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Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas

en HPLC y UPLC

Las claves del éxito para análisis por HPLC y/o UPLC: afrontando los problemas cromatográficos

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Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas

en HPLC y UPLC

Las claves del éxito para análisis por HPLC y/o UPLC: afrontando los problemas cromatográficos

A través del chat resolveremos las dudas y cuestiones que vayan surgiendo.

Olatz Mitxelena Soporte Técnico Comercial División Columnas

Elena Chiquero Responsable ventas División Columnas área Madrid


Desafíos en los laboratorios

Realizar análisis cromatográficos y asegurar la exactitud de los resultados cromatográficos a través de un enfoque de garantía de la calidad.

Minimizar el tiempo empleado en el diagnóstico de averías o malfuncionamiento.

Trabajar com métodos robustos que aporten resultados sólidos, fiables y duraderos.


Botella- Bomba Autoinyector Columna Detector Fase móvil

Tiempo de retención Área

Linearidad

Resolución

”Factor cola” Nº platos

Ruido/deriva

Mapa origen malfuncionamiento


Agenda

Introducción: la columna Conexiones de columna a sistema cromatográfico Filtros de columna Relleno de columna


Introducción: la columna

Entrada conector

Salida conector Filtro entrada

Filtro salida

Relleno: partículas sílica funcionalización C18, Fenil,…

- Conexiones al sistema - Filtros: particulado proveniente de fase móvil, muestra o precipitados - Relleno: particulado, condiciones de trabajo (pH fase móvil, temperatura, viscosidad y presión), contaminación química, interacción muestra


Conexiones: Posición de la férrula fijada de forma incorrecta

N 5sigma = 5025 Factor de cola= 1.31

N 5sigma = 6959 Factor de cola= 1.17

Posición incorrecta de la férrula

Posición correcta de la férrula


Férrula reutilizable enroscada manualmente con excesiva fuerza

Férrula deformada

Férrula buen estado

Conexión reusable instalada Correctamente

au

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

Conexión reusable enrosque forzado

au

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Minutes 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

P/N 700003139

P/N PSL613315


Filtros columnas

- Mantienen relleno - Evitan entrada particulado en relleno

Tamaño partícula relleno (dp) ↔ Porosidad filtro 25, 20, 10 µm ↔ 5 µm 10, 5, 4, 3.5, 3 µm ↔ 2 µm 2.5, 1.8, 1.7, 1.6 µm ↔ 0.2 µm UPLC


Filtros columnas: particulado

- Partículas insolubles muestras - Precipitados “in-situ” - Particulado fases móviles - Contaminación bacteriana, algas,… - Precipitados sales tampones fosfato - Restos membrana filtración no adecuada

Crecimiento bacteriano filtro entrada

Polisulfona procedente de membrana de filtración en filtro de entrada a columna

Injection 10

Injection 627

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Time = 2.17 d

Time = 1 h

Efecto 1: Sobrepresión Efecto 2: Pérdida Resolución


Particulado: Consejos para la preparación de muestras HPLC/UPLC

Verificar la ausencia de partículas visibles tras la dilución de la muestra Filtración sistemática:

– Filtro 0.2µm/0.45µm compatible con diluyente utilizado ¡Cuidado! Interacciones membrana/muestra

Recomendado el uso de filtros en línea antes de la columna. La centrifugación puede ser necesaria para eliminar las micropartículas.

– Una centrifugación de 4000 a 12000 rpm durante 5 a 30 min permite aislar partículas invisibles.

Tableta Donepezil diluída según la monografía (muy peligroso)

Muestra filtrada con 0.2µm

Partículas muy finas: solución

turbia(peligroso)

Muestra filtrada y centrifugada a 12000 rpm Solución transparente

(OK)


Particulado muestra: recomendaciones

Preparación muestra: filtración membrana

adecuada/centrifugación http://www.waters.com/app/selector/en/filters.html Preparación muestra: Sirocco (precipitación proteínas), Ostro

(precipitación proteínas+eliminación fosfolípidos), Sep-Pak, Oasis, DisQuE (Quechers)

“Microprecipitaciones”: componentes muestra insolubles en las condiciones del método.

http://www.waters.com/app/selector/en/filters.html


Vidrio borosilicato, proceso fabricación y certificación calidad: fuente contaminación y picos fantasma

Filtro botella: especial atención, fuente contaminación bacteriana

Particulado: ambiental, sales y crecimiento bacteriano

Particulado: Botellas Fases Móviles


Contaminación bacteriana: fuente de problemas tanto en UPLC como en HPLC.

