Dr. José A. Sainz U.M.Fetal. H.U.Valme

U.M.Fetal. Diagnóstico Prenatal y Ginecología. H. Viamed

Puesta al día en D. Prenatal.

Aplicación Clínica de nuevas

técnicas diagnosticas en Genética

Donde estamos en Diagnóstico Prenatal ?

A que nos ayudan las nuevas técnicas de Genética ?

OBJETIVOS

“Toda anomalía del desarrollo morfológico, estructural, funcional o

molecular, presente al nacer (aunque pueda manifestarse más

tarde), externa o interna, familiar o esporádica, hereditaria o no,

única o múltiple”

DEFECTO CONGENITO (OMS)

2-4% 7%

Primera causa de mortalidad-morbilidad infantil: 20% en 1º año

DIAGNÓSTICO PRENATAL

ICBDSR EUROCAT ECEMC

Creado 1.979 1,7 mill. nacimientos anuales 43 miembros (23 países) 358.396 casos de anomalías congénitas desde 1.980 a 2.010 95 defectos ---- +/- cromosomopatía

cardíacas 71,33/10.000 gest. cromosomopatías 31,96/10.000 gest. (18,77/10.000 SD)

EUROCAT

Cualquier actuación encaminada a la identificación

de los DC se denomina Diagnóstico Prenatal

Tipo de D C Incidencia por nacimiento en %

Incidencia por D C %

Anomalías Cromosómicas 0.6 12

Enfermedades hereditarias

monogénicas

1.4 28

Malformaciones 3 60

Total 5 100

DIAGNÓSTICO PRENATAL

ECEMC 2004

Cribado de Malformaciones Eco morfológica

Cribado de Cromosomopatías

80-85 (datos base) 86-2001 2002

2,22% 1,55% 1,1%

MALFORMACIÓN

MAYOR

nº Tasa de Diagn antes

Diagnóstico de las 24 s

Radius (1987-91) 15151 11-35% 17%

Eurofetus (1990-93) 170800 56.2% 55%

Mayores es del 66%

Menores es del 40.7%

Eurofetus 98

Malf. SNC 88.5%

Sist. Génito-urinario 88.1%

Sist. Respiratorio 66.7%

Sist. Digestivo 55.5%

Sist. Esquelético 38.1%

Sist. Cardiovascular 28.9%

Alts. Faciales 18.7%

D. PRENATAL DE MALFORMACIONES ESTRUCTURALES

• Cribado Universal y de Garantía

• Adecuado ecográfo, tiempo y FORMACIÓN

Chitty et al., 1991

Levi et al., 1991

Shirley et al., 1992

Luck, 1992

Crane et al., 1994

Carrera et al., 1995

Levi et al., 1995

Skupski et al., 1996

Magriples et al., 1998

Lee et al., 1998

Van Dorsten et al., 1998

Boyd et al., 1998

Instituto Dexeus, 2002

1988-89

1984-89

1989-90

1988-91

1987-91

1970-91

1990-92

1990-94

1997-98

1990-94

1993-96

1991-96

1970-02

8745

15654

6512

8844

7575

33192

9601

860

911

3004

1611

33376

62592

18-20

16-20

19

19

15-22

18-22

16-20

18-20

16-20

18-20

15-22

18-22

18-22

1.5

2.3

1.4

1.9

2.30

3.03

2.45

1.16

3.07

0.76

1.30

2.17

2.9

71.5

21

57.3

85.3

16.6

78.33

25.6

15.0

71.4

13.5

47.6

41.1

87.2

Autores Periodo n Prevalencia (%)

Sensibilidad (%)

Edad gestacional

(sem.)

D. PRENATAL DE MALFORMACIONES ESTRUCTURALES

- Aportación de los marcadores ecográficos de segundo nivel al Cribado Combinado de Primer Trimestre-

H.U.

VALME RADIUS

EUROFE

TUS Levi et al.

Chitty

et al.

Salvador

et al.

Nº fetos 12746 7685 200000 16353 8432 99753

Tasa de

diagnóstico

prenatal

80,75% 35% 61,4% 40% 71% 56%

Tasa de

diagnóstico

antes de la

semana 24

77,12% 17% 44% 21% 71% 36%

Diagnóstico ecográfico de 95% de Malf Mayores

Diagnóstico ecográfico de 68,15% de Malf Menores

Prevalencia al nacimiento de Malf Mayores : 0,34%

SINDROME DE DOWN (10.000 nacimiento)

1980-1985 1986-2004 2002 2005

Andalucía 15,37 13,61 15,25 5,30

Media Nacional 14,78 10,95 8,20 7,40

?

Modelos de Cribado ? • Cribado por Edad (37 años) • Cribado Bioquímico del 2 T • Cribado con TN • Cribado con Test Combinado

Control del Cribado ?

