una mezcla de oxido de propileno:resina en las mismas concentraciones antes mencionas pero en estas fueron cambios de 30 min hasta resina pura,, para finalmente proceder a la inclusión en resina durante 24 horas a 60ºC.

Los cortes se realizaron en un micrótomo, obteniéndose cortes de 500nm y 70nm, y las observaciones se realizaron a través de un microscopio óptico y con un Microscopio electrónico de Transmisión respectivamente.

Contrastación de la muestra:

Las soluciones de citrato de plomo, acetato de uranilo acuoso y alcoholico se centrifugaron a 10,000 rpm durante 30 min. Los cortes de 70 nm se colocaron en rejillas de cobre de 100 mesh, ya colocadas aquí se llevo a cabo la contrastación en cámaras húmedas en tres etapas:

Las cámaras húmedas fuero hechas con cajas petri de vidrio, en las cuales se coloco parafilm y se agrego una gota de la solución de acetato de uranilo alcohólico sumergiendo las rejillas durante 15 min, pasado el tiempo las rejillas se lavaron tres veces con agua destilada con extran y colocadas en una caja petri.

Se repitió en procedimiento antes descrito cambiando la solución por acetato de uranilo acuoso.

Finalmente se colocaron las rejillas en la solución de citrato de plomo por 20 min y se coloco hidróxido de sodio dentro de la cámara para evitar que la solución precipitara, terminado el tiempo las rejillas se lavaron con agua con extran (limpio) seguido de otros tres lavados.

Procesamiento de las micrografíasPara el procesamiento de las micrografías, se utilizó el programa Corel Photo Paint (V11.0, Corel Corporation, USA). Para esto, las imágenes fueron recortadas y trasladadas a una nueva carpeta a una escala de 8 bits. Ya procesada la imagen en Corel se utilizo el programa de Sigma Scan en el cual se midió el Área (µm2), Perímetro (µm), Eje mayor (µm), eje menor (µm), Factor forma (adimensional), Compacicidad (adimensional) y Factor Elíptico (Ecuación 1).

(adimensional) Ec. 16.5.- Planteamiento Experimental

Obtención y caracterización de la inulina

En este sentido, se obtuvo inulina en polvo a partir del Agave Angustifolia Haw proporcionada por la empresa “Centro de Acopio de Agave Morelense”. Esta actividad formó parte del trabajo de tesis de un alumno de la carrera de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad de La Sabana de Bogotá ColombiaLa materia prima fresca, con corte al día, fue transportada al CEPROBI según compromiso de los cultivadores en la cantidad y con la frecuencia necesarias para la investigación. Se trabajó con cabezas “piñas” de entre 25 Kg. para las de 3 años hasta los 70 Kg. para las 5 años.En esta etapa el cortado “troceado de las piñas se realizó manualmente mediante el uso de machetes para obtener fragmentos de diferente tamaño y deteminar la eficiencia de la extracción del jugo.

Fe ⁼Eje mayorEje menor

A nivel de laboratorio, la molienda se realizó en un licuadora industrial (Internacional nod. LA-5). En este proceso se inicio trabajando con adición de agua a 80°C en proporción 1:1 esto debido a la dureza del material, aunque con el correr de el tiempo y con una modificación en el proceso de cocción, se termino utilizando agua en proporción 1: ½ (Agave – agua). El tiempo de este proceso fue de 1 min.El bagazo obtenido fue prensado, clarificado y filtrado y el jugo obtenido obtenido de esta manera fue concentrado usando un rotavapor , desde 5 hasta 21ºBrix. El residuo fue guardado para su posterior análisisPosteriormente fue secado mediante un proceso de secado por aspersión en el Departamento de Graduados e Investigación en Alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, variando las temperaturas de entrada en el secador (100, 120, 140°C).Las muestras obtenidas fueron analizadas para azucares reductores y totales, fructosa, proteínas, grasas, humedad y cenizas. De igual manera se determinaron los solidos solubles, color, y humectabilidad de la muestra deshidratada.La determinación del tamaño de partícula se realizo mediante el Análisis Digital de Imágenes. La toma de las imágenes se realizó mediante microscopia electrónica de barrido (MEB), el cual esta conectado a un computador mediante interfaz PSI; las imágenes se almacenaron digitalmente con un formato *.tif y una resolución de 72 ppp. Las imágenes tomadas fueron estandarizadas, para el estudio morfométrico, para el cual se uso el Sigma Scan Pro.

