Estudio “in vivo” de la Conjugación de Ubicuitina a la GAP-43 en las Células NIH3T3 en Cultivo

Título del proyecto: “Estudio de la Growth Associated Protein (GAP-43), su interacción con la Ubicutina y su participación en el control del ciclo celular en células NIH3T3 transfectadas en forma estable y transiente.” Investigador Responsable: Dra. Ana María AdamoColaboradores: De Moliner, Karina L. (a cargo de los estudiantes) Millanovich, Verónica L. Aparicio, Evangelina Milanesio, Berenice Instituto: Departamento de Química Biológica Patológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA. IQUIFIB-CONICET.Alumnos: Rodrigo C. Pampin y Robby Mattes

Índice

1) Resumen Página 3 a) English Página 42) Introducción Página 53) Parte Experimetntal Página 8 a) Amplificación de los Plásmidos Página 8 I) Digestión Enzimática Página 10 II) Electroforesis Página 10 b) Purificación Del Plásmido en Gran Escala Página 10 I) Midiprep Página 10 c) Cultivo Celular Página 11 I) Transfección de Células Página 114) Resultados Página 13 a) Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC Página 13 b) Control de los Plásmidos Después de su Purificación Página 13 c) Cuantificación de la Cantidad de ADN Para Realizar las Transfecciones Página 14 d) Cultivo Celular Página 14 e) Transfecciones de los Plásmidos NY-Ub y Jun-CC Página 155) Conclusiones Página 16 a) Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC Página 16 b) Electroforesis Página 16 c) Cuantificación por Absorbancia Página 16 d) Transfección Página 16 e) Conclusión final Página 176) Bibliografía Página 17

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Resumen

La Growth-Associated Protein (GAP-43) es una proteína específica del sistema nervioso. Cuando se expresa en las neuronas durante el desarrollo promueve el establecimiento y la remodelación de las conexiones neuronales. Trabajos de distintos grupos de investigadores han demostrado que el nivel de esta proteína está controlado por la estabilidad de su ARN mensajero. Sin embargo, no se sabía nada acerca del control de la vida media de la proteína. Recientemente, De Moliner y col. han demostrado que la GAP-43 se degrada por el sistema Ubicuitina-proteasoma, un sistema de proteolítico caracterizado por su alta especificad. La GAP-43 es una proteína que se ubica en la membrana plasmática y hasta el momento no se sabe cuáles son las señales que la convierten en un blanco para este sistema proteolítico ni el lugar subcelular donde se produce la conjugación con Ubicuitina para su posterior degradación por el porteasoma. Con el objeto de realizar estudios in vivo en cultivos celulares para determinar el sitio subcelular donde se lleva a cabo la conjugación, se decidió poner a punto una técnica que se basa en la complementación de fluorescencia. Para tal fin utilizaremos una línea de fibroblastos, NIH-3T3. Las células serán transfectadas con dos plásmidos simultáneamente, el pFLAG-CMV2 que tiene la secuencia de ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent Protein (YN-Ub) y el pECFP que tiene la secuencia de la proteína Jun (que es un sustrato conocido del sistema Ubicuitina-proteasoma) fusionada al fragmento C-terminal de la Cyan Fluorescent Protein (Jun-CC). Cuando in vivo se produzca la conjugación de Jun con ubicuitina, el fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent Protein se unirá al fragmento C-terminal de la Cyan Flurescent Protein y se observará fluorescencia en el área subcelular donde este proceso haya ocurrido. Una vez puesta a punto esta técnica en nuestro sistema, se insertará la secuencia de GAP-43 en el sitio donde se encuentra de secuencia de Jun para poder realizar los estudios propuestos.

