Introducción3

1.1. DAÑOS EN EL ADN Y SISTEMAS DE REPARACIÓN

Ya que los procesos implicados en la integración de ADN extraño son básicamente

idénticos a aquellos responsables de la reparación de las roturas de tipo DSB, un mayor

conocimiento del proceso de recombinación desencadenado por la rotura en el ADN sería

la base para mejorar la eficiencia de gene targeting en plantas.

La recombinación homóloga es la principal vía de reparación de roturas en la

doble cadena del ADN en levaduras y procariotas, a diferencia de lo que ocurre en

eucariotas superiores en los que es el mecanismo de NHEJ el que predomina en la

reparación de estas lesiones. Esto tiene un gran impacto en la mejora genética de plantas

cultivadas, ya que el mecanismo predominante para la reparación de DSBs es también el

usado para la integración del ADN foráneo.

1.1.1. ROTURAS DE DOBLE CADENA DEL ADN (DSBs)

El genoma de cualquier organismo está expuesto a una amplia variedad de agentes

causantes de estrés genotóxico, tanto agentes endógenos (intracelulares) como

ambientales. Las consecuencias biológicas que pueden tener estos agentes sobre el

genoma van a depender de la naturaleza química de la alteración y, en último caso, la

toxicidad o mutagénesis del daño va a depender de la eficiencia de los mecanismos

celulares implicados en la detección, el reconocimiento y la eliminación de este daño, y

de su precisión a la hora de reparar las lesiones.

Las roturas en la doble cadena de ADN están entre las formas más citotóxicas de

daño del ADN, y pueden dar lugar a aberraciones cromosómicas e inestabilidad del

genoma. Aunque estas roturas pueden originarse en un genoma por distintas causas como

la radiación ionizante o diferentes agentes químicos, la principal causa de la aparición de

DSBs en una célula suele ser la proliferación de errores durante la replicación del ADN,

ya que este proceso puede convertir una rotura de cadena simple en una DSB. La

reparación errónea o la ausencia de reparación pueden llevar a graves alteraciones en el

Introducción8

genoma, con lo que la adecuada reparación de éstas es fundamental para el

mantenimiento de la integridad del genoma.

1.1.2. MECANISMOS DE REPARACIÓN DE DSBs EN EL ADN

Las roturas de tipo DSB en el ADN pueden ser reparadas fundamentalmente a través de

dos mecanismos: mediante recombinación homóloga (HR), o mediante recombinación

ilegítima (NHEJ).

La reparación mediante recombinación homóloga requiere grandes tramos de

secuencias homólogas, que serán empleados como molde para la reparación del daño. En

el mecanismo de reparación mediante NHEJ se unen los extremos de ADN originados

tras la rotura, los cuales tienen muy poca o ninguna homología, de forma no conservativa,

y en algunos casos perdiendo información genética. Por ello, el mecanismo de NHEJ

debe ser regulado con precisión para mantener la integridad del genoma.

Aunque frecuentemente se refiere a las vías de NHEJ y HR como propensa al

error y libre de errores, respectivamente, esto no deja de ser una simplificación. Las

roturas “limpias” con extremos complementarios pueden ser reparadas mediante NHEJ

perfectamente, de hecho en mamíferos más del 50% de las DSBs producidas por

nucleasas son reparadas mediante NHEJ sin introducir errores en la secuencia. En otros

casos, se emplean microhomologías que suponen pequeñas deleciones o inserciones. En

el caso de reparación mediante HR, si el molde empleado en la reparación es

completamente homólogo, la precisión suele ser del 100%. Sin embargo, con excepción

de las cromátidas hermanas, el resto de moldes no son perfectamente homólogos,

produciéndose en muchos casos procesos de conversión génica (Shrivastav y col., 2008).

1.1.2.1. Recombinación Homóloga

Existen tres modelos de recombinación homóloga, los cuales están basados en gran

medida en los estudios llevados a cabo en levaduras (Bray y West, 2005; Britt y May,

2005; Puchta, 2005).

Introducción3

Modelo DSBR (Double-Strand Break Repair)

Este es el modelo que explica la recombinación meiótica. El proceso se inicia con una

rotura en el ADN de tipo DSB y supone la formación de uniones Holliday como

intermediarios, produciendo cruzamientos entre cromosomas homólogos alineados, más

que entre cromátidas hermanas.

En meiosis, las DSBs en el ADN se producen por la proteína SPO11, y estas

roturas son reparadas únicamente mediante la vía de recombinación homóloga, usando la

secuencia del cromosoma homólogo. SPO11 se une covalentemente a los extremos 5’ del

ADN, de manera que el siguiente paso es la formación de una mella en el ADN próxima

al lugar de la rotura, con la consiguiente liberación de la proteína SPO11 junto con unos

pocos nucleótidos. Para llevar a cabo esta liberación se requiere la acción, entre otras, de

las proteínas MRE11 y RAD50, integrantes del complejo MRN. Tras el corte en el ADN

y la liberación de SPO11, se generan colas de ADN de cadena sencilla de extremo 3’,

proceso que está mediado por una nucleasa aún no identificada, y también se ha

implicado aquí al complejo MRN. Estas colas son cubiertas por la proteína RPA

(Replication Protein A) y por RAD51, la cual forma unos filamentos que promueven la

búsqueda de zonas de homología y la invasión de la hebra (Figura 1.3). Tras la síntesis

del ADN empleando como molde esta región homóloga, la cadena invasora es liberada y

se liga con el otro extremo de la rotura, resultando en la formación de una molécula unida

a través de dos uniones Holliday (Figura 1.4).