Elaboración y análisis de los carotenoides encapsulados con inulina

En una campana de extracción y por triplicado se pesaron y agregaron 1 g de tejido seco a un mortero, se le adicionaron 30 mL de etanol. Se pulverizo el tejido con la mezcla y se colocó en un matraz erlenmeyer cubierto con papel aluminio para evitar el efecto de la luz sobre el extracto. Posteriormente se agregaron 20 mL de KOH al 40% en metanol al 80% y se incubó a 20 °C, con agitación orbital a 200 rpm durante 16 h en una incubadora Lab-line incubator-shaker.

La mezcla se transfirió a un matraz aforado de 100 mL y se adicionaron 30 mL de hexano para el extracto A y 30 mL de etanol para el extracto B, se agitó el matraz, se aforó a 100 mL con Na2SO4 al 10% y se dejó reposar por 1 h. Se separó la fase orgánica y se retiró la fase acuosa con una micropipeta, se pasó por una columna preparada con Na2SO4 anhidro la cual contenía un filtro de 0.2 μm (millipore). Se colocó el volumen recuperado en un tubo falcon puesto a peso constante, se concentró a sequedad bajo atmósfera de nitrógeno en una campana de extracción y almacenó en obscuridad a -70°C en un ultracongelador hasta ser analizadas.

Liofilización

El extracto fue distribuido en un frasco para liofilizar y se congeló durante 14 horas en un Ultracongelador a una temperatura de -72 °C. Después de congelada

la muestra se colocó en una liofilizadora Labconco freeze dryer-18 durante 28 horas hasta sequedad. Se utilizó la liofilización con la finalidad de obtener el extracto completamente seco

Análisis de color

Se calibró el colorímetro MILTON ROY Diano Color Products Color Mate usando el estándar blanco (Serial 4FB4186006), se adicionaron 3mL de la muestra a un tubo vidrio y se leyeron los parámetros L, a, b del sistema color CIELAB, en el cual el parámetro L corresponde a la claridad o brillo, mientras que a y b corresponden a la cromaticidad. El parámetro a define al componente rojo (+) y verde (-).El parámetro b define el componente amarillo (+) y azul (-). Con lo cual se determinó la diferencia de color ΔE descrito por Nava-Rodríguez (1999). Y el índice de color IC* descrito por Vignoni y col. (2006).

Utilizando las siguientes formulas:

ΔE=[(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2]1/2

IC =a.1000

L.b

El IC por sus características de variación puede utilizarse como variable de control de calidad organoléptica de alimentos:

♦ IC* entre -40 a -20, corresponde con colores que van desde el azul- violeta al verde profundo.

♦ IC* es de -20 a -2, corresponde con colores que van desde el verde profundo al verde amarillento.

♦ IC* esta entre -2 a +2, corresponde con colores que van desde el verde amarillento al amarillo pálido.

♦ IC* es de +2 a +20, corresponde con colores que van desde el amarillo pálido al naranja intenso.

♦ IC* es de +20 a +40, corresponde con colores que van desde el naranja intenso al rojo profundo.

Cuantificación de carotenoides de cempaxuchil

Cuantificación espectrofotométrica

En extracto

La calibración se llevo a cabo utilizando celdas de cuarzo y acetona o etanol como blanco según el disolvente usado como agente extractor; posteriormente se tomo la cantidad indicada en el cuadro 1, se mezclo con el disolvente y se realizó un barrido leyendo a una longitud de onda de 380 a 500 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV, no obstante que la longitud de onda máxima para la luteína es de 422 a 474 nm (Rodríguez-Amaya, 2001).

La concentración de los carotenoides presentes en los extractos fue calculada por la ecuación (Aman Robert y col. 2004; Meléndez- Martínez y col. 2007).

x = (A * y)

(A%cm*100)120

Donde x es el peso del carotenoide en gramos, y es el volumen de la disolución en mililitros, A es la absorbancia medida experimentalmente y (A%

cm ) el coeficiente de absorción especifico que es 2550 para luteína en etanol y 2500 cuando no se ha determinado el coeficiente (Rodríguez-Amaya, 2001; Martínez- Meléndez, 2007).