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English:

The Growth-Associated Protein (GAP-43) is a specific protein of the nervous system. When it is expressed in neurons during development, it promoves the growth and repair of neural conexions. The works from different groups of investigators have shown that their ARN messenger’s stability controls the level of this protein. On the other hand, nothing was known about the control of the standart life of this protein. Recently, De Moliner and col. have demonstrated that the GAP-43 is degraded via the Ubiquitin-proteasome system, a proteolytic system characterized for it‘s high specify. The GAP-43 is a protein that is located in the cell membrane and, until now, nothing is known about the signals that converts it into a target for this proteolytic system or the subcelular place where the conjugation with Ubiquitin, for later degradation via proteasome, takes place. With the objetive of studying in vivo cell cultures to determinate the subcelular place where the conjugation takes place, we decided to improve a technique that is based in fluorescense complementation. For that purpose we will use a line of fibroblasts, NIH-3T3. The cells cultures will be transfected with two plasmids at the same time, the pFLAG-CMV2 wich conteins the sequence of Ubiquitin fusioned to the N-terminal of the Yellow Fluorescent Protein (YN-Ub) and the pECFP that contains the sequence of the Jun Protein (known substrate of the Ubiquitin-proteasome system) fusioned to the C-terminal of the Cyan Fluorescent Protein (Jun-CC). When the in-vivo conjugation of Ubiquitin and Jun happens, the N-Terminal of the Yellow Fluorescent Protein will join into the C-terminal of the Cyan Flurescent Protein and we will be able to see fluorescense in the subcelular area where this process has taken place.Once improved this technique in our system, the sequence of GAP-43 will be inserted in the place of the Jun sequence allowing the proposed studies.

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INTRODUCCIÓN

El sistema nervioso es una red de tejidos altamente especializada. El componente principal de esta red son las neuronas, células conectadas entre sí de forma compleja, que poseen la característica de transmitir una enorme variedad de estímulos dentro del tejido nervioso, utilizando señales electroquímicas, y hacia el resto de los tejidos, coordinando así múltiples funciones del organismo. Se subdivide en el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico. Este último está constituido por los nervios, craneales y espinales, procedentes del sistema nervioso central, y por los ganglios periféricos, que contienen los únicos cuerpos neuronales fuera del sistema nervioso central. El sistema nervioso central, constituido por el cerebro, el cerebelo, el tronco cerebral y la médula espinal, está protegido por las meninges, tres membranas que lo recubren. En su interior existe un sistema de cavidades, con el nombre de ventrículos, por los cuales circula el líquido cefalorraquídeo.

Las células que forman el sistema nervioso central están distribuidas de tal forma que dan lugar a dos formaciones muy características: la sustancia blanca, compuesta principalmente por las prolongaciones nerviosas, las dendritas y los axones. Las funciones del axón son el transporte tanto de organelas como de otros componentes celulares y la conducción del impulso nervioso. La sustancia gris está formada por los cuerpos neuronales.

El grupo de investigación que dirige actualmente la Dra. A. Adamo hace unos años se interesó por estudiar la importancia de la Ub en la degradación de proteínas en el sistema nervioso central (SNC) ya que parecía tener una gran importancia en el desarrollo de ciertas enfermedades neurodegenerativas. La función de una proteína puede alterarse por cambios en su conformación, su localización o por interacción con otras moléculas. Un camino eficiente para llevar a cabo este cometido, es su modificación post-traduccional, a través de la adición de otras moléculas. Una de estas modificaciones post-traduccionales es la ubicuitinización de una proteína que consiste en la adición de varias moléculas de ubicuitina (Ub) a dicha proteína. La Ub es un

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polipéptido de 76 aminoácidos, altamente conservado que se expresa en todas las células eucarióticas. El sistema Ubicuitina-proteasoma es un camino proteolítico caracterizado por su alto grado de especificidad y selectividad. Este sistema está involucrado en:

- La regulación del ciclo celular- La diferenciación y el desarrollo- La respuesta celular a efectos extracelulares y al estrés- La modulación de los receptores de superficie celular y canales iónicos- La reparación del ADN- La regulación de la respuesta inmune e inflamatoria- La biogénesis de organelasEste sistema de degradación proteica mediado por la ubicuitina y el proteosoma es sumamente complejo y está integrado por un conjunto de enzimas conocidas como E1 o enzima ligadora de ubicuitina, una familia de enzimas E2 o enzimas conjugantes y la familia de E3, ligasas, que son las que les confieren la especificidad a este sistema proteolítico, dado que reconocen al sustrato que se conjugará con ubicuitina para ser degradado por el proteasoma.

