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GENERALIDADES SOBRE PURIFICACION DE PROTEÍNAS.

El método de purificación debe diseñarse desde un principio teniendo en cuenta la cantidad de proteína que se requiere. Hay etapas de purificación que se puedenaumentar de escala fácilmente y otras en que no es posible hacerlo.

El grado de pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la proteína. Para usos en investigación, la escala es reducida y es mas importante la pureza que el rendimiento. Para usos terapéuticos la escala es mayor y la pureza requerida esmáxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajocosto y pureza menor.

Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de origen, convienebuscar una fuente fácil de obtener, barata, que contenga esa proteína en abundancia. Si existe la posibilidad de partir de organismos enteros o de células en cultivo, esto último es en general preferible. Lo óptimo es producir la proteína pormétodos de DNA recombinante.

Dependiendo de la finalidad, la proteína debe ser obtenida en estado nativo o puedeestar desnaturalizada. Para actividad biológica, debe estar nativa; para determinarestructura primaria, puede estar desnaturalizada.

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Se debe seleccionar un método de determinación específico de la proteínaen cuestión (p.ej.: actividad, si se trata de una enzima; unión de ligando a un receptor; unión de un anticuerpo específico en un RIA) y un método de determinación de la proteína total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la determinación de proteína por análisis de aminoácidos o por peso seco, todos los demás métodos son semicuantitativos, a menos que se los estandardice con la propia proteína en estudio. Entre estos métodos se pueden mencionar 1) espectrofotometría en el UV (280 nm, Trp; 210-215 nM, unión peptídica); Biuret(Cu2+ alcalino); Lowry (Cu2+ alcalino + reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford (Coomassie Blue); unión de Ag.

La actividad específica (AE) es igual a la relación entre la cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad de proteína total.

El grado de purificación es el cociente de la AE en la etapa 2 sobre la AE en la etapa 1 (la purificación global, AE final sobre AE inicial)

Se debe utilizar un método adecuado para juzgar la pureza de la proteínaobtenida; actualmente se utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente, bidimensional. En otras épocas, se utilizó la ultracentrifugación analítica.

Se debe evitar la proteólisis de la proteína en estudio durante supurificación, utilizando “cócteles” de inhibidores de proteasas, y trabajando tan rápido como sea posible y en frío, para minimizar su acción.

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Purificacion step TotalProtein

Totalactivity

SpecificActivity

Purificationfactor

Yield

Cell-free extractConA-SepharoseMono QMono P

mg

227.5 5.6

0.67 0.36

unitsa

56.0043.7525.9514.70

unitsa/mg

0.246 7.8138.7340.83

Fold

1 31.75 157.44 165.97

%

100 78.1

46.34 26.25

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ESQUEMA GENERAL DE UN METODO DE PURIFICACION1) Separación de las células.

2) Si la proteína es intracelular, ruptura celular y separación de restos.

3) Concentración.

4) Aislamiento primario.

5) Purificación de alta resolución.

6) “Pulido” del producto final.

Problemas a ser resueltos para diseñar el proceso:1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoquímicos.

2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final buscada.

3) Diseñar una secuencia de etapas óptima, con el menor número de etapasposible, lo que aumentará el rendimiento final.

4) Minimizar la desnaturalización y efectos de superficie; evitar agregación: minimizar la degradación; cuidar la limpieza y desinfección del equipo usado.

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METODOS PARA LA RUPTURA DEL MATERIAL

A menos que se trate de una proteína extracelular, liberada al medio, lascélulas o tejidos deben romperse para extraer la proteína de interés. Estaruptura debe ser sólo la necesaria, no excesiva, para evitar la extraccióninútil de proteínas contaminantes.

Los distintos tipos de células tienen diferente susceptibilidad a la ruptura.

Las células animales son muy fáciles de romper, pues carecen de pared. Las vegetales tambien, pues, pese a tener pared celular, su gran tamañolas hace vulnerables a la ruptura mecánica. Las células bacterianas son más resistentes, y esta propiedad depende de que sean Gram positivas o Gram negativas. El predominio del peptidoglicano en la pared de lasprimeras, las hace mucho mas sensibles a métodos suaves, como la digestión con lisozima. Los hongos filamentosos y las levaduras son los más resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienenhasta 80 - 90 % de polisacárido (quitina y glicanos en hongos, manano y glucano en levaduras), además de lípidos y proteínas.

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ALGUNOS METODOS DE RUPTURA DE CELULAS

1) Mortereado con arena, alúmina, bolitas de vidrio, carburo de silicio.