Esta forma de cálculo se utilizó como un criterio de seguimiento de la presencia de los carotenoides durante el proceso.

5.2.5 Elaboración de emulsiones

Se elaboraron diferentes formulaciones de emulsiones las cuales fueron variando en cuanto a su composición, el orden en que se fueron adicionando los materiales, la velocidad y el tiempo de homogenización (cuadro 2), utilizando un homogenizador Virtis “45”.

Se utilizo lecitina de soya Pronat ultra, maltodextrina de 10 E.D. Inamalt 110, aceite La gloria, inulina Agaviotica, Sacarosa grado analítico Merk.

Materiales Formulaciones1 2 3 4 5 6

Lecitina 1 mL d 2.5 mL 3 mL d 30 3 mL d 30Extracto 12 mL c 12 mL b 12 mL c 120 12 mL b 120Maltodextrina 0.5 g e 0.5 g e 0.5 g e 2.5 ºAceite 6.5 mL b 5 mL c 2.5 mL a 15 2 c mL 15Agua 20 mL a 6 a 6 mL b 50 6 mL a 50Sacarosa 2 g f 2 g f 2 g f 5 1.5 g f 5Inulina 0.5 g e 2.5Tiempo(min.) 14 18 16 15 15 30 15 15 15 30 15 15Velocidad 25 27 27 27 27 27

A las emulsiones obtenidas se les realizó análisis de color y extracción de carotenoides, de acuerdo a las técnicas antes mencionadas.

Encapsulación de carotenoides

Determinación de sólidos totales

Se determinó el contenido de sólidos totales en la emulsión 4 con maltodextrina y la emulsión 6 con inulina siguiendo el procedimiento de humedad de la Norma NMX-F-83-1986. Se colocaron a peso constante 3 charolas durante 16 horas en un horno Lab line Imperial V Laboratory oven, posteriormente estas fueron colocadas en un desecador durante 1 hora. Se pesaron 2g de la emulsión y se llevaron a una estufa a 165 °C durante 16 horas.

La humedad contenida en un alimento es determinada como la perdida en peso que sufre al someterlo a las condiciones de tiempo y temperatura prescritos, por lo tanto los sólidos totales son los residuos del alimento.

El porcentaje de sólidos totales fueron calculados de acuerdo a la siguiente formula:

% de humedad = (P-P1)100/ P2

% de sólidos totales = 100 - % de humedad

Donde :

P = peso del recipiente con la muestraP1 = peso del recipiente con la muestra secaP2 = peso de la muestra

Este método se realizo por que para poder encapsular en el secador por aspersión se requería que las muestras tuvieran de un 20% aun 40% de sólidos totales.

5.2.6.2 Secado por aspersión

La emulsión con maltodextrina y la emulsión con inulina fueron secadas en un secador con aspersor diseñado por colaboradores del área de alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, compuesto por: detector de temperaturas Digi-Sense - Scanning Thermometer Cole-Parmer, medidor de flujo para alimentación Easy – Load (Masterflex-uses 15 & 24 turbing) Cole Parmer model 7518-12, medidior de presión Metron – grupo infra de 10-14 Kg / cm2 . Los parámetros de trabajo fueron Temperatura de entrada 170 ° C ± 5 y Temperatura

de salida 80 ° C ± 5 para las emulsiones, con un flujo de aire de 0.3 , presión 1.2 Kg / cm2 y un flujo de alimentación de 20 mL / min, (Rodríguez- Hueso y col, 2004) .

A los encapsulados obtenidos se les realizó análisis de color y se les extrajeron los carotenoides de acuerdo a las técnicas antes mencionadas.

5.2.6.3 Morfología de partículas

Usando la técnica establecida por Bozzola y Russell (1992) se colocó una cinta conductiva en los porta muestras, las muestras (inulina, encapsulado con inulina, maltodextrina y encapsulado con maltodextrina) fueron espolvoreadas sobre la cinta y se introdujo en una ionizadora Denton Vacuum (DESK II) para ser sometida a un baño de oro. Las muestras tratadas se observaron en un microscopio de barrido JEOL J5M-5800LU Scanning Microscope.