La contaminación bacteriana es una fuente de obturación de columna UPLC, y también en menor medida en HPLC

¡Cuidado! Con las líneas 100% acuosas: – Preparar las fases 100% acuosas cada día. o Nota: Los filtros en línea pueden dejar pasar ciertas bacterias.

Limpiar regularmente los filtros


Utilizar solventes, tampones y aditivos de “alta calidad”

Solventes orgánicos:

— Calidad High Grade LC o LC/MS, filtrar una vez abierta

Agua : — El Agua Milli-Q está filtrada a través de una membrana 0.22 µm, no es necesario

volver a filtrarla. — Los aditivos compatibles LC/MS (ácido fórmico) no requieren ser filtrados en su

preparación. — Cambiar las fases acuosas cada día (UPLC) o cada 2 días (HPLC) — No transferir los nuevos solventes recién preparados a las botellas que están en uso.

Filtración : — Membranas compatibles solventes fase móvil: GHP/PVDF — HPLC 0.45 µm / UPLC 0.22 µm (<3 µm)

Recomendaciones Fases Móviles particulado


Todas las botellas han de estar cerradas – Nunca utilizar Parafilm® para cubrir las botellas. o Se puede disolver y crear picos fantasma.

Utilizar botellas con una buena calidad de vidrio – El vidrio borosilicato para las fases móviles aporta un alto pH.

Utilizar material de vidrio limpio (para las botellas y la filtración) – No utilizar detergentes

Precauciones a considerar con las Fases Móviles


Particulado filtro columna: ¿qué hacer?

Prevención Determinar origen, en casos sobrepresión: punto obturación Presiones teóricas: calculadora Acquity/Preparativa

Cambio prefiltro columnas UPLC/UHPLC Cambio filtro columnas UPLC

Tratamiento “solubilización” o descontaminación

Consulta Waters


Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)

Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente

Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas

Relleno columna



Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas

Relleno columna





Relleno columna


¿Qué hace que una columna LC sea

reproducible?

A) Sorbentes

0

5

10

15

20

25

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

1 . 7 µm ACQUITY UPLC® BEH C18

2 . 5 µm XBridge™ BEH C18 XP

2 . 6 µm Core-Shell C18

Linear Velocity, u (cm/sec)

Plat

e He

ight

(H, 4

sig

ma)

Acenaphthene, 2.1 x 50 mm columns

70/30 MeCN/H2O, 30 °C, 254 nm

B) Empaquetado C) Ingeniería

¡Todos ellos son CRITICOS!


Aseguramiento reproducibilidad

Primary Manufacturer

Particle Creation

Bonding

Column Packing

Sales and Distribution

Bonder

Bonding

Column Packing


Column Packer

Column Packing


Distributor


• Certificación cGMP, ISO 9001 e ISO 13485 • Registrado FDA


Test Acceptance

Criteria Ziprasidone Zip-Imp

1 Zip-Imp

2 Zip-Imp

3 Zip-Imp

4 Result

Intermediate Precision

Ret Time < 2% RSD 1.1 1.1 1.1 0.9 0.8 Pass

Peak Area < 5% RSD 1.7 2.1 2.6 3.8 4.9

AU

-0.010

0.000

0.010

AU

-0.010

0.000

0.010

AU

-0.010

0.000

0.010

Minutes1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20

Lot 101

Lot 103

Lot 109

Tests con kit “Method Validation” ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 50 mm Method Validation Kit (P/N 186005571)

Testar 3 lotes diferentes de columna para evaluar la calidad y la fiabilidad del método: Robustez.

Recomendaciones Columnas





Relleno columna


Otras fuentes de contaminación

Preparar y manipular las muestras adecuadamente: – Utilizar viales con certificación según detector y aplicación:

“Vial selector” “Filter Selector” http://www.waters.com/app/selector/en/vials.html http://www.waters.com/app/selector/en/filters.html

-Particulado -Solventes -Muestra (p.e.Proteínas) -Detergentes -Plastificantes -Filtros solvente -Aditivos -Par iónico

http://www.waters.com/app/selector/en/vials.html

http://www.waters.com/app/selector/en/filters.html

http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10087073


Uso de precolumnas (guarda-columnas) para aumentar la vida de las columnas

Muestra alimentaria con celulosa vegetal, sílice y estearato de magnesio, disuelta en 50/50 Agua/Acetonitrilo


Precauciones con las precolumnas:

Ratio volumen precolumna/columna (1:25 – 1:10) Imprescindible la misma química que la columna para reducir el

riesgo de cambios de selectividad


¡NUEVAS! Precolumnas VanGuard

Nuevo formato de precolumnas para HPLC: – Conexión directa a columna para minimizar volúmenes muertos o Disponibles dos formatos según férrula de entrada de columna

– Alto rendimiento de empaquetado para mantener la separación – Disponibles en todos los tamaños de partícula (2.5µm a 5µm) XBridge, XSelect, Atlantis, SunFire, XTerra, Symmetry


Contaminación relleno columna: ¿qué hacer?

