RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE PACIENTES CHAGASICOS …

RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE PACIENTES CHAGASICOS FRENTE A LISADOS COLOMBIANOS DE Trypanosoma cruzi.

CLARA INES ENCISO CAMACHO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar el título de

BACTERIOLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

CARRERA DE BACTERIOLOGIA

Santa Fe de Bogotá, D.C.

RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE PACIENTES CHAGASICOS FRENTE A LISADOS COLOMBIANOS DE Trypanosoma cruzi.

CLARA INES ENCISO CAMACHO

___________________________

Concepción Puerta B., Ph.D

Directora

__________________________

Marleny Montilla., MSc.

Codirectora

______________________ ______________________ Adriana Rodriguez., MSc. Santiago Nicholls.,MD MSc. Jurado Jurado ____________________ ____________________ Aura Rosa Manacero. MSc. Carlos Corredor, PhD. Directora de Carrera Decano académico Bacteriología Facultad de Ciencias

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1.946 “ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”.

DEDICATORIA

A Ti Señor, por iluminarme en este largo camino y la luz que me brindaste para

afianzar mi fe en ti.

A mis queridos padres Vicente y Miriam por la fe y la confianza que siempre

depositaron en mí y la constante ayuda que me brindaron durante toda mi carrera.

A mi hermano Luis Carlos por ser el punto de apoyo en mi vida.

A mis tías Isabel y Gilma por estar siempre a mi lado brindándome su apoyo

incondicional y la fortaleza necesaria para seguir siempre adelante.

Clarita

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Concepción Puerta Bula por ser mi guía a lo largo de este trabajo. A la Dra. Marleny Montilla por ser mi punto de apoyo, mi amiga y mi consejera durante esta investigación. A la Dra. Adriana Rodríguez por la orientación y la colaboración que me brindo en desarrollo de este trabajo. A la Dra. Marcela Mercado por la ayuda que me proporciono durante el desarrollo de mi trabajo de grado. Al Dr. Hugo Diez por haber creído en mi y ser una ayuda incondicional durante este trabajo. Al Dr. José Joaquín Cantor de la Cruz Roja Colombiana por su colaboración en este trabajo de investigación.

TABLA DE CONTENIDO

Pág 1. INTRODUCCION 1 2. MARCO TEORICO 4 2.1 Trypanosoma cruzi 4 2.1.1 Taxonomía 4 2.1.2 Morfología de T. cruzi 5 2.1.3 Ciclo de Vida de T.cruzi 7 2.2 Enfermedad de Chagas 10 2.2.1 Transmisión 12 2.2.2 Ciclo de transmisión 14 2.2.3 Reservorios 15 2.2.4 Diagnóstico 16 2.2.4.1 Métodos parasitológicos directos 16 2.2.4.2 Métodos parasitológicos indirectos 17 2.2.4.3 Procedimientos serológicos 18 2.2.5 Perfil de la respuesta inmune 22 3. JUSTIFICACION 29 4. OBJETIVOS 32 5. MATERIALES Y METODOS 33 5.1 Pacientes 33

5.1.1 Procedimientos para garantizar aspectos éticos de los

pacientes involucrados en el estudio 34

5.2 PARÁSITOS 34 5.2.1 Lisados de T. cruzi 35 5.2.2 PAGE SDS 36 5.3 Prueba de ELISA 36 5.4 Análisis de resultados 38 6. RESULTADOS Y DISCUSION 39 6.1 Análisis de los lisados del parásito 39 6.1.1 Análisis PAGE-SDS 41 6.2 Análisis de la población de estudio 46 6.2.1 Donantes positivos 46 6.2.2 Pacientes crónicos 49 6.2.3 Donantes negativos 51 6.3 Estandarización de la prueba de ELISA 53 6.4 Determinación de la reactividad de pacientes chagásicos

frente a un “Pool” de lisados de las tres cepas colombianas de Trypanosoma cruzi 54

6.4.1 Reactividad de los donantes positivos 58 6.4.2 Reactividad de los donantes crónicos 60 6.4.3 Reactividad de los donantes negativos 61 6.4.4 Comparación de la reactividad frente a lisados de cepas

colombianas de Trypanosoma cruzi entre los diferentes grupos de estudio 65

6.4.5 Comparación de las pruebas de CHAGATEK, IFI y ELISA 71

6.4.5.1 Determinación de la sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA usando cepas colombianas 71 6.4.5.2 Correlación de las pruebas ELISA, CHAGATEK e IFI 74 7. CONCLUSIONES 78 8. RECOMENDACIONES 80 9. ANEXOS 81 10. BIBLIOGRAFÍA 90

1. INTRODUCCION

Los protozoos parásitos pertenecientes a la familia Tripanosomatidae son

responsables de un grupo de enfermedades que afectan al hombre y a varias

especies animales salvajes y domésticas. Dentro de esta familia se

encuentra el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de

Chagas. (Tanowltz y col., 1992)

La enfermedad de Chagas, involucra tres fases distintas: (i) una fase aguda,

que ocasiona la muerte en aproximadamente el 10% de los casos, en su

mayoría niños, (ii) una fase indeterminada o crónica asintomática, la cual

compromete cerca del 40% de los casos serológicamente positivos, y (iii) una

fase crónica, la cual se caracteriza por la existencia de cardiomagelia o

megasindromes intestinales (WHO., 1991; Tanowltz y col.,1992)

Desafortunadamente, la mayoría de las infecciones por T. cruzi son

detectadas en la fase crónica de la enfermedad, fase en la cual el

tratamiento directo contra el parásito es muy controvertido y por lo general,

se limita a un tratamiento de tipo sintomático.

Por el contrario, para los pacientes que se encuentran en la fase aguda de

la enfermedad, se recomienda el tratamiento específico contra el parásito con

drogas derivadas de los nitrofuranos, las cuales tienen el inconveniente de

ser tóxicas y producir efectos secundarios severos (WHO., 1991;Galvao y

col., 1993).

Por su parte los pacientes infectados asintomáticos, revisten un gran

problema no solo a nivel de banco de sangre, sino a nivel clínico ya que se

desconoce el momento en el cual el paciente inicia la fase crónica y por lo

tanto debe empezar a ser revisado y tratado médicamente.

Dado que algunos estudios evidencian la existencia de antígenos del

parásito, diferencialmente expresados y/o reconocidos en cada una de las

fases de la enfermedad (Frash y col., 1989; Brodskyn y col., 1996); en el

presente trabajo se pretendió comparar mediante ensayos

immunoenzimáticos (ELISA) la reactividad frente a lisados de cepas

colombianas del parásito entre pacientes chagásicos asintomáticos y

sintomáticos; como un primer paso hacía la búsqueda de moléculas que

puedan constituir marcadores potenciales de la enfermedad.

2. MARCO TEORICO

2.1. Trypanosoma cruzi

Se considera que la especie T.cruzi es un conjunto de poblaciones de

parásitos que circulan entre reservorios animales, humanos y vectores

intradomiciliarios y silvestres. Ampliamente definidos, los microorganismos

que pertenecen a este género son protozoarios flagelados de la familia

Trypanosomatidae que pasan a través de diferentes estadios morfológicos

(amastigota, epimastigota y tripomastigota) en sus huéspedes vertebrados e

invertebrados. (Kirchhoff y col., 1992)

2.1.1 Taxonomía

El agente causal de la enfermedad de Chagas es el T.cruzi cuya ubicación

sistémica es la siguiente: ( Levine y col.,1980)

Reino: Protista.

Phylum: Sacaromastigophora.

Sub-phylum: Mastigophora.

Clase: Zoomastigophora.

Orden: Kinetoplastida.

Suborden: Trypanosomatina.

Familia: Trypanosomatidae.

Género: Trypanosoma.

Subgénero: Schizotrypanum.

Especie: cruzi.

2.1.2 Morfología del T.cruzi

Los tripanosomas son protozoarios que presentan tres estadios morfológicos

principales a través de su Ciclo de Vida: Tripomastigotes, amastigotes y

epimastigotes. Los tripomastigotes son: fusiformes, pequeños, muy móviles

y aplanados lateralmente (Baker., 1982). Su cuerpo largo y sinuoso tiene un

extremo anterior puntiagudo y un extremo posterior romo, este se caracteriza

por tener un flagelo que se origina en el cinetoplasto y corre a lo largo del

cuerpo del parásito, el cual se encuentra envuelto en una membrana

ondulante. (Figura 1). Se extiende más allá del cuerpo en la forma de una

estructura libre como un filamento. La membrana ondulante y la parte libre

del flagelo confieren considerable motilidad al microorganismo. (WHO., 1991;

Kirchhoff y col., 1992)

Figura 1. Coloración de Giemsa de Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi.

El tripomastigote sanguíneo, en el huésped vertebrado, tiene predilección por

los macrófagos, células del sistema retículo endotelial, tejido muscular

cardíaco, muscular estriado, muscular liso y menos frecuente por tejido

nervioso (Brener., 1973). Dentro de estas células el tripomastigote

sanguíneo se transforma en amastigote, el cual se caracteriza por ser

redondeado u oval, multiplicarse por división binaria, medir aproximadamente

de 1.5 a 4 micras de diámetro y no poseer flagelo. Los amastigotes se

aglomeran dentro de las células formando nidos (Figura 2). En el ciclo

celular, el parásito también adopta una forma intermedia de tamaño un poco

menor que el tripomastigote, llamada epimastigote, de aspecto fusiforme, con

cinetoplasto y flagelo anteriores al núcleo. (WHO., 1991)

Figura 2. Coloración de Giemsa de células epiteliales infectadas con amastigotes de

Trypanosoma cruzi

2.1.3 Ciclo de vida del Trypanosoma cruzi

Esta enfermedad es transmitida al hombre a través de las heces de insectos

hematofagos infectados de la familia Reduviidae, subfamilia Triatominae y

géneros Rhodnius, Triatoma y Panstrongylus, conocidos popularmente en

nuestro país como "pitos". (Figura 3) (WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992).

Figura 3. Rhodnius prolixus insecto vector de la enfermedad de Chagas.

Estos vectores colonizan las grietas de las paredes de las viviendas

construidas principalmente con bahareque, y emergen durante la noche para

alimentarse de la sangre de los habitantes de las mismas. Las especies

predominantes de los vectores varían entre los diferentes países, es así

como en Colombia y Venezuela, por ejemplo predomina el Rhodnius prolixus,

mientras que en Brasil, Argentina, Perú Bolivia, Uruguay y Chile, predomina

la especie Triatoma infenstans (Corredor y col., 1990).

Las formas epimastigotas flageladas se multiplican en el tracto digestivo del

intestino, con posterior diferenciación en la forma infectiva, el tripomastigote

metaciclíco, el cual es depositado con las heces en el momento de la

picadura del triatomineo vector. Estas formas metaciclícas, tienen la

capacidad de internarse in vivo en las células del huésped, dentro de las

cuales se diferencian en su estadio no flagelado, el amastigote. Las formas

intracelulares amastigotas, tras varias rondas de replicación se diferencian en

tripomastigotes, los cuales son liberados al torrente sanguíneo por ruptura de

la célula infectada. El ciclo de T. cruzi se completa cuando el insecto vector

ingiere durante su comida las formas tripomastigotas sanguíneas y estas se

diferencian dentro del mismo en epimastigotes. (Figura 4) (WHO., 1991;

Tanowltz y col., 1992)

Figura 4. Ciclo de Vida del Trypanosoma cruzi.