METODOLOGÍA CRIBADO SENSIBILIDAD

(TFP 5%)

CRIBADO POR EDAD (70’S)

Amniocentesis >35 a 30%

CRIBADO BIOQUÍMICO 2ºT (DATN)

Marcadores bioquímicos en suero materno

DOBLE TEST AFP+hCG 55-60%

TRIPLE TEST AFP+hCG+uE3 60-65%

CUADRUPLE TEST AFP+hCG+uE3+inhA 70-75%

SONOGRAMA GENÉTICO (90’S)

AE+MB 65-75%*

CRIBADO BIOQUÍMICO 1erT βhCG+PAPP-A 65%

TRASLUCENCIA NUCAL (TN) Medición TN 75%

TEST COMBINADO βhCG+PAPP-A +TN 80%

Gold Estándar: Precoz, Sensible (SURUSS, FASTER)

SINDROME DE DOWN (10.000 nacimiento)

1980-1985 1986-2004 2002 2005

Andalucía 15,37 13,61 15,25 5,30

Media Nacional 14,78 10,95 8,20 7,40

Cobertura del 95.4% de la población

Sen 81.3% F+ 4.4%

Universal

Análisis Cromosómico: “Gold Standard” en prenatal

Cariotipo Bandas-G

Tamaño 5MB

Error del 0.01-0.02%

Avances en Genética

1970

Técnica de Banda

1986

FISH

2002

Arrays

2011/12

cfDNA

Incorporación de genética molecular : Detección Rápida

FISH

Sonda gen específica

Sonda centromérica

Sonda telomérica

Pintado cromosómico

Di George

Incorporación de genética molecular : Detección Rápida

QF-PCR

Fácil, Rápido pero Caro equipos y Personal Entrenado

Incorporación de genética molecular : Detección Rápida

MLPA (Múltiple Ligadura-Dependiente de la sonda de Ampliación)

Unión de Sonda a gen y ampliación por PCR

Trastorno cromosómico, Delecciones, Duplicaciones,

Amplificaciones, Reordenamiento

Arrays

Arrays: Técnica molecular que permite diagnosticar cambios

en la cantidad de ADN

de expresión, de metilación, de dosis (a-CGH)

Prenatal: Array-CGH “Hibridación genómica comparativa”

Array-CGH Oligonucleótidos // BAC

SNP-array “Polimorfismos de nucleótido único”

Combinación

Oligonucleotidos

BACs-on-Beads

• Medio líquido

• ADN procedente de bacterias

o BAC fijado en microesferas

• En < 24 horas

• Precio más bajo que arrays

Principales aneuploidias

Chr 21 (5 sondas)

Chr 13 (5 sondas)

Chr 18 (5 sondas)

Chr X (5 sondas)

Chr Y (5 sondas)

Síndromes de microdeleción

DiGeorge 1 (4 sondas)

DiGeorge 2 (4 sondas)

Williams-Beuren (5 sondas)

Prader-Willi /Angelman (7 sondas)

Smith-Magenis (4 sondas)

Wolf-Hirschhorn (5 sondas)

Cri du Chat (8 sondas)

Langer-Giedion (7 sondas)

Miller-Dieker (6 sondas)

SNP-Array “Polimorfismos de nucleótido único”

90% de variaciones del genoma

1 cada 1.300 Pb

Variante de A-oligonucleótidos donde se incluyen SNP

Identifica deleciones-duplicaciones y además disomías

uniparenterales y perdida de heterocigosidad

Arrays según tamaño de la sonda:

Dirigidos o “Targeted”

De Genoma Completo “Whole genome array”

Array ¿ Que detecta?

Todas las anomalías cromosómicas diagnosticadas por

cariotipo convencional donde sobran o faltan cromosomas

o segmentos de este

En teoría una resolución x 100 al caritipo

Pero esas deleciones o duplicaciones (CNV “variación en

el número de copias”) aparecen el 12% del ADN de un

individuo sano

Arrays. Recomendaciones de Sociedades Científicas

Post natal A C Medical Genetics 2010:

Discapacidad intelectual inexplicable

Autismo

AC múltiples no explicable

Array ¿ Porqué?

En teoría una resolución x 100 al caritipo

De 3-10 millones PB a 50.000 PB

Cualquier muestra de DP y tejido de feto + aunque superior

la cantidad de ADN y calidad

Resultado en 48-72 h y se automatiza

Array Limitaciones

No detecta reordenamientos estructurales equilibrados

(aunque los reordenamientos de novo es de 0.05%)

Poca capacidad para diagnosticar Poliploidias

(SNP-arrays si). Se detectan por ecografía.

Array Limitaciones

Mosaicismo solo diagnostica >20-30% (SNP-arrays <10%)

Caros

CNV de significado incierto en el 1-3%

Tipos de Array

Array-CGH más sensible (0.1-10MB)

Array-SNP 1.5KB pero menos CNV,

Ploidias

Disomías parenterales

Mosaicismos (?)

