Universidad Complutense de Madrid Máster en Biología Evolutiva

“Relaciones filogenéticas, revisión taxonómica y filogeografía del complejo de especies Dendropsophus

leucophyllatus (Beireis, 1783) y Dendropsophus triangulum (Günther, 1869) (Anura: Hylidae)”

- Trabajo Fin de Máster -

Marcel Adrián Caminer Rodríguez

Departamento de Biología Evolutiva y Biodiversidad, Museo Nacional de Ciencias Naturales (MNCN), Consejo Superior de Investigaciones

Científicas (CSIC)

Noviembre de 2014

Autor: Lic. Marcel Caminer Fdo.: ________________________

Director: Dr. Borja Milá Fdo.: ________________________ Departamento de Biología Evolutiva y Biodiversidad, Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC

VºBº Tutor: Dr. Javier Pérez-Tris

Fdo.: ________________________ Departamento de Zoología y Antropología Física, Universidad Complutense de Madrid

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Resumen Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum son dos ranas arborícolas con amplia

distribución en la cuenca amazónica. Sus patrones de variación morfológica y diferenciación

genética sugieren que se trata de un complejo de especies. En el presente trabajo analizo la

filogenia y filogeografía de 129 individuos pertenecientes a 56 poblaciones de D.

leucophyllatus y D. triangulum para dilucidar sus relaciones evolutivas y definir límites entre

especies. Para ello, examino conjuntamente la variación en datos genéticos (secuencias de

ADN mitocondrial y nuclear), morfológicos y bioacústicos. Por otro lado, comparo la

diversidad genética y la diversidad fenotípica en los principales clados para determinar si

ambas están correlacionadas. En base al análisis integrativo realizado en este estudio,

reconozco nueve especies candidatas dentro del Grupo Dendropsophus leucophyllatus, de las

cuales tres difieren significativamente en sus cantos y su morfología, y por lo tanto las

considero como especies confirmadas. Dos de ellas corresponden a Dendropsophus

leucophyllatus y Dendropsophus triangulum. Asimismo, encuentro que las poblaciones

pertenecientes a dos de los clados con baja diversidad fenotípica (B y H) muestran baja

diversidad genética y evidencian una expansión demográfica reciente, por tanto la relativa

homogeneidad fenotípica podría ser debida a posibles cuellos de botella genéticos. En

contraste, un tercer clado (C) presenta un alto número de fenotipos por haplotipo, patrón

posiblemente relacionado con el papel de la selección apostática. Mis análisis identifican

además varios clados que sugieren la existencia de linajes adicionales que deberán ser

confirmados en base a muestreos y análisis futuros.

Palabras claves: bioacústica; cuenca amazónica; especies candidatas; morfología;

ranas arborícolas.

Introducción El aumento de la destrucción y alteración de los ecosistemas naturales en todo el mundo están

precipitando extinciones catastróficas de las especies (Brook et al., 2006). Dado que muchas

especies permanecen sin ser descritas, los esfuerzos para catalogar y explicar la biodiversidad

requieren ser priorizados.

Para los taxónomos, los caracteres fenotípicos han sido el criterio más común para

delimitar e identificar las especies y, aún hoy en día, la mayoría de las especies están descritas

en base a su morfología. Sin embargo, durante la última década, la adquisición masiva de

datos genéticos ha llevado al desarrollo de varios métodos, entre estos las filogenias

moleculares, que en base a caracteres neutros han sido relevantes para la reconstrucción de

historias evolutivas y la delimitación de especies (Sites & Marshall, 2004; Wiens, 2007). Los

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árboles de genes proporcionan evidencia vital para entender el proceso de especiación, ya que

abarcan la evolución intra e interespecífica, la cual es una conexión que evidencia de mejor

manera las relaciones ancestro-descendiente de los alelos dentro de las filogenias y las

poblaciones (Hey, 1994; Templeton, 1994). Debido a que el patrón de la coalescente del alelo

es estocástico y se puede definir de una manera probabilística (Tajima, 1983; Takahata y Nei,

1985; Hudson, 1991), la tasa por la cual un polimorfismo ancestral se pierde en un

determinado linaje proporciona una valiosa información de la divergencia temporal que se

produce entre linajes emparentados (Rosenberg, 2002; Hudson & Turelli, 2003). Esta

divergencia puede ser evidencia de que no se ha producido un intercambiado de migrantes

entre linajes cercanas, y por tal motivo puede servir como base para su delimitación.

El varios estudios se ha utilizado las propiedades biológicas para definir a una especie

(definiciones operativas; ver Wiley, 1978), por consiguiente se ha producido un largo debate

a través de la historia ya que no es posible determinar de forma inequívoca que las

propiedades biológicas son necesarias y suficientes para reconocer a una especie (revisado

Mayden, 1997; Wheeler y Meier, 2000). Sin embargo, se han propuesto marcos teóricos

alternativos en donde se define a una especie como un linaje de una metapoblación que tiene

unidad evolutiva (de Queiroz, 2005 y 2007). La especie, concebida de este modo, se convierte

en una categoría de organización biológica en lugar de un rango, y la única propiedad

necesaria y suficiente de una especie es que represente un fragmento de evolución por

separado de un linaje de la metapoblación. Otras propiedades de las especies como la

diagnosticabilidad morfológica, el aislamiento reproductivo y la monofilia son reinterpretados

como contingentes, y un linaje pueden o no adquirir dichas propiedades durante el curso de su

existencia (de Queiroz, 2005 y 2007). Bajo este concepto, la especie es la única categoría

biológica por encima de un organismo, la especiación es el proceso de división de un linaje, y

bajo ninguna medida se podría predecir la diferenciación de un carácter. Por lo tanto al

nombrar a las nuevas especies, los taxónomos deben presentar diferentes líneas de evidencia

para apoyar la hipótesis de que una población está evolucionando de manera independiente

(Padial y De la Riva, 2009).

Por otro lado, el comprender la distribución de la diversidad genética en el espacio

proporciona información de cómo se iniciaron los eventos de divergencia y especiación, y

permite poner a prueba las hipótesis relacionadas con los rangos fronterizos de las especies

(Zeisset y Beebee, 2008). El objetivo principal de la filogeografía es explicar los patrones

históricos de una determinada población en todo el mundo, teniendo en cuenta las grandes

diferencias regionales en la latitud, la topografía y las corrientes oceánicas (Hewitt, 2000).

Los análisis filogeográficos se basan en la comparación de la información del genotipo, a

menudo derivado de las secuencias de ADN mitocondrial, muestreado de poblaciones con

determinado rango de distribución. La filogeografía también ha proporcionado información

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específica sobre los factores que influyen en el flujo genético, como por ejemplo las barreras

geográficas (Eriksson et al., 2004; Worley et al., 2004).

La aplicación de métodos moleculares está revolucionando y revitalizando los

campos de la taxonomía y la sistemática (Yang y Rannala, 2012). Al combinar los datos

genéticos con otros conjuntos de caracteres independientes, una práctica que se ha

denominado recientemente como "taxonomía integrativa" (Dayrat 2005; Padial y De la Riva,

2009), los límites de las especies se pueden definir de forma objetiva. De hecho, en base a

esta nueva herramienta se ha encontrado que las especies crípticas pueden ser mucho más

abundantes en la naturaleza de lo esperado (Bickford et al., 2007; Elmer et al., 2013; Elmer y

Cannatella, 2008; Fouquet et al., 2007b; Funk et al., 2012; Jansen et al., 2011), tanto a través

de taxones y entre regiones geográficas (Fouquet et al., 2007a; Fouquet et al., 2012; Milá et

al., 2012; Pfenninger y Schwenk, 2007).

La morfología se ha utilizado ampliamente para la reconstrucción filogenética

durante décadas, y muchos estudios moleculares no han hecho más que confirmar las

agrupaciones ya establecidos por los morfólogos. De hecho, gran parte de la teoría moderna

de la sistemática se desarrolló casi exclusivamente en base a datos morfológicos (Hennig,

1966; Wiley, 1981). Sin embargo, los datos morfológicos son particularmente propensos a la

convergencia adaptativa (Hedges y Sibley, 1994; Givnish y Sytsma, 1997). Por ejemplo, se

han encontrado ecotipos similares en las lagartijas anolis que han evolucionado en diferentes

islas del Caribe (Losos et al., 2006), también existen convergencias morfológicas asociadas a

las adaptaciones a los diferentes hábitats y recursos específicos en peces cíclicos de los lagos

de Tanganica (Muschick et al., 2012), y asimismo se ha podido determinar la evolución de

rasgos similares en los pájaros cantores que se alimentan de néctar en Australia debido a

presiones selectivas comunes (Fleischer et al., 2008). A menudo se invoca la posibilidad de la

convergencia en los análisis filogenéticos morfológicos para explicar los conflictos

producidos entre los árboles obtenidos de los datos moleculares y los morfológicos (por

ejemplo, Wake, 1991; Losos, 2009; Fleagle y McGraw, 1999). La idea de que los datos

morfológicos son altamente susceptibles a la convergencia tiene sentido intuitivo, debido a

que interactúan con el medio ambiente de manera más directa y con más frecuencia que los

caracteres moleculares, los cuales se supone que son esencialmente neutros (Kimura, 1983;

Hedges y Sibley, 1994).

En anuros el alto nivel de similitud morfológica, y a menudo la presencia de

homoplasías (Emerson, 1986) han oscurecido sustancialmente su sistemática antes del

advenimiento de caracteres moleculares (Bossuyt y Milinkovitch, 2000; Frost et al., 2006;

Van der Meijden et al., 2005). Sin embargo, en la sistemática a nivel de especies, los

caracteres bajo selección sexual pueden ser muy útiles para la designación de especies

biológicas. La coloración y los cantos de anuncio de los machos tienen a menudo un

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componente hereditario y por tanto están sujetos a la selección (Endler, 1992; Hoekstra et al.,

2004; Hoffman et al., 2006; Kingston et al., 2003; Ryan et al., 1996). Los polimorfismos en

el color pueden surgir y ser mantenidos por diferentes procesos evolutivos. Por ejemplo, una

reducción en el flujo genético entre poblaciones ecológicamente distintas puede llevar a la

divergencia fenotípica (Gray y McKinnon, 2006; Rueffler et al., 2006). Sin embargo, el papel

de la coloración en la comunicación intraespecífica en ranas aún no está bien esclarecido

(Hödl y Amézquita, 2001). Por el contrario, los cantos de anuncio en las ranas son el principal

mecanismo de reconocimiento, y los caracteres bioacústicos son de excelente uso en la

taxonomía, aunque la tasa de evolución en los diferentes parámetros del canto pueden variar

entre los diferentes grupos (Cocroft y Ryan, 1995; Richards, 2006; Ryan, 1986;) y su valor

para la reconstrucción filogenética es poco conocido. Todos estos rasgos tienen una función

de señalización parcial (patrones de coloración) o exclusiva (cantos de anuncio) que es

importante en la comunicación intraespecífica, de manera que se encuentran potencialmente

bajo la selección sexual (Arak, 1983; Forester y Czarnowsky, 1985; Gabor et al., 2000; Ryan,

1999; Ryan y Rand, 1990; Ryan y Wilczynski, 1991).

Una predicción del concepto de linaje evolutivo es que existe una correspondencia

entre divergencia genética y divergencia fenotípica, y por tanto una amplia diferenciación

morfológica intraespecífica debería estar acompañada de un patrón filogeográfico mucho más

marcado que en taxones morfológicamente uniformes. Sin embargo, si la variación

morfológica es el resultado de una fuerte selección natural, la divergencia fenotípica podría

superar a la de marcadores genéticos neutros. Asimismo, en varios grupos, el alto nivel de

diferenciación genética no es correspondido por una diferenciación morfológica sustancial,

dando lugar a linajes crípticos (Good, 1989; Good y Wake, 1992; Shaffer et al., 2004; Veith

et al., 2004). En este contexto, y a fin de cuantificar la biodiversidad y comprender los

procesos que la generan, es importante la comparación de la estructura filogeográfica entre

especies estrechamente relacionadas con diversos niveles de variación morfológica

intraespecífica.

En el presente estudio comparo los patrones de variación genética y fenotípica en el

complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum a fin de esclarecer sus

relaciones filogenéticas, patrones filogeográficos, estructura de la población y los rasgos

fenotípicos potencialmente implicados en el aislamiento reproductivo. El grupo

Dendropsophus leucophyllatus actualmente se encuentra integrado por diez especies

distribuidas en las regiones amazónica y andina de America del Sur (de acuerdo a Faivovich

et al., 2005; Frost, 2014): Dendropsophus anceps (Lutz, 1929), D. bifurcus (Andersson,

1945), D. ebraccatus (Cope, 1874), D. elegans (Wied-Neuwied, 1824), D. leucophyllatus

(Beireis, 1783), D. manonegra (Rivera-Correa y Orrico, 2013), D. rossalleni (Goin, 1957), D.

