Redalyc.Métodos de mapeo de loci de rasgos cuantitativos y sus ...

Técnica Pecuaria en México

ISSN: 0040-1889

[email protected]

Instituto Nacional de Investigaciones

Forestales, Agrícolas y Pecuarias

México

Moro-Méndez, José; Hayes, John F.

Métodos de mapeo de loci de rasgos cuantitativos y sus aplicaciones potenciales en la industria

lechera

Técnica Pecuaria en México, vol. 44, núm. 3, septiembre-diciembre, 2006, pp. 329-350

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

Mérida, México

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ESTRATEGIAS PARA EL MAPEO DE LOCI DE RASGOS CUANTITATIVOSTéc Pecu Méx 2006;44(3):329-350

Métodos de mapeo de loci de rasgos cuantitativos y susaplicaciones potenciales en la industria lechera

Quantitative trait loci mapping methods and potentialapplications in the dairy cattle industry

José Moro-Méndeza, John F. Hayesa

RESUMEN

En todos los autosomas bovinos se han detectado loci con efecto sobre producción de leche, grasa y proteína (kilos y porcentaje),resistencia a mastitis, y conteo de células somáticas. La detección de loci de rasgos cuantitativos (QTL) depende de la presenciade desequilibrio de ligamiento (DL) entre los marcadores genéticos y los QTL en la población bajo estudio. Debido a quediferentes poblaciones pueden tener diferentes frecuencias alélicas y cantidades de DL, es posible que marcadores asociadosespecíficamente con un QTL con efecto sobre rasgos cuantitativos en alguna población, puedan no tener la misma asociación conel mismo QTL en otra población; más aún, el QTL puede tener un efecto diferente o puede no existir; de tal modo queindependiente del potencial éxito en la detección de QTL en otros países, el mapeo de QTL en animales domésticos es unaactividad que debe realizarse dentro del país interesado en aplicar selección asistida por marcadores genéticos (SAM). El objetivode esta revisión es presentar los principales resultados en la detección de QTL para rasgos productivos y resistencia a mastitisen ganado lechero, así como discutir varios factores que pueden afectar la detección de QTL. También se proporciona informaciónútil para el diseño de programas de mapeo de QTL en ganado lechero en México.

PALABRAS CLAVE: Loci de rasgos cuantitativos (QTL), Desequilibrio de ligamiento, Ganado lechero.

ABSTRACT

All bovine autosomes have been reported to be harboring quantitative trait loci (QTL) with effects on milk, fat and protein (kgand percentage), resistance to mastitis, and/or SCS. The detection of QTL depends on the presence of linkage disequilibrium(LD) between the genetic markers and the QTL in the population under study. Because different populations are likely to havedifferent allelic frequencies and amounts of LD, it is possible that markers associated with a particular QTL affecting quantitativetraits in a population might not have the MASe association with the MASe QTL in another population; thus regardless of thepotential success of QTL mapping in other countries, QTL mapping in dairy cattle is an activity that must be undertaken withina country interested in applying marker assisted selection. The objective of this review is to present the main results in thedetection of QTL in dairy cattle (mainly in Holstein) for both yield and mastitis resistance traits, as well as to discuss severalfactors that might affect QTL mapping. Useful information for the design of QTL mapping programs in dairy cattle in Mexicois provided.

KEY WORDS: Quantitative trait loci (QTL), Linkage disequilibrium, Dairy cattle.

Recibido el 7 de junio de 2005 y aceptado para su publicación el 10 de febrero de 2006.

a Animal Science Department, McGill University. Ste-Anne-de-Bellevue, Québec, Canada. H9X3V9; [email protected]. Correspondencia al primer autor.

Trabajo parcialmente financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) a través de una beca doctoral para el primer autor.

INTRODUCCIÓN

Se estima que México tiene infraestructura yrecursos humanos para el desarrollo de labiotecnología, sin embargo, muestra rezagos en eldesarrollo de aplicaciones como biotecnología

INTRODUCTION

Mexico has been assessed to have importantinfrastructure and human resources to developbiotechnology; however, it is also slow indeveloping applications such as in marine

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José Moro-Méndez, et al. / Téc Pecu Méx 2006;44(3):329-350

marina, animales transgénicos, y secuenciado yanálisis de genomas(1). El análisis de genomas escrítico en la identificación precisa de efectosgénicos, mismos que son esenciales en la selecciónasistida por marcadores genéticos (MAS, por sussiglas en inglés), introgresión de genes, otransgénesis. La identificación de genes con efectobenéfico sobre características económicamenteimportantes para la industria lechera mexicana debepromoverse debido a la serie de beneficios que laacompañan cuando es exitosa. El objetivo de estetrabajo es revisar evidencia de QTL detectados conefecto sobre características cuantitativas en ganadolechero y enfatizar principios generales de métodosde análisis; esta información puede ser útil en eldesarrollo de programas para el mapeo de QTL enel ganado lechero mexicano.

Loci de rasgos cuantitativos y marcadores genéticos

Se considera que las características cuantitativasmás importantes en producción animal están bajocontrol de varios loci(2), que en consecuencia hansido denominados loci de rasgos cuantitativos (QTL,por sus siglas en inglés). Rara vez la sola detecciónde QTL constituye evidencia suficiente para explicarla base genética de rasgos cuantitativos; para lograrla disección genética completa de un fenotipo serequiere conocer las identidades y número de todoslos genes que lo definen, las tasas de mutación deesos loci, el número e identidades de los genes queafectan el fenotipo dentro y entre poblaciones, ydentro de especies, así como los mecanismos deacción de los genes(3). Adicionalmente, se necesitaconocer el papel de las marcas o impresionesgenómicas (genomic imprinting) que en forma demetilaciones de bases (principalmente citosinas)afectan la expresión génica; las metilaciones puedenheredarse, y tienen gran relevancia en el destinode los transgenes(4,5). Otro factor involucrado esla existencia de acido ribonucleico intrónico (iRNA,por sus siglas en inglés)(6) que puede afectar laexpresión génica, y aunque falta ser probado, alterarel fenotipo resultante debido a interacciones conQTL. Hasta ahora, ninguna característica ha sidoanalizada al nivel de resolución descritoanteriormente; sin embargo, existen formas deanalizar parcialmente los factores genéticos que

biotechnology, transgenic animals, sequencing andanalysis of genomes(1). The analysis of genomes iscritical for the accurate identification of gene effectswhich are essential in marker assisted selection(MAS), gene introgression, or transgenesis. Theidentification of genes with beneficial effects oneconomically important traits in the context of theMexican dairy industry should be encouraged giventhe series of benefits that accompany it whensuccessful. The objective of this review is to analyzeevidence concerning the detection of genes witheffects on quantitative traits in dairy cattle, as wellas to emphasíze general principles of methods ofanalysis; this information may be useful in thedevelopment of gene mapping programs forMexican dairy cattle.

Genetic markers and quantitative trait Loci

The most important quantitative traits in animalproduction are thought to have several lociunderlying them(2). These loci have been termedQuantitative Trait Loci (QTL). The sole detectionof QTL is seldom enough evidence to explain thegenetic basís of quantitative traits. A completeunderstanding of how a phenotype is geneticallydetermined requires the knowledge of the identitiesand number of all genes defining the phenotypic trait,mutation rates of these loci, the number and identitiesof genes affecting the trait within and betweenpopulations, and populations within species, as wellas their mechanism of action(3). Additionally, it isnecessary to know the role of genomic imprinting inthe population under study; methylation of bases(mainly cytosines) has been pointed out as responsiblefor the control of gene expression; methylations areinherited, and they are highly relevant in the fateof transgenes(4,5). Another factor in play is theexistence of intronic rebonucleic acid (iRNA)(6)

which may affect gene expression, and, though yetto be proven, alter the resulting phenotype throughinteractions with QTL. Nowadays no trait has beenanalyzed at that level of resolution. However, thereare ways to partially dissect the underlying geneticsof quantitative traits. A first step is to map QTLaffecting economically important traits.

Different types of markers have been used to mapQTL. For instance, the first attempt to detect a

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ESTRATEGIAS PARA EL MAPEO DE LOCI DE RASGOS CUANTITATIVOS

controlan los rasgos cuantitativos. Un primer pasoes el mapeo de QTL con efecto sobre característicascon importancia económica.

Diferentes marcadores se han utilizado paraidentificar QTL. Por ejemplo, el primer intentopara detectar un QTL estudió el peso de frijoles(Phaseolus vulgaris) con el uso del pigmento de lassemillas como marcador fenotípico(7). Otro tipo demarcador son polimorfismos proteicos, como losgrupos sanguíneos. Este tipo de marcador fue usado,aunque sin éxito, durante los sesentas para buscarQTL con efecto sobre producción de leche enganado danés(8). Ese fue el primer intento de usarel análisis de varianza para encontrar diferenciasen rendimiento atribuibles a polimorfismos. Conlos años, una variedad de herramientas de genéticamolecular ha ayudado en la generación de variosnuevos tipos de marcadores genéticos. Un marcadorgenético es una variación en la secuencia a nivel delADN que puede usarse para identificar segmentos delgenoma que influyen en rasgos cuantitativos(9).Durante los ochentas y noventas varios tipos demarcadores moleculares fueron desarrollados, porejemplo: polimorfismos de longitud de los fragmentosde restricción, ADN amplificado al azar, ypolimorfismos de nucleótidos individuales (RFLP,RAPD, y SNP, respectivamente, por sus siglas eninglés)(10,11,12). Para que un marcador genético seaútil debe ser altamente polimórfico y codomi-nante(10,13). Aunque en el pasado la mayoría de losmarcadores genéticos se consideraban sin significadobiológico debido a su localización intrónica, estasituación ha cambiado; hay evidencia de que el iRNA(acido ribonucleico derivado de la región intrónica yeliminado durante la transcripción) tiene un rol enregulación génica(14) por medio de un mecanismode silenciado de genes denominado interferenciade ARN (RNAi, por su siglas en inglés)(15).