5.2.7 Cuantificación de carotenoides de cempaxuchil durante el proceso de encapsulación por HPLC

Las muestras se filtraron a través de una membrana de nylon con poro de 0.45 µm; el Standard de xantofila de alfalfa (Sigma Aldrich Sara 313) y las muestras se inyectaron en un cromatógrafo compuesto por un detector UV/ visible, interfase serie Link, serie 200 Ic Pum, columna C18 Perkin Elmer y Binary Lc Pump. Utilizando un sistema de elusión en gradiente con acetato de etilo 100% como fase A y acetonitrilo: metanol (9:1) como fase B. La velocidad de flujo fue de 1.0 mL / min y se inyectaron 20 µL a una longitud de onda de 450 nm según el programa implementado en la escuela nacional de ciencias biológicas dirigido por Jaramillo Flores (cuadro 3). Todos los disolventes son grado HPLC.

Programa elusión HPLC para flor de cempaxuchil. Fase A: Acetato de etilo 100%; Fase B : acetonitrilo: metanol (9:1)

Step Tiempo (min) Flujo (mL/min) Fase A Fase B

0 0.3 1.0 20 80

1 15 1.0 20 80

2 10 1.0 60 40

3 50 0.3 80 20

La cuantificación de carotenoides se realizo de acuerdo a la siguiente formula:

x = y + 92153 145542

Donde:

x= concentración de carotenoides en µg / µL y = Área

RESULTADOSPRINCIPALES

El mayor número de primordios florales se presentó en los cultivos de transplante en noviembre y diciembre alcanzando 43±8.6 y 50.6±11.5 primordios por planta respectivamente (cuadro 4). Esto pudo ser ocasionado por las bajas temperaturas que se registraron durante estos meses, causando en las plantas el efecto llamado de vernalización, el cual induce la floración en las plantas expuestas a bajas temperaturas.Las flores con mayor diámetro se obtuvieron en los meses julio (5.3±0.5 cm), con la mayor HR (82.55±1.59%) y en las de noviembre (5.2±0.4 cm), en donde aunque la HR fue baja se sumó el hecho de que la radiación solar fue también la mas baja (475.6±23 mol/mes.m2) y aunque no hubo una diferencia significativa con respecto a los otros meses de transplante, si se pudo observar que las flores de octubre tuvieron el tamaño más pequeño (3.2±0.4 cm de diámetro

En el presente trabajo se sugiere que HR que se presenta en los meses de julio a septiembre favorecería el diámetro de las inflorescencias pero al mismo tiempo la radiación solar disminuye dicho efecto. Por otra parte, en los meses de noviembre y diciembre HR baja podría afectar el tamaño de las flores, sin embargo esta situación se compensa con la disminución de la radicación solar y favorecería el tamaño, lo que hace pensar que puede ocurrir un equilibrio que se ve reflejado en el diámetro de las flores, pero no así en el peso de las mismas.

Indice de color de las inflorescencias en campo

RESULTADOS

Tagetes erecta y carotenoides

Variación de las condiciones ambientales del experimento en campo, desde el inicio del primer cultivo hasta la última colecta de inflorescencias (julio 2007 a marzo 2008).

Condición Ambiental

Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero

Temp. Max.(°C)

29.5±1.4a 28.9±1.9a 28±1.4a 30.4±1.7a 31±2.7ab 28.5±0.8a 27±1.5a 34.6±1.7bc

Temp. Min.(°C)

12.9±1.2a 13.9±0.98a 12.7±0.94ac 11.4±1.02ab 10±1.2bc 9.5±1.8b 8.5±1.6b 11.8±0.7ab

Temp. Prom.(°C) (NS)

19.9±8.9 20.2±8.2 19.1±8.2 19.6±10.2 19.2±11.4 17.7±10.2 16.6±9.9 21.9±12.2

HR Prom.(%)

82.55±1.59a 82.03±1.81a 79.12±1.16a 66.76±3.5ab 57.01±4.2ab 53.72±3.1ab 47.81±2.3bd 46.4±2.7b

Rad. Solar(mol/mes.m2)