2) Molinos de ruptura, por agitación con abrasivos.

3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas rotativas.

4) Sonicación.

5) Congelación y descongelación.

6) Extrusión de líquido o sólido (material congelado)

7) Descompresión explosiva.

8) Enzimas líticas, seguido por shock osmótico o tratamiento mecánico.

9) Detergentes (Triton, digitonina) o solventes (tolueno).

10) Aislamiento previo de la organela en que se encuentra la proteína.

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METODOS DE SEPARACION Y CONCENTRACION

Remoción de agua y moléculas pequeñas por

1) Agregado de un polímero seco on poros muy pequeños como paraque la proteína penetre (Sephadex G-25).

2) Remoción a través de una membrana semipermeable(ultrafiltración). Celdas filtrantes. Diálisis contra polietilenglicol. “Diálisis” en vacío.

3) Remoción de agua en vacío: liofilización. Buffers volátiles, como el bicarbonato de amonio.

Cambios de buffer:

1) Diálisis. 2) Filtración por gel; 3) Diafiltración.

Purificación por ultrafiltración.

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PURIFICACIÓN Y CONCENTRACION POR PRECIPITACION

1) Precipitacion por aumento de la fuerza iónica (salting-out):

Series de Hoffmeister. Sulfato de amonio.

2) Precipitación por disminución de la fuerza iónica (salting-in)

3) Precipitación por alteración del pH (mínima solubilidad en el pI).

4) Precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona), quedisminuyen la constante dieléctrica de la solución y por ello su poderde solvatación.

5) Desnaturalización de impurezas por altas temperaturas, extremosde pH, solventes orgánicos.

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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.

1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.

2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).

3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.

4)Fraccionamiento cromatográfico.

Principio de separación Tipo de cromatografíaForma y tamaño Filtración por gelCarga neta Cromatografía de intercambio iónico.Punto isoeléctrico CromatoenfocadoHidrofobicidad Cromatografía de interacción

hidrofóbicaCromatografía en fase reversa

Función biológica Cromatografía de afinidadAntigenicidad InmunoadsorciónContenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas

inmobilizadasGrupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalenteCapacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos

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CROMATOGRAFIA

Separación diferencial de los componentes de una muestra entre una fasemóvil y una fase estacionaria.

La fase móvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se eluyen las proteínas (puede ser el mismo o variar durante la corrida).La fase estacionaria comprende las partículas, en general esféricas, con quese llena la columna. Estas partículas están formadas por una matriz y, en la mayoría de los casos, moléculas de menor o mayor tamaño con las que se la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientoscromatográficos.

La matriz es el sustrato sólido de la fase estacionaria. Las más comunes son celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.Deben tener buena estabilidad mecánica y química, alta capacidad, tamañoy forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar lasinteracciones no específicas, y tamaño de partícula adecuado al flujo de solvente deseado y a la presión operativa.

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TIPOS DE CROMATOGRAFIA

1. Corridas a presión normal (LPLC, low-pressure liquid chromatography). Presión inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano.

2. Corridas a presión intermedia (MPLC, medium-pressure liquid chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid chromatography). Presión entre 6 y 50 bar. Requiere matrices masrígidas. Permite flujos mayores.

3. Corridas a alta presión (HPLC, high-pressure - o high-performance -liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requierematrices de rigidez alta, partículas pequeñas y columnas y tuberías de material altamente resistente a la presión, como el acero inoxidable o el titanio.

Según la presión a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos:

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CARACTERISTICAS TIPICAS DE LPLC Y HPLC.

Característica LPLC HPLC

Tamaño de partícula (μ) 100 10

Flujo (ml.cm-2.h-1) 10 - 30 100 - 300

Presión de trabajo (bar) < 5 > 50

Tiempo de separación (hs.) Hasta 24 1 - 3

Volumen de muestra ml - litro μl - ml

Etapa de purificación Variable En general tardía

Resolución Buena Excelente

Dificultades Largo tiempo, Alto costo de equipo,

cámara fría Posible desnaturalización

por presión.

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La aplicación de la muestra a la columna se hace generalmente a través de un “loop”, imprescindible para FPLC o HPLC. En LPLC puede hacerseaplicación manual.

La elución de las proteínas introducidas en la columna puede hacerse sin cambiar la composición de la fase móvil (elución isocrática) o cambiandola, por etapas o continuamente (gradientes).

El tamaño de la columna a utilizar dependerá del procedimientocromatográfico a seguir y de la cantidad de muestra a purificar.

Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada, dejandola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no se utilizan continuamente deben ser guardadas conteniendo un agenteconservador, como el etanol al 20 % o la azida sódica, para evitar el crecimiento de microorganismos.

OTRAS CONSIDERACIONES GENERALES.

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METODOS CROMATOGRAFICOS BASADOS EN LA CARGADE LA PROTEINA.

Todas las proteínas contienen residuos cargados, positiva o negativamente, y su balance a un determinado valor de pH dala carga neta de la molécula a ese pH. El valor de pH en el que las cargas se balancean, y en consecuencia la carga neta de la molécula es 0, es el punto isoeléctrico de la proteína.

Los métodos cromatográficos basados en la carga son dos:

1) La cromatografía de intercambio iónico.

2) El cromatoenfocado.

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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.La mayoría de las proteínas tienen su pI entre pH 5 y 9. Por encima de su pIla carga neta de la proteína es negativa, y por debajo es positiva.

El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargadospositivamente (que intercambian iones negativos, y se llaman por esointercambiadores aniónicos, como DEAE-celulosa) o negativamente(intercambiadores catiónicos, como CM-celulosa).

La adsorción puede hacerse en “batch” o en columna. Las proteínas migrarán(en condiciones isocráticas) en base a su carga neta a ese determinado pH. Sise trabaja a un valor de pH tal que muchas proteínas se adsorben, la eluciónse hará cambiando el pH o aumentando la fuerza iónica del buffer.

Los intercambiadores pueden ser débiles (utilizables cuando la proteína tienecarga elevada a ese pH) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usarintercambiadores fuertes para proteínas muy cargadas a ese pH, pues la interacción será muy fuerte y la elución más dificil.

La regeneración de la columna se hace con alta fuerza iónica (ClNa 1 M,p.ej.).

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GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES USADOS EN PURIFICACION DE PROTEINAS.

Fórmula Nombre Abreviatura

Aniónico fuerte

- CH2N+(CH3)3 Trimetilaminometil TAM -

- C2H4N+(C2H5)3 Trietilaminoetil TEAE -

Aniónico débil

- C2H4N+H3 Aminoetil AE -

- C2H4N+(C2H5)2 Dietilaminoetil DEAE -

Catiónico fuerte

- SO3- Sulfo S -

- CH2 SO3- Sulfometil SM -

Catiónico débil

- CH2 - COO- Carboximetil CM -

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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANIÓNICO)

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CROMATOENFOCADOEl cromatoenfocado puede ser considerado como una extensión del isoelectroenfocado (IEF) y la cromatografía de intercambio iónico.

En IEF las proteínas se separan por electroforesis en un gradiente de pH; se aplica en electroforesis bidimensional.

En cromatografía de intercambio iónico se puede eluir con un gradiente de pH, que se forma fuera de la columna.

En cromatoenfocado, el gradiente se forma dentro de la columna, mezclandouna matriz de intercambio aniónico pre-ajustada a un valor de pH, con un buffer de pH más bajo.

La proteína al descender en la columna encontrará valores crecientes de pH; cuando llegue a su pI se volverá electronegativa, y se unirá a la matrizpositivamente cargada. Como el buffer sigue corriendo, la proteína se separará y unirá sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida(“enfocada”) al pH correspondiente a su pI.

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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO)

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PURIFICACION BASADA EN LA HIDROFOBICIDADLa llamada originalmente “cromatografía de partición” utilizaba una faseestacionaria polar y una fase móvil orgánica.

La cromatografía en fase reversa se denomina de ese modo porque utilizauna fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La fase estacionariaestá en general formada por cadenas alifáticas de hasta C18 unidas a unamatriz de silica. La fase móvil es un solvente polar como metanol, propanol, etanol o acetonitrilo. Estas condiciones pueden causar la desnaturalización de muchas proteínas . Por ello se las utiliza en general en HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar proteínas y péptidospara su secuenciación. Se usan contraiones como el ácido trifluoroacético para asociarse con grupos cargados en la proteína y aumentar su hidrofobicidad.

Para purificar proteínas en estado nativo se utilizan condiciones mas suaves, en la llamada cromatografía de interacción hidrofóbica. Se utiliza en general octil-Sepharosa o fenil-Sepharosa; la adsorción de las proteínas se hace en general a alta fuerza iónica, y la elución disminuyéndola, y, si esnecesario, agregando un solvente como propanol o butanol.

