INFORME: DETERMINACION DE LA VITAMINA “C” Y CROMATOGRAFIA

noviembre 232012

Nombre:

Aguilar Coria Ximena Gabriela

Docente:

Ing. Grima Velasco

Universidad Mayor de San Andrés Facultad de Ingeniería

Cromatografía Liquida de Alta resolución HPLCLABORATORIO QUIMICA ANALITICA CUANTITATIVA________________________________________________________________

Cromatografía Liquida de Alta resolución HPLC

1. ANTECEDENTES.

La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión o High pressure liquid chromatography (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

2. PRACTICA.

Realizar la curva de Calibración de la glucosa si por el método de cromatografía Liquida HPLC, se tienen los siguientes resultados de estándares de Glucosa, Xilosa, Arabinosa y manosa.Los tiempos de retención se encuentran por: (recuerden que los tiempos de retención varían en un cierto rango para cada Cromatograma)

Glucosa: 12,5 a 13,1 minXilosa: 14,03 a 14,42 minArabinosa: 17,04 a 17,68 minManosa : 18,1 a 18,30min

CROMATOGRAMA DE ESTANDARES DE CARBOHIDRATOS

 Concentración de estándares GLUCOSA

C(g/l)) (g/l) AREAS1 10 3501570

S2 82767953,3

3S3 6 2088435,6

Cromatografía Liquida de Alta resolución HPLCLABORATORIO QUIMICA ANALITICA CUANTITATIVA________________________________________________________________

7

S4 41393183,3

3

S5 2725882,66

7

0 1000000 2000000 3000000 40000000

2

4

6

8

10

12

f(x) = 2.88687001680648E-06 x − 0.0491618658342521R² = 0.999743968416975

C vs. Area

C vs. Area

Linear (C vs. Area)

Area

Conc

entr

accio

n

Determinar la concentración de la glucosa por HPLC de una muestra de fermentación, si éste se diluye de 1 a 10 ml acondicionando el pH en la Columna HPX-87P (específica para carbohidratos) y filtrando con una membrana “Millipore” (filtro), el resultado del cromatograma nos da los siguientes resultados:

Cromatografía Liquida de Alta resolución HPLCLABORATORIO QUIMICA ANALITICA CUANTITATIVA________________________________________________________________

El tiempo de retención de la glucosa se encuentre entre:Glucosa: 12,5 a 13,1 min

Entonces llevamos este tiempo de retención a los resultados del cromatograma allí podemos apreciar que los valores que se acercan son:

Tiempo de Retención (min)

Area

11,471 2316713,012 253486

Entonces tomamos el máximo de 13,012 y lo llevamos a la recta de calibracióny = 3E-06x - 0,0492

R² = 0,9997

y = 3E-06* (253486)- 0,0492

y= 0,027258 (g/l)

Cromatografía Liquida de Alta resolución HPLCLABORATORIO QUIMICA ANALITICA CUANTITATIVA________________________________________________________________

0 1000000 2000000 3000000 40000000

2

4

6

8

10

12

f(x) = 2.88687001680648E-06 x − 0.0491618658342521R² = 0.999743968416975

C vs. Area

Linear (C vs. Area)

Series4

Area

Conc

entr

accio

n

3. CUESTIONARIO

Que pH de trabajo se debe acondicionar la muestra para la utilización de la columna HPX-87P? (marca Biorad)

El pH puesto puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica.

Qué cuidados se debe tener con muestras para la determinación por HPLC?

CARACTERISTICAS DE LA FASE MOVILAparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial, y como que la entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.

DIÁMETRO INTERNOEl diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad.Las columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en lapurificación de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan.

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MEDIDA DE LAS PARTÍCULASLa mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.

TAMAÑO DE POROMuchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande; por ejemplo, una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.

PRESIÓN DEL SISTEMALa presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante

Qué Tamaño poro de filtro es recomendable utilizar para acondicionar las muestras analizadas por HPLC?

El tamaño de poro debe ser pequeño ya que proporcionan una mayor superficie Describir el funcionamiento de una Bomba de HPLC.

Su rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presión puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los aparatos más modernos de HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder utilizar partículas de tamaño más pequeño en las columnas (< 2 micrometros).

Describir tipos de detectores de una máquina HPLC.

En sistemas cromatográficos que utilizan detectores ultravioleta, la respuesta de ésos depende de la absortividad de los correspondientes analitos, por lo que normalmente se utilizan los denominados factores de respuesta.

4. BIBLIOGRAFIA

Dolan, J. W. y Snyder, L. R. 1989 Troubleshooting LC Systems: A Comprehensive Approach to Troubleshooting LC Equipment and Separations. Humana Press, Totowa, New Jersey.

Cromatografía Liquida de Alta resolución HPLCLABORATORIO QUIMICA ANALITICA CUANTITATIVA________________________________________________________________

Dong, M.W. 2006. Modern HPLC for Practicing Scientists. John Wiley and Sons, New York. (http://lchromatography.com/hplcfind/index.html.