645.5±101a 684.8±18a 696.6±27a 561.6±15.9a 554.8±38ab 475.6±23b 487.8±8.26b 535.2±23.3ab

Fotoperíodo(h)

13.12±0.12a 12.75±0.56a 12.29±0.34a 12.01±0.14a 10.17±0.16a 9.35±0.01ab 9.1±0.01b 8.96±0.09b

Precp. Acum.(mm)*

281.45 236.4 202.2 41 0 0 0 0

Los datos son valores de medias (±desviación estándar), las diferentes letras indican que hay diferencias estadísticamente significativas de las variaciones ambientales de los diferentes meses de acuerdo con la prueba de Tukey con P<0.001. (NS) No significativo. *Prueba no realizada.

IC*=Índice de color

Las flores procedentes de las fechas de transplante restantes presentaron valores mayores de 2 lo que indica, de acuerdo con la nomenclatura del índice de color (2-20), que los colores van desde el amarillo pálido al naranja intenso.

Variación de la acumulación de xantófilas totales en las diferentes épocas de treansplante. Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con Tukey para

una (P≤0.05). *Mes de siembra por motivos religiosos.

En este trabajo, cuando las radiaciones solares fueron menores en los meses de noviembre y diciembre (575 y 475 mol/m2.mes) se favoreció la acumulación de estos compuestos y por el contrario en los meses de mayor radiación solar el contenido fue menor debido posiblemente a que ésta puede estar dañando a los pigmentos oxidándolos y transformándolos en grupos epóxido.

Específicamente los cromatogramas de los extractos de las inflorescencias de cempaxúchil del cultivo de julio presentaron un perfil típico de xantófilas, con un pico principal a los 4.72 min el cual correspondió a luteína comparado con el estándar correspondiente, también se observaron otros picos adyacentes al principal, los cuales posiblemente sean esteres e isómeros de luteína.

(1)

(2)(3)

Estudio de la ultraestructura

En las micrografías obtenidas en el Microscopio Electrónico de Transmisión (MET), se observaron diferencias en la morfología de las células, así como en los componentes de los plastidios que estas presentaron como: en las membranas de tilacoides y en la acumulación de plastoglobulos. Para el caso de los cromoplastos se observaron en diferente etapa de desarrollo los cuales presentaron en su mayoría la presencia de membrana de tilacoides la cual es característica de los cloroplastos, así como la presencia de plastoglobulos característica de la presencia de carotenoides, sin embargo también se observo lo que pareciera ser un granulo de almidón.

Micrografías de los plastidios con diferentes etapas de desarrollo, obtenidos de cortes de lígulas. En las estructuras se indican mt-membranas de tilacoides, Pl-plastoglobulos, a-granulo

de almidón y Pc –Pared celular.Escala de observación: A) 50000X B) 30000X C) 25000X D) 40000X

Este análisis se muestra por medio de un histograma de distribución de tamaño de partícula para plantas de 3 y 5 años de maduración y diferente temperatura .

En las fotomicrografias siguientes se muestran características morfológicas del polvo obtenido y de una muestra comercial proporcionada por la empresa Agaviótica

3 años 5años 100ºC 120ºC 140ºC1 1,307 - 2,615 14 52 29 7 402 2,616 - 3,922 27 29 37 42 303 3,923 - 5,229 15 2 18 31 144 5,230 - 6,536 4 1 3 7 95 6,537 - 7,843 3 0 3 1 16 7,844 - 9,15 1 0 1 2 17 9,151 - 10,458 0 0 0 1 08 10, 458 - 10,854 0 0 1 0 0

IntervalosTamaño (micras)Frecuencias

A

B

r

cr

A

m

P

Micrografía(MEB) de la muestra Secada por aspersión

Adicionalmente a éstas, se obtuvieron micrografías del tejido de las “piñas”, por microscopia optica y MEB, en el Lab de microscopía del CEPROBI, con la finalidad de evaluar su dureza dirigido a establecer el tipo de molienda óptima . Estos resultados serán concluidos y presentados en el siguiente informe La inulina obtenida esta siendo ocupada para encapsular carotenoides, trabajo que ha sido el tema de una tesis de una alumna de la Licenciatura de Ing. Bioquímica del ITAEl producto de los lavados en este proceso esta siendo colectado y concentrado para llevar a cabo el análisis de azúcares correspondientes, con la finalidad de aprovechar este subproducto del proceso definido como una mezcla de azúcares. Actualmente tanto el polvo obtenido alto en fructanos como la mezcla de azúcares se enviaron al CIBIS, institución participante en el proyecto para el análisis del contenido de inulina.