Métodos para detectar QTL en ganado lechero

Existen varios métodos para detectar genes mayoresy QTL. Mientras algunos métodos no hacen uso demarcadores genéticos, otros dependen grandementede ellos. Decidir el uso o no de marcadoresgenéticos es el paso inicial en la disección genéticade características cuantitativas.

QTL studied the weight of beans (Phaseolusvulgaris) by using the pigment of the seeds as aphenotypic marker(7). A different type of markeris protein polymorphism, such as blood groups.Such markers were used without success duringthe sixties to search for QTL affecting milkproduction in Danish cattle(8). This was also the firstattempt to use analysis of variance to finddifferences in performance attributable to polymor-phisms. Over the years, molecular tools have helpedgenerate several new types of genetic markers. Agenetic marker at the DNA level is a sequencevariation that can be used to identify certainsegments of the genome that influence quantitativetraits(9). During the eighties and nineties severaltypes of genetic markers were developed, forexample: restriction fragment length polymorphisms(RFLP), randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) and single nucleotide polymorphism(SNP)(10,11,12). For a genetic marker to be usefulit should be highly polymorphic, and co-dominant(10,13). Although in the past most of thegenetic markers were not considered to bebiologically significant due to their location in theintronic regions, this situation has changed; evidencepoints out that iRNA (RNA spliced during thetranscription process) has a role in generegulation(14) through a mechanism of gene silencingcalled RNA interference (RNAi)(15).

Methods to detect QTL in dairy cattle

There are several methods to detect major genesand QTL. While some methods make no use ofgenetic markers, others rely heavily on them.Deciding whether to use genetic markers or not isthe initial step towards the genetic dissection ofquantitative traits.

Some marker-free approaches are based on analysisof multimodal distributions, departure from normaldistribution, heterogeneity of variances, oroffspring-parent resemblance(13,16), whilesegregation analysis, the most powerful applicationto detect major genes with no information of geneticmarkers, is based on the comparison of thelikelihood obtained from two models: a model withtransmission probabilities (0, 1/2, and 1; which

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Algunas estrategias que no usan marcadoresgenéticos están basadas en análisis de distribuciónmultimodal, desvío de la distribución normal,heterogeneidad de varianzas, o parecido cría-progenitor(13,16); otro método es el análisis desegregación, el más poderoso para detectar genesmayores sin información de marcadores, que estábasado en la comparación de las verosimilitudesobtenidas a partir de dos modelos; un modeloincluye probabilidades de transmisión (0, 1/2, y 1;que pueden obtenerse a partir de pedigríes), y elotro modelo se define con probabilidades detransmisión iguales (a este modelo se le llama nogenético)(17). Un incremento significativo en laverosimilitud sugiere la existencia de un gen mayorsegregando en la población. Algunas modificacionespropuestas(18) consisten en establecer un modelocon efectos fijos no genéticos y un modelo con unlocus con efecto mayor. La ventaja del análisis desegregación es que las observaciones fenotípicaspueden usarse para detectar genes mayores cuandono existen marcadores genéticos disponibles;asimismo, su principal limitación es que noproporciona ninguna información sobre la posicióndel gene responsable de la variación del rasgocuantitativo.

Métodos como el de mapeo por intervaloscompuestos(19), mapeo a intervalos utilizandoregresión(20), y modelos lineales utilizando análisisde varianza hacen uso de marcadores genéticospara probar asociaciones entre estos y rasgoscuantitativos(8,10). Estos métodos pueden detectarsegmentos de cromosomas que alojan QTL. Si LDestá presente entre un marcador genético y un QTL,marcadores con efecto significativo puedenencontrarse por análisis estadísticos. Respecto alos marcadores genéticos, los análisis puedenrealizarse utilizando marcadores anónimos outilizando marcadores de genes con funciónfisiológica conocida(9).

Con respecto a la metodología estadística utilizadapara estimar efectos de QTL, hay dos métodosprincipales: modelos lineales utilizando análisis devarianza y métodos de máxima verosimilitud. Laaplicación de análisis de varianza para detectarasociaciones entre marcadores genéticos y rasgos

can be obtained from pedigrees), and a model withequal transmission probabilities (referred to as non-genetic model)(17). A significant increase in thelikelihood is taken as an indication that a major geneis segregating in the population. Proposedmodifications(18) involve fitting an initial model withfixed non-genetic effects and then a model with amajor locus effect. The advantage of segregationanalysis is that phenotypic observations may be usedto detect major genes when DNA markers are notavailable; likewise, its main limitation is that itgives no information regarding the position of thegene responsible for the variation of the quantitativetrait.

Methods such as composite interval mapping(19),regression interval mapping(20), and linear modelsusing analysis of variance(8) make use of geneticmarkers to test for associations between them andquantitative traits(8,10). These methods can detectchromosomal segments that harbor QTL. If LD ispresent between a genetic marker and a QTLunderlying a quantitative trait, significant markereffects may be found through statistical analyses.With regard to the genetic markers, analyses may beperformed using anonymous markers or using markersof genes with known physiological function(9).

With respect to the statistical methodology used toestimate QTL effects, there are two mainapproaches: linear models using analysis of varianceand maximum likelihood methods. Application ofanalysis of variance to detect associations betweengenetic markers and phenotypic traits (which suggestthe presence of a QTL linked to the genetic markeraffecting the trait) has been widely applied, mainlybecause it is relatively easy to perform usingstandard statistical software. Variations ofmethodology proposed Weller, Kashi and Soller(21)

have been applied to detect QTL in dairycattle(22,23). A few studies(24,25) have usedmaximum likelihood methodology in which thelikelihood of the model given the phenotypes andmarker genotypes is compared under alternativeassumptions regarding the position of the QTL (andthus recombination rate between the marker andthe QTL). Likelihood methods are considered morepowerful that ANOVA methods; however the

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fenotípicos (lo cual sugiere la presencia de un QTLligado al marcador genético con efecto sobre elrasgo) ha sido ampliamente difundida, debidoprincipalmente a la relativa facilidad con la que sepueden realizar con programas estadísticos estándar.Variaciones a la metodología propuesta por Weller,Casí y Soller(21) se han aplicado para detectar QTLen ganado lechero(22,23). Algunos estudios(24,25)

han usado la metodología de máxima verosimilitud,en la cual la verosimilitud del modelo considerandolos fenotipos y los genotipos dados por losmarcadores es comparado con la verosimilitud demodelos alternos que suponen diferentes posicionesdel QTL (es decir, suponen diferentes tasas derecombinación entre el(los) marcador(es) y el QTL).Los métodos que usan máxima verosimilitud sonconsiderados más poderosos que los métodos queusan análisis de varianza, sin embargo, laconstrucción de funciones de verosimilitud escompleja debido al gran número de posiblesgenotipos requerido.

Diseños experimentales para detectar QTL enganado lechero

El uso de marcadores genéticos en análisis deasociación para identificar QTL se basa en el tipode asociación que exista entre un marcador genéticoy un QTL. Un marcador genético puede: 1) afectardirectamente la característica, es decir, el marcadores el QTL, o 2) estar en DL con el QTL queafecta la característica, lo que implica, aunque nonecesariamente, que el marcador está físicamenteligado al QTL. En estudios de asociación es difícilestablecer si el marcador está estrechamente ligadoa un QTL (o a un grupo de QTL) o si el marcadores de hecho el gen que afecta la característica.Cuando no existe recombinación entre el marcadory el QTL no hay manera, en estudios de asociación,de diferenciar al marcador del QTL, y en ese casopara usos prácticos el marcador es el QTL. Si dosgenes segregan juntos (esto es, los dos genes tienenuna asociación no aleatoria) se dice que están enDL. Ligamiento físico puede producir DL, peroincluso dos alelos en diferentes cromosomas (estoes, no ligados físicamente) pueden estar enDL(26,27). Así, se debe enfatizar que DL norequiere necesariamente de ligamiento físico(28).

construction of likelihood functions is complex dueto the large number of possible genotypes required.

Experimental designs for QTL mapping in dairycattle

The use of genetic markers in association studiesto map QTL can rely on the kind of relationshipbetween a genetic marker and a QTL. A geneticmarker can be either: 1) Directly affecting thetrait, i.e.: the marker is the QTL, or 2) in LD withQTL affecting the trait, which implies, though notnecessarily, that the marker is physically linked tothe QTL. In association studies it is difficult toestablish whether a marker is tightly linked to aQTL (or a cluster of QTL) or whether it is actuallythe gene affecting the trait. When recombinationbetween the marker and the QTL is zero, there isno way, in association studies, to differentiate themarker from the QTL and for all practical purposesthe marker is the QTL. If two genes segregatetogether (i.e. the two genes are in non-randomassociation) they are said to be in LD. Physicallinkage can produce LD, but even two alleles indifferent chromosomes (i.e.: not physically linked)can be in LD(26,27). Thus, it has to be emphasízedthat LD does not necessarily require physicallinkage(28). Not all alleles segregating together arephysically linked. Linkage disequilibrium betweennon-physically linked alleles has a shorter durationthan the LD of physically linked alleles. Theduration of the LD from linked genes depends onthe rate of recombination. The further apart twogenes are on the MASe chromosome, the higherthe rate of recombination between them. Thepresence of selection, migration, mutation and/orgenetic drift in the population is necessary to createand maintain LD between genes not physicallylinked.