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CROMATOGRAFIA COVALENTEA pH 8, reaccionan la mayor parte de las proteínas que contienen Cys-SH; a pH 4,

sólo las que tienen Cys residuos con un pKa muy bajo, como la papaína.La columna se regenera con 2,2´-dipiridildisulfuro. La piridin-2-tiona absorbe a 343 nm

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CROMATOGRAFIA DE QUELATOS METALICOS (IMAC)

La matriz tiene unido covalentemente un quelante, como el ácidoiminodiacético.

Se carga la columna con un ión adecuado, que puede ser Zn2+, Ni2+, Cu2+, Co2+. La proteína se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de His, Cys o Trp. Se puede eluir con quelantes, o bajando el pH a 4 - 6, o compitiendo con imidazol.

Esta técnica es muy usada actualmente para purificar proteínasrecombinantes, expresandolas como fusiones con un “tag” de poly-His (en general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-terminal. Se eluyen con imidazol.

Si todo funciona bien, se puede tener proteína recombinante pura en un solo paso de purificación. Debe tenerse en cuenta que iones como el Co2+ puedencatalizar la oxidación de grupos en la proteína, en especial de -SH.

Luego de la purificación la columna se regenera con un quelante comoEDTA, y para reutilizarla se la debe volver a cargar con metal.

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CROMATOGRAFIA DE AFINIDADSe basa en que todas las proteínas tienen sitios de unión para algún ligando, ya sea una molécula pequeña (p.ej.: un análogo del sustrato de una enzima, una hormona para un receptor) u otra proteína (p-ej.: la Concanavalina A para unir glicoproteínas de alta manosa, o anticuerpos específicos para ligar sus antígenos). El ligando elegido para la proteína que se desea purificar debe inmovilizarse sobre una matriz adecuada.

La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina para carboxilasas con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para dehidrogenasas NAD o NADP-dependientes). La afinidad de la proteína por el ligando debe ser moderada (KLentre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unión y una disociación ulterior del complejo en condiciones no desnaturalizantes.

Para desarrollar el material para cromatografía de afinidad, primero hay que activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego fijarle el ligando. El material debería ser lo suficientemente estable como para permitir su reutilización.

Se pueden expresar proteínas recombinantes como fusiones que permiten aplicar cromatografía de afinidad (glutation S-transferasa y GSH-Sepharosa; maltose-binding protein (MBP) y maltosa-agarosa).

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GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE

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CRUZIPAINA

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FILTRACION POR GEL (CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIONMOLECULAR, O DE TAMIZADO MOLECULAR)

El material cromatográfico es un gel en partículas esféricas, de porosidad controlada, sin derivatizaciones. La separación de las proteínas se hace en base a la forma y la masa de la proteína. La elución es isocrática. Las proteínas que no penetran en absoluto en los porosdel gel son las que salen primero (en el llamado volumen de exclusión o volumen vacío, Vo). Las demás moléculas en la muestra se separan, saliendo últimas las que penetran porcompleto en las particulas de gel. Se usa en general fuerza iónica alta, para minimizar lasinteracciones de las proteínas entre si, y de las proteínas con la matriz (en este último caso, no relacionadas con el tamaño de poro).

Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). Puede usarse en LPLC, y tambien en FPLC (Superosa, Superdex) y HPLC (silica porosa, como Lichrosorb).

En la filtración por gel es crítica la relación entre el volumen de muestra y el volumen de la columna (1 a 5 % del volumen total (Vt) del gel), por lo cual es una técnica que no se puedeaumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de proteínas, se admite hasta un 25 - 30 % del Vt.

Aplicaciones: Purificación de proteínas - Desalado - Determinación de pesos molecularesde proteínas nativas - Determinación de constantes de equilibrio de unión (“binding”).

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Purificacion step TotalProtein

Totalactivity

SpecificActivity

Purificationfactor

Yield

Cell-free extractConA-SepharoseMono QMono P

mg

227.5 5.6

0.67 0.36

unitsa

56.0043.7525.9514.70

unitsa/mg

0.246 7.8138.7340.83

Fold

1 31.75 157.44 165.97

%

100 78.1

46.34 26.25

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PURIFICACION DE PROTEINAS DE MEMBRANA.

Proteínas integrales y Proteínas periféricas

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PROTEINAS INTEGRALES

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Para purificar proteinas de membrana, lo mejor es empezar purificandola membrana. La solubilización de las proteínas dependerá de que se trate de proteínas integrales o periféricas.