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salli (Jungfer, Reichle y Piskurek, 2010) D. sarayacuensis (Shreve, 1935) y D. triangulum

(Günther, 1869). (Figura 1)

La mayoría de los individuos pertenecientes al grupo D. leucophyllatus pueden ser

reconocidos morfológicamente con bastante facilidad, sin embargo algunos han demostrado

ser difíciles de asignar a una determinada especie, ya que al ser polimórficos en sus patrones

de coloración, pueden compartir algunos morfotipos entre diferentes especies. Es así que la

especie D. triangulum ha sido descrita como una nueva especie en cuatro ocasiones

posteriores a su primera descripción en 1869 (Duellman 1974), debido a que posee diferentes

patrones de coloración y se pensaba que cada determinado patrón era una nueva especie. Por

ejemplo, Dendropsophus elegans fue considerada un sinónimo de D. leucophyllatus durante

más de un siglo (Caramaschi y Jim, 1982), y una rana descrita como Hyla favosa (Cope,

1885) ha resultado ser una variante de color de D. leucophyllatus (Titus et al., 1989).

La sistemática de este grupo fue establecida por primera vez en base a caracteres

morfológicos de sus renacuajos (Duellman y Trueb, 1983), y posteriormente se refinaron con

análisis moleculares (Check et al., 2001; Faivovich et al., 2005; Fouquet et al., 2007a;

Jungfer et al., 2010; Pyron y Wiens, 2011; Rivera-Correa y Orrico, 2013) combinados con

datos bioacústicos (Jansen et al., 2011; Lougheed et al., 2006). Chek et al. (2001)

proporcionó evidencia molecular de que D. leucophyllatus es un complejo de más de una

especie, cuando encontró que algunas poblaciones de D. leucophyllatus estaban más

estrechamente relacionadas a D. triangulum que a otras poblaciones de D. leucophyllatus; sin

Figura 1. Distribución geográfica de las especies pertenecientes al grupo Dendropsophus leucophyllatus.!

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embargo, no se han encontrado hasta la actualidad caracteres útiles para identificar a estos

nuevos linajes evolutivos (ver Lougheed et al., 2006).

Los cuatro objetivos principales de este estudio son: (1) lograr una mejor

comprensión de las relaciones filogenéticas dentro de este complejo de especies utilizando

marcadores moleculares; (2) proponer una revisión taxonómica del grupo; (3) utilizar una

aproximación filogeográfica para estudiar la historia evolutiva y demográfica de los

principales clados del grupo; y (4) comparar patrones de diversidad genética con patrones de

diversidad fenotípica.

Para el primer objetivo, genero una nueva filogenia molecular utilizando marcadores

mitocondriales y nucleares para determinar las relaciones evolutivas entre los diferentes

linajes. Para el segundo combino la filogenia con los patrones fenotípicos para evaluar la

relevancia en la sistemática de la bioacústica y los caracteres morfológicos para la

identificación de las especies y de los principales clados dentro de este grupo de ranas. Para el

tercer objetivo realizo árboles y redes de haplotipos derivados del ADN mitocondrial, y

superpongo los datos genéticos con la distribución geográfica para inferir la historia evolutiva

de la población. Finalmente, comparo patrones filogenéticos con patrones fenotípicos para

identificar casos de posible convergencia fenotípica entre linajes o casos de divergencia

fenotípica rápida.

Materiales y Métodos Extracción del ADN, amplificación y secuenciación

Extraje el ADN de tejidos (hígado y músculo) preservados en etanol al 95% de individuos

que fueron recolectados en el campo y que se encuentran disponibles en las colecciones del

Museo de Zoología (QCAZ) de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador, del Museo de

Historia Natural Noel Kempff Mercado de Bolivia (MNKA) y en el Centro de Ornitología y

Biodiversidad en Perú (CORBIDI). Utilicé los protocolos estandarizados de extracción con

fenol-cloroformo (Sambrook et al., 1989) y con el kit de extracción Qiagen DNeasy

(QiagenTM, Valencia, CA). Después de extraer el ADN amplifiqué los segmentos de los

genes mitocondriales 12S rRNA, 16S rRNA, NADH Deshidrogenasa I (ND1) y Citocromo

Oxidasa I (CO1) y porciones de los genes nucleares de la proopiomelanocortina (POMC), del

gen activador de la recombinación 1 (RAG-1) y del factor neurotrófico derivado del cerebro

(BDNF), mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con protocolos

estandarizados. Los cebadores y protocolos utilizados se presentan en los Anexos 1 y 2. Los

productos amplificados fueron secuenciados en plataformas comerciales (Macrogen Inc.,

Seoul, Korea, y Secugen, Madrid, España).

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Análisis filogenéticos

Estimé las relaciones filogenéticas entre las especies pertenecientes al grupo Dendropsophus

leucophyllatus utilizando secuencias de cuatro genes mitocondriales (12S, 16S, CO1, y ND1)

y de tres genes nucleares (POMC, RAG1 y BDNF). Para ampliar el muestreo de las especies,

también incluí secuencias del GenBank. Utilicé muestra de Dendropsophus brevifrons, D.

carnifex, D. parviceps y D. rhodopeplus como grupo externo (basado en Pyron y Wiens,

2011). Todas las muestras utilizadas aparecen listadas en el Anexo 3.

El alineamiento preliminar de las secuencias lo realicé con el programa Geneious

5.4.4 (GeneMatters Corp.). La matriz fue importada a Mesquite (versión 2.72; Maddison y

Maddison, 2009) y las regiones alineadas ambiguas fueron ajustadas manualmente para

producir una alineación parsimoniosa. Para los fragmentos de genes que codifican para

proteínas, las secuencias de ADN fueron traducidas a aminoácidos con Mesquite para ayudar

a la alineación manual. Debido a que el conjunto de datos incluye varios genes, es poco

probable que se ajuste a un único modelo de sustitución nucleotídica. Por lo tanto, dividí los

datos para analizar cada partición bajo un modelo separado elegido con el programa

JModelTest versión 0.1.1 (Posada 2008) y utilizando el Criterio de Información de Akaike.

Definí particiones para cada gen, y en el caso de los genes codificantes, utilicé cada posición

del codón como particiones separadas.

Los árboles filogenéticos se obtuvieron utilizando inferencia bayesiana y máxima

verosimilitud. Para estos análisis se concatenaron los genes mitocondriales y los nucleares por

separado. Para el análisis bayesiano se corrieron dos análisis independientes utilizando el

método de la cadenas de Markov-Monte Carlo con cuatro cadenas por 10 millones de

generaciones. Utilicé el programa TRACER versión 1.5 (Rambaut y Drummond, 2007) para

monitorear los valores de verosimilitud y confirmar visualmente la convergencia y la

estacionalidad de las corridas. Cada corrida fue muestreada cada 1.000 generaciones y se

descartaron los primeros 2.500 (20%) árboles (burn in), el resto se utilizó para estimar el

árbol bayesiano, las probabilidades posteriores y otros parámetros del modelo. El análisis

filogenético bayesiano lo llevé a cabo con el programa en MrBayes 3.2.1 (Ronquist et al.,

2012).

También estimé la filogenia bajo el criterio de máxima verosimilitud utilizando el

programa GARLI versión 2.0 (Zwickl, 2006). Se realizaron 10 análisis independientes para

asegurar que los valores de verosimilitud fueran consistentes. Además se empleó la técnica de

bootstrap no paramétrico para evaluar el soporte de cada nodo, con 100 réplicas. El consenso

de los árboles fue obtenido en Mesquite 2.74 (Maddison y Maddison, 2009) utilizando la

regla mayoritaria al 50%.

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Índices de diversidad de las secuencias, redes de haplotipos y filogenias del ADN

mitocondrial

Calculé los índices de diversidad haplotípica (h), nucleotídica (!) y de secuencias (k) en el

programa DnaSP (Librado y Rozas, 2009) para cada uno de los principales clados obtenidos

en el análisis filogenético con el ADN mitocondrial. Para determinar si existió cambios

repentinos en el tamaño de la población utilicé la prueba de la neutralidad de Fu (Fu, 1997), la

cual detecta desviaciones de la neutralidad en escenarios caracterizados por un exceso de

alelos raros y mutaciones recientes en secuencias no recombinantes. El programa Arlequin

versión 3.0 (Excoffier et al., 2005) fue utilizado para obtener los valores de Fs de Fu, y los

valores grandes negativos y significativos fueron interpretados como un exceso de

mutaciones recientes causadas por una expansión de la población (Fu, 1997). La significación

de los valores Fs fue evaluada utilizando 1.000 permutaciones aleatorias en el programa

Arlequin.

En algunos análisis intraespecíficos un formato de árbol jerárquico puede ser

inadecuado para la representación de las relaciones entre los haplotipos, debido a que el

período de tiempo durante el cual se han desarrollado las muestras es tan corto que coexisten

haplotipos ancestrales y derivados (Posada y Crandall, 2001; Kratysberg et al., 2004). Por tal

motivo, para examinar las relaciones filogenéticas entre los haplotipos construí redes de

haplotipos para cada uno de los clados principales utilizando el algoritmo “median-joining”

en el programa Network 4.6.0 (Fluxus Technologies Inc.). En estas redes, los haplotipos se

representan como círculos en los nodos de un árbol en vez de en las puntas, y el tamaño del

círculo es proporcional a la frecuencia del haplotipo en la población. También realicé

filogenias de los haplotipos para cada uno de los genes mitocondriales utilizando inferencias

bayesianas con los mismos parámetros y modelos evolutivos que fueron empleados en la

filogenia de los genes mitocondriales concatenados.

Análisis morfológicos y de coloración

Observé patrones de coloración para determinar si la diversidad genética revelada por el ADN

mitocondrial es acorde con la diversidad fenotípica. Los patrones de coloración fueron

observados en individuos vivos (en base a fotografías) y en preservación, tomando en cuenta

solamente los individuos adultos. Se determinó la edad y la condición sexual por medio de

una disección o por la observación de los caracteres sexuales secundarios externos. Revisé un

total de 440 individuos adultos pertenecientes al complejo de especies D. leucophyllatus-

triangulum depositados en las colecciones de los museos: Museo de Zoología de la Pontificia

Universidad Católica del Ecuador (QCAZ), Museo de Zoología de la Universidad de São

Paulo (MZUSP), Museo de Historia Natural Noel Kempff Mercado de Bolivia (MNKA),

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Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid (MNCN) y Centro de Ornitología y

Biodiversidad de Perú (CORBIDI). Medí la longitud rostro cloacal (LRC) con un calibrador

digital con precisión de 0.01mm marca Tresna.

Los caracteres cualitativos utilizados para las diagnosis se basaron principalmente en

Duellman (1974 y 1978), Cochran y Goin (1970), Goin (1957), Rodriguez y Duellman (1994)

y referencias citadas en estos artículos. Se examinó: (1) coloración del dorso y vientre, (2)

presencia o ausencia de una o dos manchas en las pantorrillas y antebrazos, (3) coloración de

los flancos y lados de la cabeza (4) forma y número de marcas en el dorso, (5) presencia o

ausencia del patrón de coloración reticulado y (5) coloración en vida del iris.

Análisis bioacústicos

La comunicación acústica en anuros puede ser utilizada para atraer a la pareja (por ejemplo,

Haddad y Cardoso, 1992; Brenowitz y Rose, 1999) y también puede estar relacionada con la

defensa del territorio, incluyendo encuentros entre machos que compiten por los sitios de

llamada (por ejemplo, Wells, 1988; Bastos y Haddad, 2002) o sitios de postura de huevos (por

ejemplo, Martins et al., 1998). En este estudio se reconocieron dos tipos de cantos emitidos

por los machos que forman parte del complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum.

Todas las vocalizaciones eran simples y estaban formadas por una o varias notas pulsadas,

pero eran distintas en su estructura física y fueron emitidas en diferentes contextos sociales.

Cantos de anuncio.—Este tipo de canto es de gran valor para la determinación de la

identidad de la especie y para la resolución de problemas taxonómicos, además permite la

identificación de especies crípticas e híbridos (Heyer et al., 1996; Angulo et al., 2003; Gergus

et al., 2004). Los machos pertenecientes al complejo Dendropsophus leucophyllatus-

triangulum producen este tipo de canto antifonalmente: cantos frecuentes y sincronizados

producidos por diferentes machos que interactúan evitando la superposición acústica. La

primera nota para este tipo de canto (denominada nota A en este estudio) es pulsada (10–20

pulsos) y tiene un tiempo de duración entre 0,08 y 0,2 segundos; puede estar o no

acompañada por una o varias notas secundarias (nota B) que también son pulsadas, pero se

diferencian de la primera nota en su duración (0,02–0,04 s) y número de pulsos (2–6 pulsos).

Cantos territoriales.—Es una forma de interacción agonística (comportamiento

agresivo) que se produce cuando un individuo intenta adquirir un recurso impugnado, tal

como un territorio, a expensas de otro. Los cantos territoriales se emiten al comienzo de la

actividad de las llamadas y pueden ser utilizados para delimitar los límites territoriales.