En el esquema se representa lo antedicho y se observa que varias moléculas de ubicuitina deben unirse a la proteína sustrato para que ésta sea reconocida por el proteasoma para su degradación. Es importante mencionar que una vez degradada la proteína sustrato, las moléculas de ubicuitina pueden ser reutilizadas para conjugarse a nuevos sustratos. Entonces, con el objeto de identificar sustratos neuronales de este sistema proteolítico y su relevancia en el desarrollo y la patología del SNC estudiaron el recambio de una proteína neuronal, importante durante su desarrollo, la GAP-43 (growth-associated protein). La GAP-43 es una fosfoproteína específica de las neuronas que se encuentra especialmente en el cono de crecimiento neuronal y en las sinapsis (Skene et al., 1986; Benowitz and Perrone-Bizzozero, 1991) y está localizada en la superficie interna de la membrana plasmática. La función precisa de esta proteína no se conoce completamente pero probablemente participe en los mecanismos de traducción de señales a nivel de la membrana del terminal nervioso. El nivel de esta proteína está controlado por la estabilidad de su ARN mensajero pero no se sabía nada acerca de su degradación. En este campo de investigación el grupo de investigación con el que estamos trabajando ha demostrado que la GAP-43 es degradada por esta vía (De Moliner et al., 2005), sin embargo, no se conoce aún el sitio subcelular donde se produce la conjugación de esta proteína con ubicuitina para su posterior degradación. Nuestro objetivo, en esta pasantía, es poner a punto una metodología de complementación de fluorescencia (Deyu Fang and Tom K. Kerppola, 2004) para poder estudiar en las células “in vivo” donde se produce la conjugación de ubicuitina con la GAP-43. Para esto utilizaremos dos plásmidos, pFLAG-CMV2 (de Sigma) que contiene la secuencia que codifica para la ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent Protein (YN-Ub) y el plásmido pECFP (Clontech) que contiene la secuencia que codifica para la proteína Jun fusionada al fragmento C-terminal de la Cyan Fluorescent Protein (Jun-CC). Al conjugarse la proteína Jun con ubicuitina para su posterior degradación por el proteasoma, el fragmento N-terminal de la Yellow

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Fluorescent Protein se unirá al fragmento C-terminal de la Cyan Fluorescent Protein y se podrá observar fluorescencia en el área subcelular donde se produzca esa unión.Una vez puesto a punto este sistema, se reemplazará la secuencia de la proteína Jun por la de la GAP-43 y se caracterizará la conjugación de la GAP-43 a la ubicuitina. Estos estudios se realizarán mediante la transfección de ambos plásmidos a la línea de fibroblastos NIH-3T3 y permitirá confirmar la conjugación de ubicuitina a la GAP-43 caracterizando el sitio celular donde este proceso ocurre.

Parte Experimental

Amplificación de los Plásmidos:

Utilizamos los plásmidos pFLAG-CMV2 (Sigma) (A), que contiene la secuencia que codifica para ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la enhanced yellow fluorescent protein (YN-Ub), y el plásmido pECFP (Clontech) (B), que contiene la secuencia que codifica para la proteína Jun (2-319) fusionada al fragmento C-terminal de la enhanced cyan fluorescent protein (Jun-CC).

(A)

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(B)

El plásmido que codifica para YN-Ub le confiere a las bacterias transformadas resistencia a ampicilina y el que codifica para Jun-CC les confiere resistencia a kanamicina. Se realizaron las amplificaciones de cada plásmido por duplicado mediante la transformación de bacterias competentes. Para ello, a 100 μl de la suspensión de bacterias competentes se le agrega 1μg de ADN (plásmido), se lo incubó durante 30 minutos a 4ºC, luego 1 minuto a 42ºC y se lo llevó nuevamente a 4ºC durante 2 minutos adicionales. Finalmente se agregaron 300 μl de LB (10gr de tryptona, 5gr de extracto de levadura y 10gr de

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(C)

NaCl, disueltos en 1 litro de agua) sin antibiótico y se incubó durante una hora a 37ºC, con agitación. Por último, se sembraron 50 μl de la suspensión de bacterias transformadas en placas de LB/agar en presencia de ampicilina 20 μg/ml y en presencia de kanamicina 10 μg/ml según corresponde para cada plásmido como se muestra en la figura (C)Las placas se incubaron durante aproximadamente 12 hrs. a 37ºC.Seleccionamos 2 colonias aisladas de cada placa, las colocamos en el medio de cultivo LB con el antibiótico correspondiente para cada caso y las dejamos incubando durante toda la noche a 37ºC.Para controlar que las bacterias se transformaron correctamente, se purificaron los plásmidos a partir de las mismas. Se tomaron 1,5 ml de cada uno de los cultivos de las bacterias y se centrifugaron a 10000 x g durante 2 minutos.