Proteínas periféricas: Buffer con EDTA 0.1 - 1 mM, o alta fuerza iónica,hasta 1 M ClNa o ClK. En algunos casos se requieren condiciones más drásticas(urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M). Incluir inhibidoresde proteasas.

Proteinas integrales: Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden ser solubilizadas cortando la parte que las ancla en la membrana con fosfolipasas o proteasas, según de qué ancla se trate. Las de Clase I se extraen por delipidación con solventes orgánicos, agentes caotrópicos o detergentes.

Detergentes: Moléculas anfifílicas, relativamente pequeñas. Por encimade la concentración micelar crítica las moléculas coalescen a través de su parte hidrofóbica para formar micelas, en equilibrio con el monómero.

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Cuando se agrega un detergente a una membrana, se particiona dentro de la bicapa hasta que esta se hace inestable y se desintegra. Los lípidos forman en general micelas mixtas con el detergente, en tanto que las proteínas hidrofóbicas se cubren con una monocapa del mismo.

Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedadde ser miscible con el agua a 0 - 4oC, pero se separa en dos fases a 20 - 25oC. Las proteínas integrales, solubilizadas a baja temperatura, particionan en la fase de detergente al llevarlas a 20 -25oC.

Existe una variedad considerable de detergentes empleados en purificación de proteínas de membrana. Pueden ser detergentes iónicos, como el SDS o el CTAB, o no iónicos, como la digitonina, el octilglucósido, el Lubrol, el Triton, y otros.

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PURIFICACION DE LAS PROTEINAS SOLUBILIZADAS.Las proteínas periféricas (o los fragmentos hidrofílicos de proteínas integrales) en general se purifican por los mismos métodos que los usados para las solubles. Las proteínas integrales presentan problemas especiales, debido a que requieren la presencia continua de detergentes o solventes orgánicos.

La filtración por gel puede aplicarse; prácticamente todos los materiales para esta técnica pueden usarse en presencia de detergentes o desnaturalizantes, y existen algunas resinas (poliéteres hidroxilados, dextranos hidroxipropilados) admiten solventes orgánicos. La cromatografía de intercambio iónico y el cromatoenfocado pueden utilizarse, en presencia de detergentes no iónicos. La cromatografíaen fase reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra solubilizada en ácido fórmico al 50 - 70 % en agua. La cromatografía de afinidad es aplicable en general, requiriendose a veces resinas de altas porosidad y brazos espaciadores largos.

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PURIFICACION DE PROTEINAS PARA USO TERAPEUTICO.

Lo que se requiere en este caso es la máxima pureza. Por lo demás, losmétodos usados son como para cualquier proteína soluble. La fuente pueden ser tejidos o sueros animales, sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos, o hibridomas.

El nivel aceptable de contaminantes se relaciona con la frecuencia de administración de la proteína, y está regulado por las autoridades sanitarias. La significación clínica de los contaminantes es variable: 1) Antigenicidad: puede dar origen a reacciones de hipersensibilidad. 2)Transformación por DNA. 3) Enfermedades transmisibles (virus, priones). 4) Pirogenicidad por lipopolisacáridos de pared bacteriana.

Para insulina, se considera que el nivel de contaminantes por debajo del cual no se producen anticuerpos es de 10 ppm. Para DNA se pueden considerar aceptables valores de 10 pg por dosis. Para virus y priones, ausencia completa.

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Se requieren, por lo tanto, métodos muy sensibles para la detección de contaminantes. Para contaminantes proteicos, lo mas usados son los métodos inmunológicos. Tambien puede usarse tinción con Ag. El límite de sensibilidad es del orden de 5 ppm por inmunoensayo, 25 - 50 ppm por Western blot y de 200 - 400 ppm por tinción con plata.

Para DNA contaminante, se usan técnicas de hibridización. Paradetección de virus, hibridizaciones y PCR con oligonucleótidos adecuados. Para endotoxinas bacterianas, gelificación de lisado de amebocitos de Limulus polyphemus.

OTRAS APLICACIONES ESPECIALES:

1) SECUENCIACION: Evitar el bloqueo del N-terminal (usar urealibre de cianato). Usar RP-HPLC o SDS-PAGE y electrotransferencia para la purificación final.

2) CRISTALOGRAFIA: La pureza debe ser alta, pero sobre todo deben evitarse las microheterogeneidades de la propia proteína a cristalizar (en especial la proteína desnaturalizada). Es bueno terminar lapurificacion con cromatografía de afinidad.

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PURIFICACION DE PROTEINAS EN GRAN ESCALA.