También se pueden escuchar cantos territoriales adicionales cuando los machos invaden los

territorios de sus congéneres, y generalmente acaban a la salida del intruso (Toledo, 2004). Se

observó que los machos pertenecientes al grupo D. leucophyllatus-triangulum emitían este

tipo de canto a tasas elevadas cuando existe una alta actividad de llamados conspecíficos y

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también cuando se producen interacciones interespecíficas. El número de notas para este

canto puede variar de 3 a 7 (notas B), las cuales pueden incrementarse a medida que las

interacciones continúen. A diferencia del canto de anuncio, no se emite la nota A.

Para la grabación de los cantos utilicé una grabadora digital OlympusTM LS10 y un

micrófono direccional SennheiserTM ME-67. También incluí cantos publicados en Duellman y

Pyles (1983), Lougheed et al. (2006) y Jansen et al. (2011). Los cantos están depositados en

el archivo de audio del Museo de Zoología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador

(QCAZ), en la Fonoteca Zoológica del Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC) de

Madrid y en la Macaulay Library del Laboratorio de Ornitología de la Universidad de

Cornell.

Se obtuvieron cantos pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus

leucophyllatus-triangulum de las localidades de BOLIVIA: SANTA CRUZ: Puerto

Alcamcén; Ñuflo de Chávez; Ichilo; BENI: Yucuma; Estación Biológica de Beni; BRASIL:

PARÁ: 200 km al oeste de Redençao; Alter do Chão; Obidos; AMAPÁ: Serra do Navio;

ACRE: Río Branco; ECUADOR: SUCUMBÍOS: Santa Cecilia; PASTAZA: Loracachi;

NAPO: Misahualli; ORELLANA: 57 km vía Maxus; Tambococha; Chiroisla; PERÚ:

MADRE DE DIOS: Puerto Maldonato; GUAYANA FRANCESA: CAYENNE: Kaw;

Toponowini.

En total se obtuvieron las grabaciones de los cantos de 50 individuos que representan

siete de los ocho clados obtenidos en este estudio. Los oscilogramas, espectrogramas y

espectros de poder fueron editados y realizados con el programa Raven Pro versión 1.5

(Charif et al., 2010). El espectrograma fue generado mediante una transformación Fourier

directa (DFT) a partir de una muestra de 1024 puntos y una resolución de frecuencia de 43.1

Hz. Se utilizaron varios cantos y notas por individuo para calcular un promedio individual.

Para este trabajo consideré como “canto” a una secuencia estereotipada de notas; una

“nota” como la unidad de sonido constituida por uno o más pulsos producidos durante un solo

ciclo de flujo de aire (McLister et al., 1995); mientras que un “pulso”, es el resultado pasivo

del flujo del aire a través de la laringe (McLister et al., 1995).

Los parámetros analizados fueron: duración del canto (Ddc), número de notas por canto

(Nnc), tiempo de subida del canto (Tsc), número de pulsos por canto (Npc), duración de la

nota A (DdlA), número de pulsos de la nota A (NpA), duración de la nota B (DdlB), número

de pulsos de la nota B (NpB), distancia entre notas (Dtn), promedio de la frecuencia

dominante del canto (Fdc), banda de la frecuencia del canto (Bfc) y distancia entre pulso

(Dtp). Todas estas características del canto son de uso común para las descripción de cantos y

el reconocimiento taxonómico (Cocroft y Ryan, 1995; Bosch y De la Riva, 2004; Lougheed et

al., 2006; Márquez et al., 1995; Padial et al., 2008). En el Anexo 4 se provee información

más detallada de cada parámetro utilizado y en la Figura 2 se muestra un ejemplo de la forma

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de un onda típica y el espectrograma a partir de la cual se midieron las variables los cantos.

Debido a que las variables del canto pueden estar afectadas principalmente por la

temperatura del ambiente (Gerhardt y Huber, 2002), los datos fueron sometidos a una

regresión de todas las variables con la temperatura. Los análisis mostraron una falta de

correlación entre la temperatura y todas la variables por lo que no se aplicaron correcciones

adicionales. La falta de correlación puede ser consecuencia del rango relativamente pequeño

de temperaturas registradas durante las grabaciones (23–26 oC).

Realicé un análisis de componentes principales (ACP) con el fin de conocer el grado

de diferenciación de los cantos entre clados. Posteriormente realicé una prueba de t pareada

para analizar las variables entre clados para los componentes principales encontrados en el

ACP. Los análisis se ejecutaron en el programa SPSS ® (2009, version 17.0 para Windows).

Delimitación de las especies

Los linajes encontrados en este estudio serán clasificados en tres categorías según las

definiciones realizadas por Vieites et al. (2009). (1) Especies candidatas confirmadas (ECC),

son aquellas que difieren claramente por caracteres morfológicos y bioacústica y por lo

general muestran alta diferenciación genética. (2) Especies candidatas no confirmadas (ECN),

son linajes genealógicos profundos en los que su bioacústica y morfología todavía no han sido

estudiadas. (3) Linajes conespecíficos profundos (LCP), son linajes genealógicas divergentes

que no presentan diferenciación acústica ni morfológica, o que solamente las presentan en

caracteres conocidos que muestran la variabilidad intraespecífica.

Figura 2. Oscilograma (A) y espectrograma (B) de un canto representativo del complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum. En el oscilograma, se muestra la nota primaria denominada en este estudio como Nota A, seguida de una nota secundaria (Nota B). !

! *#!

Resultados Análisis filogenéticos

Se obtuvieron secuencias de 163 individuos para los genes mitocondriales 12S (~967 pb), 16S

(~1.106 pb), CO1 (~642 pb), ND1 (~1.102 pb) y para los genes nucleares POMC (~632 pb),

RAG-1 (~448 pb) y BDNF (~718 pb), incluyendo los grupos externos (Anexo 3). Los

modelos evolutivos utilizados para las particiones de los análisis filogenéticos y los valores de

sus diferentes parámetros se detallan en el Anexo 5.

Los análisis de inferencia bayesiana y máxima verosimilitud para los genes

individuales y para los genes combinados mitocondriales muestran árboles similares, por

consiguiente sólo se presenta la topología del árbol con los genes mitocondriales

concatenados (Fig. 3). Actualmente, el grupo de especies Dendropsophus leucophyllatus es

relativamente bien conocido en cuanto a su composición de especies (ver Duellman 1974;

Titus et al., 1989; De la Riva y Duellman, 1997; Chek et al., 2001; Wiens et al., 2005;

Faivovich et al., 2005; Jungfer et al., 2010; Rivera-Correa y Orrico, 2013). La única especie

que por el momento no posee análisis filogenéticos es D. rossalleni, aunque De la Riva y

Duellman (1997) sugieren que pertenece a este grupo debido a que presenta un cierto grado

de similitud en su morfología.

A pesar de estas contribuciones, en este estudio hay dos aspectos en la sistemática del

grupo de especies Dendropsophus leucophyllatus que requieren una especial atención. En

primer lugar, dos especímenes de Perú colectados en la localidad de La Mar (departamento de

Ayacucho), presentan una morfología y un patrón de coloración muy parecido a D. salli y D.

bifurcus (dorso de color marrón, con manchas de color crema en el hocico, las líneas

dorsolaterales, la rabadilla, los antebrazos y las pantorrillas). Estos especímenes pertenecen al

Clado I (Fig. 3), se encuentran estrechamente relacionados con la especie D. salli con

soportes estadísticos muy altos de probabilidad posterior (0,99) y bootstrap (100%), y

presentan una divergencia muy alta en sus secuencias de ADN mitocondrial (distancias p no

corregidas varían entre 8,4–9,5% para el gen 16S). Al mismo tiempo, ambas especies

comparten un ancestro común con D. elegans y por consiguiente forman un grupo

monofilético.

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Figura 3. Filograma consenso resultante del análisis bajo el criterio de inferencia bayesiana de los genes combinados 12S, 16S, ND1 y CO1 que representa las relaciones dentro del Grupo Dendropsophus leucophyllatus. Se muestra el número de museo de cada individuo y su localidad. Los colores representan los diferentes clados obtenidos en este estudio. Los valores de bootstrap y las probabilidades posteriores aparecen en las ramas; los valores faltantes indican valores por debajo de 50 (bootstrap) o 0,5 (probabilidades posteriores). No se muestra el grupo externo. Las abreviaturas son: BO Bolivia, BR Brasil, CO Colombia, EC Ecuador, GF Guayana Francesa, PE Perú, SU Surinam. !

! *%!

En segundo lugar, la filogenia identificó ocho clados con buenos soportes (>0,89

probabilidades posteriori; >78% bootstrap) dentro de lo que actualmente se reconocen como

dos especies Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum. Estos resultados son

congruentes con la filogenia presentada por Lougheed et al. (2006), en la cual se identificaron

tres de estos clados (B, C y D + F–H ). Las distancias p no corregidas entre los linajes más

emparentados para el gen 16S oscilaron entre 3,1 y 8,5%, mientras que dentro de cada linaje

las distancias p variaron entre 0,0 y 1,8%. Los ocho clados se encuentran clasificados en dos

subclados basales y alopátricos con un soporte estadístico muy alto. El primero está

conformado por 3 clados (A, B y C) y el segundo por los clados D, E, F, G y H.

El clado A es hermano del clado B, lo que nos indica que están cercanamente

emparentados. El clado A se distribuye en los departamentos de Beni y Santa Cruz en

Bolivia; mientras que el clado B se encuentra al noroccidente de Brasil (Estados de

Amazonas, Amapá y Pará), en Surinam (Distrito de Para), y gran parte de la Guayana

Francesa (Distritos de Cayena y Saint Laurent du Maroni). Finalmente, el clado C se

encuentra geográficamente ubicado al norte y suroriente del Ecuador (Provincias de

Sucumbíos, Napo, Orellana, Pastaza y Morona Santiago), al noroeste de Brasil (Estado de

Amazonas) y en la región amazónica del Perú (Departamento de Loreto) (Fig. 4). El clado C

forma un grupo monofilético con los clados A y B, que excluye a los clados D, E, F, G y H.

Figura 4. Mapa de las localidades muestreadas en este estudio para las especies pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Las estrellas azules corresponden al clado A, los pentágonos marrones al clado B, los triángulos verdes al clado C, los cuadrados rojos al clado D, los círculos naranjas al clado E, el cuadrado redondeado morado al clado F, los círculos celestes al clado G y los círculos amarillos al clado H. !

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En el segundo subclado tenemos la presencia del clado D, el cual es el más basal de

este grupo y comparte su ancestro común con los clados E, F, G y H. El clado D está

distribuido en los estados de Acre y Pará (Brasil) y en los departamentos del Cusco y Madre

de Dios (Perú). Debido a que los valores de probabilidad posterior y bootstrap fueron muy

bajos, no hubo una buena resolución filogenética entre los clados E, F, G y H. Los clados F y

G están presentes en el estado de Pará en Brasil; el clado E se encuentra distribuido en el

departamento del Cusco en Perú; mientras que el clado H está geográficamente ubicado en

región amazónica del Ecuador (Provincia de Orellana y Sucumbíos), al noroccidente y

nororiente de Brasil (Estados de Acre y Pará) y al nororiente del Perú (Departamento de

Loreto) (Fig. 4).

Para la filogenia con los genes nucleares combinados bajo el criterio de inferencia

bayesiana y máxima verosimilitud (Anexo 6) hay poca resolución, por ende la topología del

árbol de los genes nucleares fue incongruente con la de los genes mitocondriales.

Análisis de coloración

Se encontraron variables cualitativas que fueron diferentes entre algunos clados resultantes de

los análisis filogenéticos. Los estados de estas variables se repiten en individuos de diferentes

localidades y pertenecientes a un mismo clado. Principalmente, se analizaron los patrones de

coloración del dorso y vientre, los cuales han sido y siguen siendo de gran utilidad para

asignar a los diferentes linajes dentro del complejo de especies Dendropsophus

leucophyllatus-triangulum (ver Boulenger, 1882; Cochran y Goin, 1970; Titus et al., 1989;

Duellman, 1974 y 1978; Rodriguez y Duellman, 1994). A continuación describo las variables

cualitativas para cada clado:

Clado A.— (Fig. 5A-B) La coloración del dorso es café o marrón obscuro, y presenta

machas de color amarillo brillante o blanco cremoso en las líneas dorsolaterales y la rabadilla.

Estas manchas con bordes irregulares y pequeños puntos marrones en su interior (Fig. 5A),

también se encuentran presentes en los antebrazos y las pantorrillas (2 ó 3 en cada una), y

pueden diferenciarse de las manchas encontradas en los clados B, D, E, F, G y H (manchas

con bordes lisos y sin puntos). La punta del hocico, lados de la cabeza, la región supra-

cloacal, las superficies dorsales de las extremidades superiores e inferiores, y los flancos son

de color marrón. Algunos individuos tienen una coloración muy diferente a la descrita

previamente, pues consiste de un dorso con una fina red de líneas amarillas o blancas en un

fondo café o marrón obscuro (morfo "reticulado"; Fig. 5B). Esta fina red se extiende en las

superficies dorsales de la cabeza, el cuerpo y las extremidades. En la noche las manos, los

pies, las axilas, las superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies

ventrales de los miembros son naranja-amarillento o rosado; de día estas superficies son

anaranjadas. El saco vocal es amarillo y el iris es bronce oscuro.