Arrays versus cariotipo convencional en prenatal

Alt Totales 7.5-9% Δ 2.5-3.5%

Δ 5.2-12% ME

CNV 1-3%

Emanuel 2007, Ahn 2010 , Wapner 2012

Arrays versus cariotipo convencional Muerte Perinatal

arrays Bandas-G

Total 8.3% 5.8% Δ 42%

Anteparto 8.8% 6.5% Δ 35%

Con ME 30% 19% Δ 54%

Éxito de Resultados 87% versus 70%

Reddy 2012

Arrays con alteración ecográfica y cariotipo normal

Shaffer 2012 (945 casos)

Arrays con alteración ecográfica y cariotipo normal

Shaffer 2012 (2858 casos)

1 ME 5.6%

2 o + 9.5%

CIR aislado 2.6%

Holoprosencefalia 10.6%

Fosa Posterior 14.6%

A Esquelética 10.7%

CIV 10.6%

Hvi 16.2%

Llep/PH 10.3%

Arrays. Recomendaciones de Sociedades Científicas

Post natal ACMedicalGenetics 2010:

Discapacidad intelectual inexplicable

Autismo

AC múltiples no explicable

Prenatal ACOG 2009 indica Bandas-G primera línea

pero abre la posibilidad en:

ME y cariotipo normal

Muerte fetal con AC e incapacidad Banda-G

TN aumentada

SNC Cardiopatia

MEsq

CIR Marcadores Ecograficas

Unidad de Medicina Fetal

- Aportación de los marcadores ecográficos de segundo nivel al Cribado Combinado de Primer Trimestre-

Diagnóstico ecográfico de 95% de Malf Mayores

Diagnóstico ecográfico de 68,15% de Malf Menores

Ya no nos vale

Tipo de D C Incidencia por

nacimiento en %

Incidencia por D C %

Anomalías Cromosómicas 0.6 12

Enfermedades hereditarias monogénicas 1.4 28

Malformaciones 3 60

Total 5 100

Evaluación de la Ecografía Morfológica Precoz

Eco de 20s centralizada

Es la ecografía la que criba

Avances en Genética

1970

Técnica de Banda

1986

FISH

2002

Arrays

2011/12

cfDNA

DNA fetal en sangre materna

Método de Cribado

No método de diagnóstico prenatal no invasivo

ADN materno de apoptosis de eritrocitos

ADN fetal de apoptosis Trofoblasto

Supone 10-20% del ADN en sangre materna

Representado todo el genoma

150PB

Dura poco tiempo (min)

Desaparece rápido tras nacimiento

ADN materno versus fetal: Como se distingue ?

• Tamaño

• Inmunoprecipitado con Hipo-Hipermetilación

• Enlace del nucleosoma

• Muestreo por formaldehido

No utilizado

Es la secuenciación masiva

Secuenciación masiva en paralelo

• Diferencia de ADN es del 10%

• Resultado en z-score

• C 21 es el 1.5%, secuenciar

millones de fragmentos

Secuenciación masiva dirigida en paralelo

Solo amplifica las secuencias

seleccionadas

Menor secuenciación y costo

Resultado en LR con edad…

Análisis dirigido de SNPs

• Solo amplia las regiones de los cromosomas que interesan

• 19488 SNPs de 21,18,13,X,Y

• Menos secuenciación y costo

• Resultado en LR con edad…

Otros:

• Selección de ADN fetal por la hipermetilación

• PCR digital

• Basados ARN (que solo lo expresa el trofoblasto)

Test Prenatal no invasivo o evaluación cfDNA

No método de diagnóstico prenatal no invasivo Benn 2013

Resultados en Alto y Bajo Riesgo

S F+

Down S 99% 0.1%

Edwards S 97% 0.1%

Patau S 78% 0.4%

SNP studies

242 gestaciones con 32 cromosomopatías

Resultados en el 95%

S 100% E 100% T 21, 13, 18, X, Y

Secuenciación masiva. Sin resultados

Fallo de resultado del 6.1% (0.8-9.9%)

Escaso cfDNA fetal 2% (nueva muestra 32%)

Tiempo 10-14 dias y re-respuesta 10-15 dias

Gestación Múltiple ?

En teoria SNPs mejores resultado

Secuenciación en G Múltiples con S 99% (Canick 2012, Lau 2013)

Evanescente (?)

Futuro de cfDNA

• Anomalias de cromosomas sexuales (80%)

(mosaicos, Y poca cantidad, X se pierde con la edad)

• Mosaicismo (50%, confinado a la placenta?)

• Translocaciones (Tecnologia SNP)

• Triploidias (Basada en z-score no, SNP)

• Genotipo completo

(Fan, Kitzman 2013)

Ya que es un método de cribado debemos valorar:

Costos

Tiene que ir a metodología Contingente

Pero si vamos a metodología Contingente

Si añades PIF y AFP

S 98% F+ 0.4%

S F+

TC 80% 4.2%

Secuencial 93.3% 4.8%

S F+

TC 80.3% 3.8% 970,000 E

Contingente 81.5% 1.1% 941,000 E

Estamos preparados para la metodología

contingente

Tiene sentido aquí cfDNA

Todo coordinado desde UMFetal

El primer paso es el Test Combinado

S > 95% F+ < 0.5%

Conclusiones cfDNA

En caso de ME y cariotipo normal Δ 5.2-12%

En caso de Muerte fetal Δ 8.5%

CNV 1-3%

Debemos incorporarlo en las UMFetal

Conclusiones Arrays

Gracias