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ETAP DE ARAKA Vitoria-Gasteiz

REF: CONVOCATORIA DE SUBVENCIONES A LOS PROGRAMAS Y PROYECTOS DE INNOVACION, INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO RELACIONADOS CON EL AGUA Y LOS SISTEMAS ACUÁTICOS 1



1. TITULO DEL PROYECTO SUBVENCIONADO

“Desarrollo e Intercalibración de un nuevo sistema de alerta,

basado en recuentos de microalgas, detección de colonias

productoras de toxinas, test de microcistina y Bioensayo en

cultivos celulares”

Embalse de Ullibarri Octubre 2007 (Bloom algal)



2. DEFINICION DE LA ACTUACIÓN

a. ANTECEDENTES.

La captación mayoritaria de AMVISA es el embalse de Ullibarri-Gamboa. Para

establecer las condiciones del proceso de potabilización y obtener un agua que

cumpla con creces la reglamentación actual realizamos una serie de controles en el

agua captada desde este origen.

Entre estos controles, realizamos vigilancia de la evolución tanto de microalgas

totales como de los distintos grupos de mic roalgas, con especial hincapié en la

vigilancia de la evolución de las cianobacterias. Por legislación realizamos también el

control de los niveles de microcistina, con los métodos actualmente disponibles.

En los resultados de esta vigilancia hemos detectado la presencia de cianobacterias

potencialmente productoras de toxina, cuyos recuentos aumentan en determinadas

épocas del año, siendo altos en algunos de los años desde que estamos realizando

esta investigación (Bibliografía-1).

b. PROBLEMÁTICA.

Las cianobacterias contienen en su interior toxinas que afectan a animales y al

hombre. Aproximadamente 40 especies de cianobacterias producen potentes toxinas

(Bibliografía-2).

Las primeras intoxicaciones de poblaciones humanas por el consumo de agua

contaminada por cepas tóxicas de cianobacterias fueron descritas en Australia,

Inglaterra, China y África del Sur. En Brasil se conocen varios casos pero el más

grave fue el episodio de Caruaru en 1996 donde murieron más de 50 enfermos

sometidos a hemodiálisis en los que se utilizó agua contaminada con cianotoxinas.

(Bibliografía-3,4,5).

Hay estudios que apuntan a que una ingesta continua de bajas cantidades de

toxinas de cianobacterias es un promotor de cáncer hepático (Bibliografía-6,7).

La toxina más conocida es la microcistina, pero dentro de esta se conocen hasta 60

variedades, todas con distinta toxicidad (Bibliografía-8). Además hay otras toxinas

menos conocidas, que en algunos casos, al encontrarse presentes en el agua, han



resultado de acción sinérgica, de forma que poca concentración de varios tóxicos han

resultado de una toxicidad total alta.

Teniendo en cuenta las perspectivas de cambio global, con la probabilidad de

aumento de la temperatura del agua, existe la preocupación de que las masas de

agua tiendan en mayor medida a la eutrofización, con un aumento en los bloom de

algas y, por tanto, en el número de episodios tóxicos que se registren.

c. ESTUDIOS ANTERIORES Y PLANTEAMIENTO DEL PRESENTE PROYECTO.

Durante los últimos años, hemos desarrollado varios proyectos coordinados con el

grupo ALBIOTOX (Biotecnología de microalgas: Producción y toxicidad), de la

Universidad Complutense de Madrid, mediante los cuales hemos establecido un

sistema de niveles de alerta basado en:

recuentos de microalgas,

recuentos de cianobacterias,

test de microcistinas

bioensayos en ratón

Dichos niveles están establecidos para llevar a cabo modificaciones, en el

tratamiento en la Estación de Tratamiento de Agua Potable de Araka, ante la

posible presencia de tóxicos procedentes de las cianobacterias en el agua del

embalse de Ullibarri y del rio Zadorra (Bibliografía-1).

Sin embargo observamos que estos niveles de alerta establecidos son mejorables:

A) En cuanto a los recuentos de cianobacterias, puesto que no todas las

colonias observadas son productoras de toxina, el diferenciar si las colonias

que observamos son o no productoras de toxinas nos permitiría incluir un

escalón mas fino en nuestros niveles de alerta.