! *'!

Clado B.— (Figs. 5C y 6) La coloración del dorso es café o marrón obscuro en el

centro, y blanco cremoso o amarillo brillante en las periferias. Las esquinas posterolaterales

son confluentes con una amplia franja marrón en los flancos. La mancha blanca que se

encuentra presente en la rabadilla es característica para este clado, y puede diferenciarse de

las manchas presentes en el resto de clados (A, D, E, F, G y H) debido a su peculiar forma de

hoja alargada (Fig. 5C y 6). La punta del hocico, lados de la cabeza, la región supra-cloacal,

las superficies dorsales de las extremidades superiores, los flancos y los muslos son de color

marrón. En la pantorrilla se encuentra presente una mancha crema o amarilla que puede cubrir

la mayor parte la superficie, y en algunos casos puede estar dividida por una banda transversal

de color marrón; manchas con similares coloraciones pero de formas redondas pueden

encontrarse en los antebrazos (una o dos en cada extremidad). En algunos individuos, también

se encuentra presente el morfotipo reticulado. En la noche las manos, los pies, las axilas, las

superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies ventrales de los miembros

son naranja-amarillento; de día estas superficies son anaranjadas. El saco vocal es amarillo y

el iris es de color bronce oscuro.

Figura 5. Diferentes patrones de coloración de individuos perteneciese al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. (A y B) Clado A; (C) Clado B; (D–G) clado C; (H) clado D; (I–L) clado H. !

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Clado C.— (Figs. 5 D–G y 6) La coloración dorsal en este clado puede variar de blanco

cremoso a crema amarillento, amarillo, café o marrón obscuro, con o sin una o más marcas

marrones obscuras sobre todo el dorso. Las superficies dorsales de las pantorrillas y algunas

veces los antebrazos y los pies son del mismo color que el dorso. Duellman (1974) identificó

7 morfotipos para este clado, para los cuales se basó en el número y la distribución de las

marcas encontradas en el dorsal. A continuación describo los mismos morfotipos con algunas

variaciones: (1) individuos sin marcas en el dorso; (2) una marca de forma circular o

triangular en la región occipital; (3) dos marcas, una ubicada en la región media dorsal y la

otra en la región occipital; (4) una marca en forma de triángulo o una banda ancha que va

desde la cabeza hasta la región media dorsal; (5) tres marcas redondas, una en la cabeza y dos

en la región media dorsal; (6) una fila de marcas redondeadas en la región media dorsal y en

las líneas dorsolaterales; y (7) numerosas marcas circulares distribuidas sobre todo el dorso.

Para los morfotipos 6 y 7, marcas similares pueden estar presentes en las superficies dorsales

de las extremidades superiores e inferiores (Fig. 5E). El patrón en los individuos que

Figura 6. Fotografías dorsales de individuos preservados pertenecientes a los Clado B, C y H del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. !

! *)!

presentan varias marcas en el dorso (morfotipo 7) puede ser fácilmente confundido con el

morfotipo reticulado encontrado en los clados A, B, E, F, G y H. Los lados de la cabeza, los

flancos, las superficies dorsales de las manos, pies, antebrazos y muslos son de color marrón

oscuro o de un gris uniforme. Las manos, las axilas, las superficies anteriores y posteriores de

los muslos y las superficies ventrales de los miembros son de color rosa por la noche y rojo en

el día. El saco vocal es amarillo y el iris es bronce oscuro.

Clado D–H.— (Figs. 5 H–L y 6) Después revisar los patrones de coloración de los

especímenes preservados y vivos (fotografías), no se encontró ningún carácter diagnóstico

que permita diferenciar los clados obtenidos en los análisis moleculares. Los individuos

pertenecientes a estos cinco clados presentan una marca dorsal marrón obscura distintiva en

forma de reloj de arena con un color de fondo amarillo brillante o cremoso (Fig. 5K); en

algunos casos la marca dorsal tiene forma de banda y podría confundirse muy fácilmente con

el morfotipo 4 del clado C. Por otra parte, en algunos especímenes una o las dos esquinas

posterolaterales son confluentes con una amplia franja marrón en los flancos (Fig. 5 H–J); la

mancha que se forma en la rabadilla posee una variedad de formas y tamaños (e.j., círculo,

óvalo o rectángulo con bordes redondeados). En estos cincos clados, también se encuentra

presente el morfotipo reticulado (fina red amarilla brillante o cremosa que se extiende por

toda la superficie dorsal, incluyendo las extremidades; Fig. 5L). La punta del hocico, lados de

la cabeza, la región supra-cloacal, los flancos, las superficies dorsales de las extremidades

superiores e inferiores son de color marrón. Las superficies dorsales de las pantorrillas poseen

de 1 a 3 manchas; mientras que las superficies dorsales de los antebrazos pueden tener o no 1

ó 2 manchas redondeadas. En las localidades pertenecientes al Ecuador se ha encontrado que

la mancha en la pantorrilla puede cubrir la mayor parte de la superficie. Las manos, los pies,

las axilas, las superficies anteriores y posteriores de los muslos y las superficies ventrales de

los miembros son de color naranja pálido por la noche y anaranjado brillante en el día. El saco

vocal es amarillo y el iris es de color bronce oscuro.

La prueba de t realizada con la variable longitud rostro-cloacal en los machos permitió

determinar diferencias en el tamaño corporal entre clados (Anexo 7). La Figura 7 muestra que

los individuos del clado C son los más pequeños (el promedio es 24,71 ± 2,53 mm) y se

diferencian de los demás clados (P <0,001); los especímenes del clado A son los más grandes

(30,60 ± 1,63 mm) y también presenta significación con los clados B, E, y H (P <0,002);

mientras que el clado E es diferente a los clados F y G (P = 0,02).

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Análisis bioacústicos

Los resultados obtenidos del análisis de componentes principales muestran tres componentes

principales (CP) que explican en conjunto el 75.97% de la variación total (Anexo 8). El CP1

(42,54% de la variación explicada) tiene cargas mayores en la duración (DdlB) y número de

pulsos de la nota B (NpB), y el número de notas por canto (Nnc). El CP2 (21,45% de la

variación explicada) tiene cargas mayores en la banda de la frecuencia del canto (Bfc) y el

número de pulsos por canto (Npc). El CP3 (11,97%) tiene las cargas mayores en la distancia

entre notas (Dtn).

La proyección de los individuos sobre el CP1 y el CP2 (Fig. 8) permite separar a los

cantos de anuncio de los territoriales, y también diferenciar algunos de los clados dentro de

los cantos de anuncio. En el caso del CP1, los cantos de anuncio de los clados A y D se

separan de los cantos de anuncio pertenecientes a los clados B, C, F, G y H por tener una

menor duración y número de pulsos de la nota B, y también por un menor número de notas en

sus cantos de anuncio. De igual manera, los cantos de territorio se separan ligeramente de los

cantos de anuncio por tener una mayor medida de estas tres variables. En el caso del CP2,

tanto los cantos de territorio como los de anuncio para el clado C tienden a separarse del resto

Figura 7. Diagrama de caja que compara la longitud rostro cloacal (LRC) de los machos adultos del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Se muestra la media para cada clado (línea central de cada caja), la variación de los datos (rango intercuartil: longitud de la caja), los límites sobre los cuales se ubican los datos atípicos (barras de error) y los datos extremos (puntos negros). !

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de clados debido a que poseen una mayor banda de frecuencia y un mayor número de pulsos

por canto. Las características de los cantos de anuncio y territorio para cada clado, con

excepción del clado E del cual no pude obtener grabaciones, se resumen en el Anexo 9.

La prueba de t permitió determinar qué caracteres, de acuerdo a los componentes

principales, son diferentes entre los clados. El primer componente (CP1) para los cantos de

anuncio, que está relacionado con las variables obtenidas de la nota B y el número de notas

por canto, nos indica que los clados A y D son altamente significativos con respecto a los

clados B, C, F, G y H (P <0,001); el clado C es diferente de B, F, G y H (P <0,005); y los

clados G y H también presentan significación (P = 0,01). Para el segundo componente (CP2)

para los cantos de anuncio, el cual está influenciado por la banda de la frecuencia y el número

de pulsos por canto, los resultados muestran que el clado C se diferencia de los demás clados

(P <0,01); mientras que los clados A y D son diferentes a B y F (P <0,03).

En cuanto a la comparación de los componentes principales para cada clado con

respecto a los cantos territoriales, el CP1 nos indica que existe significación entre el clado D y

los clados B, C, G y H (P <0,008); el clado A es diferente a B, C y H (P <0,01); y los clados

B y C presentan significación al igual que G y H (P <0,01). Por otra parte, al comparar el

segundo componente principal entre clados, el clado C muestra diferencias con el resto de

clados (P <0,02); mientras que los clados B y G son diferentes a los clados A y D (P <0,01).

En el Anexo 10 se indica la significación estadística entre las comparaciones de los

componentes principales para los cantos de anuncio y de territorio.

Figura 8. Proyección de las variables acústicas sobre los componentes principales CP1 y CP2 de un análisis de componentes principales pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. !

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Estatus taxonómico de Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum La examinación del holotipo de D. triangulum (BM 68.11.15.2, Figura 9) que se encuentra

depositado en la colección del Museo Británico en Londres, sugiere que pertenece al clado C

debido a la combinación de la presencia de una mancha en forma de triángulo en la cabeza y

por la localidad tipo “Brasil”, la cual es consistente con el rango de distribución del clado C.

El holotipo de D. leucophyllatus no pudo ser examinado porque está perdido (Böhme,

1981). Sin embargo, la descripción y dibujo del holotipo de D. leucophyllatus en una revisión

hecha por Böhme (1981) combinada a la ubicación de la localidad tipo, sugieren que

pertenece al clado B. El énfasis de Beireis (1783) en la mancha blanca ovalada ubicada en la

superficie dorsal de la rabadilla es consistente con la mancha característica del clado B. Por

otra parte, la presencia exclusiva de individuos del clado B con este tipo de patrón de

coloración en la región de la Guayana es consistente con la localidad tipo “Surinam”.

Índices de diversidad de las secuencias, redes de haplotipos y filogenias del ADN

mitocondrial

Se tomaron en cuenta sólo los datos moleculares de los clados B, C y H para compararlos,

debido a que estos poseían un mayor número de muestras y localidades en relación a los

demás clados. La prueba de neutralidad de Fu mostró tanto valores positivos como negativos,

no obstante sólo hubo significancia para los valores negativos de los clados B (Fs = -1,72; P

= 0,01) y H (Fs = -1,82; P = 0,03) en el fragmento 12S, lo cual indica un exceso de

mutaciones recientes y que la población ha sufrido una expansión poblacional (Fu 1997). Por

otra parte, el clado C fue el que presentó un mayor número de sitios polimórficos (s = 19–61)

Figura 9. Holotipo de Dendropsophus triangulum (BM 68.11.15.2, LRC = 27 mm). A la izquierda vista dorsal y a la derecha vista ventral. !

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y mayor diversidad nucleotídica (! = 0,005–0,012) en todos los fragmentos de los genes

mitocondriales, seguido por el clado H (s = 6–25; ! = 0,001–0,007) y posteriormente por el

clado B (s = 2–9; ; ! = 0,0006–0,003); lo cual está muy acorde con el número individuos y

sitios muestreados por clado. En cuanto a la diversidad haplotípica, el clado H presentó los

valores más altos para los fragmentos de los genes 16S y ND1 (! = 0,85 y 0,90

respectivamente), y el clado C para los fragmentos 12S y CO1 (! = 0,82 y 0,83). Los

resultados de la prueba de la neutralidad y los índices de diversidad genética para cada gen

mitocondrial y para cada uno de los clados principales obtenidos de la filogenia mitocondrial,

se resumen en la Tabla 1.