2.2 Enfermedad de Chagas

La infección de T. cruzi en humanos se caracteriza por involucrar tres

fases: aguda, indeterminada o asintomática y crónica.

La enfermedad aguda se caracteriza por malestar general con una variedad

de manifestaciones clínicas. Los síntomas por lo general son moderados y

atípicos, razón por la cual la enfermedad es tan solo reconocida en 1 a 2%

de los pacientes con infección aguda. Aún cuando la fase aguda se puede

desarrollar a cualquier edad, en las áreas endémicas se ha visto que los

niños menores de diez años son los más propensos a padecerla.

Presentándose la sintomatología más severa en niños menores de dos años,

los cuales pueden desarrollar miocarditis o meningoencefalitis fatales.

(WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992). En el sitio de entrada del parásito, se

puede desarrollar una lesión inflamatoria, conocida como chagoma. El

proceso inflamatorio se dispersa regionalmente, ocurriendo también

linfadenopatías a nivel local. Los parásitos se replican asincrónicamente

dentro de las células del sistema reticuloendotelial, destruyéndolas y

reinfectando nuevas células. Posteriormente, los tripanosomas se replican

intracelularmente como amastigotes, para luego diseminarse a través del

torrente sanguíneo, como tripomastigotes principalmente, alcanzándose el

pico de parasitemia alrededor del décimo día después de la infección. Los

síntomas generales del período agudo son: fiebre, hepatoesplenomegalia,

edema generalizado y linfadenopatías. Algunas veces también se presentan

náuseas, vómitos, diarrea, anorexia y exantema generalizado. La muerte

puede sobrevenir o meningoencefalitis, o, la enfermedad puede pasar a

estado crónico (WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992).

Una vez establecida la infección de T. cruzi dura toda la vida del individuo.

Sin embargo, la mayoría de las personas crónicamente infectadas, no

desarrollan síntomas de la enfermedad, encontrándose entonces en la etapa

indeterminada o asintomática (WHO, 1991; Tanowltz y col., 1992). Durante

esta fase, las personas se sienten saludables y muestran tanto

electrocardiogramas como radiografías de pecho normales. Sin embargo, las

pruebas serológicas permanecen positivas y en un 20-60% de los casos se

puede evidenciar el parásito mediante xenodiagnóstico. Adicionalmente, los

pacientes durante esta etapa son ignorantes respecto a la infección que

padecen y constituyen un reservorio importante de la infección,

contribuyendo a mantener ciclo del parásito. (WHO., 1991).

Alrededor de la cuarta década de la vida, del 10-30% de las personas

crónicamente infectadas, comienzan a dar muestras clínicas de la

enfermedad. Este periodo se caracteriza principalmente por las lesiones

cardíacas, con hipertrofias del corazón y arritmias, que terminan en bloques

aurículo-ventriculares y de la rama derecha del haz His, que conducen a una

insuficiencia miocardiaca crónica, la que con frecuencia es causa de la

muerte. Se han descrito los tipos cardiacos, meningoencefálico,

mixedematoso, seudomixedematoso y supracraneal de la enfermedad.

Adicionalmente, dependiendo del tropismo de la cepa, se puede presentar

daño neurológico u otros megasindromes tales como: dilatación del esófago

(Megaesófago) y del colón (Megacolón). Los cuales son debidos al

peristaltismo desordenado que se manifiesta como resultado de la

destrucción de los ganglios autónomos que están dentro de las paredes

viscerales (WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992).

2.2.1 Transmisión

a. Por vectores. Este es el principal mecanismo de transmisión en

condiciones naturales, es transmitido por varias especies de insectos

triatomideos hematofagos o insectos redúvideos de los géneros:

Pastrongylus, Rhodnius y Triatoma; pero los principales transmisores

son: T. infestans, F. Sordida, P. megistus y R. prolixus. Los redúvideos

(chinches hociconas) pueden conservar la infección más de dos años, tal

vez toda sus vida (Brener Z., 1973).

Este parásito pasa del triatomineo a través de las deyecciones que

deposita

en la piel o mucosas durante o después de la picadura del huésped.

(WHO.,

1991)

b. Transfusión sanguínea. Esta forma de transmisión se presenta en

aquellas zonas endémicas, en donde los donadores de sangre tienen

parásitos circulantes. En sangre almacenada a 4º C, los parásitos pierden

su viabilidad después de 3 semanas. Debido a la importancia de este

modo de transmisión en estas zonas, se deben hacer de rutina estudios

serológicos en los bancos de sangre. (WHO., 1991)

c. Transplantes de órganos. Lo mismo que con la transfusión, los

transplantes de órganos de donantes procedentes de zonas endémicas

pueden llevar los parásitos, que al llegar a un huésped inmunosuprimido

diseminan la parasitosis. En estos casos se presentan infecciones agudas

y en algunos se han informado casos fatales. Los pacientes chagásicos

crónicos se agravan con la inmunosupresión. (WHO., 1991; Cortés y

col., 1995).

d. Placentaria. Este modo de transmisión ha sido plenamente demostrado

en algunas zonas endémicas de diferentes países, por lo tanto se deben

estudiar las madres embarazadas y los recién nacidos. La mayoría de las

mujeres que han tenido niños con infección congénita, no presentaron

síntomas de la enfermedad. (WHO., 1991)

e. Accidental. Entre el personal que trabaja en el laboratorio con parásitos

vivos, existe la posibilidad de inoculación accidental. (WHO., 1991).

f. Vía digestiva. La ingestión de carne cruda o sangre de animales

infectados,

permite la entrada del parásito por las mucosas. Esta demostración se

ha

realizado en animales pero no se han documentado casos en el ser

humano.

(WHO., 1991)

2.2.2 Ciclo de transmisión

a. Ciclo doméstico: Responsable de mantener la infección en el humano,

ocurre principalmente en casas de áreas rurales y suburbanas, de

construcciones de paredes de bareque, adobe y techo de paja.

(Shumunis G.A., 1991)

b. Ciclo selvático: Involucran triatomineos selváticos que infectan roedores,

marsupiales y otros animales selváticos. (Shumunis G.A., 1991)

c. Ciclo Peridoméstico: Mamíferos (roedores domésticos, marsupiales,

gatos y perros) y vectores selváticos intervienen en este ciclo, los

mamíferos se desplazan libremente cerca de las casas donde viven los

humanos, donde los vectores son atraídos por la luz de las casas y el

alimento. Este ciclo actúa como eslabón del ciclo doméstico y salvaje.

(Shumunis G.A., 1991)

2.2.3 Reservorios

Los animales reservorios constituyen una gran fuente de infección para los

vectores, por su parasitemia prolongada y el alto número de tripanosomas en

sangre. El perro y en ciertas regiones la zarigüeya y los roedores son

probablemente los huéspedes reservorios más importantes dentro del ciclo

peridomiciliario y destacándose en el ciclo salvaje la zarigüeya (Didelphis).

T.cruzi también ha sido encontrado en monos y murciélagos en Colombia.

(Marinkelle C.J., 1982; Shumunis G.A., 1991).

2.2.4 Diagnóstico

El diagnóstico diferencial de la enfermedad varía de acuerdo a la forma

clínica en que se encuentre el paciente. En la fase aguda puede confundirse

con varias enfermedades infecciosas febriles; sin embargo, la presencia del

chagoma o el signo de Romaña, son características que contribuyen al

diagnóstico. En la forma crónica es más difícil de orientar el diagnóstico.

La sospecha clínica de la enfermedad se debe confirmar por el laboratorio,

los procedimientos disponibles por el laboratorio se dividen en

parasitológicos directos, parasitológicos indirectos y serológicos. (WHO.,

1991; Kirchhoff., 1992)

2.2.4.1 Métodos parasitológicos directos:

Examen en fresco: Tiene por objeto visualizar el tripomastigote en una gota

de sangre entre lámina y laminilla. La búsqueda se facilita con el

microscopio de contraste de fase. El movimiento de los parásitos ayuda a su

detección. (WHO., 1991; Kirchhoff., 1992)

Extendido coloreado: Los extendidos de sangre o frotis de sangre o

plasma, en lámina o laminillas, se pueden colorear con los derivados de

Romanowsky, especialmente Giemsa, lo cual es importante para la

identificación morfológica.

(WHO, 1991; Kirchhoff, 1992)

Gota gruesa: este método permite estudiar un mayor volumen de sangre y

es más que el extendido cuando la parasitemia es baja. (WHO.,1991;

Kirchhoff., 1992)

Biopsia: Este método se utiliza para comprobar las formas tisulares de T.

cruzi. Se pueden ver en los tejidos los llamados nidos de amastigotes en su

interior. (WHO, 1991; Kirchhoff, 1992)

2.2.4.2 Métodos parasitologicos indirectos

Son el método de elección para establecer que un individuo esta infectado y

tiene un riesgo de desarrollar síntomas asociados con una infección crónica

con T. cruzi. (Kirchhoff., 1992)

Xenodiagnóstico: Esta técnica consiste en permitir que de 10 a 30 insectos

redúvideos criados en el laboratorio y no infectados se alimenten con la

sangre del paciente, en forma directa o a través de una membrana delgada

que cubre un frasco-ampolla que contiene sangre anticoagulada con

heparina sin conservadores. ( Kirchhoff., 1992)

Cultivo: El más utilizado en la actualidad es el medio LIT (Liver-Infusion-

Trytose), debido a que se puede obtener una positividad relativamente alta,

tanto en la fase aguda como en la crónica. Otros medios utilizados son: NNN

(Novy-MacNeal-Nicolle), Noeller, Packchanian, Davis, etc. (WHO., 1991)

2.2.4.3 Procedimientos serológicos

Son el método de elección para establecer la presencia de anticuerpos que

nos indican la existencia, presente o pasada, del parásito en el organismo.

Estas pruebas se utilizan especialmente en las etapas latente y crónica de la

infección, cuando es difícil encontrar los parásitos. Por lo general se utiliza la

prueba de ELISA como un "Screening" y luego una prueba confirmatoria

como la técnica de inmunofluorescencia indirecta, (IFI). (WHO., 1991)

ELISA (Enzime Linked Inmunoabsorbent Assay)

La unión covalente de enzimas a las moléculas de anticuerpos produce una

herramienta inmunológica que posee alta especificidad y alta sensibilidad.

Esta técnica utiliza los anticuerpos a los que se han enlazado

covalentemente las enzimas, de modo que quedan sin alteración las

propiedades catalíticas de la enzima y la especificidad del anticuerpo. Es por

ello que utiliza como antígeno extractos del parásito o sus fracciones,

absorbidas en microplatos. Además conjuga dos marcadores con peroxidasa

o fosfatasa. Es una prueba muy sensible para detectar anticuerpos Ig G o Ig

M. (Hornebeck P., 1991; Controy A., 1991)

La técnica se desarrolla siguiendo estos pasos fundamentales:

1. Sensibilización de los pozos de la microplaca utilizada para desarrollarla

técnica con el antígeno diluido.