Se preparó una mezcla conteniendo 10 μl de Lisozima y 90μl de buffer TELT (Tris/HCl ph: 7.5 50 mM, EDTA 62,5 mM, Triton X-100 0,4% y ClLi) por tubo, se agregó a las suspensiones de bacterias y se agitó utilizando un vortex para lograr una buena resuspensión.Para permeabilizar las membranas de las bacterias, las muestras se dejaron 5 minutos a temperatura ambiente, se llevaron a 100ºC durante 1 minuto y luego se dejaron en hielo

por 2 minutos. Las suspensiones se centrifugaron durante 15 minutos a 10000 xg y se recogió el sobrenadante (Figura D), al cual se agregó 1 volumen equivalente de isopropanol y se dejaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se centrifugaron durante 20 minutos a 10000 x g y se descartó el sobrenadante. Se agregaron 10μl de etanol 70% (v/v) y se centrifugó durante 5 minutos a 10000 xg. Las muestras se secaron al vacío, se resuspendieron en 10 μl de agua estéril

y se conservaron las muestras a -20ºC hasta la semana siguiente.

Digestión Enzimática:

Se preparó una mezcla con 5μl del plásmido, 1μl de ARNasa, 10μl de agua estéril, 4μl de Bam H1 (Promega), en un volumen final de 20μl, y se deja 2 hrs. a 37ºC.A dicha mezcla se le agrega 4μl de buffer loading (azul de bromofenol y glicerol 30%), y se siembra la totalidad en un gel de agarosa 1%. (Figura E)

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(D)

(E)

Electroforesis:Se evaluó la presencia de los plásmidos mediante una electroforesis en un gel de azarosa 1% (0,5gr de agarosa, 50ml de buffer TBE [2,7gr Tris, 1,3075 de ácido bórico, 1ml de EDTA 0,5 molar pH 8]) y 4μl de Bromuro de Etidio. (F). Se observó la presencia de ambos plásmidos en las preparaciones evaluadas.

Purificación Del Plásmido en Gran Escala:

Midiprep:

Se realizó una midiprep para la purificación del ADN utilizando un kit comercial de Wizard Plus Midipreps DNA Purification System (Promega) que permite un método de aislamiento rápido y confiable para el ADN. (G). Una vez obtenido el ADN, se realizó una nueva digestión enzimática para realizar una electroforesis en geles de azarosa 1% para la cuantificación utilizando un estándar גHind III. También se realizó la cuantificación midiendo la relación de absorvancias a 260 y 280 nm.

Cultivo Celular:

Las células 3T3 se cultivaron a 37ºC, bajo atmósfera de 5% de CO2 en DMEM alta glucosa conteniendo suero fetal bovino 10% v/v, antibióticos penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml (medio completo). Esta línea celular crece formando una monocapa que se la evalúa según el grado de confluencia de la misma. Cuando esta monocapa alcanza aproximadamente el 70-80 % de confluencia se realizan los subcultivos (H). Se descartó el medio en el cual están creciendo y se trató la monocapa

con 2 ml de una solución de Hanks, pH 7.4 conteniendo tripsina 0.25% (P/V) y EDTA 1mM. Se incubó durante no más de 5 minutos, se puede observar,

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(F)

(G)

macroscópicamente, el desprendimiento de la monocapa. Luego se neutraliza la tripsina con 1ml de suero fetal bovino.Posteriormente se tomó el medio resultante y se disgregaron las células mediante pasajes a través de una pipeta de 10 ml. La suspensión celular se centrifugó a 800 xg durante 5 minutos y el pellet conteniendo las células se resuspendió en el medio de cultivo. Alícuotas de esta suspensión se sembraron en placas o frascos T75 según el requerimiento de posteriores experimentos.