16S (~503 pb)

Clados No. sitios

No. individuos

No. Hap. s h ! Fs P

B 14 25 3 2 0,29 ± 0,01 0,0006 ± 0,0002 -1,004 0,16 C 21 46 9 19 0,75 ± 0,04 0,007 ± 0,001 1,15 0,74 H 11 27 10 12 0,85 ± 0,04 0,007 ± 0,0005 -1,13 0,34

12S (~781 pb)

Clados No. sitios

No. individuos

No. Hap. s h ! Fs P

B 9 14 4 3 0,49 ± 0,15 0,0007 ± 0,0002 -1,72 0,014 C 20 43 9 21 0,82 ± 0,03 0,005 ± 0,001 1,76 0,82 H 7 16 5 6 0,53 ± 0,14 0,001 ± 0,0004 -1,82 0,038

ND1 (~939 pb)

Clados No. sitios

No. individuos

No. Hap. s h ! Fs P

B 9 16 6 9 0,83 ± 0,56 0,002 ± 0,0005 -0,61 0,35 C 16 35 13 61 0,81 ± 0,05 0,012 ± 0,002 2,61 0,87 H 6 15 9 25 0,90 ± 0,05 0,006 ± 0,001 -0,46 0,42

CO1 (~625 pb)

Clados No. sitios

No. individuos

No. Hap. s h ! Fs P

B 7 12 4 6 0,56 ± 0,15 0,003 ± 0,0009 0,75 0,69 C 17 42 12 31 0,83 ± 0,03 0,011 ± 0,002 1,19 0,73 H 6 14 5 9 0,70 ± 0,10 0,003 ± 0,001 0,55 0,69

La secuenciación de 73 individuos para el fragmento del gen 12S, 96 para el 16S, 66

para ND1 y 68 para CO1 produjo 18, 10, 28 y 21 haplotipos únicos, respectivamente (Anexo

11). Las filogenias obtenidas en base al análisis bayesiano y las redes de haplotipos

construidas para cada uno de los cuatro marcadores de ADN mitocondrial indican que el

clado B posee el menor número de haplotipos en los cuatro fragmentos de genes en relación

al resto de clados, y su estructura genética no presenta un patrón geográfico definido (Fig.

10).

Tabla 1. Diversidad genética e índices de la historia demográfica de los principales clados obtenidos en la filogenia molecular del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Los clados corresponden a los definidos por la Figura 3. No. Hap. = número de haplotipos, s = número de sitos polimórficos, h = diversidad haplotípica, ! = diversidad nucleotídica y Fs = valores de la prueba de Fu. !

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Figura 10. Red de haplotipos y análisis bayesiano de cuatro fragmentos de ADN mitocondrial para los principales clados obtenidos en este estudio. (A) 12S, (B) 16S, (C) ND1 y (D) CO1. Los colores representan a los diferentes clados: café para el clado B, verde para el C y amarillo para el H. Se muestran las probabilidades posteriores en las rama del árbol. Los haplotipos están representados por círculos, su tamaño es proporcional a su frecuencia en la población. Cada rama de la red representa un cambio de nucleótido único y las mutaciones adicionales se indican con barras a lo largo de las ramas. Los números en los cuadrados indican los cambios de nucleótidos que separan a las poblaciones más divergentes. !

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Para el clado C, se observan dos clados bien definidos con valores de soporte altos en

sus ramas (probabilidad posterior >0,92) para todos los árboles filogenéticos, en los cuales se

separan a las poblaciones de Requena (ubicada al sur-oriente de Loreto) y Sacado (al sur-

occidente del Estado de Amazonas) del resto de poblaciones muestreadas. En las redes de

haplotipos creadas con los cuatro diferentes marcadores mitocondriales (Fig. 10A–D), la

poblaciones de Requena se diferencian por un rango de 10 a 35 pasos mutacionales y la de

Sacado por 7 pasos del resto de poblaciones; mientras que los haplotipos encontrados en una

misma localidad del Ecuador tienden a separase por un rango de 2 a 9 pasos. Finalmente en el

clado H, las poblaciones de Requena se diferencian por 12 y 4 pasos del resto de poblaciones,

pero solamente en los fragmentos ND1 y CO1 respectivamente.

Discusión Divergencia genética y delimitación de las especies

En este estudio he identificado 9 linajes genealógicos con gran divergencia genética dentro

del complejo Dendropsophus leucophyllatus-triangulum, hasta ahora considerado dos únicas

especies. Los análisis bioacústicos y morfológicos junto a la filogenia molecular revelan la

existencia de varias especies taxonómicas nuevas. En base a la clasificación propuesta por

Vieites et al. (2009) pude identificar 3 especies candidatas confirmadas (clados A–C), una

especie candidata no confirmada (clado I) y 5 linajes genealógicos profundos. Al igual que en

otros estudios sobre los anfibios de la Amazonía (por ejemplo, Elmer et al., 2013; Fouquet et

al., 2007; Funk et al., 2011), los resultados de este estudio documentan una gran proporción

de la diversidad que se encontraba oculta en el grupo Dendropsophus leucophyllatus dentro

de un conjunto de poblaciones que antes eran tratadas como dos especies con amplia

distribución.

La baja variabilidad los genes nucleares utilizados en este estudio (POMC, RAG-1 y

BDNF) no resolvió las relaciones filogenéticas a nivel de especies. Las inconsistencias entre

las árboles filogenéticos mitocondriales y los nucleares puede deberse a sus respectivas tasas

de evolución. La elevada tasa de mutación y menor tamaño de población efectiva, hacen que

los genes mitocondriales sean más variables que los nucleares (Brown et al., 1996).

Los individuos pertenecientes a los clados A, B y C presentan diferencias en sus

secuencias de ADN mitocondrial (distancias p no corregidas >4,8% para el gen 16S), cantos

de anuncio, patrones de coloración y tamaño del rostro cloacal, además sus rangos de

distribución son alopátricos. Por consiguiente, existen suficientes evidencias para

categorizarlas como linajes evolutivos independientes.

Las ranas pertenecientes a los clados D, E, F, G y H se encuentran caracterizadas por

una morfología relativamente conservada que puede ocultar una profunda diferenciación

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genética, lo que indica que la tasa molecular está divergiendo más rápidamente que la

evolución morfológica (Heyer y Maxson, 1982; Duellman y Tueb, 1994). Los cantos de

anuncio entre los clados D, F, G y H que, según los análisis, representaría linajes distintos, en

algunos casos han demostrado ser muy similares o incluso idénticos. Sin embargo, se ha

demostrado que la hibridación natural a veces se produce entre especies con llamadas bien

diferenciadas, lo que indica que las diferencias en los cantos no son necesariamente

suficientes para evitar la hibridación interespecífica cuando otros mecanismos de aislamiento

se debilitan o se eliminan (Blair, 1958).

En ciertas localidades los análisis revelaron que algunos linajes independientes se

encuentran en simpatría o al menos en una proximidad muy cercana (por ejemplo, la

localidad de Redençao para los clados D y G; Alter do Chão para B y F; La Convención para

D y E; Requena, San Vicente, Chiroisla, Huiririma, Nuevo Rocafuerte y Tabatinga para C y

H). Los grupos fenotípicamente o genéticamente diferentes que son capaces de mantener su

integridad genética en simpatría pueden interpretarse como especies biológicas (Mallet,

2008). No obstante, los linajes de ADN mitocondrial divergentes en simpatría también

podrían ser el producto de contactos secundarios entre poblaciones previamente aisladas y

todavía co-específicas (capaces de reproducirse) (Hewitt, 2011). Por tal motivo, interpreto a

las entidades simpátricas que no poseen variables fenotípicas únicas para su diferenciación

como linajes genealógicos profundos a la espera de nuevas pruebas para su posible

designación como especies.

Consideraciones biogeográficas

La biodiversidad se encuentra distribuida de una forma heterogénea dentro del Neotrópico.

Los bosques tropicales de América del Sur se pueden dividir en cinco regiones principales

(Duellman, 1999): el Chocó en la costa del Pacífico; las empinadas laderas de los Andes; la

selva costera del Caribe; la selva atlántica del Brasil y la selva amazónica. Estas regiones se

caracterizan por un alto grado de endemismo (Duellman, 1999). Las tierras bajas del

Amazonas (<600m) son consideradas como un conjunto de sub-regiones que comprenden la

Amazonía occidental (Alto Amazonas), el Escudo Brasileño y el Escudo Guayanés.

La distribución geográfica del clado B restringida al Escudo Guayanés, podría indicar

que este linaje es endémico de la región y en consecuencia presentaría una larga historia

evolutiva de gran relevancia dentro de la Guayana Francesa. Por otra parte, al interpretar

como variación dentro de la misma especie al amplio número de pasos mutacionales de las

poblaciones de Requena (Perú) que conectan con los haplotipos de las localidades cercanas o

pertenecientes al Ecuador en los clados C y H, se podría inferir que la historia biogeográfica

de la Amazonía occidental es independiente para ambas regiones muestreadas. Sin embargo,

se necesitarán muestreos adicionales para sustentar esta hipótesis.

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Correlación entre la diversidad genética y la fenotípica

Dentro del complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum encontré tres linajes (clados B,

C y H) que presentan diferentes niveles de diversidad fenotípica y genética. El clado C

presenta un gran número de fenotipos de coloración diferentes y una alta diversidad

haplotípica y nucleotídica, mientras que los clados B y H muestran baja diversidad genética,

una relativa homogeneidad fenotípica, y no presentan un patrón geográfico definido. La gran

variación de colores y manchas que poseen las ranas pertenecientes al clado C podría ser

resultado de la selección apostática contra depredadores visuales, en donde las formas

comunes de una especie son mayormente depredadas en comparación a las más raras y esto

permite que los morfos raros tengan una ventaja selectiva en la población (Paulson, 1973).

También es posible que la combinación de los patrones de coloración con el entorno sea una

señal suficiente para disuadir a los posibles predadores (cripsis) (por ejemplo, Osorio y

Srinivasan, 1991).

Los resultados de la prueba de la neutralidad de Fu para el gen mitocondrial 12S

indican que los clados B y H sufrieron una expansión poblacional reciente (Fu, 1997), lo cual

explicaría la menor diversidad genética y fenotípica que poseen estos clados en comparación

al clado C. Estas expansiones demográficas recientes fueron probablemente precedidas por

cuellos de botella genéticos que pudieron afectar no solamente a las regiones neutras del

genoma sino también a las que codifican la variabilidad fenotípica, reduciendo así tanto el

número de haplotipos mitocondriales como de fenotipos de coloración. Por otra parte, se ha

demostrado que la selección sexual en anuros es a menudo mayor en los cantos que en la

coloración (Dreher y Pröhl, 2014), sin embargo no se podría descartar la posibilidad de que la

selección sexual estuviese actuando también en los patrones de coloración para estos dos

clados, produciendo de esta manera morfos específicos para el reconocimiento de especies.

Conclusiones Dendropsophus leucophyllatus y D. triangulum, han sido consideradas hasta ahora dos

especies de ranas con una gran variabilidad fenotípica y un amplio rango de distribución. Mis

análisis demuestran que de hecho nos encontramos ante un complejo conformado por ocho

linajes evolutivos independientes, algunos de los cuales difieren en su morfología y sus cantos

de anuncio y territorio. Los patrones de coloración y cantos de anuncio en anuros son

importantes para el aislamiento reproductivo y la delimitación de las especies, y los resultados

de este estudio han demostrado que la selección sexual está afectando de distinta manera a

cada uno de estos rasgos en cada linaje independiente. Además, pude determinar que las

poblaciones de la Amazonía ecuatoriana difieren en su historia evolutiva de las poblaciones

conespecíficas de Requena en Perú. Finalmente, encontré una correlación positiva entre la

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diversidad fenotípica y la diversidad genotípica en los tres linajes principales de este estudio,

lo que sugiere que existe una relación entre la historia demográfica de los clados y su

diversidad fenotípica y genética que merece ser explorada más a fondo.

Por otro lado, la mayoría del muestreo se limitó a varias localidades del Ecuador,

Perú, y Guyana Francesa y pocas localidades del Brasil y Bolivia, así que es probable que

existan más linajes independientes de los que se han encontrado en este estudio. Estos

resultados ponen de manifiesto la necesidad de llevar a cabo estudios sistemáticos a gran

escala de los anfibios amazónicos para lograr una comprensión más realista de su diversidad y

evolución.

Agradecimientos

Agradezco a Borja Milá, director de la disertación, y a Santiago Ron por darme la confianza y

oportunidad de realizar este trabajo y compartir sus valiosos conocimientos conmigo.

También agradezco a Rafael Márquez, Ignacio de la Riva, Mario García-París, Noemí

Goicochea y Pau Alexaindre por sus valiosas sugerencias y aporte en la elaboración de este

trabajo. A Liliana Jaramillo y Gabriela Castillo del Laboratorio de Biología Molecular del

QCAZ por su colaboración. A Martin Jansen, Antoine Fouquet, Jean-Pierre Vacher, Pablo

Venegas, Germán Chávez, Andrew Chek, William Duellman, Steffan Reichle y Philippe

Gaucher por el préstamo de tejidos, grabaciones de los cantos y fotografías de los

especímenes. A mis padres, a Stephany Torres, Hamid Ghanavi, Pilar Ochoa, Guillermo Friis

y Diushi K'eri por sus consejos, apoyo y enseñanzas, los cuales han sido de mucha utilidad en

la elaboración de este trabajo y en mi vida personal. Finalmente quedo agradecido al

Ministerio de Ambiente del Ecuador por los permisos de colección, a la Pontificia

Universidad Católica del Ecuador, al Museo Nacional de Ciencias Naturales (MNCN) y

especialmente a la Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación

(SENESCYT) por el financiamiento de mis estudios y de esta investigación.

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ANEXOS

Anexo 1. Regiones de ADN y cebadores utilizados en este estudio.