2. Lavados para retirar el antígeno que no fue adsorbido en la placa.

3. Incubación con las muestras de sueros a analizar, en donde se espera

que encuentren los anticuerpos específicos para reaccionar con el

antígeno adsorbido formando el complejo Ag-Ac.

4. Lavados para retirar los anticuerpos que no se unieron al antígeno.

5. Incubación con una anti-Inmunoglobulina marcada enzimáticamente

(comúnmente con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), de modo

que el conjugado reacciona con los anticuerpos capturados por el

antígeno adsorbido al pozo de la microplaca.

6. Lavados para remover el exceso de conjugado.

7. Adición del sustrato enzimático y medición de la absorbancia a la longitud

de onda adecuada. De tal forma que la intensidad del color desarrollado

sea proporcional a la concentración de anticuerpos en la muestra.

Como prueba de tan amplia aplicación clínica y tan universalmente empleada

ello ha motivado que cientos de casas comerciales se hayan lanzado a la

producción de los reactivos en estuches que contienen todo lo necesario

para realizar las pruebas con un estricto control de calidad interno

asegurando un grado de confiabilidad. ( Controy., 1991)

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

Es un procedimiento inmunológico que utiliza anticuerpos fluorescentes. Las

moléculas de anticuerpos pueden volverse fluorescentes agregándoles

químicamente un compuesto orgánico fluorescente, como Isotiocianato de

fluoresceína ó Tetrametil rodamina. Esto no modifica la especificidad de los

anticuerpos de manera importante, pero hace posible detectar los

anticuerpos adsorbidos por las células o tejidos mediante el empleo de

microscopio de fluorescencia. (Nicholls y col., 2001)

Se emplean dos procedimientos de tinción diferentes: El Directo y el

Indirecto. En el método indirecto, la presencia de un anticuerpo sobre la

superficie de la célula queda detectado por el empleo de otro anticuerpo

fluorescente dirigido contra el mismo anticuerpo específico. Una de las

ventajas del método de tinción indirecto es que elimina la necesidad de hacer

anticuerpos fluorescentes para cada organismo de interés. (Nicholls y col.,

2001)

2.2.5 Perfil de la respuesta inmune en las diferentes fases de la

enfermedad

La respuesta inmune en la enfermedad de Chagas juega un papel dual: por

una parte confiere resistencia parcial contra la infección y por otra parte está

implicada en la patogenesis de la enfermedad debido a respuestas

autoinmunes desarrolladas en los pacientes crónicos.

Tanto la respuesta humoral como la celular se han visto comprometidas en

la inducción de la respuesta inmune en los estados agudo y crónico de la

enfermedad. Dadas las características propias de cada una de las fases de

la enfermedad de Chagas, es lógico suponer que los determinantes

antigénicos expresados por el parásito y reconocidos por el huésped, en

cada una de las fases de la enfermedad difieran al menos, parcialmente.

Es así como estudios realizados por Frasch y col., 1989, muestran como

diez clones del parásito aislados a partir del "screening" de una librería de

expresión, presentan diferente perfil de reconocimiento por sueros de

pacientes en la fase aguda y crónica de la enfermedad: (i) 26 de los 28

sueros correspondientes a pacientes en la fase aguda de la enfermedad,

reaccionan preferencialmente con el antígeno expresado por el clon 7 y en

menor extensión con los antígenos de los clones 13 (11 sueros positivos)

y 36 (10 sueros positivos). (ii) La mayoría de los 37 sueros de pacientes

en la fase crónica detectan el antígeno 1 (27 sueros positivos) y 2 (25

sueros positivos) y solamente tres de ellos reconocen el antígeno del clon

7. Estos resultados muestran como el clon 7 codifica para una proteína

que es altamente antigénica durante la fase aguda de la enfermedad,

mientras que los clones 1 y 2 codifican para proteínas antigénicas durante

la fase crónica de la enfermedad.

De otra parte, Levin y col., 1989, realizaron el "screening" de una librería

de cDNA del parásito, con el suero de un paciente (JL) con miocarditis

chagásica severa. En dicho "screening" aislaron el clon JL5, el cual

reacciona predominantemente con sueros de pacientes chagásicos

cardíacos y no contra, sueros de individuos infectados sin compromiso a

nivel de corazón.

Por su parte, Cerban y col., 1993, estudiaron la reactividad de los isotipos

de IgG presentes en pacientes infectados con T.cruzi, frente a epimastigotes

y a una fracción citosólica acídica del parásito (F IV). Los pacientes

estudiados eran seropositivos para el parásito y fueron divididos en los

siguientes grupos: I, pacientes con electrocardiogramas normales; grupo II,

pacientes con electrocardiogramas anormales, pero sin cardiomagalia, III,

pacientes con electrocardiogramas anormales y presencia de cardiomegalia.

Se encontró que la IgG 1 era el principal isotipo de anticuerpo encontrado en

todos los grupos de los pacientes. Además, el patrón de reconocimiento

antigénico de la Ig G1 mediante "Wester blot" entre los grupos de pacientes

presentaba diferencias significativas: Los pacientes del grupo I reconocían

los antígenos de 80, 53 y 43 Kd de F IV. Mientras que los sueros del grupo

III reconocían principalmente la banda correspondiente a 43 Kd.

Otro estudio realizado por Guevara y col., 1995, muestra como la proteína

recombinante de 24 Kd de T.cruzi, puede ser empleada para monitorear la

cura de los pacientes chágasicos agudos, en base a la desaparición de la

reactividad contra esta proteína, una vez la etapa aguda ha sido superada.

Es decir la Tc 24 es reconocida solamente por los pacientes agudos.

Umezawa y col., 1996, realizaron ensayos de inmunoblot con el fin de

analizar la reactividad de pacientes chagásicos crónicos, agudos y con

Chagas congénito, frente a los antígenos secretados y excretados del

parásito. Encontrando que los sueros de pacientes con Chagas congénito y

agudo reconocen una escalera de fracciones de 130-200 Kd. Mientras que

los sueros de pacientes crónicos reaccionan frente a una amplia banda de

150 a 160 Kd.

Por su parte, Breniere y col., 1997, estudiaron la respuesta humoral frente

al antígeno SAPA (" Shed acute phase antigen”) en dos grupos de niños de

una región endémica de Bolivia. Es así como los análisis de ELISA

revelaron que en los niños que recién habían adquirido la infección así como

también en los niños con Chagas asintomáticos, se encontraron niveles

elevados de respuesta con alrededor del 80% de los pacientes positivos; en

contra posición a los niveles bajos de reactividad de los pacientes crónicos

enfermos observados en estudios anteriores. (Breniere y col., 1997).

Morgan y col., estudiando el perfil de inmunoglobulinas y sus isotipos

respectivos frente a lisados del parásito mediante ELISA (1996) y "Western

blot" (1998) en pacientes con diferentes manifestaciones clínicas de la

enfermedad de Chagas (manifestaciones cardiacas, manifestaciones

digestivas y asintomáticos), encontraron que: (1) los niveles de isotipos

varían según el estadio de la enfermedad, por ejemplo: los pacientes con

sintomatología a nivel gastrointestinal presentan los niveles más elevados de

Ig A. (2) La unión de ciertos antígenos con algún isotipo es más frecuente en

algunos grupos que en otros. Es así como la Ig G3 de 13 de 19 (68%)

individuos con manifestaciones digestivas se unían a una molécula de 68

Kd, mientras tan solo en 3 de 31 (9%) de los individuos con

manifestaciones cardiacas se presentó este reconocimiento.

Más adelante Zuñiga y col., (1999) estudiaron la respuesta de pacientes

chagásicos agudos y crónicos frente a fracciones alcalinas y ácidicas del

parásito; los cuales estaban compuestos principalmente por la enzima

Glutamato deshidrogenasa (GluDH) y la cisteín proteasa (cruzipain)

respectivamente. Es así como los estudios de ELISA e inmunoblot

mostraron que mientras anticuerpos Ac anti- cruzipain son detectados

durante todas las fases de la infección, los anticuerpos contra GluDH (47 Kd)

solo fueron detectados en pacientes agudos, siendo la Ig M el principal

isotipo producido.

A nivel celular, la respuesta inmune también parece discriminar los

determinantes expresados y/o reconocidos en las diferentes etapas de la

enfermedad. Es así como en un estudio de "T-cell Western blotting"

realizado con extractos de epimastigotes del parásito, se encontró que las

moléculas ubicadas en el rango de 100 a 150 Kd, son preferencialmente

reconocidas por las células mononucleares de sangre periférica de

pacientes asintomáticos (5 de 8) que de pacientes crónicos con

sintomatología cardíaca (1 de 7). Adicionalmente, el análisis por "Western

blotting" de la reactividad de los sueros de ambos grupos de pacientes,

arrojó resultados similares (Gazzinelli y col., 1990).

Así mismo, estudios realizados por Kahn y col., 1993, demuestran como la

respuesta blastogénica de las células mononucleares de sangre periférica

frente a lisados de tripomastigotes del parásito difieren entre pacientes

asintomáticos y sintomáticos. Encontrándose la respuesta celular

significativamente disminuida en los pacientes sintomáticos en comparación

a los asintomáticos.

Brodskyn y col., 1996, estudiando la citotoxicidad en pacientes

asintomáticos con cardiomiopatía encontraron que estos presentan una

respuesta más elevada en comparación a los pacientes en la fase

indeterminada y a los pacientes crónicos con cardiomiopatía.

El perfil de las citokinas en las diferentes fases de la enfermedad de Chagas

también ha sido estudiado. Es así como los estudios de Samudio y col.,

(1998) demuestran como mientras dos niños con Chagas agudo de una

región endémica del Paraguay presentan un perfil Th 1, (INFα , INFγ), 25

niños con Chagas asintomático de la misma región presentan un perfil ThO

(expresión de IFNγ e interleukina 4, IL 4). Posteriormente, Oliveira y col.,

(1999) encontraron que el INFγ estaba significativamente aumentado en

pacientes con manifestaciones cardiacas, (83%) en comparación con

pacientes asintomáticos (59%).

Finalmente, estudios realizados por Zuñiga y col., (2000) muestran como

los linfocitos B de ratones chagásicos que se encuentran en el estado agudo

de la enfermedad, sufren de procesos apoptósicos espontáneos que con

llevan a la inmunosupresión característica de esta fase de la enfermedad.

3. JUSTIFICACION

Dada las alarmantes cifras de 100 millones de personas expuestas a la

enfermedad de Chagas y de 17 millones de personas infectadas con

Trypanosoma cruzi en Latino América (WHO., 1991); Colombia no escapa a

este grave problema de salud pública, presentando según la Organización

Panamericana de la Salud, alrededor de 900.000 personas infectadas, con

un 23% de la población en riesgo de contraer la enfermedad y entre 30 y 40

mil nuevos casos anualmente (Panamerican Health Organization., 1994).