B) En cuanto a la técnica de bioensayo en ratón, buscamos encontra r un

bioensayo que elimine la utilización de animales vivos. El realizar un

bioensayo es fundamental pues permite cubrir la poca correspondencia que

puede existir entre recuentos de cianobacterias y niveles de toxicidad real

en el agua. Igualmente nos permitirá medir el efecto sinérgico que puede



existir al encontrarse una suma de varios contaminantes, algo que no se

puede determinar por ninguna otra técnica.

3. DESARROLLO DEL PROYECTO POR OBJETIVOS

3. 1.- Puesta a punto e intercalibración de la técnica de detección de daño

celular, en cultivo de hepatocitos humanos, ante presencia de tóxicos en

el agua de origen.

Desde 2008 hemos trabajado en el mantenimiento y replica de cultivos celulares.

En 2009 seleccionamos y comenzamos a trabajar con una línea de hepatocitos

humanos. Realizamos las primeras pruebas para su uso como bioensayo,

introduciendo muestras con toxicidad conocida y evaluando al microscopio el

posible daño celular.

Tras los resultados de estas pruebas nos decantamos por buscar un “test de

proliferación”, que permitiera medir de forma objetiva este daño celular.

Nuestro objetivo inicial era, con el uso de este test, calibrar un bioensayo con una

relación dosis-efecto, comenzando desde dosis bajas de tóxicos.

Entre final de 2009 y principios de 2010 vimos los distintos test de proliferación

del mercado y seleccionamos uno de ellos que se adaptaba bien a nuestra

dinámica de trabajo, el kit de proliferación MTT de Innoprot. Preparamos el

protocolo de ensayo, adquirimos el material necesario, optimizamos el cultivo

celular en microplaca y realizamos los primeros ensayos. Una vez puesto a punto

quedamos a la espera de poder organizar un ejercicio de ínter calibración entre

varios laboratorios especializados.

En Junio de 2010, previo a la intercalibración, se vuelven a hacer ensayos con

distintas muestras, para observar la reproducibilidad. Se detectan una serie de

puntos débiles y se rectifican, redactando de nuevo el protocolo de ensayo.

En Julio de 2010 se realizan ensayos con las muestras que nos envían desde la

UCM. El resultado de las 5 muestras testadas es que todas presentan una

toxicidad baja y muy parecida.



TABLA 1

MUESTRA RESULTADO

(Absorbancia)

Medio sin células 84 (0,084)

Medio con células (crecimiento

máximo)

399 (0,399)

Muestra A 354 (0,354)

Muestra B 359 (0,359)

Muestra C 339 (0,339)

Muestra D 350 (0,350)

Muestra E 354 (0,354)

Gráfico 1

INTERCALIBRACIÓN JUNIO 2010

0

50

100

150

200

250

300

350

Controlpositivo

Muestra A Muestra B Muestra C Muestra D Muestra E



La asesoría contratada con la Universidad Complutense, que es la que ha

organizado el ejercicio de intercalibración, realiza un estudio de los resultados y

una serie de estudios posteriores en sus instalaciones para calibrar el test en

dosis-efecto. En sus conclusiones presentan el kit como:

• A dosis medias y altas (por encima de 0,4 ppb de microcistina LR

equivalente): Ensayo muy fiable, con elevada repetitibilidad y

reproducibilidad.

• A dosis bajas (0,1 ppb) no se logra una adecuada reproducibilidad, en

ocasiones los resultados salen bien y otras no se detecta nada.

Tras una investigación detallada detectan que tras los diversos pases que

hacemos para mantener el cultivo (con frecuencia semanal), han aparecido

hepatocitos con resistencia a la microcistina, de forma que al cabo de un tiempo,

una vez alcanzado el equilibrio entre resistentes y no resistentes, el test no

detecta dosis bajas de microcistina.