Gen Cebadores Secuencias (5 !- 3 !) Fuente 12S Mitocondrial

tPhe-frog tVal-frog tRNA-Val tPhe2-frog MVZ59 MVZ50

ATAGCRCTGAARAYGCTRAGATG TGTAAGCGARAGGCTTTKGTTAAGCT GGTGTAAGCGARAGGCTTTKGTTAAG GCRCTGAARATGCTGAGATGARCCC ATAGCACTGAAAAYGCTDAGATG TCTCGGTGTAAGCGAGAGGCTT

Wiens et al. (2005) Wiens et al. (2005) Goebel et al. (1999) Goebel et al. (1999) Goebel et al. (1999) Goebel et al. (1999)

16S Mitocondrial

16Sbr-H 16SC-16L 16H47

CCGGTCTGAACTCAGA TCACGT GTRGGCCTAAAAGCAGCCAC AAAGRGCTTAGRTCTTTYGCA

Palumbi et al. (1991) Pauly et al. (2004) Heinicke et al. (2007)

ND1 Mitocondrial

WL384 WL379 16S-frog tMet-frog

GAGATWGTTTGWGCAACTGCTCG GCAATAATYATYTGAACMCC TTACCCTRGGGATAACAGCGCAA TTGGGGTATGGGCCCAAAAGCT

Moen y Wiens (2008) Moen y Wiens (2008) Wiens et al. (2005) Wiens et al. (2005)

CO1 Mitocondrial

LCO1490 dgHCO2198

GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG TAAACTTCAGGGTGACCAAAR

Folmer et al. (1994) Folmer et al. (1994)

POMC Nuclear

POMC-1 POMC-2 POMC-3 POMC-4

GAATGTATYAAAGMMTGCAAGATGGWCCT TAYTGRCCCTTYTTGTGGGCRTT TCTGCMGARTCWCCYGTGTTTCC TGGCA TTYTTGAAAAGAGTCA T

Wiens et al. (2005) Wiens et al. (2005) Wiens et al. (2005) Wiens et al. (2005)

BDNF Nuclear

BDNFAmp-F1 BDNFAmp-R1

ACCATCCTTTTCCTKACTATGG CTATCTTCCCCTTTTAATGGTC

Santos y Cannatella (2011) Santos y Cannatella (2011)

RAG-1 Nuclear

R1-GFF R1-GFR

GAGAAGTCTACAAAAAVGGCAAAG GAAGCGCCTGAACAGTTTATTAC

Faivovich et al. (2005) Faivovich et al. (2005)

Anexo 2. Protocolos para amplificar los genes mitocondriales y nucleares utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Gen Protocolos

12S y 16S

1 ciclo: 2min 94°C, 30s 42°C, 1min 72°C 5 ciclos: 30s 94°C, 30s 42°C, 1min 72°C 22 ciclos: 30s 94°C, 30s 50°C, 1min 72°C 1 ciclo: 5min 72°C

12S y 16S

1 ciclo: 2min 94°C, 30s 55°C, 1min 72°C 5 ciclos: 30s 94°C, 30s 55°C, 1min 72°C 22 ciclos: 30s 94°C, 30s 60°C, 1min 72°C 1 ciclo: 5min 72°C

16S 1 ciclo: 2min 94°C 35 ciclos: 2min 94°C, 30s 60°C, 1min 72°C 1 ciclo: 5min 72 °C

16S y ND1

1 ciclo: 2min 94°C, 30s 55°C, 1min 72°C 9 ciclos: 30s 94°C, 30s 55°C, 1min 72°C 30 ciclos: 30s 94°C, 30s 60°C, 1min 72°C 1 ciclo: 5min 72°C

ND1

1 ciclo: 2min 94°C, 30s 50°C, 1min 72°C 5 ciclos: 30s 94°C, 30s 50°C, 1min 72°C 22 ciclos: 30s 94°C, 30s 58°C, 1min 72°C 1 ciclo: 10min 72°C

CO1 1 ciclo: 5min 95°C 34 ciclos: 30s 95°C, 30s 50°C, 1min 72°C 1 ciclo: 5min 72°C

CO1 y BDNF 1 ciclo: 2min 94°C 25 ciclos: 45s 94°C, 30s 57°C, 1min 72°C 1 ciclo: 7min 72°C

POMC y RAG-1 1 ciclo: 2min 94°C 45 ciclos: 20s 94°C, 25s 52°C, 2min 72°C 1 ciclo: 7min 72°C

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Anexo 3. Lista de individuos utilizados en este estudio. Se indica el número de catálogo, a qué clado pertenecen dentro de este estudio, la localidad, el país, los fragmentos de genes secuenciados y el número del Genbank para acceder a las secuencias de ADN. Las abreviaturas son: BO Bolivia, BR Brasil, CO Colombia, EC Ecuador, GF Guayana Francesa, PE Perú, SU Surinam. No. Catálogo Especie Clado Región (País) Localidad 12S 16S ND1 COI RAG-1 POMC BDNF

QCAZA53042 Dendropsophus leucophyllatus A Beni (BO) Yucuma, Los Lago -- X X X -- -- --

QCAZA53044 D. leucophyllatus A Santa Cruz (BO) Ichilo, Buenavista X X X X -- -- -- QCAZA53047 D. leucophyllatus A Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chávez, San Sebastián X JF790064 X X X X X QCAZA53048 D. leucophyllatus A Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chávez, San Sebastián X JF790065 X X -- -- -- QCAZA53049 D. leucophyllatus A Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chávez, San Sebastián X JF790066 X X X X X QCAZA53050 D. leucophyllatus A Beni (BO) Beni, Yucuma X JF790067 X X -- X --

AF063 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Petit-saut X X -- -- -- -- -- AF064 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Petit-saut X X -- -- -- -- --

AF1341 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Montagne tortue grande X X X -- -- X -- AF1396 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Aratai X X X X -- -- -- AF1710 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Saul Limonade X X -- X -- -- -- AF1748 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Chutes Voltaire X X X X -- X -- AF1815 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Mana -- X X -- -- X -- MC123 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Kaw X X X -- -- -- -- MC124 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Kaw X X X X -- -- -- MC125 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Kaw X X X -- -- -- -- MC191 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Apatou X X X X -- -- -- MC192 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Apatou X X X X -- -- -- MC224 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Saul X X X X -- -- -- MC297 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Toponowini X X X X -- -- -- MC300 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Toponowini X X X X -- -- -- MC36 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Kaw EF376023 EF376059 X X -- -- --

MC373 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Apatou X X X X -- -- -- MC404 D. leucophyllatus B St. Laurent (GF) Lucifer X X X -- -- -- -- MC99 D. leucophyllatus B Cayenne (GF) Kaw X X X X -- -- --

MZUSP950143 D. leucophyllatus B Amapá (BR) Serra do Navio -- AF308087/DQ393417 -- -- -- -- --

MZUSP950156 D. leucophyllatus B Amapá (BR) Serra do Navio AF308068 AF308088 -- -- -- -- -- MZUSP950161 D. leucophyllatus B Pará (BR) Alter do Chão -- DQ393416 -- -- -- -- -- MZUSP950193 D. leucophyllatus B Amazonas (BR) 100km north of Manaus -- DQ393428 -- -- -- -- -- MZUSP950231 D. leucophyllatus B Amazonas (BR) 100km north of Manaus -- AF308091 -- -- -- -- --

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No. Catálogo Especie Clado Región (País) Localidad 12S 16S ND1 COI RAG-1 POMC BDNF

MZUSP950232 D. leucophyllatus B Amazonas (BR) 100km north of Manaus -- AF308092/DQ393427 -- -- -- -- --

BPN918 D. leucophyllatus B Pará (SU) Road to Apura JN690789 JN691396 -- -- -- -- --

INPA2976 D. triangulum C Amazonas (BR) Sacado AF308077 AF308106/DQ393438 -- -- -- -- --

MZUSP960042 D. triangulum C Amazonas (BR) Tabatinga AF308078 AF308107/DQ393437 -- -- -- -- --

MZUSP960053 D. triangulum C Amazonas (BR) Tabatinga -- AF308108/DQ393439 -- -- -- -- --

KU202745 D. triangulum C Napo (EC) Misahualli AY326053 A Y326053 -- -- -- -- -- KU217664 D. triangulum C Sucumbíos (EC) 2,5 km Norte de Lago Agrio DQ380377 -- -- -- -- -- --

QCAZA12537 D. triangulum C Sucumbíos (EC) Tipishca X X X X -- -- -- QCAZA17411 D. triangulum C Pastaza (EC) Canelos X X X X -- -- -- QCAZA28312 D. triangulum C Sucumbíos (EC) Puerto Bolívar X X X X -- -- -- QCAZA37872 D. triangulum C Orellana (EC) Pompeya, Sacha Lodge X X X X -- -- -- QCAZA37887 D. triangulum C Pastaza (EC) 6km vía San Ramón-El Triunfo X X X X -- -- -- QCAZA39480 D. triangulum C Orellana (EC) Nuevo Rocafuerte X X X X -- -- -- QCAZA43085 D. triangulum C Sucumbíos (EC) Reserva Limoncocha X X X X X X X QCAZA43086 D. triangulum C Sucumbíos (EC) Reserva Limoncocha X X X X -- -- -- QCAZA43665 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43666 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43667 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43726 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43753 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43758 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43759 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA43767 D. triangulum C Orellana (EC) Coca X X X X -- -- -- QCAZA44211 D. triangulum C Orellana (EC) Edén X X X X -- X -- QCAZA44212 D. triangulum C Orellana (EC) Edén X X X X -- -- -- QCAZA44213 D. triangulum C Orellana (EC) Edén X X X X -- -- -- QCAZA44367 D. triangulum C Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44368 D. triangulum C Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44485 D. triangulum C Orellana (EC) San Vicente X X X X -- -- -- QCAZA44486 D. triangulum C Orellana (EC) San Vicente X X X X -- -- -- QCAZA44487 D. triangulum C Orellana (EC) San Vicente X X X X -- -- -- QCAZA44587 D. triangulum C Orellana (EC) Huiririma X X X X -- -- -- QCAZA44588 D. triangulum C Orellana (EC) Huiririma X X X X -- -- --

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No. Catálogo Especie Clado Región (País) Localidad 12S 16S ND1 COI RAG-1 POMC BDNF QCAZA44589 D. triangulum C Orellana (EC) Huiririma X X X X -- -- -- QCAZA44668 D. triangulum C Orellana (EC) Santa Teresa X X X X -- -- -- QCAZA44669 D. triangulum C Orellana (EC) Santa Teresa X X X X -- -- -- QCAZA44814 D. triangulum C Orellana (EC) Nuevo Rocafuerte X X X X X X X QCAZA44815 D. triangulum C Orellana (EC) Nuevo Rocafuerte X X X X -- -- -- QCAZA44816 D. triangulum C Orellana (EC) Nuevo Rocafuerte X X X X -- -- -- QCAZA46396 D. triangulum C Morona Santiago (EC) Napimias X X X X -- -- -- QCAZA46397 D. triangulum C Morona Santiago (EC) Napimias X X X X -- -- -- QCAZA48836 D. triangulum C Napo (EC) Reserva Yachana X X X X -- -- -- QCAZA48840 D. triangulum C Napo (EC) Reserva Yachana X X X X -- -- -- QCAZA49319 D. triangulum C Pastaza (EC) Centro Fatima X X X X -- -- -- QCAZA49338 D. triangulum C Pastaza (EC) Centro Fatima X X X X -- -- -- CORBIDI0091 D. triangulum C Loreto (PE) Maynas, Redondococha -- X X X -- -- --

CORBIDI12252 D. triangulum C Loreto (PE) Requena, Comunidad Galicia X X X X -- X -- CORBIDI12254 D. triangulum C Loreto (PE) Requena, Comunidad Galicia X X X X -- -- -- CORBIDI12255 D. triangulum C Loreto (PE) Requena, Comunidad Galicia X X X X -- X -- MZUSP930044 D. leucophyllatus D Pará (BR) 200km west of Redençao -- DQ393421 -- -- -- -- --

MZUSP950253 D. leucophyllatus D Acre (BR) Río Branco AF308072 AF308097/DQ393432 -- -- -- -- --

MZUSP950254 D. leucophyllatus D Acre (BR) Río Branco -- DQ393433 -- -- -- -- -- KU215274 D. leucophyllatus D Madre de Dios (PE) 15 km Este de Puerto Maldonado DQ380360 -- -- -- -- -- --

CORBIDI10045 D. leucophyllatus D Cusco (PE) La Convención, Pagoreni X X X X X X X

CORBIDI6631 D. leucophyllatus E Cusco (PE) La Convención, Pongo de Mainique X X X X X X X

CORBIDI6639 D. leucophyllatus E Cusco (PE) La Convención, Pongo de Mainique X X X X X X X

CORBIDI9738 D. leucophyllatus E Cusco (PE) La Convención, Shokoriairi X X X X -- -- -- MZUSP950162 D. leucophyllatus F Pará (BR) Alter do Chão -- DQ393422 -- -- -- -- --

MZUSP950163 D. leucophyllatus F Pará (BR) Alter do Chão AF308069 AF308089/DQ393419 -- -- -- -- --