Adicionalmente, estudios de la prevalencia de sangre infectada con T.cruzi

en bancos de sangre en el territorio nacional, revelan como el riesgo de

infectarse con sangre contaminada con dicho parásito es 20 veces más

grande que el riesgo de adquirir HIV y 10 veces más elevado que de

contagiarse con hepatitis B (TDR., 1996)

La infección de T.cruzi en humanos sigue tres fases con manifestaciones

clínicas que varían ampliamente. La fase inicial aguda, con parasitemias

que suben hasta niveles evidentes, dura generalmente 6 u 8 semanas.

Durante este período, la respuesta inmune del huésped generalmente logra

eliminar solamente los parásitos del torrente sanguíneo, de manera que el

paciente pasa a la fase asintomática de la infección con los parásitos

multiplicándose dentro de las células de casi todos los órganos vitales, pero

esencialmente del corazón. La infección crónica dura toda la vida, y

generalmente es asintomática. Pero la destrucción progresiva de los tejidos

puede conducir a lesiones severas, especialmente del corazón, vísceras y

nervios. (WHO., 1991;Tanowltz y col., 1992)

Durante la fase asintomática o indeterminada de la enfermedad, las personas

se sienten saludables y muestran tanto electrocardiogramas como

radiografías de pecho normales. Sin embargo, las pruebas serológicas

permanecen positivas y en un 20-60% de los casos se puede evidenciar el

parásito mediante xenodiagnóstico. Adicionalmente, los pacientes durante

esta etapa son ignorantes respecto a la infección que padecen y constituyen

un reservorio importante de la infección, contribuyendo a mantener el ciclo de

vida del parásito. (WHO., 1991)

Por lo tanto, los pacientes infectados, asintomáticos, revisten un gran

problema no solo a nivel de banco de sangre, como transmisores del Chagas

transfusional, sino a nivel clínico y epidemiológico, ya que se desconoce el

momento en el cual el paciente inicia la fase crónica y por lo tanto debe

empezar a ser revisado y tratado médicamente.

Dado que algunos estudios evidencian la existencia de antígenos del

parásito, diferencialmente expresados y/o reconocidos en cada una de las

fases de la enfermedad (Frash y col., 1989; Brodskyn y col., 1996), en el

presente trabajo comparar mediante ensayos immunoenzimáticos (ELISA)

la reactividad frente a lisados de cepas del parásito entre pacientes

chagásicos asintomáticos y sintomáticos.

4. OBJETIVOS

GENERAL

Comparar mediante ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) la reactividad de

pacientes chagásicos frente a lisados de cepas colombianas de

Trypanosoma cruzi.

ESPECIFICOS

1. Obtención y análisis de lisados de tres cepas colombianas de

Trypanosoma

cruzi.

2. Estandarización de la Prueba de ELISA.

3. Determinar la respuesta humoral de pacientes infectados con

Trypanosoma

cruzi (sintomáticos y asintomáticos) y no infectados frente a lisados

totales

de cepas colombianas del parásito mediante ensayo de ELISA.

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Pacientes:

Se trabajó con el suero de 59 individuos agrupados en primera instancia de

la siguiente manera: (I) 14 donantes de la Cruz Roja Colombiana, positivos

para la infección por Trypanosoma cruzi por las pruebas de CHAGATEK

(ELISA Organon) e IFI (Laboratorio Centro de Investigaciones en

Microbiología y Parasitología Tropical (CIMPAT), U. Andes), (II) 18 pacientes

de la Clínica Shaio Bogotá (Colombia) con sintomatología compatible de

Miocarditis chagásica y positivos a la infección por Trypanosoma cruzi por

las pruebas de EIA (ELISA Abbot) e IFI (CIMPAT-U. Andes) y (III) 27

donantes saludables de la Cruz Roja Colombiana, catalogados como

negativos en dicha institución para la infección por Trypanosoma cruzi,

debido a que presentaron uno de los siguientes perfiles: (a) Prueba

CHAGATEK negativa, ó (b) prueba CHAGATEK positiva e IFI negativa.

Adicionalmente, se recolectaron 20 muestras de sangre provenientes de

personas sanas de alrededor de 20 años de edad, las cuales no han vivido

en zonas endémicas. A partir de dichas muestras se obtuvo el punto de

corte de las pruebas de ELISA.

5.1.1 Procedimientos para garantizar aspectos éticos de los pacientes

involucrados en el estudio

Este proyecto se rigió de acuerdo a las normas técnicas, científicas y

administrativas para la investigación en salud, del Ministerio de Salud de

Colombia resolución número 008430 del 4 de octubre de 1993. El estudio

protegió en todo momento la privacidad e intimidad del individuo

identificándolo con un número interno. Adicionalmente se anexa el formato

de aceptación de participación en el estudio. (Anexo 1)

5.2 Parásitos

Se trabajó con 3 cepas de T.cruzi aisladas de R. prolixus, D. marsupialis y

humano, representando ambos ciclos de transmisión: doméstico y silvestre,

(Tabla 1) procedentes de distintas regiones geográficas del país.

Tabla 1. Características de las cepas de Trypanosoma cruzi.

CEPA CODIGO HUÉSPED PROCEDENCIA CICLO DE

TRANSMISION

Munantá IRHO/CO/98

R. prolixus Boyacá Domiciliaria

S. P. R MHOM/CO/87 Humano Casanare Domiciliaria

MDID

MDID/CO/87/

No.3

Didelphis

marsupialis

N. Santander Silvestre

Los parásitos se cultivaron en medio REI modificado (Anexo 2),

suplementado con 2% SFB (suero fetal bovino) y gentamicina 100 µg/ml a

24º C. (Duque y col., 1993).

5.2.1 Lisados de T.cruzi

Los parásitos fueron recolectados por centrifugación a 900 g a 4º C y lavados

con PBS. Posteriormente, éstos fueron contados en cámara de Neubauer y

resuspendidos en solución de lisis (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Bisulfito de

sodio 380 ng/mL, NP40 1%, SDS 1%, PMSF 1 mM, aprontinina 0.5 mg/mL) a

una concentración de 5 x 105 parásitos/µL. (Santana y col., 1998)

Una vez resuspendidos, los parásitos se sometieron a diez ciclos de

congelación y descongelación en nitrógeno líquido y baño serológico a 37ºC,

respectivamente. Pasado este proceso, se centrifugaron a 7.000 g y a 4ºC,

se extrajo la fracción proteica de cada lisado y se hicieron alícuotas que se

almacenaron a -70º C. Posteriormente, la concentración de proteínas fue

medida según el método de Bradford. (Bradford, MM., 1976). (Anexo3)

5.2.2 PAGE- SDS

La fracción proteica de los lisados fue separada electroforéticamente en un

gel de poliacridamida - sodio dodecil sulfato (PAGE-SDS) al 10% (Anexo 4),

utilizando una concentración de 200-300 µg lisado/ pozo de corrido.

(Sambroock y col., 1989). Las bandas resultantes fueron visualizadas

mediante la tinción con Azul de Coomasie. (Sambroock y col., 1989).

(Anexo 5).

5.3 Prueba de ELISA

Placas de 96 pozos de poliestireno (Nuclon TM surface, Nalge Nunc,

International) fueron cubiertas con 100 µl del antígeno (pool de lisados de las

3 cepas del parásito) en buffer bicarbonato de sodio 0.05 M pH 9.6, a una

concentración final de 10 µg/pozo. Los microplatos luego de ser incubados

a 37 º C durante 3 h y a 4 º C durante toda la noche, fueron lavados con

TBS-T (TBS-Tween 20 0.1%, v/v). A continuación, los sitios de unión del

pozo no saturados fueron bloqueados con TBS-T y leche descremada al 5%

(w/v) durante 1h a 37º C. Después de lavar los microplatos tres veces con

TBS-T se adicionaron las muestras de suero diluidas en solución de

bloqueo. Cada una de las muestras fueron analizadas por triplicado.

Posteriormente las placas fueron incubadas 1h a 37 º C y lavadas cuatro

veces con TBS-T. 100 µl del conjugado anti Ig G humana acoplado a

fosfatasa alcalina (Sigma) diluido en solución de bloqueo, fueron

adicionados a cada pozo, seguido de la incubación de las placas a 37 º C por

1h. Después de lavar tres veces con TBS-T, se adicionaron 100µl del

sustrato (p-nitrofenilfosfato, Sigma). Pasados 30 min., se detuvo la reacción

con NaOH 1N, determinándose la densidad óptica a 405 nm, en un lector de

ELISA automático (Labsystems multiskan MCC/340). En cada microplato se

montaron un control positivo alto, un control positivo bajo (cercano al punto

de corte) y un control negativo. Adicionalmente, los niveles de "backgrouwnd"

de la absorbancia con TBS-T fueron sustraídos de cada una de las muestras

de suero. Las diluciones optimas de las muestras de suero y conjugado, así

como la concentración del antígeno/pozo, fueron establecidas mediante

estandarización de la prueba, de manera que las mismas permitirán la

máxima diferenciación entre sueros positivos y negativos. El punto de corte

de la prueba se estableció como la media del valor de los sueros controles

normales (20 sueros de personas sanas no infectadas), más o menos 2

desviaciones estándar. La positividad o negatividad de las muestras frente a

cada antígeno fue determinada aplicando la siguiente formula:

Indice de Reactividad = Absorbancia de la muestra/ Absorbancia del control

positivo bajo

Si la absorbancia de la muestra fue mayor de 1.1, la muestra se consideró

positiva, y menor de 0.90 negativa. Las muestras ubicadas entre 0.90 y 1.1

se sitúan en la zona gris de la prueba, considerándose dudosas.

5.4 Análisis de resultados

La diferenciación de la respuesta inmune frente a antígenos totales del

parásito entre los tres grupos de estudio se estableció mediante pruebas de

hipótesis estadística.

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Análisis de los lisados del parásito

Se trabajó con tres cepas colombianas de Trypanosoma cruzi aisladas de

diferentes regiones geográficas del país y diferentes huéspedes. (Tabla 1).

Una vez obtenido el cultivo en masa de cada una de las cepas, estas fueron

lisadas según lo descrito en materiales y métodos (No. 5.2.1) y cada uno de

los lisados obtenidos fueron analizados mediante determinación de la

concentración de proteínas y análisis de las fracciones proteícas mediante

“PAGE-SDS” al 10%.

La concentración de proteínas fue determinada según el método de Bradford,

utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como patrón. Tal como se

esperaba, la concentración total de proteínas fue bastante similar en los tres

lisados. (Figura 5,Tabla 2).

Figura 5. Curva de Calibración de la concentración proteíca, según el método de Bradford.

0,492

0,504

0,558

0,48

0,49

0,5

0,51

0,52

0,53

0,54

0,55

0,56

0,57

0,61 0,62 0,63 0,64 0,65 0,66 0,67 0,68 0,69 0,7 0,71

Concentraciónde BSA( mg/ml)

Ab

sorb

anci

as (

540

nm

)

Munanta 12,4mg/ml

S.P.R 12,6 mg/ml.