Durante los meses de Septiembre, Octubre y Noviembre de 2010 se realizan

varios ensayos, introduciendo patrones comerciales de microcistina, muestras de

interlaboratorios, una muestra de embalse con episodio de toxicidad y muestras

naturales de nuestro embalse (Ullibarri).

Dentro de las muestras introducidas de nuestro embalse, se procesan muestras

correspondientes a dos semanas con recuentos de cianobacterias en el nivel de

alerta 1 y muestras con niveles de microcistina superiores a 0,5 ppb con el kit

comercial que utilizamos habitualmente. Se adjuntan tablas y gráficos con

resultados de los distintos ensayos.



TABLA 2

8-sept-2010

MUESTRA RESULTADO

(Absorbancia)

Observaciones



máximo)

459 (0,459)

Ull 17/8 concentrado de 5l 396 (0,396) Recuento cianobacterias entre 5.000 y 10.000 col/l

Ull 20/8 concentrado de 5l 401 (0,401) Recuento cianobacterias entre 5.000 y 10.000 col/l

Ullib 20/8 filtrado

456 (0,456)

Ull 3/9 concentrado de 5l 419 (0,419) Recuento cianobacterias inferior a 5.000 col/l

Ull 3/9 filtrado

469 (0,469)

GRÁFICO 2

ENSAYO 8 SEPT 2010

-500

50100150200250300350400450

Con

trol

posi

tivo

Ull

17/8

conc

entr

ada

intr

acel

ular

Ull

20/8

conc

entr

ada

intr

acel

ular

Ulli

b 20

/8

Ull

3/9

conc

entr

ada

intr

acel

ular

Ull

3/9



TABLA 3

5-oct-2010

MUESTRA RESULTADO

(Absorbancia)

Observaciones

Medio sin celulas 143 (0,143)

Medio con celulas (crecimiento

máximo)

457 (0,457)


Ull 29/9 filtrado 408 (0,408) Microcistina <0,25 ppb

Patrón zeu 0,25 ppb 421 (0,421) Patrón zeu 0,5 ppb 521 (0,521) Patrón zeu 1 ppb 459 (0,459) Patrón zeu 2,5 ppb 472 (0,472)

GRAFICO 3

ENSAYO 5 OCT 2010

-203080

130180230280330380

Con

trol

posi

tivo

Ull

29/9

conc

entr

ada

intr

acel

ular

Ull

29/9

Pat

rón

zeu

0,25

ppb

Pat

rón

zeu

0,5

ppb

Pat

rón

zeu

1pp

b

Pat

rón

zeu

2,5

ppb



TABLA 4

26-oct-2010

MUESTRA RESULTADO

(Absorbancia)

Observaciones



máximo)

446 (0,446)


Ull 13/10 filtrado 392 (0,392) Microcistina <0,25 ppb

Ull 13/10 disuelto 381 (0,381) Microcistina 0,9 ppb (kit comercial)

Ull 8/10 disuelto 386 (0,386) Microcistina 0,9 ppb (kit comercial)

Patrón zeu 0,25 ppb 337 (0,337) Patrón zeu 0,5 ppb 355 (0,355) Patrón zeu 1 ppb 309 (0,309) Patrón zeu 2,5 ppb 382 (0,382)

GRAFICO 4

ENSAYO 26 OCT 2010

050

100150200250300350400

Con

trol p

ositi

vo

Ull

13/1

0 co

ncen

tra..

Ull

13/1

0 fil

trado

Ull

13/1

0

Ull

8/10

Pat

rón

zeu

0,25

ppb

Pat

rón

zeu

0,5

ppb

Patró

n ze

u 1

ppb

Pat

rón

zeu

2,5

ppb



TABLA 5

9-nov-2010

MUESTRA RESULTADO

(Absorbancia)

Observaciones



máximo)

235 (0,235)

Ull 13/10 disuelto conservado en nevera

303 (0,303) Microcistina 0,9 ppb (kit comercial)

Ull 13/10 disuelto conservado en congelador

236 (0,236) Microcistina 0,9 ppb (kit comercial)

Ull 15/10 disuelto 272 (0,272) Microcistina 0,7ppb (kit comercial)