Transfección de Células:

El día anterior al experimento se sembraron 3000 células en placa de 24 pocillos conteniendo cubre objetos de vidrio previamente tratados con poly-L lisina. En el momento de la transfección, las células estuvieron en un 70-80 % de confluencia, fase exponencial del crecimiento de las mismas donde el ingreso del plásmido esta favorecido. Para cada pocillo se obtuvo una mezcla de transfección que constó en la preparación en forma separada de dos soluciones. En una de ellas se diluyó 1 g de DNA (ya sea el plásmido YN-Ub o el Jun-CC) en 200 l de medio libre de suero y antibiótico. La otra solución contenía 5l de LipofectaminaTM 2000 diluida en 200 l de medio libre de suero y antibiótico (I). Ambas soluciones se dejaron reposar aproximadamente 15 minutos. Luego de la incubación se combina el ADN diluido con la solución de LipofectaminaTM 2000 para la formación de los complejos y se le adicionan 600 l del medio sin suero y sin antibiótico (volumen final 1 ml). Se mezcló suavemente y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto la monocapa de células se lavó con medio libre de suero y antibiótico y cumplido los 45 minutos se le agregó a cada pocillo los complejos (J). Las células se incubaron en estufa en su forma habitual y 5 horas más tarde se les agregó a cada pocillo 1ml de medio conteniendo 20% de suero fetal bovino, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml (2 x el medio completo). De esta manera, al entrar en contacto con el medio presente, este se diluyó a su concentración habitual. Al día siguiente se cambia el medio de cultivo y se incuba hasta cumplidas las 24 hrs. post-transfección. Posteriormente se incubaron las células 6 hrs. a 30ºC para poder observar la complementación de fluorescencia ya que esto favorece la maduración del fluoróforo. Una vez cumplido ese tiempo las células fueron fijadas con paraformaldehido 4% en PBS durante 20 minutos. Luego se procedió a lavados exhaustivos con PBS para eliminar restos de paraformaldehido y finalmente los cubreobjetos de vidrio fueron montados en portaobjetos con medio de montaje para fluorescencia (Dako). Las células se mantienen

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(H)

en oscuridad. Se observo la fluorescencia de las células transfectadas con microscopio de fluorescencia (Olympus Optical CO, LTD, Japón) y se capturó la imagen de las mismas ya que este posee una cámara acoplada Olympus BX50.

Resultados

Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC:

Para la transformación se procedió como se describió en la metodología. Luego del cultivo, se observó que las bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub se multiplicaron como se esperaba mientras que no hubo desarrollo de las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CC. Con estos resultados decidimos repetir la transformación de las bacterias con el plásmido Jun-CC. Después de repetir el

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(H)

(I)

procedimiento se obtuvo desarrollo de las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CC. Solo las bacterias que habían incorporado el plásmido, y por lo tanto resistentes al antibiótico, formaron colonias (Figura 1). Se observaron colonias en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub pero solo unas pocas colonias dispersas se observaron en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CC.

Figura 1. Crecimiento de colonias resistentes al antibiótico de selección.

Placa representativa del crecimiento de colonias de las bacterias que incorporaron el plásmido.

Control de los Plásmidos Después de su Purificación:

El control de los plásmidos después de su purificación se realizó por electroforesis en geles de agarosa como se describió en la metodología. Los resultados de la misma se observan en la Figura 2

Figura 2. Gel de Agarosa 1%

Las bandas correspondientes a los plásmidos fueron visualizadas con bromuro de etidio que emite fluorescencia cuando se ilumina con luz ultravioleta.

Cuantificación de la Cantidad de ADN Para Realizar las Transfecciones:

La cantidad total de ADN presente en las muestras de los plásmidos purificados se determinó midiendo la absorbancia de una alícuota de dichos plásmidos a 260 nm y a 280 nm con un espectrofotómetro. La absorbancia a 260 nm se empleó para calcular la concentración de ADN. Una solución de 50 μg/ml proporciona una absorbancia de 1, por lo que la concentración de ADN en la muestra en μg/ml es igual a 50 x A260 nm. El

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cociente de absorbancias 260/280 se utiliza para calcular la pureza de la preparación. Un cociente inferior a 1.8 indica que hay impurezas. Tabla 1

Tabla 1:

260nm 280nm 260/280 ConcentraciónYN-Ub 0,344 0,227 1.5 0.592 μg/μlJun-CC 0,932 0,605 1.5 2.33 μg/μl

Cultivo Celular:

Se procedió a realizar el cultivo de células como fue descripto en la metodología. Las células en presencia de medio completo alcanzaron un 70-80% de confluencia.