Introducción8

Aunque estos intercambios son necesarios para la correcta segregación de los

cromosomas homólogos durante la meiosis, podrían ser peligrosos durante la reparación

de DSB en células somáticas, si se produce entre cromosomas o cromatidios no alineados,

o entre secuencias repetidas dispersas, pudiendo generarse deleciones, duplicaciones o

translocaciones.

Modelo SDSA (Synthesis-Dependent Strand Annealing)

Este modelo de reparación juega un papel importante en la reparación de las roturas de

tipo DSB en células somáticas, pudiendo usar como sustrato para la recombinación una

cromátida hermana, cromosomas homólogos, o una región ectópica de homología en el

genoma.

Figura 1.4 La unión Holliday, se produce cuando dos moléculas duplexas de ADN implicadas en la recombinación se intercambian en una región de homología para dar lugar a una estructura ramificada que tiene cuatro brazos duplexos. Dependiendo de la orientación del corte, las uniones Holliday se pueden resolver por conversión génica, donde las dos moléculas de ADN mantienen sus secuencias flanqueantes, o por sobrecruzamiento, donde estas secuencias se intercambian.

Figura 1.3 Esquema del modelo DSBR que explica el mecanismo de recombinación en meiosis.

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Igual que en el modelo anterior, la reparación es iniciada por una digestión del

extremo 5’ formando una larga cola de ADN de cadena sencilla 3’, que invade un dúplex

homólogo y ceba la síntesis de ADN (Figura 1.5A). En contraste con el modelo DSBR, el

ADN sintetizado de nuevo se re-alinea con la otra parte de la rotura, reparando la rotura y

reduciendo la probabilidad de formación de uniones Holliday y de sobrecruzamientos, los

cuales podrían ser altamente mutagenéticos si esta reparación ocurre entre regiones

ectópicas con menor homología. No obstante, la formación de uniones Holliday puede

ocurrir durante la reparación SDSA, y los sobrecruzamientos podrían no ser mutagénicos

si se restringen a cromátidas hermanas.

Figura 1.5 Vías de reparación de DSBs en células somáticas. La HR es iniciada por una digestión del extremo 5’, formando largas colas 3’ las cuales son cubiertas por la proteína RPA. (A) En el modelo de SDSA la formación de filamentos de RAD51 promueve la búsqueda de homología y la invasión de la hebra, pudiendo formarse uniones Holliday. (B) En el modelo SSA se toma como molde para la reparación repeticiones homólogas próximas al lugar de la rotura, con pérdida de la información situada entre estas repeticiones.

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Ambos mecanismos de recombinación homóloga, SDSA y DSBR, pueden operar

en células somáticas y meióticas, aunque la frecuencia relativa será diferente en los

distintos tipos celulares, predominando la vía de DSBR en células meióticas, mientras que

en células somáticas opera en mayor medida como mecanismo de reparación la vía SDSA

(Bray y West, 2005).

Modelo SSA (Single-Strand Annealing)

Este tercer mecanismo de recombinación homóloga funciona cuando se producen roturas

de tipo DSB en regiones con secuencias repetidas. Igual que en los modelos anteriores,

una exonucleasa con actividad 5’→ 3’ actúa formando colas simplexas 3’, que en este

caso se alinean con las regiones homólogas proporcionadas por las secuencias repetidas.

El modelo SSA describe una reacción no conservativa, ya que da lugar a la pérdida de la

información situada entre las repeticiones alineadas una vez que se repara la rotura

(Figura 1.5B).

Hay evidencias de que estas tres vías de recombinación homóloga están actuando

en plantas, y el convencimiento creciente de que gran parte de la maquinaria molecular es

común entre los diferentes mecanismos de recombinación homóloga (Puchta, 2005;

Schuermann y col., 2005). Las frecuencias de recombinación van a variar enormemente,

dependiendo del origen de las secuencias receptoras y donadoras. En células somáticas de

plantas, la reparación de DSBs en el ADN mediada por recombinación homóloga ocurre

rara vez, aproximadamente en uno de cada 100.000 acontecimientos de reparación. Las

frecuencias son similares, entre 10-5 y 10-7, en la reparación de DSBs cuando se utilizan

secuencias ectópicas homólogas. Esto indica que, al menos en células en fase G 1 del ciclo

celular, la recombinación homóloga juega un papel muy minoritario en la reparación de

estas roturas en plantas (Puchta, 1999). En cualquier caso, en situaciones donde se

encuentran secuencias homólogas disponibles próximas al lugar de rotura, como por

ejemplo si la rotura ocurre entre repeticiones en tándem, hasta una tercera parte de estas

roturas son reparadas vía SSA, y aproximadamente un 7% por SDSA (Orel y col., 2003;

Siebert y Puchta, 2002).