For dairy cattle, there are two experimental designsthat facilitate the detection of QTL: the daughterdesign (DD) and the granddaughter design (GDD).The DD(8,29) consists in the use of the phenotypicinformation of progeny homozygous for alternatealleles from heterozygous sires (for the relevantmarkers) to test the hypothesis of associationbetween the markers and the quantitative trait. The

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No todos los genes segregando juntos estánfísicamente ligados, y el DL entre alelos no ligadosfísicamente tiene una duración más corta que elDL entre alelos ligados físicamente. La duracióndel DL de genes ligados físicamente depende de latasa de recombinación entre ellos; mientras másseparados estén dos genes uno del otro sobre elmismo cromosoma, la tasa de recombinación serámayor. La creación y mantenimiento de DL entregenes que no están ligados físicamente depende dela presencia de selección, migración, mutación yderiva genética en la población.

Existen dos diseños experimentales que facilitan ladetección de QTL en ganado lechero: el diseñohija (DH) y el diseño nieta (DN). El DH(8,29)

consiste en el uso de la información fenotípica deprogenie homocigota (para alelos alternos) desementales heterocigotos (para los marcadores deinterés) para probar la hipótesis de asociación entrelos marcadores y el rasgo cuantitativo. El otrodiseño, el DN(21), consiste en genotipificar hijosde sementales heterocigotos (para los marcadoresde interés), y recolectar medidas fenotípicas (comovalores genéticos, desviaciones de producción delas hijas, y habilidades de transmisión predichas) apartir de la progenie (esto es, vacas en control deproducción, nietas de los sementales). General-mente, el DN es preferido sobre el DH debido albajo costo de genotipificado. En el DH un posiblemodelo estadístico podría incluir los efectos demarcador genético, semental, y otros efectosambientales. Un efecto significativo del marcadorindica que existe un QTL segregando (en LD conel marcador en la población bajo estudio)(21,29).En el DN un posible modelo estadístico para mapearQTL a nivel poblacional podría incluir el efectodel marcador y el efecto de los toros (esto es, hijosy sementales). Un efecto significativo del marcadorcon este modelo tiene la misma interpretación queel modelo bajo el DH(21,29); pero con el DN,también es posible definir un modelo para detectarQTL a nivel familiar, incluso cuando el marcadorpueda estar en equilibrio de ligamiento con el QTLa nivel da la población. El análisis intrafamiliar(bajo el DN) puede incluir efectos del abuelopaterno, marcador (heredado por los toros) anidadodentro del abuelo paterno, y toro (hijos de los

other design, the GDD(21), consists in genotypingsons of heterozygous (for the markers of interest)sires, and retrieving phenotypic measurements (i.e.Estimated Breeding Values, Daughter YieldDeviation, or Estimated Transmitting Abilities forthe traits of interest) from the progeny (i.e.Granddaughters in milk recording). Generally, theGDD is preferred over the DD due to the low costof genotyping in this design. In the DD a possiblestatistical model might include the effect of themarker, sire, and other environmental effects. Asignificant effect for the marker indicates that thereis a QTL segregating (in population wide linkagedisequilibrium with the marker) in thepopulation(21,29). In the GDD a possible statisticalmodel to map QTL across the population is to fita model with the effect of the marker and theeffect of the bulls (i.e. sons and their sires). Asignificant effect of the marker under this modelhas the MASe interpretation as in the model underthe DD(21,29). Also, under the GDD it is possibleto fit a model to detect QTL at family level, evenwhen the marker may be at linkage equilibriumwith the QTL at population level. The within-familyanalysis (under the GDD) might include effects ofgrandsire, marker (inherited by sons) nested withingrandsire, and sons nested within marker andgrandsire(29). A significant effect for the markerindicates that the marker is linked within familiesto a QTL affecting the trait(26) (i.e. LD will alwaysexist within families if there physical linkage of theQTL to the marker). The within-family analysismay be performed pooling all the grandsire families,or within each grandsire-family(29). It can be seenthat GDD is not a requirement to run an across-population analysis; however, once information hasbeen collected under a GDD having in mind toperform within-family analyses, it is feasíble torun across-population analyses as those performedunder DD. In that way the hypothesis of associationbetween the marker(s) and the trait(s) may be testedat population, and at family level. In summary,DD and GDD will allow the detection of QTL atthe population level (which implies that there isLD between the marker and the QTL, even betweengenes not physically linked) or at within-familylevel (i.e. LD due to physical linkage).

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abuelos paternos) anidado dentro del marcador yabuelo paterno(29). Un efecto significativo delmarcador indica que el marcador está ligado dentrode familias a un QTL afectando la característica(26)

(esto es, DL siempre existirá dentro de familias sihay ligamiento físico entre el QTL y el marcador).El análisis intrafamiliar puede ser realizadoconsiderando todas las familias de abuelos al mismotiempo, o dentro de cada familia(29). Se puedeapreciar que el DN no es requerimiento para realizaranálisis poblacionales, sin embargo, una vez que lainformación se ha colectado con un DN teniendocomo propósito la realización de análisisintrafamiliares, es factible realizar análisispoblacionales como los realizados con DH. De esamanera la hipótesis de asociación entre elmarcador(es) y la(s) característica(s) cuantitativa(s)puede(n) probarse a nivel de la población y a nivelfamiliar. Resumiendo, los DH y DN permitirán ladetección de QTL a nivel poblacional (lo queimplica que existe DL entre el marcador y el QTL,incluso entre genes que no están ligado físicamente)o a nivel familiar (donde el DL se debe a ligamientofísico del marcador y el QTL).

Factores a considerar en estudios de asociación

A pesar del número de QTL detectados coninfluencia sobre características económicamenteimportantes, el uso de esos QTL dentro deprogramas de mejoramiento es limitado; variosposibles factores causantes de lo anterior han sidodiscutidos en literatura sobre el tema. El retraso enel uso de QTL dentro de esquemas de MAS hasido atribuido a la falta de certeza sobre la existenciade los QTL o si los QTL están segregando en lapoblación(30). Esta falta de certeza está relacionadaal hecho de que algunos resultados significativosreportados en la literatura pueden haber ocurridodebido al azar. Por ejemplo, de 2,392 pruebas designificancia realizadas (para detectar QTL conefecto sobre producción y composición de leche,conformación, y salud)(22), se detectaron 32 efectossignificativos (P<0.01); a este nivel de signi-ficancia, se podrían esperar 24 efectos significativosdebido al azar. El anterior es un problema comúnde comparaciones múltiples cuando varias hipótesisse prueban con la misma base de datos.

Factors to consider in association studies

Despite the number of QTL reported with influenceon economically important traits, the use of theseQTL in breeding programs appears quite limited.Several factors affecting the use of detected QTLin breeding programs have been discussed in theliterature. The delay in the use of QTL in markerassisted selection (MAS) schemes has been ascribedto the uncertainty about whether the QTL are realand whether the QTL are segregating in the breedingpopulation(30). This uncertainty is in part relatedto the fact that some significant effects reported inthe literature may occur by chance. For instance,from 2,392 significance tests (performed to mapQTL affecting milk yield, milk composition,conformation, and health)(22), 32 significant effectsat P<0.01 were observed; at that significance level,one would expect 24 significant effects by chance.This is a common problem of multiple comparisonswhen several hypotheses are tested with the MASedata set. The problem of multiple comparisons inQTL mapping is increased by the fact that geneticmarkers on the MASe chromosome are notindependent; hence multiple tests done with theMASe data set will increase the chance of declaringa significant QTL even when the QTL does notexist. In other words, there will be higherprobabilities of rejecting the null hypothesis of noassociation between the marker and the quantitativetrait when in fact it is true (i.e. Type I error).

The problem of multiple comparisons in QTL mappinghas been addressed by several authors, the mostfrequent citation being Churchill and Doerge(1994)(31). These authors developed an empiricalmethod to obtain threshold values based on permutationtests, an approach first proposed (although not forQTL mapping) by Fisher in his Design of experiments,published in 1935. Basícally, the method consists inthe repeated random shuffling of the quantitative traitvalues with regard to the individuals under study,while holding the marker data constant. The permuteddata are then used to analyze marker effects. Thetest statistics obtained from each permutation arestored and the p-values stored are used to obtaincritical values to test hypothesis with the originaldata. It was determined that 1000 permutations are

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sufficient to estimate experiment-wise p-values at5% level of significance(31), and hence reduce theprobability of type I errors.