Figura 3. Visualización de la monocapa en microscopio óptico invertido

Imagen mostrando la morfología de las células NIH3T3 y la formación de la monocapa.(Aumento 20x)

Transfecciones de los Plásmidos NY-Ub y Jun-CC:

Se procedió según la metodología. En la figura 4 observamos las células transfectadas con las distintas construcciones y la cotransfección con ambos plásmidos. De esta manera evaluamos la interacción entre Jun y Ubiquitina.

Figura 4. Visualización de la ubicuitinización en células NIH3T3. Ubicuitinización por complementación de fluorescencia.

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Visualización de los conjugados de Jun con ubicuitina. Las imágenes fluorescentes fueron tomadas 30 hs después de la transfección.

Conclusiones

Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC:

Pudimos obtener un crecimiento de colonias aisladas tanto en presencia de ampicilina como en presencia de kanamicina que demuestra que las bacterias fueron transformadas

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correctamente con los distintos plásmidos y por lo tanto adquirieron la resistencia a los antibióticos.

Electroforesis:

Se demostró la presencia de los plásmidos en las muestras. Las bandas obtenidas corresponden al tamaño de cada uno de los plásmidos siendo las mismas de aproximadamente 4.5 bp cuando se la compara con el estándar.

Cuantificación por Absorbancia:

Determinamos la concertación de ADN en las muestras. Esto nos sirvió para conocer la concentración de los plásmidos y realizar así una correcta transfección a las células, ya que la misma requiere que haya una relación ADN/Lipofectamina óptima para que la eficiencia de transfección sea la mayor posible.

Transfección

Se pudo obtener una visualización directa de los conjugados de Jun con ubicuitina en las células transfectadas con las distintas construcciones. Como se puede observar en la imagen de la figura 4, las células transfectadas con ambos plásmidos son fluorescentes y sorprendentemente esta fluorescencia se observa principalmente en pequeñas estructuras citoplasmáticas, visualizadas como un puntillado. La localización de estas estructuras es perinuclear. Por otro lado, las células transfectadas con los plásmidos solos no muestran una fluorescencia marcada y la distribución de la misma es diferente a la de las células cotransfectadas. Este resultado confirma la factibilidad de la metodología, la identificación de conjugados de Jun con ubicuitina en células “in vivo” y sugiere que la ubicuitinización de Jun causa un transporte de esta proteína nuclear hacia estructuras citoplasmáticas como fue descripto por Deyu y colaboradores.

Conclusión final:

Los resultados presentados en esta monografía demuestran que se cumplieron los objetivos propuesto. La visualización de los conjugados de ubicuitina es una tarea dificultosa y hasta el momento las técnicas generalmente utilizadas para la detección de los mismos incluyen inmunoprecipitación seguida de Western Blot utilizando

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anticuerpos específicos. Esta técnica tiene limitaciones ya que no permite el análisis de la ubicuitinización en células in vivo. La técnica de fluorescencia por complementación desarrollada por Deyu Fang and Tom K. Kerppola es una herramienta útil para la visualización de proteínas ubicuitinizadas en células in vivo. Una vez puesto a punto este sistema, el mismo podrá ser utilizado para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier proteína de interés. Teniendo en cuenta los antecedentes del grupo de trabajo, este sistema podrá ser utilizado para caracterizar la conjugación de GAP-43 a la ubicuitina.Además, cabe destacar que en esta monografía se utilizaron técnicas de biología molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y compresión de diversos procesos celulares.

Bibliografía:

Growth-Associated Protein-43 Is Degraded Via the Ubiquitin-Proteasome

System – (K. L. Moliner, M. L. Wolfson, N. Perrone Bizzozero, A. M. Adamo)

Introduction of Recombinant Vectors into Mammalian Cells – (Molecular

Cloning. Sambrook, Fritsch, Maniatis)

Química Biológica – (Antonio Blanco)

Skene et al., 1986; Benowitz and Perrone-Bizzozero, 1991 Ubiquitin-mediated fluorescence complementation reveals that Jun ubiquitnated

by Itch/AIP4 is localized to lysosomes (Deyu Fang amd Tom K. Kerppola 2004)

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