Prevención Determinar origen Cambio prefiltro columnas UPLC/UHPLC Cambio filtro columnas UPLC Uso precolumnas o guardacolumnas Tratamiento “solubilización” o descontaminación: manuales

columnas

Consulta Waters



Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas

Relleno columna


Degradación de relleno: pH

Sílica convencional pH>7 se disuelve

Sílica híbrida pH>12 (XBridge)

Grupos funcionales (C18) pH<2 hidrólisis ácida

Funcionalización y End-capping pH<1 (XBridge)


Degradación de relleno: Temperatura

- Disminuye viscosidad fase móvil - Parámetro crítico: azúcares, aminoácidos… - Herramienta desarrollo métodos (ajuste fino) - Herramienta regeneración columna - Acelera procesos degradación (cuidado pH + T)

ACQUITY TUV ChA - ACQUITY TUV ChA 260nm

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

ACQUITY TUV ChA - ACQUITY TUV ChA 260nm

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

Minutes1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

Tmax = 80 ºC Tmax bajo pH= 80 ºC Tmax alto pH= 60 ºC


Test acelerado estabilidad rellenos


Minutes0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20

Vo Shift

Colapso Hidrofóbico: ¿De qué se trata?

Al trabajar con una fase móvil altamente acuosa con columnas muy hidrófobas, pueden darse cambios repentinos de V0 así como de tiempo de retención. Esto es indicativo de que los poros expulsan la fase móvil y se secan, perdiendo capacidad de retención. *1 – 10% de reducción en el volumen muerto – 23% de pérdida de retención del analito

ACQUITY UPLC® BEH C18 L = 5 cm F = 0.3 mL/min P = 2,040 T = 90 oC % Dewet = 23.10

*1 T.H. Walter, P. Iraneta and M. Capparella J. Chromatogr. A 1075 (2005) 177-183

1.25

-Atlantis T3 -XSelect HSS T3 -XBridge BEH Shield RP18





Relleno columna


Tiempos de equilibrado

Nota: Optimización posible experimentalmente. Re-equilibrado gradientes: 5-8 volúmenes columna HILIC, ciertos aditivos requieren mayor tiempo equilibrado/re- equilibrado

ID Length Volume 5X Vol Flow Rate EQUILIBRATION TIMEmm mm mL mL mL/min 2695 2795 ACQUITY

0.60mL 0.35mL 0.15mL

4.6 250 4.15 20.76 1.39 16.2 15.7 15.3

3.9 150 1.79 8.95 1.00 10.8 10.0 9.43.9 50 0.60 2.98 1.00 4.8 4.0 3.43.9 20 0.24 1.19 1.00 3.0 2.2 1.6

2.1 150 0.52 2.60 0.29 15.2 12.6 10.52.1 100 0.35 1.73 0.29 12.2 9.6 7.52.1 50 0.17 0.87 0.29 9.2 6.6 4.52.1 20 0.07 0.35 0.29 7.4 4.8 2.7

1.0 100 0.08 0.39 0.07 32.7 21.5 12.61.0 50 0.04 0.20 0.07 29.8 18.6 9.6


Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente


Relleno columna


Interacciones secundarias

Procesos síntesis sílica, funcionalización y End-capping actuales optimizados para minimizar estos efectos


Recomendación relleno: Viales QCRM

Comprobación rápida rendimiento SISTEMA + COLUMNA: Específicamente formulado para proporcionar una evaluación rápida y fácil del sistema en ciertas condiciones de fase reversa

Componentes del vial con las siguientes características: – Separados adecuadamente por fase reversa – Buena absorbancia a 254nm – Separación para amplia gama de condiciones

Referencia QCRM Neutros: 186006360


Diagnóstico del sistema a través de los QCRM

720004635EN


QCRMs disponibles :

Neutrals 186006360 Reversed-Phase 186006363 LCMS 186006963 Quad LCMS 186007362 QDa 186007345 Preparative 186006703 Dye Standard 716000765 HILIC 186007226 SEC125 186006519 SEC200 186006518 SEC450 186006842 IEX Cation 186006870 IEX Anion 186006869

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