Some of the positive effects reported in the literatureconcerning QTL may be due to LD produced bylinkage between a specific marker allele and QTLwithin some families, rather than to LD between amarker and a QTL with effect on the trait acrossthe population. For example, in a study(32) someof the detected QTL affecting SCS had an effect insome of the eight grandsire families analyzed, butnot in all of them. Only one marker allele wasfound to be associated with lower DYD values forSCS, regardless of grandsire family. QTL effectswithin families imply that MAS must be applied ina per family basís rather than in a populationapproach. Among the factors which create LD (evenamong genes that are not linked) are selection,migration, mutation, and random drift(13). All ofthese factors are present in dairy cattle populations.Therefore, methods chosen to study QTL-markersassociations, and the interpretation drawn from theresults, have to take into account these factors inorder to formulate conclusions. Association studieshave a resolution of only about 20 cM(29). Withinthis wide range hundreds of genes may be located;hence the importance of refining and constantlyanalyzing the region where a QTL has beenmapped, in order to obtain a more precise locationof the underlying genes. Ultimately, a combinationof techniques (linkage analysis, evolutionary treemapping, comparative mapping, association analysis,fine mapping, positional cloning, differential geneexpression, epigenetic analysis) may be necessary toidentify the gene underlying the QTL(33,34).Information about the genetic control ofeconomically important traits has accumulated sincethe first major study to map QTL in dairy cattlewas published in 1995(35). By now, almost all thebovine autosomes (BTA) have been reported toharbor QTL with effects on both yield and healthtraits(36). Although results vary, some conclusionsand lessons can be drawn from these.

QTL studies in dairy cattle: yield traits

QTL for milk production were mapped for the firsttime(32) by genotyping 159 DNA markers on 1,518

El problema de comparaciones múltiples en mapeode QTL es exacerbado por el hecho de que losmarcadores genéticos sobre el mismo cromosomano son independientes; como consecuencia, larealización de múltiples pruebas de hipótesis con lamisma base de datos incrementará la probabilidadde detectar QTL incluso cuando en realidad elQTL no exista. En otras palabras, habrá altaprobabilidad de rechazar la hipótesis nula de noasociación entre el (los) marcador(es) y el (los)rasgo(s) cuantitativo(s) cuando en realidad es cierta(Error tipo I).

El problema de comparaciones múltiples endetección de QTL ha sido abordado por distintosautores, siendo la cita más frecuente Churchill yDoerge(31). Estos autores propusieron un métodoempírico para obtener valores umbral basado enpruebas de permutación, una estrategiaprimeramente elucidada (aunque no para ladetección de QTL) por Fisher en su Diseño deExperimentos, publicado en 1935. Básicamente, elmétodo consiste en realizar repetidosreordenamientos aleatorios de la característicacuantitativa con respecto a los individuos en estudio,mientras la información de los marcadores semantiene inalterada en cada individuo. Los datosreordenados (permutados) son usados para analizarel efecto de los marcadores genéticos sobre el rasgocuantitativo. Las pruebas estadísticas obtenidas apartir del análisis de cada grupo de datos permutadosson almacenadas y los valores de probabilidad (p-values) que se almacenaron se usan para obtenervalores umbrales para probar las hipótesis con losdatos originales. Se ha determinado que 1000permutaciones son suficientes para estimar valoresde probabilidad a nivel experimental de 5%, y conello reducir la probabilidad de errores tipo I(31).

Algunos de los efectos positivos reportados en laliteratura relacionada con QTL pueden ser debidoa DL producido por ligamiento entre un alelo enparticular y un QTL en algunas familias, más quedebido a DL entre un alelo y un QTL con efectosobre la característica a nivel de la población. Porejemplo, en un estudio(32) algunos de los QTLdetectados con efecto sobre el conteo lineal decélulas somáticas (CLCS) tuvieron un efecto en

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US Holstein sires (with more than 150,000daughters); QTL affecting milk yield were foundon five chromosomes: 1, 6, 9, 10, and 20. Theevidence implied that QTL marker-alleles were inassociation with the quantitative trait in somefamilies. In another study(23) 13 families ofNorwegian cattle were used to analyze associationsbetween milk yield traits and casein haplotypes.The analyses included the effect of the grandsire,the haplotypes nested within grandsire, and therandom effect of sire nested within haplotype. Theyfound a significant effect of one of the haplotypesin five grandsire families; however, they did notfind associations when they performed the analysispooling all grandsire families. The authors suggestthat at least in some families a particular haplotypewas associated with a favorable QTL allele affectingprotein yield.

In another study, relationships between geneticvariants within the 3rd intron of the bovine GrowthHormone gene and the estimated transmittingabilities (ETA) of milk, fat and protein yields in172 Canadian bulls (100 Holstein, 51 Ayrshire,and 21 Jersey) were found(37). The model includedthe fixed effect of the genotype of the bulls and therandom residual effect. In this analysis no significanteffects were found for any of the genotypes. In theMASe study, the authors report using x2 tests thatdetected differences in the genotypic proportionsof LL and LV genotypes (L=leucine, V=valine)among bulls classified as top, middle and bottomin ETA for milk, fat and protein; however, thesmall MASple size and the extreme genotypicfrequencies were reasons for which the authorssuggest further studies are required in order toelucidate the relationships among growth hormone(GH) and milk yield. Associations between the GHfactor-1 (Pit-1, a transcription factor that activatesthe expression of prolactin and GH) and milk yieldand conformation traits were studied in ItalianHolstein bulls(38) (89 sires); the authors calculateddaughter yield deviations for yield traits (milk, fatand protein yields, and fat and protein percent),and 16 conformation traits. Relationships amongsires were included in the analysis across-population.Although the results suggest that one allele of Pit-1is associated with high milk and protein yield and

algunas de las ocho familias de sementalesanalizadas, pero no en todas ellas. Sólo se encontróun marcador en asociación con valores de desviaciónde producción de las hijas más bajos para conteoscelulares somáticos (CCS), sin importar la familia.Efectos de QTL dentro de familias implica que laselección asistida por marcadores genéticos debeser aplicada a nivel familiar en vez de usar unaestrategia poblacional. Ya se ha mencionado queentre los factores que crean DL (incluso entre genesque no están ligados) se cuenta a la selección,migración, mutación, y deriva genética(13). Todosestos factores se encuentran en poblaciones deganado lechero. Por lo anterior, los métodosescogidos para estudiar las asociaciones entremarcadores genéticos y QTL, y la interpretacióngenerada a partir de los resultados, tienen que tomaren cuenta los factores previamente mencionadoscon el objeto de formular conclusiones.

La resolución de los análisis de asociación es sóloalrededor de 20 cM(29). Dentro de este amplio rangopodría haber cientos de genes; de ahí la importanciade refinar y analizar, de manera regular y constante,la región donde el QTL haya sido localizado con elobjeto de obtener una localización más precisa delos genes subyacentes. En última instancia, unacombinación de técnicas (análisis de ligamiento,mapeo genético con árboles evolutivos, análisiscomparativo de genomas, análisis de asociación,mapeo fino, clonado posicional, expresióndiferencial de genes, análisis de epigenética) pareceser necesaria para identificar los genes subyacentesal QTL(33,34). Desde que el primer estudio paraidentificar QTL en ganado lechero fue publicadoen 1995(35) se ha acumulado información sobre elcontrol genético de características económicamenteimportantes. Prácticamente en todos los autosomasbovinos (BTA) se han encontrado QTL con efectosobre producción de leche y características desalud(36). Aunque los resultados varían, algunasconclusiones y lecciones pueden obtenerse a partirde ellos.

QTL para características productivas

Loci de rasgos cuantitativos para producción deleche fueron identificados por primera vez(32) al

338


better conformation (deep, angular body, andstraight rear leg set), these results are not conclusivesince the study was based on a small MASple ofbulls. In Germany, 20 markers were tested fortheir associations with EBV for yield traits in fivegrandsire families of Holstein bulls(39). This studyfocused on BTA6. The authors reported finding asignificant effect on protein yield in one of thefamilies. They suggested that the QTL is locatedbetween two of the polymorphisms (TGLA37 andFBN13), within a 3-cM interval in the middlesection of the chromosome. However, cautionshould be exercised because no mention is maderegarding the adjustment in the threshold for theLOD; the non-independence of the markers used isa factor that should be addressed to reduce thechance of false positives (i.e. a significant effect ofa QTL that does not exist in the interval). Thisproblem also arose when a single-locus model usinginterval mapping was fitted(40). The intervalbetween the marker TGLA37 (one of the flankingmarkers of the putative segment with the QTL)and the marker IL90 was covered with no markers,and its length was around 30 cM. This leaves openthe possibility that markers TGLA37 and IL90 maybe in LD with other QTL located in this interval.It has been shown that LD between syntenic allelesmay extend up to 50 cM in bovine populations(27).In Canada, a study further investigated therelationships between genetic markers of the GHgene and milk yield In Holsteins(41). The authorsfound significant effects for four markers, andreported the average effect of the gene substitutionfor alleles of Gh4.1 (43 and -253.6 milk, kg forthe favorable allele and unfavorable allele,respectively) and Gh6.2 (44.9 and -283 milk, kgfor the favorable allele and unfavorable allele,respectively). These analyses were done acrosspopulation, not accounting for the relationshipsamong sires.