La escala de producción de proteínas y péptidos por la industria biotecnológica es de gramos a kilogramos, y utiliza columnas cromatográficas en un rango de volumen de litros a miles de litros.

El aumento de escala es un problema de ingeniería e involucra consideraciones que no están asociadas con ciencia pura, como se la considera en el laboratorio.

La operación en escala pequeña busca obtener cantidades limitadas de proteína, con mucha atención de personal altamente capacitado. En la operación a gran escala, se debe minimizar el costo y aumentar al máximo el rendimiento. Esto implica minimizar la intervención humana, sobre todo de científicos calificados. El proceso debe ser tan sencillo como sea posible. Las etapas innecesarias son antieconómicas, bajan el rendimieto y multiplican los problemas. Si el proceso de laboratorio está destinado desde un comienzo a una aplicación industrial, el método de purificación debe ser diseñado desde el principio con miras a su aplicación en gran escala. Hay etapas de purificación que pueden llevarse a una escala industrial y otras que no.

La industria biotecnológica es extremadamente competitiva, y el factor tiempo es crítico.

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El manejo de soluciones de proteínas en gran escala implica una serie de problemas técnicos, como evitar la formación masiva de espuma (que causa desnaturalización) en el bombeo de las soluciones, necesario para transferirlas entre etapas, evitar la agregación de las proteínas al aumentar su concentración, y evitar escrupulosamente la contaminación microbiana, que lleva a degradación.

Las operaciones a realizar son como en cualquier purificación en escala normal, pero con características especiales.

Separación de sólidos: Se pueden utilizar centrífugas industriales o filtración. Las centrífugas de alta velocidad requieren refrigeración, y contención adecuada para evitar la formación de aerosoles contaminantes del medio ambiente. El costo aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas a separar. Los filtros pueden ser los llamados filtros profundos (tierra silícea, 5 a 10 cm de espesor) o membranas (microfiltración). Los problemas más importantes son la floculaciòn de las proteínas, su unión a las membranas y la desnaturalización.

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Ruptura celular: las técnicas más aplicables a gran escala son el homogeneizador y el molino con bolitas de vidrio. Homogenizador: la suspensión (15 - 20 % de peso seco) es forzada a alta presión a través de una válvula estrecha; es el método mas usado, pero no sirve paramicroorganismos filamentosos. Puede procesar hasta 6000 litros/hora. Los molinos usan como abrasivo bolitas de vidrio, de 0.3 - 0.4 mm de diámetro. Sirve para microorganismos filamentosos. Acepta 30 - 60 % de células, peso húmedo, en suspensión y procesa hasta 2000 litros/hora.

Tambien puede utilizarse en ciertos casos lisis enzimática (lisozima, por ejemplo) o química (tolueno, detergentes como SDS o Triton X-100, agentes caotrópicos como guanidina o urea).

Operaciones primarias de separación: Incluyen la concentración, que se puede hacer por ultrafiltración o por precipitación, con sales o solventes orgánicos. La remoción de ácidos nucleicos puede hacerse con nucleasas, oagentes precipitantes, como la polietilenimina, polímero catiónico de peso molecular 24 kDa. Esta precipitación remueve además los restos celulares (“cell debris”).

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Operaciones de purificación de proteínas: Se debe buscar un mínimo de etapas, para disminuir los costos y aumentar el rendimiento. En general, una etapa preparativa (que debe dar un alto rendimiento, aunque no purifique mucho, y puede ser una precipitación salina); una etapa de alta resolución, que debe dar un producto altamente purificado, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico o de afinidad, o cromatoenfocado; yuna etapa final, de “pulido” del producto, para eliminar los últimos contaminantes; a esta altura de la purificación, puede emplearse filtración por gel. Es lo más frecuente que el aumento de escala en los métodos cromatográficos se obtenga aumentando el radio de la columna y manteniendo, o aumentando poco, su altura. Pero esto dependerá, naturalmente, del tipo de cromatografía que se use.

Existen columnas con volúmenes totales de hasta 2500 litros, con diámetrode 2 metros y alturas ajustables, hasta alrededor de 80 cm. La elución isocrática es más frecuente que el uso de gradientes, para simplificar la operación.

Se pueden emplear columnas radiales, que constituyen un concepto nuevo en el campo de la cromatografía en columna.

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Cromatografia de flujo radial. La muestra se distribuye del encabezamientode la columna (6) al canal anular externo (1); de alli difunde a través de la pared porosa (5), a través del material cromatográfico, pasa luego a través de la pared porosa interna (4)y llega al canal interno (2) de donde pasa al colector.