Ull 22/10 disuelto 300 (0,300) Microcistina 0,6pb (kit comercial)

Muestra embalse con episodio tóxico

185 (0,185)

Ínter laboratorio IELAB 262 (0,262) Microcistina 0,9 ppb (valor ínter laboratorio )

GRAFICO 5

ENSAYO 9 NOV 2010

-20

30

80

130

180

Con

trol p

ositi

vo

Ull

13/1

0 ne

vera

Ull

13/1

0 co

ngel

ador

Ull

15/1

0

Ull

22/1

0

Mue

stra

em

bals

e co

n ep

isod

io tó

xico

Ínte

r lab

orat

orio

iela

b



Tras el estudio de los resultados y el envío de las muestras que han dado

resultados de microcistina mayor de 0,5 ppb en el kit comercial que utilizamos

(MicroCystest de ZEU), concluimos lo siguiente:

• Las muestras de interlaboratorios y los patrones del kit MicroCystest no

muestran toxicidad. Esto es porque se trata de microcistina conjugada,

para evitar problemas de toxicidad. Es decir, aunque funcionan con los kit

de ensayo diseñado para detectar microcistinas, no dañan a las células de

hepatocitos, pues su toxicidad ha sido anulada.

• Las muestras que procesamos tras filtrar varios litros y extraer la toxina

intracelular presentan una ligera toxicidad, en algunos casos. Esto indica

presencia de toxinas intracelulares. Sin embargo en el agua procesada sin

concentrar no hay toxicidad.

• Las muestras que presentaban microcistina >0,5 ppb en nuestro kit

comercial fueron enviadas a la UCM para su determinación por otras

técnicas. El resultado fue que la máxima toxicidad fue de 0,31 ppb. Esto

es coherente con nuestra experiencia con el kit MicroCystest, que

sobreestima la concentración real de microcistina, y es coherente con los

resultados del bioensayo, en que se detecta que las muestras no

presentan toxicidad.

Grafico 6

Control positivo

2

4

6

8 interlab05-oct-10

09-nov-10

-20

80

180

280

380

480

interlab

08-sep-10

05-oct-10

26-oct-10

09-nov-10



3. 2.- Puesta a punto e intercalibración de una técnica para la detección

de colonias productoras de toxina.

Existen varios estudios sobre la diferenciación de microalgas a partir de su unión

con distintas lectinas (Bibliografía-9). Nos proponemos comprobar si, para las

colonias que están presentes en nuestras captaciones, la distinta afinidad de

unión con lectinas nos permite establecer de forma rápida una diferenciación

entre colonias capaces de producir toxinas y colonias que no van a producirla.

Para comenzar adquirimos, en Octubre 2009 una lectina testada en la

Universidad Complutense que ha demostrado unirse solo a colonias de

Microcystis aeruginosa que no producen toxina, mientras deja sin marcar colonias

productoras de toxina

En Junio 2010 se elabora el protocolo de análisis (adquiriéndose para ello una

centrifuga adecuada), realizándose algunas pruebas. Debido a la ausencia de

cianobacterias en esta época no se pueden comprobar los resultados.

En Agosto 2010, aprovechando los recuentos de cianobacterias superiores al nivel

de alerta 1, se realizan ensayos, con los siguientes resultados:

TABLA 6

17-AGOSTO-2010

MUESTRA RESULTADO OBSERVACIONES

A:concentrado+lectina

Chroococcus y Gomphospherea

teñidos. Microcystis flosaque y

Oscillatoria sin teñir, igual que

muestra C.

B: concentrado +

naranja acridina

Se ve mucha fluorescencia de

fondo. Hay que lavar más esta

muestra.

Control positivo

de tinción.

C: concentrado Se ve

fluorescencia

natural, para

contrastar.



Gomphosphaeria teñida con naranja de acridina

TABLA 7

20-AGOSTO-2010


A: concentrado+lectina

Chroococcus y Gomphospherea

teñidos. Microcystis flosaque y

Oscillatoria sin teñir, igual que

muestra C.

B: concentrado +

naranja acridina

Se sigue viendo fluorescencia

de fondo, aunque se ven

microalgas bien teñidos.