MDID 14 mg/ml

Tabla 2. Concentración de proteínas de los lisados. Cepa Dilución del lisado Absorbancia

D.O (540 nm) Concentración

Munantá 1/20 0.492 12.4 mg/ml S.P.R 1/20 0.504 12.6 mg/ml MDID 1/20 0.558 14 mg/ml

6.1.1 Análisis PAGE-SDS

15 -25 µL de cada uno de los lisados fue analizado mediante PAGE-SDS al

10% según lo descrito en el Anexo 4. Tal como se muestra en la Figura 6, se

obtuvieron alrededor de 20 fracciones proteicas bien definidas situadas en un

rango de 26 a 138 Kd, en cada uno de los lisados, destacándose una banda

de alrededor de 57-58 Kd. Probablemente, esta banda coincida con la

cisteinil proteinasa, proteína abundante en la forma epismastigote del

parásito con un alto grado de inmunogenicidad. (Martínez y col., 1991).

Figura 6. PAGE-SDS al 10% de los lisados de Trypanosoma cruzi, teñidos con Azul de Coomasie. 1: 10µl del patrón (HWN Pharmacia Biotech), 2:15µl de la cepa S.P.R, 4: 25µl de la cepa de Munantá, 5: 25µl de la cepa MDID y 6: 75µl del “Pool” de las tres cepas (25µl de cada una).

Un análisis detallado de cada una de las fracciones obtenidas revela como

los lisados difieren en el número de fracciones proteicas que contienen. Es

así como en la Figura 7 se muestra un gráfico que resume el perfil proteico

de cada lisado; observándose como si bien existen fracciones compartidas

por los tres lisados (1, 3, 8, 11,12 y 13), existen otras presentes solo en

dos (2, 4, 6, 9, 10, 16, 17 y 19) o incluso solo en uno de los lisados, (5, 7, 14,

15, 18 y 20).

Figura 7. Perfil de las fracciones proteícas de los lisados de las cepas de Trypanosoma cruzi.

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

160.000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fracciones Proteicas

Pe

sos

Mo

lecu

lare

s

S.P.R

MUNANTA

MDID

Un análisis porcentual de este perfil (Tabla 3) revela como por ejemplo para la cepa Munantá, el 46% de sus fracciones proteícas son comunes a las tres cepas y el 54% restantes están presentes en una cualquiera de las otras dos cepas de estudio. Para el caso de la cepa MDID, vemos como un 13.6% de las fracciones proteícas son exclusivas de esta cepa, un 46.3% son compartidas con una de las dos cepas restantes y el 40% son comunes a las tres cepas. Por su parte, la cepa S.P.R presenta el porcentaje más alto de fracciones proteícas exclusivas (33.3%) y el más bajo de fracciones compartidas con Munantá o MDID (16.6%). Tabla 3. Porcentaje de bandas comunes entre los diferentes lisados de Trypanosoma

cruzi.

CEPA (%) Compartido por

tres Cepas

(%) Compartido por

dos Cepas

(%) Correspondiente

a una Cepa

Munantá 46 54 0

MDID 40 46.3 13.6

S.P.R 50 16.6 33.3

POOL DE LAS TRES

CEPAS

30 40 30

Ahora bien, si se analiza el porcentaje de bandas comunes presentes en la

reunión de los tres lisados (“Pool”), se observa como este porcentaje cambia

a un 30% de fracciones comunes a los tres lisados, 40% comunes a

cualquiera de dos cepas y 30% específico de una cepa dada. Estos

resultados claramente indican las ventajas de utilizar más de una cepa en la

preparación de los lisados, ya que se aumenta el número de bandas

potenciales a ser reconocidas por los sueros de los pacientes.

La variación observada en las fracciones proteicas entre diferentes cepas del

parásito se explican por la naturaleza polimórfica del Trypanosoma cruzi, el

cual varía biológica, bioquímica y genéticamente entre poblaciones de

diferentes regiones geográficas. (De Lucardo y col., 1993). Recordemos

cómo en este estudio, se utilizaron cepas colombianas de distintas áreas

geográficas, huésped y ciclo de transmisión (Tabla 1).

Estudios recientes de Souto y col., 1996; Bastrenta y col., 1999 y Dos

Santos y col., 1999 indican como las poblaciones de Trypanosoma cruzi se

dividen principalmente en dos subpoblaciones: Grupo 1, correspondientes al

Zimodema ZI y Grupo 2, correspondiente al Zimodema Z2. Aún cuando las

cepas tres colombianas del Trypanosoma cruzi utilizadas en este estudio

pertenecen al Grupo 1 o Zimodema ZI, estas presentan patrones polimorfos

para algunas isoenzimas. Concretamente para las isoenzimas peptidasas I y

II (PEP I y PEP II), Glutamato deshidrogenasa (GdNad), fosfoglucomutasa

(PGM) y Glucosa fosfato isomerasa (GPI). (Tabla 4). (Rodríguez P y col.,

1998). Es decir, a pesar de pertenecer a un mismo grupo, estas cepas

difieren bioquímica y genéticamente.

Tabla 4. Análisis de los genotipos de cepas colombianas identificadas por 5

sistemas isoenzimáticos.

CEPA PEP I PEP II GDNad PGM

GPI Munantá 4/4 1/1 Ausente Ausente 4/4

MDID 2/2 Ausente 4/4 5/8 7/7

S.P.R 4/4 Ausente 2/2 5/8 7/7

• Para cada locus, el alelo 1 codifica para el electrofenotipo más rápido.

Adicionalmente, análisis del polimorfismo genético entre estas cepas usando

como marcador el gen que codifica para la histona H2A, también muestra

como dos de estas cepas difieren en su patrón de digestión con

endonucleasas, número de unidades de repetición, cromosoma portador y

niveles de expresión (Thomas M y col., 2000).

6.2 Análisis de la población de estudio

El suero de los individuos incluidos en este estudio fueron analizados

siguiendo los procedimientos éticos establecidos en materiales y métodos.

Los individuos fueron clasificados en tres grupos dependiendo de la

presencia de la infección por Trypanosoma cruzi y de la presentación de

síntomas de la enfermedad. Cada uno de los grupos fue analizado según

sexo, edad y la procedencia geográfica.

6.2.1 Donantes positivos

Este grupo se encuentra constituido por individuos infectados que no

presentan ninguna sintomatología asociada a la enfermedad de Chagas,

personas que acudieron a la Cruz Roja Colombiana, con el propósito de

donar sangre. Estas personas presentan positividad tanto en la prueba de

ELISA como de IFI. Tal como se muestra en la Figura 8 este grupo esta

conformado por un 36% de mujeres y 64% de hombres, con un rango de

edad de menores de 30 años a 60 años, procedentes la mayoría de la ciudad

de Bogotá (79%) y una minoría (7%) de áreas rurales de Cundinamarca.

Este perfil concuerda con los pacientes seropositivos encontrados en un

estudio a nivel nacional, en el cual el rango de edad de estos individuos

comprende de 21 a 52 años con una edad promedio de 33 años. (Cortés y

col., 1995).

Adicionalmente, un estudio realizado por Ja uregui (2000), con donantes de

la Clínica San Pedro Claver de la ciudad de Bogotá, incluye 35 donantes

seropositivos procedentes de Bogotá. Es decir, el criterio de exclusión de

donantes de procedencia de zonas endémicas para la enfermedad de

Chagas, no es suficiente, puesto que residentes bogotanos pueden adquirir

también el parásito durante viajes a zonas endémicas. Situación que las

personas pueden no referenciar durante su historial clínico.

A.

Sexo femenino36%

Sexo masculino64%

Sexo femenino

Sexo masculino

B.

Menores de 3014%

Edad entre 40-5021%

Edad entre 50-6029%

Edad entre 30-4036%

Menores de 30

Edad entre 30-40

Edad entre 40-50

Edad entre 50-60

Figura 8. Características de los donantes positivos de estudio. A: clasificación

según género. B: clasificación según edad. C: clasificación según lugar de

procedencia.

6.2.2 Pacientes crónicos

Corresponde a los individuos con sintomatología compatible con miocarditis

chagásica y ambas pruebas serológicas positivas para Trypanosoma cruzi,

estudiados en la Clínica Shaio de Bogotá. Como se observa en la Figura 9 el

50% de estos pacientes pertenecen al sexo masculino y el 50% al sexo

femenino; abarcando rangos de edades de 35 hasta 85 años, siendo

predominante en un 50% el rango de 55-65 años. Llamativamente, la

totalidad de este grupo incluye personas procedentes de áreas rurales de

departamentos considerados zonas endémicas para Chagas.

C.

Cundinamarca7%

Indeterminados14%

Bogotá79%

Bogotá

Cundinamarca

Indeterminados

Figura 9. Características de los pacientes crónicos. A: clasificación según el género. B:

clasificación según la edad. C: clasificación según la procedencia. 6.2.3 Donantes negativos

Conformado por individuos sanos voluntarios que acudieron a la Cruz Roja

para donar sangre. En este grupo se incluyen dos tipos de donantes: 9

A.

Sexo masculino %

50%

Sexo femenino %50%

Sexo femenino %

Sexo masculino %

B. Edad entre 75-85

5%

Edad entre 55-6550%

Edad entre 65-7511%

Edad entre 45-5517%

Edad entre 35-4517%

Edad entre 35-45

Edad entre 45-55

Edad entre 55-65

Edad entre 65-75

Edad entre 75-85

C. Arauca

5% Santander17%

Meta11%

Bolivar5%

Norte de Santander11%

Boyacá33%

Indeterminados17%

Arauca

Santander

Norte de Santander

Boyacá

Meta

Bolivar

Indeterminados

donantes cuya prueba de CHAGATEK dio negativa y por lo tanto no fueron

confirmados por IFI y 18 donantes que ante la prueba de CHAGATEK

positiva, fueron confirmados por IFI, test que proporcionó un resultado

negativo.

A semejanza del anterior grupo, hay un porcentaje mayor de hombres (55%)

que de mujeres (41%), Las edades de este grupo oscilan entre 20 años

hasta los 70 años, con un predominio de menores de 30 años (52%),

seguidos por el grupo entre 30-40 años (25%). Estas observaciones apoyan

la tendencia de asociación entre el desarrollo de sintomatología con edades

maduras mayores de 30-40 años. Hecho que se soporta en los períodos

largos de 10-40 años que comprende la fase intermedia de la enfermedad.

(Figura 10)(WHO.,1991) Finalmente, dada la localización de la Cruz Roja

Colombiana en la ciudad de Bogotá, la mayoría de donantes (92%) son

procedentes de esta ciudad.

A. Personas del sexo

Femenino41%No. Personas sexo

masculino55%

Indeterminados4%

Personas del sexoFemenino

No. Personas sexomasculino

Indeterminados

Figura 10. Características de los donantes negativos. A: clasificación según el género. B:

clasificación según la edad. C: clasificación según la procedencia.