Microencapsulación con Inulina

Para concentrar y eliminar el agua en el extracto B, sin afectar los carotenoides por la aplicación de calor, se optó por la liofilización mediante la cual se obtuvo un polvo de color amarillo muy higroscópico, característica que es benéfica por que se puede introducir con facilidad en una emulsión

Cuantificación de los carotenoides

Cuantificación espectrofotómetrica En extracto: El pico más alto se observó a una longitud de onda de 445 nm, lo que indica, que hay presencia de luteína

Espectro de absorción de los extractos de carotenoides realizados con HEAT y con etanol

Elaboración de emulsiones

Se seleccionó la formulación 4 y 6 con matriz de maltodextrina e inulina respectivamente, debido a que en éstas se conservó el color amarillo, lo cual se relacionó con la cantidad de lecitina adicionada ya que ésta puede funcionar como antioxidante además de ser un emulsificante. En las primeras pruebas en las cuales la cantidad de lecitina fue menor se desarrollo un color café, debido probablemente a reacciones de oxidación.

Las dos formulaciones seleccionadas fueron estables, aunque la formulación con inulina conservó el color amarillo después de 1 semana de elaboración; debido probablemente a que la inulina posee mayor capacidad de mantener las emulsiones estables.Encapsulación de carotenoides

Determinación de sólidos totales La emulsión elaborada con la matriz de inulina como pared encapsulante tuvo 28.37% de sólidos totales y la emulsión realizada con la matriz de maltodextrina tuvo 27.08 % de sólidos totales por lo tanto, las emulsiones estuvieron dentro del intervalo de 20 a 40 % de sólidos totales, considerado necesario para llevar a cabo el secado por aspersión.

Secado por aspersión

Después de secar las emulsiones se obtuvieron los encapsulados de color amarillo; aquellos en los que se uso como base maltodextrina presentaron una textura granular, mientras que los de inulina no presentaron esta característica, además de humedecerse más rápido al contacto con el medio ambiente

Imagen que muestra el encapsulado de carotenoides con inulina

Morfología de partículas

El análisis de la morfología demostró que las partículas de la inulina comercial presentaron formas esféricas con una amplia variedad de tamaños, de entre 25 a 150 µm de diámetro; de estas, las más grandes se observaron colapsadas., mientras que las más pequeños conservaron la superficie lisa. No obstante lo anterior, el encapsulado con inulina presentó partículas de menor tamaño en un intervalo de 3 a 15 µm de diámetro (Figura 12). La mayoría de estas partículas

a) b)

conservaron la forma esférica, formaron agregados de aproximadamente 400 µm de largo y presentaron una superficie relativamente lisa, las cuales son diferentes a las estructuras observadas por Escalona López, 2004 de encapsulados con maltodextrina y con aislado proteico de soya, debido a que no formó abolladuras que se presentan por la contracción del secado y enfriado (Rosenberg y col. 1985).

Morfología de las partículas de inulina y del encapsulado de carotenoides con inulina

Por otra parte la maltodextrina comercial presentó partículas de formas esféricas y alargadas con una amplia variedad de tamaños que fueron desde 7 a 120 µm de diámetro y de 30 a 120 µm de largo; en este caso también las esferas más grandes se colapsaron mientras que las pequeñas conservaron la superficie lisa. Las partículas del encapsulado con maltodextrina presentaron un diámetro de 5 a 15 µm de diámetro semejante a las del encapsulado con inulina.

Cuantificación de carotenoides por HPLC durante el proceso de encapsulación.