Control positivo

de tinción. Se

añade menos

reactivo y se

hacen más

lavados.

C: concentrado Se ve

fluorescencia

natural, para

contrastar.



En Septiembre 2010, tras hacer un estudio de los resultados, se llevan a cabo

algunas modificaciones y se elabora un nuevo protocolo de análisis.

A finales de Septiembre nos alertan de la observación de un bloom de microalgas

en una de las orillas del embalse. Ver foto.

En nuestros recuentos ,en el agua que se recibe en la ETAP desde el embalse, no

se detectan cianobacterias por encima de 5000 col/l (alerta 1), pero si se

observan colonias grandes de Microcystis aeruginosa, por lo que se aplica la

técnica, con los siguientes resultados:



TABLA 8

30-SEPT-2010


A: concentrado

Microcystis aeruginosa,

Microcystis flosaque y

Gomphosphaerea

amarillas.

Resto de algas rojizo-

naranjas.

Se ve

fluorescencia

natural, para

contrastar

B: concentrado +

LECTINA

Se ven algunas colonias

de Microcystis

aeruginosa teñidas y

otras colonias sin teñir.

TABLA 9

13-Oct-2010


A: concentrado

Microcystis aeruginosa y

Gomphosphaerea

amarillas.

Resto de algas rojizo-

naranjas.

Se ve

fluorescencia

natural, para

contrastar

B: concentrado +

LECTINA

Se ven algunas colonias

de Microcystis

aeruginosa teñidas y

otras colonias sin teñir.



Colonia de Microcystis aeruginosa

Posteriormente desaparece Microcystis aeruginosa de los recuentos, por lo que

no podemos volver a aplicar la técnica.

3. 3.- Establecimiento de un nuevo sistema de alerta, con actuaciones en

cada nivel, utilizando los datos de recuento de microalgas, detección de

colonias tóxicas, determinación de microcistina y bioensayo en cultivos

celulares

Durante el año se trabaja con los niveles de alerta establecidos en años

anteriores, buscando el momento en que se pueden introducir los nuevos test,

conforme se van desarrollando.

De Enero a Junio de 2010 el recuento de cianobacterias es inferior a 100 col/l.

En Julio el recuento pasa a 1.000 col/l y se detecta 0,6 ppb de microcistina

disuelta. Aunque no se supera el primer límite de alerta establecido (más de

5.000 col/l), se pasa a recuento de microalgas quincenal.

En Agosto de 2010 se establece el nivel de alerta I, por recuentos de

cianobacterias entre 5.000 y 10.000 col/l. Según este nivel de alerta se hacen



recuentos de microalgas y determinación de microcistina quincenal. Con estas

muestras se hace la puesta a punto del test de lectinas y se introduce el test de

hepatocitos tóxicos, que ya esta optimizado.

Cultivo de hepatocitos

• En cuanto al resultado del test de lectinas, al no haber Microcystis

aeruginosa, que es la diana estudiada de la lectina que estamos

utilizando, no se sacan conclusiones.

• En cuanto al test de hepatocitos se observa toxicidad en las muestras en

que se han concentrado las cianobacterias y se ha extraído la microcistina

intracelular, pero no hay toxicidad en las muestras de agua filtradas. Se

puede concluir que en algunas colonias puede haber microcistina

intracelular, pero la cantidad total en el agua esta muy por debajo del

límite de toxicidad.

En Septiembre de 2010 el nivel de cianobacterias disminuye, desactivándose el

nivel de alerta, aunque se mantienen los recuentos de microalgas quincenales.

A finales de este mes nos alertan de la observación de un bloom de microalgas

en una de las orillas del embalse.



Desde finales de Septiembre hasta primeros de Noviembre 2010, aunque por

programación y niveles de alerta no estaba programado, realizamos recuento de

microalgas y detección de microcistinas.

• El recuento de cianobacterias es inferior a 5.000 col/l, pero se

encuentran grandes colonias de Microcystis aeruginosa.

• Se aplica el test de lectinas. En dicho test se encuentra que parte de

las colonias son productoras de toxina.