MTR6315 D. leucophyllatus G Pará (BR) Serra do Kukoinhokren JN690790 JN691397 -- -- -- -- -- MZUSP930042 D. leucophyllatus G Pará (BR) 200km west of Redençao -- DQ393418 -- -- -- -- -- MZUSP930043 D. leucophyllatus G Pará (BR) 200km west of Redençao -- DQ393418 -- -- -- -- -- MZUSP930045 D. leucophyllatus G Pará (BR) 200km west of Redençao -- AF308085 -- -- -- -- -- MZUSP930046 D. leucophyllatus G Pará (BR) 200km west of Redençao AF308067 AF308086 -- -- -- -- -- MZUSP930049 D. leucophyllatus G Pará (BR) 200km west of Redençao -- DQ393420 -- -- -- -- --

MJH 3844 D. leucophyllatus H Acre (BR) Lago Catalao, Ilha Xiborena AY843680 AY843680 -- -- -- -- --

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No. Catálogo Especie Clado Región (País) Localidad 12S 16S ND1 COI RAG-1 POMC BDNF

INPA4273 D. leucophyllatus H Acre (BR) Igarapé Porangaba AF308071 AF308095/DQ393431 -- -- -- -- --

INPA4483 D. leucophyllatus H Acre (BR) Nova Vida -- AF308096/DQ393430 -- -- -- -- --

MZUSP950172 D. leucophyllatus H Pará (BR) Obidos -- DQ393426 -- -- -- -- -- MZUSP950175 D. leucophyllatus H Pará (BR) Obidos -- DQ393423 -- -- -- -- --

MZUSP950176 D. leucophyllatus H Pará (BR) Obidos -- AF308090/DQ393424 -- -- -- -- --

MZUSP950178 D. leucophyllatus H Pará (BR) Obidos -- DQ393425 -- -- -- -- -- MZUSP960009 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga -- DQ393435 -- -- -- -- -- MZUSP960018 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga AF308070 AF308093 -- -- -- -- -- MZUSP960019 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga -- DQ393436 -- -- -- -- -- MZUSP960020 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga -- DQ393436 -- -- -- -- -- MZUSP960023 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga -- DQ393429 -- -- -- -- -- MZUSP960034 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga -- DQ393434 -- -- -- -- -- MZUSP960056 D. leucophyllatus H Amazonas (BR) Tabatinga -- AF308094 -- -- -- -- -- QCAZA35504 D. leucophyllatus H Sucumbíos (EC) Garzacocha X X X X -- -- -- QCAZA44290 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44291 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44292 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44455 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44456 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44457 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Chiroisla X X X X X X X QCAZA44466 D. leucophyllatus H Orellana (EC) San Vicente X X X X -- -- -- QCAZA44467 D. leucophyllatus H Orellana (EC) San Vicente X X X X -- -- -- QCAZA44468 D. leucophyllatus H Orellana (EC) San Vicente X X X X -- -- -- QCAZA44539 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Huiririma X X X X -- X -- QCAZA44552 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Huiririma X X X X -- -- -- QCAZA44826 D. leucophyllatus H Orellana (EC) Nuevo Rocafuerte X X X X X X X

CORBIDI12194 D. leucophyllatus H Loreto (PE) Requena, Comunidad Galicia X X X X -- -- -- CORBIDI12251 D. leucophyllatus H Loreto (PE) Requena, Comunidad Galicia X X X X -- -- -- CORBIDI9613 D. sp. I Ayacucho (PE) La Mar, Rivera del Rio Apurimac X X X X X X X CORBIDI9614 D. sp. I Ayacucho (PE) La Mar, Rivera del Rio Apurimac X X X X X X X

CFBH 5797 D. anceps -- Espirito Santo (BR) Linhares AY843597 AY843597 -- -- -- -- -- QCAZA17021 D. bifurcus -- Morona Santiago (EC) Río Yunganza X X X X -- -- -- QCAZA23802 D. bifurcus -- Morona Santiago (EC) 4km Norte de Macas X X X X -- -- -- QCAZA26482 D. bifurcus -- Morona Santiago (EC) 4,8km Norte del Rosario X X X X -- -- --

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No. Catálogo Especie Clado Región (País) Localidad 12S 16S ND1 COI RAG-1 POMC BDNF QCAZA37198 D. bifurcus -- Pastaza (EC) Pomona X X X X -- -- -- QCAZA15519 D. ebraccatus -- Esmeraldas (EC) 3km de Durango X X X X -- -- -- QCAZA30680 D. ebraccatus -- (EC) Gamboa X X X X -- -- -- QCAZA40847 D. ebraccatus -- Esmeraldas (EC) Playón de San Francisco X X X X -- -- --

LM3135 D. elegans -- (BR) -- DQ380355 -- -- -- -- -- -- MZUSP95029 D. elegans -- Río de Janeiro (BR) Teresopolis -- AF308102 -- -- -- -- -- MZUSP95033 D. elegans -- Río de Janeiro (BR) Teresopolis AF308075 AF308103 -- -- -- -- --

MHUA-A 7336 D. manonegra -- Caquetá (CO) Florencia, Altamira KF009943 KF009943 -- -- -- -- -- MHUA-A 7337 D. manonegra -- Caquetá (CO) Florencia, Altamira KF009942 KF009942 -- -- -- -- --

-- D. salli -- -- -- X AY362976 -- -- -- -- -- MNKA 9446 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790043 -- -- -- -- -- MNKA 9447 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790044 -- -- -- -- -- MNKA 9448 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790045 -- -- -- -- -- MNKA 9671 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790039 -- -- -- -- -- MNKA 9673 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790040 -- -- -- -- -- MNKA 9674 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790041 -- -- -- -- -- MNKA 9677 D. salli -- Santa Cruz (BO) Ñuflo de Chavez, San Sebastián -- JF790042 -- -- -- -- --

QCAZA17429 D. sarayacuensis -- Pastaza (EC) Fátima Centro Experimental X X X X -- -- -- QCAZA23030 D. sarayacuensis -- Tungurahua (EC) Baños, Río Lagarto X X X X -- -- -- QCAZA32637 D. sarayacuensis -- Morona Santiago (EC) Nueve de Octubre X X X X -- -- -- QCAZA36697 D. sarayacuensis -- Napo (EC) Río Salado X X X X -- -- -- QCAZA18174 D. brevifrons -- Orellana (EC) Jatun Sacha X X X X -- -- -- QCAZA17826 D. brevifrons -- Napo (EC) Estación Científica Yasuní X X X X -- -- -- QCAZA28273 D. brevifrons -- Sucumbíos (EC) Playas de Cuyabeno X X X X -- -- -- QCAZA31770 D. carnifex -- Imbabura (EC) Santa Rosa, Alto Chocó X X X X -- -- -- QCAZA39333 D. carnifex -- Imbabura (EC) Santa Rosa, Siempre Verde X X X X -- -- -- QCAZA15342 D. carnifex -- Pichincha (EC) Vía Toachi-Chiriboga, Río Orito X X X X -- -- -- QCAZA37692 D. parviceps -- Orellana (EC) Yanakinka X X X X -- -- -- QCAZA32555 D. parviceps -- Pastaza (EC) Bobonaza X X X X -- -- -- QCAZA35720 D. parviceps -- Orellana (EC) Parque Nacional Yasuní, X X X X -- -- -- QCAZA24425 D. parviceps -- Tungurahua (EC) Río Verde X X X X -- -- -- QCAZA44328 D. rhodopeplus -- Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44329 D. rhodopeplus -- Orellana (EC) Chiroisla X X X X -- -- -- QCAZA44584 D. rhodopeplus -- Orellana (EC) Huiririma X X X -- -- -- --

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Anexo 4. Descripción de las variables temporales y espectrales obtenidas del análisis de los cantos de anuncio del complejo de especies D. leucophyllatus-triangulum. Simbología Variable Descripción

Duración del canto Ddc Medición física del canto, tiempo desde el comienzo hasta el final del canto

Número de notas por canto Nnc Conteo físico de las notas del canto

Tiempo de subida del canto Tsc Tiempo en el cual en el canto se invierte la mayor energía (la frecuencia y la amplitud aumentan, y luego llegan a estabilizarse)

Número de pulsos por canto Npc Conteo físico de los pulsos del canto

Duración de la nota A DdlA Medición física de la nota larga, tiempo desde el comienzo hasta el final de la nota

Número de pulsos de la nota A NpA Conteo físico de pulsos de la nota larga

Duración de la nota B DdlB Medición física de la nota corta, tiempo desde el comienzo hasta el final de la nota

Número de pulsos de la nota B NpB Conteo físico de pulsos de la nota corta

Distancia entre notas Dtn Tiempo entre el final de una nota y el comienzo de la nota que le prosigue

Promedio de las frecuencias dominantes del canto Fdc

Promedio de las medidas tomadas en tres diferentes puntos del canto, que miden la intensidad de la armónica con la mayor energía

Banda de la frecuencia del canto Bfc Frecuencia más alta en cualquier punto del canto menos

la frecuencia más baja en cualquier punto del canto

Distancia entre pulso Dtp Tiempo medido desde el pico más alto del pulso hasta el pico más alto del pulso que le prosigue

Anexo 5. Modelos de evolución seleccionados para cada partición en los análisis filogenéticos. Se presentan los modelos para cada partición para los genes mitocondriales (12S, 16S, CO1 y ND1) y nucleares (RAG-1, POMC y BDNF).

Gen Posición en el codón Modelo de Evolución Frecuencia A C G T

12S GTR+I+G 0,3207 0,2634 0,1965 0,2194 16S TIM2ef+G 0,3657 0,2011 0,1457 0,2875 COI 1 TIM2+G 0,2764 0,2500 0,3024 0,1712

2 F81 0,1410 0,2876 0,1557 0,4157 3 GTR+I+G 0,2684 0,3257 0,1097 0,2963

ND1 1 SYM+G 0,1706 0,2984 0,1068 0,4242 2 TPM2uf+I+G 0,1685 0,2998 0,1065 0,4253 3 TrN+I+G 0,3714 0,2955 0,0632 0,2700

RAG-1 1 JC 0,3332 0,1996 0,2592 0,2080 2 HKY 0,3720 0,1996 0,1688 0,2597 3 TrNef 0,2510 0,2905 0,2519 0,2067

POMC 1 F81 0,3710 0,1848 0,2805 0,1638 2 HKY 0,4100 0,1917 0,2067 0,1916 3 HKY+I 0,2778 0,3401 0,1986 0,1836

BDNF TPM3uf+I 0,3006 0,2128 0,2640 0,2226

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Anexo 6. Filograma consenso resultante del análisis bajo el criterio de inferencia bayesiana de los genes combinados POMC, RAG-1 y BDNF que representa las relaciones dentro del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Se muestra el número de museo de cada individuo y su localidad. Los valores de bootstrap y las probabilidades posteriores aparecen en las ramas; los valores faltantes indican valores por debajo de 50 (bootstrap) o 0,5 (probabilidades posteriores). No se muestra el grupo externo. Los colores representan a los clados identificados en la filogenia del ADN mitocondrial (ver Figura 3).

Anexo 7. Resultados de los análisis de la prueba de t con la variable longitud rostro cloacal (LRC) entre clados (machos) pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum.

LRC Clado A (n = 19)

Clado B (n = 43)

Clado C (n = 76)

Clado D (n = 7)

Clado E (n = 24)

Clado F (n = 9)

Clado G (n = 29)

Clado B (n = 43)

P = <0,001 t = 4,27 –

Clado C (n = 76)

P = <0,001 t = 9,65

P = <0,001 t =10,27 –

Clado D (n = 7)

P = 0,103 t = 1,69

P = 0,29 t = -1, 60

P = <0,001 t = -4,80 –

Clado E (n = 24)

P = <0,001 t = 4,60

P = 0,5 t = 0,67

P = <0,001 t = -8,80

P = 0,17 t = 1,48 –

Clado F (n = 9)

P = 0,28 t = 1,08

P = 0,06 t = -1,92

P = <0,001 t = -5,92

P = 0,59 t = -0,54

P = 0,02 t = -2,38 –

Clado G (n = 29)

P = 0,17 t = 1,39

P = 0,03 t = -2,20

P = <0,001 t = -8,44

P = 0,69 t = -0,40

P = 0,02 t = -2,40

P = 0,90 t = 0,12 –

Clado H (n = 44)

P = 0,002 t = 3,32

P = 0,74 t = 0,32

P = <0,001 t = -6,43

P = 0,26 t = 1,14

P = 0,88 t = -0,15

P = 0,10 t = 1,70

P = 0,07 t = 1,80

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Anexo 8. Análisis de Componentes Principales (ACP) que indica el porcentaje aportado por cada variable acústica al PC1, PC2 y PC3 en individuos pertenecientes al complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum.