6.3 Estandarización de la prueba de ELISA

Las condiciones de la prueba de ELISA referentes a la concentración de

antígeno, dilución de la enzima (conjugado), tiempos de incubación y el

porcentaje de la leche descremada en la solución de bloqueo; fueron

determinadas mediante múltiples ensayos de ELISA utilizando sueros

chagásicos francamente positivos y negativos. Las condiciones finalmente

establecidas se encuentran consignadas en la tabla 5.

B.

Edad entre 40-5011%

Edad entre 50-604%

Edad entre 60-704% Indeterminados

4%Edad entre 20-30

52%

Edad entre 30-4025%

Edad entre 20-30

Edad entre 30-40

Edad entre 40-50

Edad entre 50-60

Edad entre 60-70

Indeterminados

C. Indeterminados8%

Bogota92%

Bogota

Indeterminados

Tabla 5. Estandarización de la prueba de ELISA para la detección de anticuerpos anti- Ig G

humana en sueros de pacientes chagásicos.

CONCENTRACION VOLUMEN TIEMPO INCUBACION TEMPERATURA

INCUBACION

ANTIGENO TOTAL

(0.33 µµg cada lisado)

1 µµg/ pozo 100µµl 3 horas 37ºC

SOLUCION BLOQUEO

(TBS) Tween 0.1%

Leche descremada al

5%

100µµl 1 hora 37ºC

SUERO PACIENTE 1/10 100µµl 1 hora 37ºC

CONJUGADO

Anti Ig G humana

acoplada a fosfatasa

alcalina

1/30000 100µµl 1 hora 37ºC

SUSTRATO

(p-nitrofenilfosfato)

1 mg/ml 100µµl 1/2 Ambiente

A partir de un grupo de estudiantes jóvenes, de la ciudad de Bogotá, que no

hubieran vivido en zonas endémicas, o viajado a las mismas, se estableció el

punto de corte, igual al promedio de la absorbancia más dos desviaciones

estándar. Con base en este punto de corte, se seleccionaron los sueros

control positivo bajo y el control negativo, los cuales fueron incluidos por

triplicado en cada una de las microplacas.

6.4 Determinación de la reactividad de pacientes Chagásicos frente a un

“Pool” de lisados de las tres cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.

Una vez determinadas las condiciones del ensayo, se procedió a realizar el

ELISA analizado por triplicado cada una de las muestras de estudio. La

positividad de cada una de las muestras fue determinada según el índice de

reactividad (Apartado 5.3) con el fin de eliminar las variaciones de la

absorbancia entre placas. (Tablas 6,7,8)

Tabla 6. Reactividad de los donantes positivos frente a los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.

CODIGO

ABSORBANCIA

INDICE DE REACTIVIDAD

68 0.495 9.1

69 0.427 7.9

70 0.299 5.53

72 0.013 0.24

74 0.455 8.4

75 0.363 6.7

76 0.059 1.09

78 0.474 8.7

79 0.318 5.8

80 0.393 7.2

83 0.381 7.05

84 0.516 9.5

86 0.393 7.27

120 1.54 7.58

Tabla 7. Reactividad de los pacientes crónicos frente a los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.

CODIGO

ABSORBANCIA

INDICE DE REACTIVIDAD

30 0.594 9.9

31 0.723 12.05

32 0.447 7.45

33 0.485 8.9

35 0.498 8.3

36 0.367 6.1

37 0.707 11.78

40 0.272 4.5

41 0.645 10.7

42 0.503 8.3

43 0.596 9.9

44 0.453 7.55

45 0.733 12.2

46 0.714 11.9

48 0.518 8.6

49 0.318 5.3

50 0.592 9.8

51 0.577 9.6

Tabla 8. Reactividad de los donantes negativos frente a los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.

CODIGO ABSORBANCIA INDICE DE REACTIVIDAD

71 0.051 0.94

73 0.438 8.1

77 0.043 0.7

81 0.41 7.5

82 0.051 0.94

85 0.039 0.72

105 0.03 0.16

109 0.21 1.03

111 1.2 5.9

113 0.06 0.3

114 0.195 0.96

115 0.07 0.37

116 0.11 0.54

117 1.36 6.69

118 0.102 0.5

119 0.17 0.83

121 0.11 0.56

123 1.305 6.42

124 0.102 0.5

129 0.125 0.61

132 0.045 0.22

135 0.021 0.1

136 0.078 0.38

138 0.033 0.16

150 0.182 0.89

143 0.12 0.54

149 0.048 0.23

6.4.1 Reactividad de los donantes positivos

Dado que la reactividad se considera positiva por encima de un índice de 1.1,

en primer lugar se determinó si el índice promedio de este grupo era mayor

1.1. Para ello, se realizó una prueba estadística de hipótesis para la media

con un α de 0.05, encontrándose que el índice promedio era mayor de 1.1

con un p= 2.4 x 10-6. Posteriormente, se determinó la distribución de los

índices de reactividad en este grupo. Tal como se muestra en la figura 11, la

mayoría de los sueros se ubicaron por encima del índice promedio de

reactividad de 6.57 (DS=2.75). Mientras que tan solo un suero se ubica en la

zona gris en el límite superior, y otro, es francamente negativo. Estos

resultados indican por una parte como 12 de los 14 pacientes (86%)

reconocen ampliamente los determinantes antígénicos de las tres cepas

colombianas utilizadas en este estudio; en tanto que un 7% (1/14) los

reconoce parcialmente y el otro 7% (10/14) restante tiene una respuesta

francamente negativa. Así mismo, la falta de reactividad de estos 2 sueros,

catalogados anteriormente por dos pruebas de principio serológico diferente

como positivos, sugiere que el reconocimiento inmune esta dado tanto por la

presencia de determinantes antigénicos en los lisados de parásitos [los

cuales difieren dependiendo de la cepa y del procedimiento de lisis

empleados (Mendes y col., 1997) ] como por un backgrouwnd genético

apropiado del individuo que le permita responder a los mismos.

Figura 11. Indice de reactividad de los donantes positivos.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Pacientes

Ind

ice

de

Rea

ctiv

idad

X = 6,57 DS= 2,75Reactivo IR >= 1,1Zona Gris IR (0.90 - 1.1)

6.4.2 Reactividad de los pacientes crónicos En cuanto a la reactividad del grupo II se encontró como todos los pacientes

presentaban índices de reactividad mayor a 1.1 con un p=2.108 x 10-11,con

un promedio de índice de reactividad de 9.046 (DS 2.29). Indicando estos

resultados la alta reactividad de estos sueros frente al antígeno,

localizándose la respuesta dentro de un rango inferior de 5.3 de índice de

reactividad hasta uno superior de 12.2 reactividad. (Figura 12).

Figura 12. Índice de reactividad de los pacientes crónicos.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Pacientes

Ind

ice

de

Rea

ctiv

idad

X=9.046 DS 2.29Reactivo IR >= 1,1Zona Gris IR (0.9 - 1.1)No Reactivo IR < 0,9

Adicionalmente, es importante destacar como el 100% de estos pacientes

(18/18) coinciden en su respuesta de carácter positivo con las pruebas de

EIA e IFI, anteriormente empleadas. Estos resultados concuerdan con lo

reportado por Salles y col., 1996, quienes encontraron que pruebas

serológicas de principios diferentes, muestran concordancia en poblaciones

con elevados niveles de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

6.4.3 Reactividad de los donantes negativos

El análisis de la reactividad de los donantes negativos muestra como el

promedio del índice de reactividad se localiza en 1.73 (DS 2.56) es decir es

mayor a 1.1, lo cual sugiere que no todos los pacientes son negativos; tal

como lo demuestra la distribución del índice de reactividad de estos

pacientes (Figura 13), donde el 66.7% de estos pacientes (18/27) son

francamente negativos, el 14.8% (4/27) se ubica en la zona gris y el 18.5%

restante (5/27), son francamente positivos.

Figura 13. Indice de los donantes negativos.

0,1

1,1

2,1

3,1

4,1

5,1

6,1

7,1

8,1

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27

Pacientes

Ind

ice

de

Rea

ctiv

idad

X=1.73 DS= 2.56No Reactivo IR < 0,9Zona Gris IR (0.90 - 1.1)

Cuando se analiza la respuesta entre los pacientes negativos a una sola

prueba (CHAGATEK negativos) y los dudosos (CHAGATEK positivos e IFI

negativo) se encuentra que de los nueve pacientes negativos por

CHAGATEK solo uno presentó una alta reactividad frente a los lisados de las

tres cepas colombianas (Tabla 9). Mientras que de los 18 pacientes que

presentaron CHAGATEK positivo e IFI negativo, cuatro individuos presentan

índices altos de reactividad frente a las cepas colombianas y tres se sitúan

en la zona gris de reactividad. (Tabla 10). Estos resultados son muy

llamativos, no solo a la luz de la discrepancia entre las diferentes técnicas,

sino también en la conducta a seguir en banco de sangre; aspectos que

serán discutidos más adelante.

Tabla 9. Reactividad de los donantes negativos con una prueba serológica frente a

los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.

CODIGO ABSORBANCIA

INDICE DE

REACTIVIDAD

85 0.039 0.72

123 1.305 6.42*

132 0.045 0.22

135 0.021 0.1

136 0.078 0.38

138 0.033 0.16

150 0.182 0.89

143 0.12 0.54

149 0.048 0.23

Tabla 10. Reactividad de los donantes negativos, positivos frente a los lisados de

cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.

CODI

GO

ABSORBANCIA INDICE DE REACTIVIDAD

71 0.051 0.94*

73 0.438 8.1*

77 0.043 0.7

81 0.41 7.5*

82 0.051 0.94*

124 0.102 0.5

121 0.11 0.56

119 0.17 0.83

118 0.102 0.5

117 1.36 6.69*

116 0.11 0.54

115 0.07 0.37

111 1.2 5.9*

109 0.21 1.03*

113 0.06 0.3

114 0.195 0.96*

105 0.03 0.16

129 0.125 0.61

6.4.4 Comparación de la reactividad frente a lisados de cepas

colombianas de Trypanosoma cruzi entre los diferentes grupos de

estudio

El siguiente aspecto a analizar según los objetivos planteados fue el análisis

de la diferencia de medias entre grupos con un α 0.05, mediante la prueba

de hipótesis estadística. No obstante, antes de realizar este estudio, se

decidió en acuerdo a la norma establecida por la OMS (Organización

Mundial de la Salud) redefinir los pacientes donantes negativos. La OMS

establece que para un paciente sospechoso de estar en la fase latente o

crónica de la infección, sea considerado positivo para la infección de

Trypanosoma cruzi se requieren dos pruebas serológicas de principios

diferentes positivas. Si bien estos requisitos eran cumplidos a cabalidad por

el grupo I (donantes positivos asintomáticos) y el grupo II (pacientes

chagásicos crónicos), el grupo de donantes negativos tenía: 1). Una sola

prueba negativa (CHAGATEK) o, 2). Una prueba positiva (CHAGATEK) y

otra negativa (IFI). Para el primer caso la OMS recomienda realizar una

segunda prueba serológica. Para el segundo caso, la OMS recomienda

realizar una tercera prueba, la cual en caso de ser positiva confirma la

presencia de la infección y en caso de resultar negativa, dicha muestra se

considera negativa.