• En el análisis de microcistinas se encuentran valores de 0,9 ppb en

nuestro test, por lo que pasamos al nivel de alerta V (valores de

cianobacterias bajos pero microcistina >0,5 ppb).

o Según este nivel de alerta se realiza detección de microcistina en

agua pretratada y tratada cada 3-5 días y se ponen en marcha,

como prevención, los tratamientos para eliminación de

microcistinas (ozonización + carbón activo).

o Se envían alícuotas de las muestras de Septiembre y Octubre en

que se detecta microcistina >0,5 ppb al laboratorio de la

Universidad para la detección de microcistinas por otras técnicas.

En los resultados que obtienen, la cantidad máxima de microcistina

es de 0,31. Hay que tener en cuenta que esta medida esta

realizada por HPLC, que solo mide toxinas individuales. La

toxicidad real puede ser debida a la conjunción de efectos de varias

toxinas, por lo que esta determinación no da idea de la toxicidad

de la muestra.

• Se realiza en varias muestras el test de hepatocitos (bioensayo).En

dicho test las muestras no presentan toxicidad. Esto es consecuente

con los resultados de microcistina que encuentran en la Universidad, por

debajo de 0,4 ppb, que según las conclusiones de nuestra investigación,

seria el límite a partir del cual nos daría positivo el test de hepatocitos.

La diferencia entre nuestros resultados de microcistina y los de la Universidad se

debe a que los kit comerciales que existen para microcistina, en general,

sobreestiman la concentración real. Sin embargo esto es adecuado para nuestros

intereses, pues es mejor tener falsos positivos que falsos negativos.

Nos planteamos que lo más adecuado seria, en caso de detectar microcistina por

encima de 0,5 ppb en nuestro kit comercial, realizar el test de hepatocitos



(bioensayo). Los resultados para establecer modificaciones en el tratamiento

serian los obtenidos por el test de hepatocitos, que tendría en cuenta el efecto

sumatorio de toxicidades.

En Noviembre de 2010 ha disminuido la concentración de microcistina, por lo que

se paran los tratamientos de ozono y carbón activo y se vuelve a la vigilancia

mensual de microalgas y microcistinas.

A final de año se realiza un estudio de todos estos resultados, a efectos de definir

un nuevo sistema de alerta, objetivo fundamental de este estudio. (Ver el

apartado 5.-Conclusiones.)



4. DESARROLLO DEL PROYECTO EN CRONOGRAMA

en feb mar abril mayo junio julio agos sept oct nov dic

Bioensayo celular: Puesta a punto. X XBioensayo celular: Pruebas con distintas muestras.

X

Bioensayo celular: Intercalibración con otros organismos (Universidades, empresas de agua)

X

Bioensayo celular: Ensayos con muestras de rutina.

X X X

Diferenciación de colonias tóxicas: Puesta a punto

X

Diferenciación de colonias tóxicas: Pruebas con distintas muestras.

X

Diferenciación de colonias tóxicas: Intercalibración con otros organismosDiscusión de resultados y estudio de modificaciones.

X

Diferenciación de colonias tóxicas: Ensayos con muestras de rutina

X X

Propuesta de nuevos niveles de alerta- Utilidad respecto los manejados hasta ahora

X

Estudio de resultados- Conclusiones – Prespectivas de futuro

X

PropuestoX Realizado



5. CONCLUSIONES

5.1. Bioensayo de toxicidad (TEST DE HEPATOCITOS)

5.1.1 La técnica ha sido puesta a punto con éxito y ha demostrado funcionar bien,

pues ha demostrado ser una buena medida de toxicidad, proporcionando una

medida más real que la detección de microcistina (que sobreestima la

concentración real) y podría alertarnos ante presencia de varios tóxicos

sinérgicos que no detectamos ahora por ningún otro método.