Variables Componentes 1 2 3

Duración del canto 0,630 0,578 -0,388 Número de notas por canto 0,890 -0,134 -0,215 Tiempo de subida del canto 0,429 0,489 -0,618 Número de pulsos por canto 0,462 0,640 -0,008 Nota A (duración) -0,739 0,560 0,220 Nota A (número de pulsos) -0,627 0,595 0,391 Nota B (duración) 0,841 -0,265 0,205 Nota B (número de pulsos) 0,938 -0,127 0,218 Distancia entre notas 0,621 0,293 0,563 Promedio frecuencia dominante 0,162 0,491 0,092 Banda de la frecuencia del canto 0,255 0,697 0,086 Distancias entre pulsos -0,720 0,086 -0,484

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Anexo 9. Características de los cantos de anuncio para los clados del complejo de especies Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Se muestra el promedio, la desviación estándar (±), el rango en paréntesis y el número de individuos analizados (n) para cada variable. Ddc = Duración del canto, Npc = Número de notas por canto, Tsc = Tiempo de subida, Npc = Número de pulsos por canto , DdlA = Duración de la nota A, NpA = Número de pulsos de la nota A, DdlB = Duración de la nota B, NpB = Número de pulsos de la nota B, Dtn = Distancia entre notas, Fdc = Promedio de la frecuencia dominante y Bfc = Banda de la frecuencia del canto. Clados Ddc Nnc Tsc Npc DdlA NpA DdlB NpB Dtn Fdc Bfc

Cantos de Anuncio: Tipo de canto 1 Clado A

n = 7 0,19 ± 0,02 (0,16–0,23) 1 0,12 ± 0,08

(0,03–0,29) 17,44 ± 1,23 (15,6–19,0)

0,20 ± 0,02 (0,16–0,23)

17,44 ± 1,23 (15,6–19,0) No aplica No aplica No aplica 2655,37 ± 169,42

(2416,3–2876,1) 487,67 ± 75,06 (353,1–570,6)

Clado B n = 9

0,17 ± 0,02 (0,16–0,22)

2,10 ± 0,16 (2–2,4)

0,08 ± 0,04 (0,05–0,15)

16,49 ± 1,94 (14,4–20,4)

0,10 ± 0,01 (0,08–0,11)

12,19 ± 0,91 (10,8–13,8)

0,027 ± 0,007 (0,01–0,04)

3,85 ± 0,45 (3,60–4,25)

0,046 ± 0,006 (0,03–0,05)

2748,69 ± 162,89 (2453,9–2914,1)

530,32 ±113,70 (301,4–663,2)

Clado C n = 4

0,35 ± 0,05 (0,36–0,39)

4,05 ± 0,33 (3,60–4,33)

0,18 ± 0,01 (0,18–0,19)

30,39 ± 2,75 (26,4–32,6)

0,10 ± 0,01 (0,08–0,12)

13,55 ± 1,18 (12,6–17,0)

0,039 ± 0,004 (0,03–0,04)

5,56 ± 0,47 (5–6)

0,042 ± 0,004 (0,03–0,04)

2992,39 ± 100,80 (2888,3–3128,6)

705,98 ± 112,50 (574,2–843,7)

Clado D n = 4

0,21 ± 0,02 (0,19–0,24)

1,10 ± 0,20 (1–1,4)

0,15 ± 0,01 (0,13–0,16)

18,43 ± 1,21 (17,5–20,2)

0,21 ± 0,02 (0,19–0,24)

18,03 ± 0,45 (17,5–18,6)

0,004 ± 0,008 (0–0,016)

0,40 ± 0,80 (0–1,6)

0,001 ± 0,003 (0–0,006)

2493,64 ± 197,32 (2213,1–2652,9)

483,69 ± 101,13 (335,9–565,2)

Clado F n = 2

0,22 ± 0,02 (0,21–0,24) 2,50 0,09 17,00 0,11 ± 0,01

(0,10–0,12) 12,88 ± 1,59 (11,7–14,0)

0,030 ± 0,002 (0,02–0,03) 3,50 0,047 ± 0,005

(0,04–0,05) 2660,63 ± 48,05 (2626,6–2694,6)

581,39 ± 395,86 (301,4–861,3)

Clado G n = 5

0,28 ± 0,05 (0,25–0,35)

3,28 ± 0,50 (2,8–4)

0,09 ± 0,02 (0,06–0,11)

24,40 ± 2,87 (21,6–27,6)

0,11 ± 0,01 (0,10–0,12)

13,92 ± 0,66 (13,2–14,6)

0,033 ± 0,003 (0,034–0,037)

4,50 ± 0,35 (4,13–4,93)

0,041 ± 0,004 (0,03–0,04)

2570,90 ± 99,68 (2431,8–2703,4)

471,16 ± 145,27 (361,7–684,7)

Clado H n = 11

0,26 ± 0,04 (0,22–0,36)

2,33 ± 0,52 (2–3,5)

0,13 ± 0,03 (0,09–0,17)

20,92 ± 3,39 (17–28,5)

0,15 ± 0,02 (0,12–)0,18

15,72 ± 2,24 (13–20,2)

0,034 ± 0,007 (0,023–0,042)

3,75 ± 0,52 (3–4,5)

0,051 ± 0,007 (0,04–0,06)

2456,43 ± 278,91 (2101–3070,7)

494,00 ± 146,95 (281,2–818,2)

Cantos Territoriales: Tipo de canto 2 Clado A

n = 7 0,14 ± 0,01 (0,12–0,16)

3,03 ± 0,08 (3–3,2)

0,07 ± 0,02 (0,03–0,10)

11,60 ± 1,13 (12–13) No aplica No aplica 0,035 ± 0,006

(0,024–0,042) 3,84 ± 0,40 (3,13–4,33)

0,020 ± 0,011 (0,011–0,045)

2668,76 ± 111,64 (2485,2–2830,3)

423,26 ± 64,73 (335,9–516,8)

Clado B n = 5

0,25 ± 0,05 (0,18–0,34)

3,96 ± 0,64 (3–4,8)

0,15 ± 0,15 (0,04–0,40)

19,96 ± 4,14 (13,8–25) No aplica No aplica 0,033 ± 0,004

(0,027–0,038) 5,01 ± 0,36 (4,6–5,5)

0,036 ± 0,004 (0,029–0,040)

2615,82 ± 196,39 (2326,6–2811,9)

548,96 ± 101,28 (469,4–689,1)

Clado C n = 5

0,59 ± 0,11 (0,48–0,71)

4,11 ± 0,72 (3,5–5)

0,38 ± 0,13 (0,24–0,51)

22,11 ± 5,71 (16–28,4) No aplica No aplica 0,038 ± 0,003

(0,035–0,041) 5,32 ± 0,53 (4,5–5,8)

0,050 ± 0,004 (0,045–0,055)

2832,05 ± 106,24 (2675,2–2924,1)

735,46 ± 120,51 (600–875)

Clado D n = 5

0,16 ± 0,01 (0,14–0,18)

3,48 ± 0,50 (3–4)

0,10 ± 0,01 (0,09–0,12)

14,01 ± 0,74 (12,8–14,8) No aplica No aplica 0,035 ± 0,005

(0,031–0,042) 4,11 ± 0,57 (3,5–4,9)

0,014 ± 0,002 (0,010–0,017)

2387,89 ± 157,40 (2141–2538,7)

301,04 ± 52,11 (215,3–355,3)

Clado G n = 2

0,44 ± 0,10 (0,37–0,52)

6,42 ± 1,53 (7,5–5,3)

0,13 ± 0,04 (0,10–0,16)

29,42 ± 4,36 (26,3–32,5) No aplica No aplica 0,036 ± 0,003

(0,034–0,039) 4,64 ± 0,44 (4,3–4,9) 0,037 2524,94 ± 172,33

(2403–2646,7) 386,72 ± 8,89 (380,4–393)

Clado H n = 5

0,24 ± 0,03 (0,19–0,27)

4,25 ± 0,23 (4–4,5)

0,14 ± 0,02 (0,11–0,16)

19,81 ± 1,66 (17,5–21,4) No aplica No aplica 0,036 ± 0,005

(0,034–0,041) 4,66 ± 0,35 (4,3–5,1)

0,027 ± 0,006 (0,018–0,033)

2411,74 ± 349,62 (2085–2968,3)

427,40 ± 187,34 (281,2–689,1)

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Anexo 10. Resultados de los análisis de la prueba de t comparando dos componentes principales obtenidos del análisis de componentes principales para los cantos de anuncio y territorio de las especies pertenecientes al complejo Dendropsophus leucophyllatus-triangulum. Los valores sobre la diagonal corresponden a la comparación del CP1. Los valores bajo la diagonal corresponden a la comparación del CP2.

Cantos de anuncio CP1

CP2 Clado A Clado B Clado C Clado D Clado F Clado G Clado H

Clado A – P = <0,001 t = -35,61

P = <0,001 t = -19,92

P = 0,52 t = -0,67

P = <0,001 t = -26,94

P = <0,001 t = -16,74

P = <0,001 t = -13,68

Clado B P = <0,001 t = 7,40 – P = 0,002

t =-8,58 P = <0,001 t = 18,02

P = 0,21 t = -1,33

P = 0,01 t = -3,76

P = 0,96 t = -0,04

Clado C P = 0,006 t = -3,55

P = <0,001 t = -8,21 – P = <0,001

t = 15,46 P = 0,003 t = 7,99

P = 0,004 t = 4,11

P = <0,001 t = 7,02

Clado D P = 0,09 t = -1,88

P = <0,001 t = -7,42

P = 0,11 t = 1,84 – P = 0,001

t = -9,61 P = <0,001 t = -11,95

P = <0,001 t = -9,29

Clado F P = 0,03 t = 4,52

P = 0,27 t = 1,16

P = 0,01 t = 4,63

P = 0,03 t = 6,51 – P = 0,12

t = -1,85 P = 0,69 t = 0,40

Clado G P = 0,24 t = 1,22

P = 0,001 t = -4,41

P = 0,01 t = 3,29

P = 0,06 t = 2,17

P = 0,11 t = -2,91 – P = 0,01

t = 2,93

Clado H P = 0,47 t = 0,73

P = <0,001 t = -5,31

P = 0,01 t = 3,03

P = 0,13 t = 1,59

P = 0,08 t = -1,91

P = 0,75 t = -0,32 –

Cantos de territorio

CP1 CP2 Clado A Clado B Clado C Clado D Clado G Clado H

Clado A – P = 0,001 t = -4,82

P = 0,001 t = -7,64

P = 0,20 t = -1,37

P = 0,10 t = -5,60

P = <0,001 t = -6,26

Clado B P = 0,006 t = -4,36 – P = 0,009

t =-3,43 P = 0,008 t = 3,53

P = 0,09 t = -2,03

P = 0,58 t = 0,56

Clado C P = <0,001 t = -9,25

P = 0,001 t = -5,07 – P = 0,001

t = 7,15 P = 0,46 t = 0,80

P = 0,005 t = 4,42

Clado D P = 0,08 t = 1,93

P = 0,001 t = 5,13

P = <0,001 t = 9,62 – P = 0,10

t = -5,20 P = 0,002 t = -4,44

Clado G P = <0,001 t = -6,16

P = 0,47 t = -0,77

P = 0,02 t = 3,03

P = 0,03 t = -5,61 – P = 0,01

t = 3,47

Clado H P = 0,22 t = -1,39

P = 0,19 t = 1,39

P = 0,001 t = 5,45

P = 0,05 t = -2,22

P = 0,19 t = 2,04 –

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Anexo 11. Haplotipos obtenidos de los fragmentos de ADN mitocondrial (12S, 16S, ND1 y CO1) encontrados en cada uno de los sitios de muestreo. Véase el Anexo 3 para las localidades exactas. País Región 12S (n = 73) 16S (n = 96) ND1 (n = 66) CO1 (n = 68) Clado B Brasil Amazonas-Manaus B1 Guyana Francesa Cayenne B1 B3 B1, B2, B3, B4 B1, B4 Guyana Francesa St Laurent Du Maroni B2, B3, B4 B2, B3 B1, B2, B3, B5, B6 B1, B2, B3 Clado C Brasil Amazonas-Tabatinga C3, C4 Brasil Amazonas-Sacado C2 Ecuador Morona Santiago C8 C10 C2 Ecuador Napo C1, C8 C1, C7 C11, C12 C1 Ecuador Orellana C1, C2, C3, C4, C6, C7 C1,C4, C5, C7 C1,C4, C5 C6, C7, C8, C9 C1, C2, C4, C6, C7, C8 Ecuador Pastaza C2, C3 C5, C8 C1, C3 C2, C10 Ecuador Sucumbíos C2, C5 C1 C2 C3, C5 Perú Loreto-Requena C9 C9 C13 C11, C12 Perú Loreto-Mayna C1 C3 C1 Clado H Brasil Acre H1 H1, H2 Brasil Amazonas-Tabatinga H5, H6 Brasil Pará H4 Ecuador Orellana H2, H3, H4 H8, H7, H9 H2, H3, H4, H5, H6, H7 H2, H3 Ecuador Sucumbíos H7 H1 H1 Perú Loreto-Requena H5, H2 H10 H8, H9 H4, H5