De manera que teniendo en cuenta lo anterior, se asignó la prueba de ELISA

realizada en este estudio como la prueba serológica adicional, que si bien

tiene el mismo principio de ELISA de CHAGATEK, difiere de este, en el

número y procedencia del antígeno, así como también en el procedimiento

en general. De acuerdo a los resultados del ELISA los sueros negativos ante

dos pruebas (Tabla 11) conformaron el nuevo grupo III. Mientras que los

sueros positivos ante dos pruebas fueron reconsiderados en el grupo I de

pacientes asintomáticos. (Tabla 12)

Es así como en las figuras 14 y 15 se muestran las distribuciones de los

índices de reactividad de los nuevos grupos I y III. Cuando se compara la

reactividad frente a los lisados del parásito entre los diferentes grupos

redefinidos, se observa como en primer lugar existen diferencias

estadísticamente significativas entre pacientes infectados (Grupo I y Grupo II)

y los no infectados (Grupo III) con un p< 0.05. Es decir que esta prueba de

ELISA sirve para diferenciar entre pacientes infectados y no infectados.

Así mismo, si se compara el grupo I con el grupo III se observan diferencias

estadísticamente significativas (p=1.912 x 10-12), que indican que esta prueba

permite diferenciar entre pacientes infectados asintomáticos y no infectados.

Tabla 11. Listado de sueros de donantes negativos en dos pruebas serológicas.

(Grupo III)

CODIGO ELISA (CHAGATEK) ELISA

(Indice de Reactividad)

85 No reactivo 0.72

124 Reactivo 0.5

121 Reactivo 0.56

119 Reactivo 0.83

118 Reactivo 0.5

116 Reactivo 0.54

115 Reactivo 0.37

113 Reactivo 0.3

132 No reactivo 0.22

135 No reactivo 0.1






77 Reactivo 0.7

105 Reactivo 0.162

129 Reactivo 0.61

Tabla 12. Listado de sueros donantes positivos con dos pruebas serológicas

positivas (Grupo I).

CODIGO ELISA (CHAGATEK) IFI ELISA

(Indice de Reactividad)

68 Reactivo Reactivo 9.1











84 Reactivo reactivo 9.5



73 Reactivo No reactivo 8.1




Figura 14. Distribución de los indices de reactividad en los pacientes asintomáticos

del grupo I

0 ,11 ,12 ,13 ,14 ,15 ,16 ,17 ,18 ,19 ,1

1 3 5 7 9

11

13

15

17

Pac ientes

Ind

ice

de

Rea

ctiv

idad

Reactivo IR >= 1,1Zona Gris IR 0.99 - 1.1X=6,68 DS=2,45

Figura 15. Distribución de los indices de reactividad en los pacientes negativos

grupo III

Igualmente, cuando se compara la respuesta de los pacientes crónicos, con

la del grupo III, también se observan diferencias estadísticamente

significativas con un p< 0.05. Es decir que esta prueba discrimina pacientes

infectados sintomáticos de pacientes no infectados.

Finalmente, cuando se comparan los grupos I y II se observa como estos

grupos se diferencian estadísticamente con un p=0.0051. Es decir esta

prueba también discrimina entre pacientes infectados asintomáticos e

infectados sintomáticos.

0,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,50 ,6

0 ,7

0 ,8

0 ,91

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8

P a c i e n t e s

Ind

ice

de

Rea

ctiv

idad

N o R e a c t i v o I R < = 0 . 9 0Z o n a G r i s I R 0 . 9 0 - 1 . 1X = 0 , 4 6 2 D S = 0 , 2 3 7

Los resultados anteriores indican como la respuesta inmune humoral de los

pacientes colombianos varían según el estadio de la enfermedad en que se

encuentre el paciente; hecho demostrado en diferentes estudios en pacientes

de otros países Latinoamericanos (Levin y col., 1989; Avila y col., 1993;

Lorca y col., 1992; Krautz y col., 1995). Por lo tanto, la existencia de

determinantes antígenicos específicamente reconocidos según el estadío de

la enfermedad del paciente, pueden constituir marcadores potenciales de

transición de un estadío a otro de la enfermedad en pacientes colombianos.

6.4.5 Comparación de las pruebas de CHAGATEK, IFI, y ELISA.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se decidió comparar la prueba

de ELISA desarrollada en este estudio con las pruebas CHAGATEK e IFI en

primer lugar en cuanto a sensibilidad y especificidad, y en segundo lugar

determinando la correlación entre estos métodos.

6.4.5.1 Determinación de la sensibilidad y especificidad de la prueba

de ELISA usando cepas colombianas

Para realizar estos estudios se tuvieron en cuenta los sueros de los

pacientes de los grupos I y III. El grupo II se descartó por cuanto no tenía la

prueba de CHAGATEK. Así mismo, en las determinaciones de sensibilidad y

especificidad se consideraron la prueba CHAGATEK e IFI como patrones de

oro. No obstante hay que aclarar que dado que a los pacientes no reactivos

por CHAGATEK no se les realizó IFI, cada prueba (IFI o CHAGATEK) fue

considerada como patrón de oro por separado. (Tabla 13)

Es así como de 32 muestras analizadas por IFI, 14 fueron positivas y 18

negativas. De estas muestras, 16 dieron positivas por ELISA y 16 negativas

(Tabla 14); para una sensibilidad de 85% y especificidad de 77% (Ver en el

anexo 6 las fórmulas pertinentes).

Tabla 13. Sueros incluidos en la comparación de ELISA, CHAGATEK e IFI.

CODIGO CHAGATEK IFI ELISA (Indice de Reactividad)

68 Reactivo Reactivo 9.1 69 Reactivo Reactivo 7.9 70 Reactivo Reactivo 5.53 72 Reactivo Reactivo 0.24* 74 Reactivo Reactivo 8.4 75 Reactivo Reactivo 6.7 76 Reactivo Reactivo 1.09* 78 Reactivo Reactivo 8.7 79 Reactivo Reactivo 5.8 80 Reactivo Reactivo 7.2 83 Reactivo Reactivo 7.05 84 Reactivo Reactivo 9.5 86 Reactivo Reactivo 7.27 120 Reactivo Reactivo 7.58 71 Reactivo No reactivo 0.94* 73 Reactivo No reactivo 8.1 77 Reactivo No reactivo 0.7 81 Reactivo No reactivo 7.5 82 Reactivo No reactivo 0.94* 85 No reactivo N.D 0.72 123 No reactivo N.D 6.42 124 Reactivo No reactivo 0.5 121 Reactivo No reactivo 0.56 119 Reactivo No reactivo 0.83 118 Reactivo No reactivo 0.5 117 Reactivo No reactivo 6.69 116 Reactivo No reactivo 0.54 115 Reactivo No reactivo 0.37 111 Reactivo No reactivo 5.9

109 Reactivo No reactivo 1.03* 113 Reactivo No reactivo 0.3 114 Reactivo No reactivo 0.96* 105 Reactivo No reactivo 0.162 132 No reactivo N.D 0.22 135 No reactivo N.D 0.1 136 No reactivo N.D 0.38 138 No reactivo N.D 0.16 129 Reactivo No reactivo 0.61 150 No reactivo N.D 0.89 143 No reactivo N.D 0.54 149 No reactivo N.D 0.23

N.D = prueba no realizada. * = Los sueros en zona gris fueron considerados negativos.

Tabla 14. Correlación IFI vs. ELISA

Positivos Negativos Total

ELISA 16 16 32 IFI 14 18 32

Por su parte, de las 41 muestras analizadas por CHAGATEK, 32 fueron

positivas y 9 negativas. De estas, mediante la técnica de ELISA 17 dieron

positivas y 24 dieron negativas (Tabla 15), para una sensibilidad de 50% y

especificidad de 88.9%.

Tabla 15. Correlación CHA GATEK vs. ELISA

Positivos Negativos Total ELISA 17 24 41

CHAGATEK 32 9 41

6.4.5.2 Correlación de las pruebas ELISA, CHAGATEK e IFI

La correlación entre el ELISA desarrollado en este trabajo, e IFI y entre la

prueba de ELISA y CHAGATEK fue determinada a través del índice Kappa

de concordancia (Anexo 6), teniendo en cuenta los sueros listados en la tabla

13. Obteniéndose un índice Kappa de 0.62 entre el ELISA y el IFI; el cual

según la clasificación del índice de concordancia Kappa es bueno (Anexo 6).

Por su parte, se obtuvo un índice Kappa de 0.243 entre CHAGATEK y el

ELISA, índice catalogado como regular.(Anexo 6).

Los resultados anteriores demuestran como en primer lugar de acuerdo a lo

reportado por Salles y col., 1996, las pruebas serológicas para Chagas en

general presentan poca concordancia entre sí, reportándose diferentes

grados de sensibilidad y especificidad. Sobre todo si se aplican a

poblaciones con bajos niveles de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi,

como es el caso de los donantes de este estudio, procedentes en su mayoría

de la ciudad de Bogotá, área no endémica para la enfermedad de Chagas.

En segundo lugar vemos como a pesar de tener el CHAGATEK y el ELISA

desarrollado en este trabajo, el mismo principio serológico, estas técnicas

difieren ampliamente, en sensibilidad y especificidad y además presentan un

índice Kappa regular de correlación (0.243).

La discrepancia entre nuestros resultados y los arrojados por la prueba

CHAGATEK puede ser debida a algunos de los siguientes hechos o a una

combinación de los mismos: (1) La procedencia geográfica de las cepas.

Mientras CHAGATEK utiliza cepas argentinas, en nuestro caso se utilizaron

cepas colombianas caracterizadas por el desarrollo de afecciones cardiacas

y menor virulencia. En contraste, las cepas del cono sur se caracterizan por

desarrollar megasíndromes intestinales y presentar mayor virulencia.

Además, mientras en Colombia la mayoría de las cepas estudiadas

pertenecen al Zimodema ZI (Saravia y col., 1987; Márquez y col., 1998; Ruíz

G. y col., 2000) en Argentina, se ha detectado la ocurrencia de 12

zimodemas diferentes, ninguno de los cuales corresponde a los tres

Zimodemas (ZI,ZII,ZIII), clásicamente descritos por Miles y col., 1980. (2) El

número, ciclo de transmisión y huésped de las cepas usadas como antígeno.

En nuestro ensayo se usaron tres cepas que difieren en su ciclo, huésped y

región geográfica de procedencia. Aún cuando en CHAGATEK no es posible

conocer las características de la cepa empleada tales como: número de

cepas, grupos o zimodemas, procedencia y estadio de desarrollo; difícilmente

se podría pensar en un mismo número de cepas de iguales características.