In another Canadian study six grandsire families(432 sons) were used(42) to search for evidence offavorable QTL affecting yield traits (production ofmilk, fat, and protein, and percentages of fat andprotein); they found that there were five putativeQTL located on chromosome 1, and two QTLlocations on chromosome 6, all related to increased

genotipificar 159 marcadores genéticos en 1,518toros Holstein de Estados Unidos (padres de másde 150, 000 hijas); los autores detectaron QTL conefecto sobre producción de leche en cincocromosomas (1, 6, 9, 10, y 20). La evidenciaobtenida sugirió que los QTL se encontraban enasociación con la característica en algunas familias.En otro estudio(23), 13 familias de ganado noruegofueron usadas para analizar asociaciones entre rasgosde producción de leche y haplotipos de caseína.Los análisis incluyeron el efecto del abuelo, elhaplotipo anidado dentro del abuelo, y el efectoaleatorio del toro anidado dentro de haplotipo. Seencontró efecto significativo de un haplotipo encinco familias de sementales; no se encontraronasociaciones cuando los análisis consideraron a todaslas familias de sementales a la vez. Los autoressugirieron que al menos en algunas familias unhaplotipo en particular estaba asociado con un alelodel QTL favorable para la producción de proteína.

En otro estudio, se detectaron asociaciones entrevariantes del 3er intron del gene bovino de lahormona de crecimiento y habilidades detransmisión estimadas (HTE) para producción deleche, grasa, y proteína en 172 toros canadienses(100 Holstein, 51 Ayrshire, y 21 Jersey)(37). Elmodelo utilizado en ese estudio incluyó el efectofijo del genotipo de los toros y el efecto aleatorioresidual; no se encontraron efectos significativosde ninguno de los genotipos. En ese mismo trabajo,los autores describen la aplicación de análisis de Jicuadrada con el que encontraron diferencias en lasproporciones de genotipos LL y LV (L=leucina;V=valina) entre los toros cuando estos fueronclasificados acorde a valores de HTE (alto, medio,y bajo) para leche, grasa y proteína. Debido a lapequeña muestra utilizada y los valores extremosde frecuencias fenotípicas los autores sugirieronmás estudios para discernir las relaciones entrehormona de crecimiento y producción de leche.Por otro lado, se han estudiado asociaciones entreel factor 1 de la hormona de crecimiento (Pit-1)(un factor de transcripción que activa la expresiónde prolactina y la hormona de crecimiento) yproducción de leche y rasgos de conformación ensementales Holstein italianos(38) (89 sementales);los autores calcularon desviaciones de producción

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de las hijas de sementales para producción de leche,grasa, y proteína, y porcentajes de grasa y proteína,y 16 características de conformación. Las relacionesde parentesco entre los sementales fueron incluidasen los análisis poblacionales. Aunque los resultadossugieren que un alelo de Pit-1 está asociado conaltas producciones de leche y proteína, y con mejorconformación (cuerpo angular y profundo, patastraseras rectas) estos resultados no son concluyentesdada la pequeña muestra de toros.

En Alemania, se estudiaron asociaciones entre 20marcadores genéticos y valores genéticos predichos(VGP) para rasgos productivos en cinco familiasde sementales Holstein(39). Este estudio se enfocóal BTA6. Los autores encontraron resultadossignificativos en el caso de producción de proteínaen una de las familias; en particular, sugirieronque un QTL está localizado entre dos polimorfismos(TGLA37 y FBN13) dentro de un intervalo de 3cM en la parte media del cromosoma. Sin embargo,los resultados se deben considerar conservado-ramente dado que no se mencionó ajuste del umbralde verosimilitud del LOD score; la no independenciaentre los marcadores empleados es un factor quedebe considerarse para reducir la posibilidad defalsos positivos. Este problema también se produjocuando se aplicó mapeo a intervalos con un modelode un locus(40). El intervalo entre el marcadorTGLA37 (uno de los marcadores que flanquean laregión candidata a contener el QTL) y el marcadorIL90 no fue cubierta con marcadores, y su longitudes de aproximadamente 30 cM. Esto deja abiertala posibilidad de que TGLA37 y FBN13 puedanestar en DL con otro QTL localizado en esteintervalo. Se ha mostrado que una cantidadimportante de DL entre alelos sinténicos puedeextenderse hasta 50 cM en poblaciones bovinas(27).

En Canadá, un estudio profundizó en las relacionesentre marcadores genéticos del gen de la hormonadel crecimiento y producción de leche en ganadoHolstein(41). Se encontraron efectos significativosde cuatro marcadores y se describió el efectopromedio de substitución del gen para alelos deGH4.1 (43 y -253.6 leche, kg para el alelo favorabley desfavorable, respectivamente) y GH6.2 (44.9 y-283 leche, kg para el alelo favorable y

milk yield. Recently, also in Canada, the effects offive markers on milk yield, and percentages ofprotein and fat were studied(43) and it was confirmedthat a marker on chromosome 20 for GH Receptorhas a significant effect on protein percentage. Instudies of US Holsteins(22,32,44,45), within familyanalyses have been used to detect QTL scatteredalong 19 bovine autosomes; the most significantQTL have been found affecting milk yield, fatpercentage, protein percentage, and protein yieldin BTA 3, 6, 10, 14, and 29. There are reportsthat QTL have been used in MAS schemes inFrance(46,47), Netherlands and New Zealand(48),and Germany(49,50,51); more detailed informationis given later. A summary of the results from theabove mentioned studies is given in table 1.

QTL studies in dairy cattle: mastitis resistance

Few studies have been carried out to detect QTLand major genes affecting mastitis resistance. Themain studies performed in this sense haveinvestigated the role of the Major HistocompatibilityComplex (MHC) genes. The associations betweenBoLA class I haplotypes and subclinical mastitiswere analyzed(52). 657 cows from various breedswere used to determine their SCC andbacteriological status (infected with Staphylococcusaureus, and/or coagulase-negative staphylococci).The model included fixed effects of herd, lactationnumber, breed and haplotype. Two alleles wereassociated with a decreased SCC and another twoalleles were associated with increased SCC. Twoalleles were associated with increased likelihood ofisolating bacteria, and two alleles were associatedwith decreased likelihood. In another study(53)

genetic associations between measures of mastitisprevalence and genotypes of the MHC class IIDRB3.2 and IgG2 loci, and the CD18 mutationresponsible for BLAD (bovine leukocyte adhesiondeficiency) were analyzed. 137 periparturientHolstein cows were under study and the measuresof mastitis used were EBV for SCS, clinical mastitis(CM), and intramammary infections (IMI) causedby major and minor pathogens. The markerDRB3.2*16 was associated with increased EBVfor SCS; DRB3.2*23 was associated with decreasedEBV for CM; the other allele, DRB3.2*24, was in

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desfavorable, respectivamente). Estos análisis fuerondesarrollados a nivel poblacional, sin tomar encuenta las relaciones de parentesco entre sementales.

En otro estudio(42) seis familias de sementales (con432 hijos) fueron usadas para buscar evidencias deQTL favorables para producción de leche, grasa yproteína y porcentajes de grasa y proteína; cincoQTL candidato fueron localizados en BTA1, y dossobre BTA6, todos relacionados a un incrementoen la producción. Recientemente, los efectos decinco marcadores sobre producción de leche, yporcentaje de proteína y grasa fueron estudiados(43)

y se confirmó que un marcador del gen del receptorde la hormona del crecimiento (localizado enBTA20) tiene un efecto significativo sobre elporcentaje de proteína. Estudios de ganado Holsteinen Estados Unidos(22,32,44,45) realizados en algunasfamilias de sementales han permitido detectar QTLdistribuidos en 19 autosomas bovinos; los QTLmás significativos afectando la producción de leche,porcentaje de grasa, el porcentaje y producción deproteína se encontraron en los autosomas 3, 6, 10,14, y 29. Hay reportes de QTL han sido usadosdentro de esquemas de MAS en Francia(46,47),Holanda y Nueva Zelanda(48), y Alemania(49,50,51);información más detallada se proporciona párrafosadelante. Un resumen de resultados de los estudiosmencionados anteriormente se proporciona en elCuadro 1.

QTL para resistencia a mastitis

Pocos estudios se han llevado a cabo para detectarQTL y genes mayores con efecto sobre la resistenciaa mastitis. Los principales estudios realizados haninvestigado el rol de genes del Complejo Mayor deHistocompatibilidad (MHC, por sus siglas eninglés). Se han analizado las asociaciones entrehaplotipos clase I del MHC y mastitis subclínica(52)

con 657 vacas de varias razas que fueron usadaspara determinar sus CCS y estado bacteriológico(negativa, o infectada con Staphylococcus aureus,y/o estafilococos coagulasa-negativos). El modeloincluyó efectos fijos de hato, lactación, raza, yhaplotipo. Dos alelos fueron asociados a unadisminución de CCS, y otros dos alelos seencontraron asociados a un incremento de CCS.

