RESISTENCIA DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE PAPAYA AL VIRUS DE LA MANCHA ANULAR DE LA PAPAYAUNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLASESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

Andrea CevallosDarío Trujillo

Virus de la mancha anular de la papaya: PRSV

Introducción PRSV en todos los

países productores

Manejo: control vectores y malezas, y eliminación de plantas

Transgénicos de papaya en Hawai, Tailandia, Brasil.

Pasos para obtención del transgénico Construcción del plásmido Cultivo de plantas in vitro Transformación de plantas Regeneración de plantas Verificación de introducción del plásmido Evaluación de líneas resistentes

Se pretende obtener un transgénico en base a resistencia por cubierta proteica

No se sabe si la resistencia es por proteínas o RNA

Construcción del plásmido

Origen de replicación

Borde derecho

Gen reportero GUS

Gen de la cubierta proteica del virus

Gen de resistencia a kanamicina

Borde izquierdo

Cultivo de plantas in vitro

Siembra en medio de inducción

Embriones somáticos

Semillas de papaya

Callos embriogénicos

Transformación de plantas

Pasar embriones a medio con kanamicina

+Bombardeo a embriones somáticos

Recubrir a las partículas de tungteno con el vector pSA1006

Después de 14 días pasar a otro medio con kanamicina

Regeneración de plantas

Callos sobrevivientes a kanamicina regenerados

Cortar y transferir a medio de enraizamiento

Sembrar plantas enraizadas en sustrato y aclimatar

Verificación de introducción del plásmido

Análisis fluorimétrico de GUS

Verificación de introducción del plásmido

Análisis PCR Análisis RT- PCR (en tiempo real)

Verificación de introducción del plásmido

DNA

Transferencia Western

Transferencia Southern

Proteínas

Resultados y discusión

8 líneas se regeneraron (G1, G2, T1, T2, T4, T5, T6 y T7)

En el análisis PCR todas las líneas muestran el gen de la cubierta proteica (CP), excepto la línea T1.

La línea G2 muestra una parte del gen CP truncada de 0,8 kb

Análisis PCR

Resultados y discusión

Transferencia Southern

La línea G2 muestra una deleción del gen CP

Solo líneas G1 y T2 tienen una copia simple del gen CP, el resto de líneas tienen reordenamientos.

Transferencia Southern

Resultados y discusión

Transferencia Western: se verifica expresión de proteínas gen CP

Solo líneas G1 y T2 resultaron positivo Estas líneas no son resistentes al PRSV Se descarta que resistencia en este

transgénico esta mediada por las proteínas

Resultados y discusión

Resumen análisis Solo línea G2 muestra resistencia a la inoculación del virus

Plantas de papaya transgénicas y no transgénicas

Gracias por su atención

…PREGUNTAS??