5.1.2 No se ha logrado encontrar una relación dosis-efecto, como era el objetivo

inicial. Esto ha sido causado por la aparición de células resistentes en los

distintos pases del cultivo realizados a lo largo del tiempo. Hemos encontrado

que nos proporciona solo una medida cualitativa, pero muy fiable para dosis

medias y altas (por encima de 0,4 ppb de microcistina LR equivalente), con

elevada repetitibilidad y reproducibilidad. A bajas dosis (0,1 ppb) no se logra

una adecuada reproducibilidad, en ocasiones los resultados salen bien y otras

no se detecta nada.

5.1.3 Observamos la necesidad de hacer una serie de modificaciones en el

protocolo:

v Realizar refundación al menos anual del cultivo con selección de

células no resistentes.

v Introducir más replicas por muestra en el ensayo con el kit de

proliferación. para una mejor repetitibilidad

v Realizar una comparación con otro procedimiento cualitativo

(cambiando de medio de cultivo y con observación de daño celular al

microscopio), para seleccionar el más adecuado.



5.2. Determinación de colonias productoras de toxinas (TEST DE LECTINAS)

5.2.1. Hemos logrado la puesta a punto con éxito de la técnica de detección y ha

demostrado funcionar bien, ya que detectamos colonias productoras de

toxina, cuando efectivamente con el kit comercial de microcistina se miden

concentraciones de microcistina mayores que las habituales.

5.2.2. Se ha descartado realizar ensayos con otras lectinas, debido al buen

funcionamiento de la lectina elegida y al escaso tiempo para desarrollar más

técnicas, debido a las características de nuestro embalse. estamos

condicionados a la aparición de un recuento suficientemente alto de

cianobacterias, que varia en fechas, cantidad y especies presentes de un año

a otro, aunque siempre coincide con el final de verano y principios de otoño.

5.2.3. En cuanto a su utilidad como alerta temprana, para introducirla dentro de

nuestras alertas habría que cambiar la forma de trabajo.

La muestra sobre las que aplicamos todas las técnicas es el agua procedente

del bombeo del embalse de Ullibarri a su llegada a la ETAP. Por tanto es el

agua que esta a 13 m por debajo de la lámina del agua, en la cercanía del

muro de la presa.

Los crecimientos de microalgas, incluidas cianobacterias, se dan en los

primeros metros de la lámina del agua, donde llega la luz (zona fotica).

Posteriormente van decantando y llegan a la profundidad donde tenemos la

toma.

En caso de bloom de cianobacterias se observaría en las capas superficiales y,

más fácilmente, en zonas de orilla donde el viento y/o las corrientes arrastren

las floraciones.

Por tanto, para utilizar este test como alerta temprana seria necesario realizar

periódicamente una inspección visual de las orillas (la periodicidad se puede

establecer según nuestros resultados previos y la época del año). En caso de

observarse acúmulos de color verde, se procedería a toma de muestra,

recuento, identificación de especies, y en caso de observar Microcystis

aeruginosa, aplicación del test de lectinas. Si con los resultados del test se ve

presencia de colonias productoras de toxina, se aplicarían los niveles de alerta

establecidos. En caso de no encontrar colonias productoras, no haría falta



realizar de forma intensiva medidas de microcistina ni bioensayos de

toxicidad.

5.3. Niveles de alerta

5.3.1. Los niveles de alerta actualmente establecidos necesitan un ajuste:

o Si se basan solo en recuentos de microalgas no tenemos en cuenta que es

probable que los aumentos de cianobacterias se den en superficie y, tras

destruirse, lleguen a la profundidad de la toma solo las toxinas y no las

cianobacterias. Por tanto hay que establecerlos con medida combinada de

recuento de cianobacterias y determinación de microcistina.

o El kit comercial de microcistina que utilizamos (Mycrocystest de ZEU), al

sobreestimar la microcistina, nos proporciona una adecuada alerta

temprana. En el momento que el análisis de microcistina sea >0,5ppb se

introduciría el bioensayo de toxicidad, que nos proporcionará un dato real

de la toxicidad del agua.

o Solo en caso de que el bioensayo de toxicidad fuera positivo se pondrían

en funcionamiento los tratamientos adecuados para la eliminación de

toxicidad (Ozono y Carbón activo), optimizando de esta forma el

tratamiento a aplicar solo a los momentos en que así lo requieren.