Cuadro 1. Loci de rasgos cuantitativos (QTL) con efectosobre características productivas en ganado lecheroreportados en varios estudiosTable 1. Quantitative trait loci (QTL) with effect on yieldtraits in dairy cattle reported on several studies

BTA Marker (or gene), Refe- position (cM) Traits rence

1 Pit-1 gene, position is notreported in the article Protein, kg 38

1 RM095-ILST004, 21.3 cM Fat, % 42ILST004-BM4307, 32-35.2 cM Fat, kgBM4307-INRA011, 35.2-54.4 cM Protein, kgINRA011-MB6506, 54.4-69.2 cM Milk, kg

3 BL41-ILST29, 32 cM Protein, kg 44HUJ246-TGLA263, 49 cM Fat, %

6 Haplotypes: αS1-CN (C), Protein, kg 23β-CN (A5), κ-CN(A); positionis not reported in the article Milk, kg

6 BM415, position is not reportedin the article Protein, % 32

6 TGLA37-FBN13, 53-58 cM Milk, kg 39Fat, kg

6 BM1236, 83.9 cM Protein, % 456 BM1329-BM143, 35.5-49.4 cM Percentage of 42

ProteinMilk, kg

10 BMS2614, 98.4 cM Milk, kg 4514 BM6425, position is not reported

in the article Protein, % 3214 BMS1678, 6.2 cM Fat, kgFat, % 3214 CSSM066, centromere Fat, % 4714 CSSM066, centromere Protein, % 4714 ILST39-BMS1678, 1 cM Fat, % 4414 BULGE30-BULGE9, centromere Fat, % 4814 KIEL_E8, centromere; DGAT1, Milk, kg 50

0.3 cM; ILST039, 1.3 cM; Fat, kgCSSM66, 8.7 cM Protein, kg

Fat, %Protein, %

19 Two polymorphsims on GH Milk, kg 41gene; 65.7 cM Protein, kg

19 GH gene, 65.7 cM Milk (ETA) 3729 ARO26-BCM8012, 10 cM Protein, kg 4426 IDVGA59, 57 cM Fat, kg 47

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Dos alelos fueron hallados asociados a una mayorprobabilidad de aislar bacterias, y dos alelos seasociaron a una menor probabilidad de aislarbacterias. Otro estudio(53) evaluó asociacionesgenéticas entre medidas de prevalencia de mastitisy genotipos del MHC clase II DRB3.2, IgG2, y lamutación CD18 responsable de la deficiencia deadhesión leucocitaria bovina (BLAD, por sus siglasen inglés); en este estudio 137 vacas Holsteinpróximas al parto fueron utilizadas; las medidas demastitis fueron VGP para conteo lineal de célulassomáticas (CLCS), mastitis clínica (MC), einfecciones intramamarias (IIM) causadas porpatógenos mayores y menores. El marcadorDRB3.2*16 se asoció con aumento de VGP paraCLCS; DRB3.2*23 se encontró asociado a unaumento de VGP para MC; otro alelo, DRB3.2*24,resultó asociado a un menor VGP para CLCS y almismo tiempo asociado a un mayor VGP para IIM.

En otro estudio, 1,100 vacas fueron utilizadas paraanalizar asociaciones entre alelos del locus DRB3.2con niveles de CCS(54). Se realizaroncomparaciones de animales con elevado CCS yanimales control. Vacas con elevado CCS seclasificaron ya sea como de incremento agudo deCCS (una muestra con más 500,000 células) oelevación crónica de CCS (tres muestrasconsecutivas con más de 500,000 células). Vacasno integradas a ninguno de los grupos mencionadosse consideraron como grupo control. Los alelosDRB3.2*8, DRB3.2*16 y CRB3.2*23 estuvieronasociados con un incremento en el riesgo deinfección en vacas con incremento agudo de CCSen primera, segunda, y tercera lactancias,respectivamente; el alelo DRB3.2*22 se asoció aun menor riesgo de conteos celulares altos en vacasde segunda lactancia. Otro estudio(53) analizóinformación proveniente de 901 vacas con unmodelo que incluyó los efectos de parto, época departo y marcadores como efectos fijos; aquí seencontró que el alelo DRB3.2*16 influyó en laexpresión de bajos conteos de células somáticas loque está en conflicto con los dos estudiosprevios(51,52).

Resultados de estudios de asociación entre genesdel MHC clase II y mastitis pudieran parecer poco

association with decreased EBV for SCS and alsoin association with increased EBV for IMI. Inanother study, 1100 cows were used to analyzeassociations between alleles of the DRB3.2 locuswith levels of SCC(54). Comparisons of animalswith elevated SCC and control animals wereperformed. Cows with elevated SCC were classifiedeither as acutely elevated SCC (one test of morethan 500,000 cells) or chronically elevated SCC(three consecutive tests of more than 500,000 cells).Cows that did not fall in either group were classifiedas control cows. Alleles DRB3.2*8, DRB3.2*16and CRB3.2*23 were associated with an increasedrisk of disease in cows with an acute SCC in first,second and third lactation, respectively; alleleDRB3.2*22 was associated with reduced risk ofhigh cell count in second lactation cows. However,in other study(53) allele DRB3.2*16 wassignificantly associated with lower SCS, conflictingwith other studies(51,52).

Results from association studies between MHC classII genes and mastitis may seem disappointing asmost of the literature shows contradictory results.A possible explanation is that the studied MHCgenes(53,54,55) may explain only partially thevariation in mastitis resistance. Several factors mayaffect the results observed: type of analysis used,structure of the population, relationships amonganimals, control of the type I error. Thesestudies(53,54,55) did not take into account factorssuch as the population structure, linkagedisequilibrium, or relationships among animals.Lack of consideration of the additive relationshipshas been considered as a possible cause of spuriouseffects in association studies(56). Some diseases aremore likely to be explained with the action of genesof the MHC, but some complex diseases are not.Possibly those complex diseases, such as mastitis,can be explained by the complementary action ofother genes affecting the immune response. Thereis evidence in support of this. There are severalQTL affecting CM, SCS, and udder conformationthat have been reported by using, mainly,anonymous markers. Three reports of QTL affectingCM were found in the literature(57,58,59). Thereare reports of QTL on BTA 6 (position 37 cM),BTA 8 (position 54 cM), and BTA 14 (position 93

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alentadores debido a que la mayoría de los estudiosdeclaran resultados contradictorios. Una explicaciónes que los genes del MHC que han sidoestudiados(53,54,55) pueden explicar únicamente demodo parcial la variación de resistencia a mastitis.Varios factores pueden afectar los resultadosobservados: el método de análisis utilizado, laestructura de la población, las relaciones deparentesco entre los animales, el control del errortipo I. Estos estudios(53,54,55) no tomaron en cuentafactores como la estructura de la población,desequilibrio de ligamiento o relaciones deparentesco entre animales. No considerar lasrelaciones de parentesco ha sido considerada comoposible causa de falsos positivos en estudios deasociación(56).

Algunas enfermedades pueden explicarse por laacción de genes del MHC, pero no necesariamentees el caso de algunas enfermedades complejas.Estas últimas podrían explicarse por la accióncomplementaria de otros genes con efecto sobre larespuesta inmune. Mastitis sería un ejemplo de estetipo de enfermedades complejas y existe evidenciaque apoya esta hipótesis. Varios QTL con efectosobre MC, CLCS, y conformación de ubre quehan sido reportados principalmente con el uso demarcadores anónimos. Tres estudios de QTLafectando mastitis clínica se hallaron en la literaturapertinente(57,58,59). Hay hallazgos de QTL en elBTA 6 (a 37 cM), BTA 8 (a 54 cM) y en BTA14 (a 93 cM)(57). También se ha reportado lapresencia de dos QTL en BTA 11 (a 25.7 y 41cM)(58); un QTL sobre el BTA 14 se encontró a40 cM(59). CLCS es la característica que másampliamente ha sido estudiada con respecto lapresencia de QTL para resistencia a mastitis. Estose explica porque CCS y CLCS son más fáciles deregistrar que otras variables de resistencia a mastitis.Análisis de segregación con datos de CLCS sugiereque un gen mayor con efecto sobre CLCS estápresente en la población Holstein de Ontario(Canadá)(60).

La literatura disponible muestra que los siguientesBTA podrían alojar QTL para CLCS: 1, 2, 4, 5,7, 8, 10, 11, 13, 14, 18 al 23, 26, y 27. La mayordensidad de hallazgos se encuentra en BTA7, donde

cM)(57). QTL on BTA11 (position 25.7 and 41cM, respectively)(58); another QTL on BTA 14was found at position 40 cM(59). SCS is the traitthat more widely has been studied with regardsQTL for mastitis resistance. This is understandableas SCC and SCS are easíer to record than anyother mastitis resistance trait. Segregation analysisof SCS data of Ontario Holsteins suggests that amajor gene affects SCS in the population understudy(60). Overall, the evidence shows that thefollowing chromosomes may harbor QTL affectingSCS: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 18 to 23, 26,and 27. The higher density of reports lies on BTA7,where QTL have been mapped at 61.6 cM(44), 75-97 cM(61), and 124.4 cM(62). On BTA 5 there arereports of a QTL at 6.7 cM(61) and another one at100 cM(60). BTA 8 harbors two QTL, one at 16.7cM(62) and at 54 cM(55). On BTA 11 within asection of 40 cM, three QTL have been reported;one at 25.7 cM and other at 41 cM(58), the thirdQTL was mapped at 63 cM(59). On BTA 22 threefindings are documented: at 43.7 and 44.5 cM(62)

and at 80 cM(46). In this case, due to the shortdistance between the two QTL located around 40cM, the figure of a single QTL can not be ruled out.At BTA 23 four QTL have been found: at 17.3cM(64), at 52 cM, 61 cM(58), and at 80 cM(44). BTA26 is reported with two QTL at 0 cM(44) and otherone within a segment located between 50.6 cM and59.8 cM(63). Other chromosomal locations withQTL affecting CM and SCS, or udder conformationhave been reported(19,44,45,49,58,62). A summaryof the results from the above mentioned studies isgiven in Table 2.