Por lo tanto hay que tener en cuenta los estudios de Souto y col., 1996,

quienes sugieren asociación entre el grupo 1 y el ciclo silvestre de

transmisión de la infección; mientras el grupo 2, se asocia al ciclo doméstico

de transmisión. Adicionalmente, Fernández y col., 1999 han encontrado

como ambos grupos del parásito tienen preferencias por huéspedes

específicos. (3) Estadio del parásito utilizado como antígeno. En nuestro

ensayo se utilizaron formas epimastigotas procedentes de cultivo in vitro. Es

bien conocido como el parásito exhibe antígenos estadío-específicos,

muchos de los cuales han sido reconocidos como participantes en los

mecanismos la infección y respuesta del sistema inmune. (4) La preparación

del antígeno. Estudios realizados por Mendes y col., 1997, indican como el

proceso de obtención de extractos solubles del parásito, así como las

condiciones de centrifugación, afectan profundamente el perfil de antígenos

y/o epítopes reconocidos por los sueros.

Por otra parte hay que destacar que si bien la prueba de ELISA en relación a

CHAGATEK presentó una sensibilidad de tan solo el 50% su especificidad

fue del 88.9%. Lo anterior, analizado dentro del contexto de que CHAGATEK

es una prueba usada en banco de sangre para el “screening” inicial de

sueros positivos, que arroja de falsos positivos, sugiere que el ELISA

desarrollado en este trabajo arroja menos falsos positivos y por lo tanto si se

aplicara a banco de sangre se desecharían menos unidades de sangre por

razones de falsos positivos; debido quizá mayoritariamente al uso de cepas

colombianas como antígeno.

Por su parte, la correlación del índice Kappa entre las pruebas de IFI y ELISA

fue mayor, debido probablemente al uso de cepas colombianas en ambos

tipos de pruebas. Resultados similares fueron obtenidos por Bucio y col.,

1999, quienes obtuvieron una mayor reactividad anti- T. cruzi en pacientes

Mexicanos al usar cepas mexicanas que Argentinas.

Por otra parte, las discrepancias entre IFI y ELISA pueden estar dadas por

las diferencias en el numero de cepas, grupo o zimodema de las mismas,

procedencia geográfica, ciclo de transmisión, huésped de origen, en la

preparación del antígeno y la técnica empleada.

Por otra parte, es importante destacar como al seguir las recomendaciones

de la OMS y redefinir el grupo III, cuatro de los pacientes catalogados como

negativos resultaron positivos. Este hecho es muy importante ya que si bien

la existencia de falsos positivos tiene como consecuencia el desecho

innecesario de unidades de sangre, los falsos negativos implican posibilidad

de transmisión de la enfermedad de Chagas al usar productos de bolsas

contaminadas.

7. CONCLUSIONES

En cuanto a los objetivos planteados en este estudió, se concluye

principalmente que la respuesta inmune humoral de los pacientes

colombianos es dependiente del estadío de la enfermedad, y por lo tanto

deben existir moléculas marcadoras de cada uno de los diferentes estadíos

que permitan monitorear la transición de la fase latente a crónica.

En segundo lugar, en cuanto a la técnica desarrollada en este estudio, se

pueden concluir los siguientes aspectos:

• El uso de más de una cepa con diferentes características amplía, al

menos en teoría la posibilidad de detectar más determinantes antigénicos

del parásito.

• El uso de cepas colombianas del parásito como antígeno, aumenta la

especificidad de la prueba, tal como lo indica la buena correlación

obtenida entre el IFI y la prueba de ELISA desarrollada en este estudio.

• Debido a lo anterior en banco de sangre se debe utilizar una prueba inicial

de “screening” que incluya cepas colombianas como antígeno.

• Igualmente, en banco de sangre ante dos pruebas serológicas con

resultados diferentes, se debe realizar una tercera prueba que defina la

positividad o negatividad del donante ante la infección por el parásito.

8. RECOMENDACIONES

En primer lugar se recomienda continuar con el estudio para localizar ya de

manera específica las moléculas marcadoras de cada estadío de la

enfermedad de Chagas, mediante ensayos de “Western blot”.

En cuanto a la prueba de ELISA se recomienda investigar el uso también de

las formas amastigotes y tripomastigotes de cepas colombianas del parásito

como antígeno. Así como también difundir los resultados obtenidos a las

autoridades pertinentes para tomar las medidas adecuadas.

9. ANEXOS

Anexo 1. Formato de consentimiento Fecha: Yo_________________________________________________________ Con cédula de ciudadanía No._______________de__________________ después de haberse sido debidamente informado sobre la naturaleza del proyecto de investigación titulado “Respuesta inmune humoral de pacientes chagásicos frente a lisados de Trypanosoma cruzi” y sus riesgos potenciales, acepto voluntariamente participar en el, y no demandare de los responsables del mismo una compensación diferente a la de ser informado de los resultados de los exámenes que me sean practicados. Entiendo que mi participación en este estudio y sus hallazgos pueden resultar en una importante contribución al avance del conocimiento sobre la enfermedad de Chagas. Así mismo declaro que mi participación consiste en la donación de una muestra de sangre. Soy libre de retirarme del estudio una vez haya comenzado, si no deseo continuar participando en el. Firmas: _______________ ________________

Paciente Testigo

C .C C.C _____________________

Investigador C.C

Anexo. 2 Medio REI modificado modificado al 2% con suero fetal bovino (SFB). Para preparar 3 litros. g/l BHI 30 NaCl 24 KCl 1.2 MgSO47H2O 0.6 KH2PO412H2O 0.18 CaCl 0.21 Glucosa 6.0 NaHCO3 3.0 El pH se ajusta a 7.2 y se esteriliza por filtración de 0.22 µm. El control de esterilidad se realiza dejando el medio BHI a 37ºC durante 72h. Agregar suero fetal bovino a 56ºC durante 30 minutos, realizar pruebas de esterilidad.

Anexo 3. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford. 1. Adicionar a cada pozo 200 µµl de Bradford diluido e el momento de

usar (1 ml de Bradford y 4 ml de agua destilada) y 5 µµl de la muestra a la dilución indicada.

2. Usar 5µµl de agua para el blanco. 3. Mezclar e incubar por 5 minutos. 4. Leer a 540 nm, realizando cada muestra por triplicado. • Reactivo de Bradford (Bio –Rad).

Anexo 4. Electroforesis vertical de proteínas en geles de acrilamida Reactivos Solución A: mezcla acrilamida/ bisacrilamida 30: 1 (p/v) Acrilamida: 29.2 g. Bisacrilamida: 0.96 g. Agua destilada: 100 ml. Almacenar a 4º C en frasco ámbar. Solución B: Buffer Tris 1,5 M pH: 8.8 Tris base 27.33 g. Agua destilada 80 ml. Ajustar el pH con HCl 1N, completar a 150 ml con agua destilada. Almacenar a 4º C en frasco ámbar. Solución C: Mezcla acrilamida/ Bisacrilamida 30:1.6 Acrilamida 30 g. Bisacrilamida 1.6 g. Agua destilada: 100ml Almacenar en frasco ámbar a 4ºC. Solución D: Buffer Tris 0.5M pH 6.8 Tris Base 6 g. Agua destilada: 60 ml. Ajustar el pH 6.8 con HCl 1N, completar la solución a la 100 ml. Almacenar a 4ºC en frasco ámbar. PSA 10% (Preparar al momento de usar) Persulfato de amonio (PSA): 0.1 g. Agua destilada: 1,0 ml.

Buffer muestra 15% de β-mercaptoetanol 15% SDS 1.5% azul de bromofenol 50% glicerol Se completa a 100% de agua destilada. Buffer de corrido-solución stock 5x pH 8.3 300ml 600ml Tris base 4.5 g 9.0 g. Glicina 21.6 g 43.2 g SDS 1.5 g 3 g Agua destilada 300ml 600ml. Diluir 60 ml de solución Stock 5x en 240 ml de agua destilada para una corrida. Almacenar en frasco ámbar. Calentar a 37ºC después de usar, si hay precipitación. 1. Preparación del gel separador o de corrido

8% 10% 15% Agua destilada: 2.235 ml 2.0 ml 1.05 ml Solución A: 1.36 ml 1.7 ml 2.55 ml Solución B: 1.3 ml 1.3 ml 1.3 ml SDS 10%: 50 µl 50 µl 50 µl PSA 10%: 50 µl 50 µl 50 µl Temed: 5 µl 5 µl 5 µl Volumen Total: 5 ml 5 ml 5 ml

Aplicar 3 a 5 ml de solución entre los cristales, adicionar unos mililitros de agua destilada y dejar polimerizar de 30 a 45 minutos. 2. Preparación del gel concentrador a 4% Agua destilada 1.4 ml Solución C: 0.33 ml Solución D: 0.25 ml SDS: 20 µl PSA: 30 µl Temed: 3 µl Volumen Total: 2 ml Remover el agua y adicionar la solución del gel concentrador, colocar el peine que forma los pozos de siembra y dejar gelificar de 30 a 45 minutos. 3. Preparación de las muestras: Hacer las diluciones necesarias de las muestras y de los patrones de peso molecular. Calentar las muestras en baño María durante 5 minutos. Sembrar 20 µl del patrón de peso molecular, sembrar 25 µl de cada una de las muestras (máximo 30µl por pozo para la microcámara). 4. Condiciones de corrido: El corrido electroforetico debe hacerse a 150 voltios, 50 milámperios y 200 walts durante una hora.

ANEXO 5. COLORACIÓN AZUL DE COOMASIE Azul de Coomasie 0.25% Acído Acético 10% Metanol 30% Mezclar y filtrar antes de usar. Coloración 10 minutos Decolorante de Coomasie Acído acetico 10% Metanol 30% Agua destilada 65% Procedimiento: Se deja el gel con el decolorante hasta que aparezcan las bandas de la intensidad deseada y el transfondo sea lo más claro posible, para obtener un mejor contraste.

Anexo. 6 Tabla de Dos por Dos, correlacionado ELISA e IFI

ELISA Positivos Negativos Total

Positivos 12 2 14

Negativos 5 13 18

IFI

Total 17 15 32

Anexo. 7

Tabla de Dos por Dos, correlacionando ELISA y CHAGATEK

ELISA

Positivos Negativos Total

Positivos 17 15 32

Negativos 1 8 9

CHAGATEK

Total 18 23 41

ANEXO 8. Cálculo de la sensibilidad (S) Positivos verdaderos

S= ----------------------------------------------------------------

Positivos verdaderos + Negativos falsos

Calculo de la especificidad (E) Negativas verdaderas

E= -------------------------------------------------------------

Negativas verdaderas + Falsos positivos

Calculo del índice Kappa

po: índices de concordancia observados. pe: índice de concordancia esperados.

po - pe

K= -----------------

1-pe a+d po = --------------- n

[ (a+b) x (a+c) ] Concordancia de casos positivos (P)= ---------- ----------- n n

Clasificación del índice de concordancia de Kappa Concordancia Kappa 1. Deficiente <0.20 2. Regular 0.21 - 0.40 3. Moderada 0.41 - 0.60 4. Buena 0.61 - 0.80 5. Muy buena 0.81 - 1.00

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