Reacción en cadena de la polimerasa.

Se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente.

1. La mezcla de reacción contiene la secuencia de ADN que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos, que servirán como cebadores, una ADN polimerasa termoestable y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato.

2. Proceso:

La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineación y una de elongación.

a) Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.

b) Durante hibridación la, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.

c) Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena complementaria. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.

Esta técnica sirve para aumentar en tamaño de los segmentos de ADN.

Electroforesis en gel

Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

Hay varios tipos:

De poliacrilamida: Forman geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

De agarosa:Debido a que esta constituido por una matriz de fibras poliméricas retarda el paso de las moléculas y se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

De gradientes:tienen un gradiente creciente de concentración de archilamida más bisacrilamida, esto produce que el tamaño de los poros de los gradientes sean cada vez mas pequeños, favoreciendo así la clasificación de moléculas por tamaño.

Esta técnica se usa para la clasificación por tamaño de las moléculas del ADN

Enzima de restricción

Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster de la doble hebra de ADN a partir de una secuencia especifica que reconocen, y ese punto donde la enzima encuentra la secuencia de nucleótidos se conoce como sitio de restricción.

Al cortar el ADN permite poder clasificarle y localizar un semejante de forma más rápida y ágil.Hay tres tipos que se diferencian en:

Las que reconocen secuencias. La forma de realizar el corte. La estructura que tienen.

El culpable es el sospechoso numero 3.