Some attempts have been done to condense theinformation regarding QTL detection in dairycattle(65); in some cases databases are availableonline such as that one created by Khatkar et al(36).

Marker assisted selection

A detailed description regarding the status of theuse of MAS in livestock is available(66). A revisionof how MAS is being used in dairy cattle is out ofthe scope of this review; here is presented only abrief description of some applications of MASavailable in the literature. Some Artificial

343


QTL se han detectado a 61.6 cM(44), 75-97 cM(61),y 124.4 cM(62). En el BTA 5 se han encontrado dosQTL, uno a 6.7 cM(61) y otro a 100 cM(60). BTA8 aloja dos QTL, uno a 16.7 cM(62) y otro a 54cM(55). En BTA 11 en una región de 40 cM se handetectado tres QTL: a 25.7 cM, a 41 cM(58), y a 63cM(59). En BTA 22 tres hallazgos se handocumentado: a 43.7 cM, 44.5 cM(62) y a 80 cM(46).En este caso, debido a la estrecha distancia entre losdos QTL localizados alrededor de 40 cM, la idea deun solo QTL no puede descartarse. En BTA 23 sehan encontrado cuatro QTL: a 17.3(63), a 52 cM, 61cM(58), y a 80 cM(44). Se ha detectado que BTA26 contiene dos QTL, uno a 0 cM (44) y otrodentro de un segmento localizado entre 50.6 y59.8 cM(64). En otras posiciones cromosómicas sehan detectado QTL con efecto sobre mastitis clínica,CLCS, o conformación de ubre(19,44,45,49,58,62).Un resumen de los resultados de los estudiosmencionados se proporciona en el Cuadro 2.

Otros autores han realizado algunos intentos porcondensar la información generada a partir deestudios de mapeo de QTL en ganado lechero(65)

y en algunos casos las bases de datos se encuentrandisponibles en línea, como la creada por Khatkaret al(36).

Selección asistida por marcadores

Una descripción detallada sobre el estado que guardaMAS en ganado doméstico se encuentradisponible(66). Una revisión extensa sobre cómo seemplea MAS en ganado lechero está fuera de losobjetivos de esta revisión; aquí sólo se mencionanbrevemente algunos ejemplos de aplicación de MASque se encuentran publicados en la literatura alrespecto. Algunas compañías de inseminaciónartificial utilizan MAS como parte de sus esquemasde selección. Sin embargo, poca información seencuentra disponible con relación a la intensidadde su uso, o sobre los procedimientos utilizadospara incorporar la información de los QTL. Parala mayoría de las características productivas esprobable que MAS sea utilizada en selecciónintrafamiliar. Un ejemplo de tal aplicación sería eluso de MAS para rasgos productivos en ganadolechero en Francia, donde el INRA (Institut National

Cuadro 2. Loci de rasgos cuantitativos con efecto sobremastitis clínica, conteo celular somático, y conformación dela ubre en ganado lechero reportados en varios estudiosTable 2. Quantitative trait loci (QTL) with effect on clinicmastitis (CM), somatic cell count (SCC), and udderconformation in dairy cattle reported on several studies

BTA Marker (or gene), Refe- position (cM) Traits rence

1 MAF46, position is notreported in the article SCC 63

2 Name of marker is notreported in the article, 100 cM SCC 49

4 RM188-TGL116, 24.7-48.9 cM SCC 645 BM6026, 6.7 cM SCC 58

BM315, 100.1 cM SCC 626 Name of marker is not reported

in the article, 37 cM CM 577 BM6117, position is not

reported in the article SCC 32BM6117-BMS2258, position isnot reported in the article SCC 32BMS2258-OarAE129,75-96.6 cM SCC 61BMS1979, 124.4 cM SCC 62

8 BM3419, position is not reportedin the article SCC 63TGLA13-INRA122, 54 cM SCC-CM 57

10 TGLA378-TGLA102, 49 cM SCC 6111 BM304, 24.4 cM Rear udder height 22

INRA177, 25.7 cM CM 58BM7169, 41 cM CM 58N/R, 11, 63 cM SCC 59

13 AGLA232, 79.5 cM SCC 6414 BMS1747-BMS740, 4.2-44.2 cM CM 54

BM302, 36.9 cM Udder 45ILSTS11-BM302, 10.6-36.9 cM conformation 64Name of marker is not reportedin the article, 93 cM SCC and CM 57

18 TGLA227, 117 cM SCC 6119 Name of marker is not

reported in the article, 32 cM SCC 4921 Name of marker is not reported

in the article, 33 and 84 cM SCC 1922 BMS875-BM4102, 80 cM SCC 44

BM3628, 44.5 cM SCC 62CSSM026, 43.7 cM SCC 62

23 BM1443, 67.1 cM SCC 58BB705-BM1818, 80 cM SCC 44RM033, 17.3 cM SCC 63D2355, 52 cM SCC 62

26 BM1314, centromere SCC 44TGLA429-BM804, 50.6-59.6 cM SCC 64

27 BM3507-TGLA179,centromere a 5.1 cM SCC 61

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de la Recherche Agronomique), LABOGENA(Laboratoire D’analyses Génétiques pour lesEspèces Animales) y la UNCEIA (Union Nationaledes Coopératives D’élevage et D’inséminationAnimales) han implementado MAS para ochocompañías de mejoramiento genético, mediante lautilización de un DN que incluyó informaciónproveniente de 1,554 sementales(46). En Alemania,desde 1995 la población de sementales lecherosjóvenes ha sido genotipificada para una serie de339 marcadores. Actualmente, la poblacióntipificada comprende 1,602 individuos; se realizanevaluaciones genéticas para producción de leche,grasa y proteína, y CLCS(51,67). En Nueva Zelanday Holanda el gen DGAT1 (acylCoA:diacylglycerolacyltransferasa), localizado en el BTA 14, conefecto sobre producción de leche y su composición,está siendo incluido en esquemas de selección. Laidentificación de éste gen sirve para ejemplificarcómo combinar herramientas de genética moleculary genética cuantitativa para disecar la variacióngenética de un QTL. Primero, usando un barridodel genoma, un QTL localizado en el centrómerode BTA14 fue localizado en Holsteins de Holanday Nueva Zelanda(68). Posteriormente, se refinó laposición del QTL hacia un segmento cromosomalde 9.5 cM(69). Más tarde, el QTL fue clonado(70)

y una mutación se identificó en el gene DGAT1con efecto sobre el contenido de grasa. Recien-temente, la mutación causante fue caracterizadacomo una substitución no conservativa lisina aalanina (DGAT1 K23A)(48). El gen DGAT1produce una enzima que cataliza el último paso enla síntesis de triglicéridos; la mutación K23A pareceincrementar la cantidad del producto del gen, porlo tanto incrementando la cantidad de grasa en laleche.

Análisis de la base molecular de los QTL

Las etapas del descubrimiento del gen DGAT1enfatiza la importancia de analizar las regiones endonde QTL ya han sido localizados. Qué regionesson susceptibles de analizar? A partir de los Cuadros1 y 2 puede apreciarse que algunos cromosomasmuestran alta densidad de QTL, por ejemplo BTA7,BTA11, BTA14, y BTA23, en el caso decaracterísticas relativas a resistencia a mastitis. Sería

Insemination Companies are using MAS within theirselection procedures. However, little informationis available regarding how intensive the use ofMAS is, or which procedures are used toincorporate QTL information. For most of theproductive traits MAS is likely being used inselection within families. An example of suchapplication is the use of MAS for yield traits indairy cattle in France, where INRA (Institut nationalde la recherche agronomique), LABOGENA(Laboratoire d’analyses génétiques pour les espècesanimales), and UNCEIA (Union nationale descoopératives d’élevage et d’insémination animales)have implemented MAS for eight breedingcompanies, by using a GDD that included 1554sires(46). In Germany, since 1995, the populationof young dairy bulls has been genotyped for 339markers; nowadays, 1602 individuals comprise thegenotyped population; genetic evaluations areperformed for milk yield, fat yield, protein yield,and SCS(51,67). In New Zealand and Netherlands,acylCoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT1),a gene (mapped on BTA 14) with effect on milkyield and milk composition is being included inselection schemes. The identification of this geneis also an example of how to combine molecularand quantitative genetic tools to dissect the geneticvariation underlying a QTL. Using a whole genomescan, a QTL located in the centromeric end ofBTA 14 was first reported(68) in Holsteins fromNetherlands and New Zealand. Subsequently theposition of the QTL was refined(69) to achromosomal segment of 9.5 cM. Later, the QTLwas cloned(70) and a missense mutation wasidentified in the DGAT1 gene with effect on milkfat content. Recently the causative mutation wascharacterized as a nonconservative substitution(lysine by alanine) (DGAT1 K23A)(48). DGAT1gene produces an enzyme that catalyses the laststep in triglyceride synthesis; the mutation K23Aseems to increase the amount of the gene product,hence increasíng the amount of fat content in milk.