5.3.2. En caso de tener medios para poder realizar una inspección periódica de las

orillas del embalse, se podrían establecer unos niveles de alerta distintos.

• Estableceríamos como vigilancia, además de los recuentos de microalgas y

cianobacterias y el seguimiento de microcistina en el agua que llega a la

ETAP, la observación periódica de bloom de algas en superficie u orillas

• Si se observan bloom en orillas y en las muestras recogidas se identifican

cianobacterias potencialmente tóxicas, se aplicaria el test de lectinas.

• Si con el test de lectinas se comprueba la presencia de colonias

productoras de toxina, se realizaría una vigilancia intensiva de

concentración de microcistina y detección de tóxicos por bioensayo en

hepatocitos.



5.3.3. Nos planteamos para el futuro otros sistemas predictivos que nos

proporcionen mayor información de lo que está pasando en el embalse, y que

nos permitan actuar con antelación, no cuando el problema ya esta en el agua

que recibimos en la ETAP desde el embalse.

Para ello estamos estudiando la posibilidad de instalar sondas de medida de

varios parámetros, que influyen en la calidad de agua que vamos a recibir, e

incluso la posibilidad de entrar en un proyecto de BIOSENSORES, (con

transmisión via radio, GSM etc ), es decir sondas en las que se incluyen

microalgas resistentes y sensibles a determinados compuestos

contaminantes, que nos alerten de la presencia de los mismos en el embalse

con antelación a la presencia de los mismos en el agua que se bombea a la

ETAP.

6. BIBLIOGRAFIA

1. Laura Muro Molina, Salomé Ortiz de Landaluce, Nuria Cifuentes Ezquerro, y Araceli

Vara Bernet. Detección y caracterización de microalgas tóxicas en el embalse de

Ullibarri-Gamboa. Tecnología del Agua, num 302, pg 36-42

2. Skulberg, O.M., W.W. Carmichael, G. A. Codd, and R. Skulberg. 1993. Taxonomy

of toxic cyanophyceae (Cyanobacteria), p. 145-164. In I. R. Falconer (ed.), Algal

Toxins in Seafood and Drinking Water. Academic Press, London, UK.

3. Carmichael, W.W., S. M. F. O. Azevedo, J. S. An, R. J. R. Molica, E. M. Jochimsen,

S. Lau, K. L. Rinehart, G. R. Shaw, and G. K. Eaglesham. 2001. Human fatalities

from cyanobacteria: chemical and biological evidence for cyanotoxins. Environ.

Health Perspect. 109(7): 663-668.



4. Jochimsen, E. M., W. W. Carmichael, J. S. An, D. M. Cardo, S. T. Cookson, C. M.

D. Holmes, M. B. D. Antunes, D. A. De-Melo, T. M. Lyra , V. S. T. Barreto, S. M. F.

O. Azevedo, and W. R. Jarvis. 1998. Liver failure and death after exposure to

microcystins at a hemodialyses center in Brazil. N. Engl. J. Med. 338(13):873-878.

5. Pouria, S., A. de Andrade, J. Barbosa, R. L. Cavalcanti, V. T. Barreto, C. J. Ward,

W. Preiser, G. K. Poon, G. H. Neild, and G. A. Codd. 1998. Fatal microcystin

intoxication in haemodialysis unit in Caruaru, Brazil. Lancet 352:21-26.

6. Falconer IR.1991. Tumor promotion and liver injury caused by oral consumption of

Cianobacteria. Enviromental Toxicology and water Quality 6:177-184

7. Juan Martinez Hernandez, V. Lopez-Rodas, E.Costas. 2009. Microcystins from tap

water could be a risk factor for liver and colorectal cancer: a risk identified by global

change. Medical Hypotheses.

8. Kaebernick, M. and B. A. Neilan. 2001. Ecological and molecular investigations of

cyanotoxin production. FEMS Microbiol. Ecol. 35:1-9.

9. Costas, E., and V. López-Rodas. 1994. Identification of marine dinoflagellates

using fluorescent lectins. J. Phycol. 30:987-990.

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