En las muestras de flor de cempaxuchil se tuvo un contenido de 984.5 µg de luteína/ g de flor. El contenido inicial de luteína en las emulsiones con maltodextrina y con inulina el cual corresponde a 8.95 y 9.14 µg de luteína/ 250 mg de emulsión respectivamente y de esta cantidad se conservó el 77 y el 75 % en los encapsulados correspondientes. De acuerdo con los resultados obtenidos, la inulina tiene un efecto protector sobre el carotenoide referido similar al ejercido por la maltodextrina, que es un compuesto efectivo como matriz

Cantidad de luteína en los extractos de carotenoides durante el proceso de encapsulación.

Muestras Cantidad de luteína Emulsión con maltodextrina) 8.95 µg de luteína / 250 mg de

emulsiónEmulsión con inulina) 9.14 µg de luteína / 250 mg de

emulsiónEncapsulado con maltodextrina) 6.9 µg de luteína / 250 mg de

encapsuladoEncapsulado con inulina) 6.9 µg de luteína / 250 mg de

encapsulado

Análisis de colorimetría

c)

a) b)c) d)

Como se muestra en el cuadro 8 los encapsulados elaborados con inulina y con maltodextrina tuvieron un cambio en el color que se manifiesta en el ∆E, derivado del incremento de L (de 34 a 51), a (de 0.06 a 2.2) y b (de -2.1 a 22.4).

En el proceso de encapsulación usando la matriz de Inulina, el color de acuerdo con el IC calculado varió desde un amarillo verdoso en el extracto de los carotenoides inicial a un naranja intenso durante la emulsión y terminando con un amarillo pálido después del secado según los parámetros descritos por Vignoni y col. (2006).En el proceso de encapsulación con la matriz de Maltodextrina el IC también presentó variaciones en el color, iniciando de igual manera que en el anterior con un amarillo verdoso en el extracto de los carotenoides, mismo que se conservó en la emulsión y terminado con un amarillo pálido durante el encapsulado.

Resultados del análisis de color durante el proceso de encapsulación con diferentes matrices.

Muestras ΔE C.I

Extracto a partir de flor 66.04 -0.8094

Emulsión con inulina 58.98 30.5843

Emulsión con maltodextrina 57.84 -0.8960

Encapsulado con inulina 57.66 2.7250

Encapsulado con maltodextrina 53.35 1.8973

IMPACTO DEL PROYECTO.

Para el desarrollo del proyecto se trabajo directamente con productores de T. erecta y agave Angustifolia Haws, mismos que están interesados en la utilización de los resultados de éste para la elaboración de productos que brinden oportunidad de negocio. Este proyecto que se termina y el que se esta proponiendo están relacionados con el FOMIX MOR-2007-C01-80576, cuyo objetivos elaborar productos que puedan ser escalables para producción industrial a mediana escala en el corto plazo, con las repercusiones sociales y económicas que esto conlleva a la comunidad de productores así como por la generación de empleos. Adicionalmente se están aportando ingredientes de alto valor biológico para estar utilizados por la industria alimentaria

BiblografíaChacon – Villalobos 2006 Perspectivas agroindustriales actuales de los oligofructosacáridos (FOS)Dorais M., Papadopoulos AP and Gosselin A. 2001. Greenhouse tomato fruit quality. Horticultural Reviews. 26: 239-319.Dumas Y., Dadomo M., Di Lucca G y Grolier P. 2003. Effects of environmental factors and agricultural techniques on antioxidants content of tomatoes. Journal of the Science of Food and Agriculture. 83: 369-382.Emter, O., Falk, H., and Sltte, P. (1990). Specific carotenoids and proteins as prerequisites for chromoplast tubule formation. Protoplasma 157, 128-135.

Kleinig. H. and Liedvogel, B. (1980). Fatty acid synthesis by isolated chromoplasts from the daffodil. Energy sources and distribution patterns ofthe acids. Planta150:166-169.

Rodriguez-Amaya, DB. 1999. Changes in carotenoids during processing and storage of foods. Archivos Latinoamericanos de Nutición 49: 38S–47S.Searle L y Coupland G. 2004. Induction of flowering by seasonal changes in photoperiod. The Embo Journal 23: 1227-1222.Serrato-Cruz MA. 2004. Cempoalxochitl. Ciencia y Desarrollo en Internet. 2004/1. [En línea] Disponible: http://www.conacyt.mx/comunicacion/revista/181/articulos/pdf/Cempoalxochit.pdf