Analyzing molecular basis of QTL effects

The discovery of DGAT1 points out the necessityfor further analyzes of regions where QTL havebeen mapped. Which regions would be worth

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factible analizar esas regiones mediante mapeo fino,y adicionalmente efectuar estudios moleculares paradisecar la base genética de los QTL. Hay evidenciasde que modificaciones a la secuencia de ADN, talcomo las metilaciones de bases, pueden regular laexpresión génica(71). Más recientemente se hapropuesto que la complejidad de los eucariotespuede ser resultado de funciones represoras delRNAi, que también regula la síntesis deproteínas(15). Análisis comparativos de ADN puedendetectar posibles factores moleculares con efectosobre la expresión de genes conocidos, o inclusodescubrir genes con implicaciones económicas paraproducción animal. Sin duda, complementar análisisde asociación con estudios moleculares es unaestrategia casi obligada para obtener conocimientosobre los posibles mecanismos de acción de genesinvolucrados. Un análisis exhaustivo de posiblesQTL es esencial en la elaboración de esquemas deMAS. Por ejemplo, respecto a genes del MHCcomo genes candidatos para resistencia a mastitis,se ha recomendado la realización de más estudiospara determinar los efectos de todos lospolimorfismos del MHC antes de establecercualquier estrategia de selección sobre alelosindividuales(72).

PERSPECTIVAS Y CONCLUSIÓN

Hasta ahora varios marcadores se han postuladocomo ligados a QTL con efecto sobre producciónde leche y resistencia a mastitis. Sin embargo, casitodos los estudios recomiendan una interpretacióncauta de los resultados. Un mapa genético bovinorecientemente ensamblado(73), estimulará el mapeode QTL en ganado lechero, de carne, y de doblepropósito. En México sólo han habido esfuerzoslimitados para establecer programas para tipificary colectar información de ADN bovino para serusada en la detección de QTL. Generalmentepoblaciones animales poseen diferente composicióngenética; de modo que es probable que algunosmarcadores genéticos asociados con QTL enalguna(s) población(es) puedan no estar asociadoscon un gen segregando (QTL) en la poblaciónbovina lechera mexicana. Otra posibilidad es quela fase de ligamiento entre el marcador y el QTL

analyzing? From tables 1 and 2 it can be seen thatsome chromosomes show a higher density of QTLreports, for instance BTA7, BTA11, BTA14, andBTA23, in the case of traits related to mastitisresistance. It would be feasíble to fine map thoseregions, and additionally perform molecular studiesto dissect the molecular basís for the QTL effects.Evidence shows that DNA sequence modificationssuch as methylation of bases (mainly cytosines)may lead to regulation of gene expression(71). Morerecently, it has been proposed that the complexityof eukaryotes may be a result of RNA interferencewhich also regulates protein synthesis; small RNAof intronic origin may have repressor function(15).Comparative DNA sequence analysis can be usedto detect possible molecular factors affectingexpression of known genes, or even the discoveryof genes affecting traits of economic importance indairy cattle in the regions where QTL have beenreported. Without doubt, complementing associationanalyses to detect QTL with molecular studies toget insight into the possible mechanism of actionof the genes involved is an almost a mandatorystrategy. A comprehensive analysis of putative QTLis essential in order to elaborate MAS schemes.For instance, with regards to MHC genes, groupsof genes that are strong candidate genes for mastitisresistance, more studies have been recommendedto determine the effects of all the MHCpolymorphisms before the establishment of anyselection strategy on single alleles(72).

PERSPECTIVES AND CONCLUSION

So far markers have been postulated as linked toQTL affecting milk yield and mastitis resistance.However, almost all studies recommend a cautionaryinterpretation of the results. A recently assembledbovine genetic map(73) will encourage QTL mappingstudies in dairy, beef and dual purpose cattle. InMexico, limited efforts have been made to establishprograms to genotype and collect bovine DNAinformation to be used in the detection of QTL.Different populations are likely to possess differentgenetic pools; hence it is likely that some geneticmarkers associated with QTL in some populationsmay not be associated with a segregating gene

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en la población mexicana sea diferente a la fase deligamiento en otra población, lo que dejaría abiertala posibilidad de que el marcador asociado al alelomostrando un cierto efecto en una población puedaestar asociado a un QTL diferente, que posea unefecto distinto sobre la misma característica en lapoblación bovina lechera mexicana. Así, es en elinterés de la industria de mejoramiento ganaderolechero en México tipificar sementales con el objetode crear un banco de datos de ADN bovino parafutura referencia y uso. Por lo tanto, el dilemasería: Cuáles polimorfismos deben tipificarse? Hayvarias opciones disponibles para hacer la selecciónde los polimorfismos. Una opción para establecerun banco de referencia de ADN para uso de laindustria ganadera lechera mexicana es aprovecharlos 1,913 marcadores genéticos dispersos en elgenoma bovino públicamente disponibles(73), ydebido a que el DL se extiende hasta 20 cM(27),podría ser apropiado tipificar sementales con unadensidad de marcadores de 10 cM; eso implicaríatipificar aproximadamente 300 marcadores genéticospara cubrir todo el genoma. Otra opción (que puedeser complementaria a la anterior) es tipificarsementales para marcadores de genes con efectofisiológico conocido, y probar sus asociaciones conrasgos de interés.

Además de la estrategia para establecer el bancode ADN bovino, es esencial que los estudios deasociación a realizar en la población bovinamexicana consideren aspectos como la estructuragenética de la población, las posibles relacionesentre los marcadores y los QTL (DL, ligamientofísico), y el ajuste estadístico requerido para reducirlos errores tipo I con el objeto de formularconclusiones. El relativo fácil acceso apolimorfismos genéticos podría crear un cuerpo dehallazgos que podría estar lleno de resultadoscontradictorios, si no se toman medidas precautoriascon respecto a los ajustes estadísticos paracomparaciones múltiples, o la naturaleza genéticade las asociaciones que se detecten(74). Unaestimación precisa de efectos de QTL es un requisitopara establecer MAS. Las respuestas a selecciónserán máximas sólo si el marcador usado está cercadel QTL. Así, MAS debería realizarse solo sobre

(QTL) in the Mexican dairy cattle population.Another possibility is that the marker-QTL linkagephase in the Mexican population may be differentfrom the linkage phase in other populations leavingopen the possibility that a marker associated to anallele showing a certain effect in one populationmight have a different effect on a quantitative traitin the Mexican dairy cattle population. Thus it isin the interest of the dairy cattle breeding industryin Mexico to genotype bulls in order to create abovine DNA data bank for future reference andusage. Hence, the dilemma is: Whichpolymorphisms should be genotyped? Severaloptions may be available to select polymorphisms.One option to establish a reference DNA data bankfor usage in the Mexican dairy industry is to takeadvantage of the 1913 publicly available markersscattered along the bovine genome(73), and giventhat LD extends up to 20 cM(27), it would beappropriate to genotype bulls with a marker densityof 10 cM; that would imply genotypingapproximately 300 genetic markers to cover thewhole bovine genome. Another option (which canbe complementary to the mentioned before) is togenotype bulls for markers of genes with knownphysiological function, and test for associationsbetween those markers and traits of interest.

Regardless of the choice to establish the DNA databank, more importantly, association studies to beperformed in the Mexican dairy cattle populationshould take into account aspects such as the breedingstructure, the possible relationship between themarkers and the QTL (LD, and physical linkage),and the adjustment to reduce Type I error (multiplecomparison problem) in order to formulateconclusions. The relatively easy access to geneticpolymorphisms would create a body of findingsthat might be full of contradictory results ifprecautions are not taken regarding statisticaladjustments for multiple comparisons, or the geneticnature of the detected associations(74). An accurateestimation of QTL effects is a requirement toestablish MAS programs. Selection responses arelikely to be maximized only if the marker used isclose to the QTL. Thus MAS can be performedonly on the genotypes of candidate animals with

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genotipos de candidatos cuando se cuenta con laposición más probable del QTL(75). Una vez queesquemas de MAS hayan sido establecidos, se debedar seguimiento con el objeto de detectar posiblesefectos negativos sobre otros rasgos. Al mismotiempo, estudios de genética molecular deberánproveer evidencia de la base genética de los QTL.La disponibilidad de la secuencia del ADN bovinoen bases de datos públicos, abre oportunidades pararealizar análisis comparativos de secuencias genéticasque podrían reforzar o corregir las conclusionesobtenidas en estudios de mapeo de QTL. Tambiénes recomendable desarrollar estrategias quecombinen el mapeo genético y análisis de perfilesde expresión génica para identificar los mecanismosde acción de las redes de genes que controlancaracterísticas complejas(76,77). Los beneficios delmapeo de QTL pueden ser importantes, pero debeapreciarse que el uso de esos QTL dentro deesquemas de MAS no es trivial; debe enfatizarse,específicamente para países en desarrollo que “Espoco probable que tecnologías genéticas tenganimpacto si se aplican de manera aislada. Programasque trabajen para entender y mejorar en su totalidadel sistema socio-económico de la producción animaly el mercadeo son más probables en tener éxitoque aquéllos que tratan componentes individualesdel sistema”(78). Al respecto, se deben establecerdiscusiones dentro (y entre) los participantes en laindustria lechera mexicana.

Esta revisión proporciona información útil conrelación al uso de polimorfismos genéticos paradetectar QTL con efecto sobre rasgos de importanciaeconómica en el ganado lechero, así comocaracterísticas esenciales de los estudios deasociación que tienen que ser tomados en cuentapara detectar apropiadamente los efectos de QTL.

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This review gives useful information regarding theuse of genetic polymorphisms to detect QTLaffecting economically important traits in dairy cattleas well as essential features of association analysesthat have to be taken into account to appropriatelytest for effects of QTL.

End of english version

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