1. La fermentación es un proceso catabólico efectuado por microorganismo que se puede dar en presencia o ausencia de oxígeno, mediante el cual un sustrato (compuesto por sustancias orgánicas) sufren una serie de cambio químico en los cuales se libera energía obteniendo al final una acumulación de metabolitos o biomasa de menor potencial que el sustrato inicial.

2.

Cuadro 1. Algunos usos industriales de distintos tipos de fermentación

PRODUCTO FINAL DE LA FERMENTACIÓN

USO INDUSTRIAL O COMERCIAL

MATERIA INICIAL

MICROORGANISMO

Etanol Cerveza Extracto de Malta Sacharomyces cerevisiae (levadura)

Vino Jugos de Uva o de otra fruta

(Sacharomyces cerevisiae var. elipsoideus

Combustible Desechos agricolas

Sacharomyces cerevisiae

Ácido acético Vinagre Etanol AcetobacterÁcido láctico Queso, yogur Leche Lactobacillus,

Streptococcus (bacterias) Pan de centeno Cereal en grano,

azucar Lactobacillus delbrukii (bacteria)

Chucrut Repollo Lactobacillus plactarum Salchicha ahumada Carne Pediococcus

Ácido propiónico y Queso gruyer Ácido láctico Propionibacterium

CO2 freudenreichii Acetona y butanol Producto

farmacéutico, uso industrial

Melaza Clostridium acetobutylicum

Ácido cítrico Aromatizador Melaza Aspergillus ( hongo) Glicerol Producto

farmacéutico, uso industrial

Malaza Sacharomyces cerevisiae

Metano Biocombustible Ácido acético Methanosarcina Sarbosa Vitamina C (ácido

ascórbico) Sorbitol Gluconobacter

Fuente: Tortor, Gerard; Funke, Berdell. Introducción a La Microbiología. Pág. 139

3. FERMENTACION ALCOHOLICA

La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la célula de levadura.

La glucosa se degrada a ácido pirúvico, proceso llamado glucolisis, este ácido formado luego es transformado a etanol y dióxido de carbono.

El oxígeno es el desencadenante inicial de la fermentación, ya que las levaduras lo van a necesitar en su fase de crecimiento. Sin embargo al final de la fermentación conviene que la presencia de oxígeno sea pequeña para evitar la pérdida de etanol y la aparición en su lugar de ácido acético. La fermentación alcohólica es un proceso exotérmico, es decir, se desprende energía en forma de calor. Es necesario controlar este aumento de temperatura ya que si ésta ascendiese demasiado (25 - 30º) las levaduras comenzarían a morir deteniéndose el proceso fermentativo. Otro producto resultante de la fermentación es el anhídrido carbónico (CO2) en estado gaseoso, lo que provoca el burbujeo, la ebullición y el aroma característico de una cuba de mosto en fermentación.

Esta ebullición hace que las partes sólidas (hollejos) suban a la superficie del mosto formándose una capa en la parte superior del depósito llamado "sombrero". Este "sobrero" capa, que dará origen al orujo, protege al mosto de ataques bacterianos y de posibles oxidaciones y, fundamentalmente, cede al mosto gran cantidad de sustancias contenidas en los hollejos, sobre todo, taninos, sustancia colorante gracias a la cual el vino adquiere su color rojizo característico, y aromas y extractos que se encuentran en la piel de la uva. A lo largo de todo el proceso de fermentación, y en función de las condiciones (cantidad de azúcar disponible, temperatura, oxigeno, etc.) cambia el tipo de levadura que predomina pudiéndose distinguir varias fases en la fermentación:

1ª fase (primeras 24 horas), predominan levaduras no esporogéneas, que resisten un grado alcohólico 4-5. Son sensibles al anhídrido sulfuroso.

2ª fase (2º-4º día), predomina el Sacharomyces cerevisiae que resiste hasta un grado de alcohol entre 8 y 16. En esta fase es cuando se da la máxima capacidad fermentativa

3ª fase sigue actuando Sacharomyces Cerevisiae junto a Sacharomyces Oviformis. También pueden existir otros microorganismos procedentes principalmente de las bodegas y de los utensilios, suelen ser hongos entre los que destacan Penicillium, Aspergilus.

FERMENTACION ACIDO LACTICA

a) Iniciación de la Fermentación:

durante la iniciación, las bacterias grampositivas y gramnegativas presentes en el vegetal fresco, compiten por el predominio; enterobacterias, bacterias aerobias formadoras de esporas, bacterias ácido – lácticas y otras bacterias, están muy activas.

Este estadio incluye el crecimiento de unos pocos microorganismos facultativos y estratos anaeróbicos, originalmente presentes en el vegetal fresco, pero seguidamente el establecimiento de las bacterias lácticas disminuye los valores

de pH y son inhibidos los organismos indeseables como son las bacterias gramnegativas y las formadoras de esporas, por lo tanto, la rapidez con que las bacterias ácido lácticas se establecen y los microorganismos indeseables son excluidos.

Eventualmente las bacterias ácido – lácticas ganan predominio por disminución del pH y ocurre la:

Fermentación Primaria:

Durante este estadio, las bacterias ácido – lácticas y las levaduras fermentativas, constituyen la microflora predominante y su crecimiento continua hasta agotarse los carbohidratos fermentables o hasta ser inhibidas por el pH formado por la propia bacteria láctica.

La capacidad amortiguadora y el contenido de carbohidratos fermentable del material vegetal, son factores importantes que determinan la magnitud de la fermentación de las bacterias ácido – lácticas y la magnitud de las consecuentes fermentación de las levaduras presentes.

Durante la fermentación primarias son activadas 5 especies de bacterias productoras de ácido láctico, en el siguiente orden:

STREPTOCOCCUS FECALIS, LEUCONOSTOC MESENTEROIDES, PEIOCOCCUS CEREVICIAE, LACTOBACILLUS BREVIS Y LACTOBACILLUS PLANTARUM.

Varias especies de levaduras fermentativas también son activas durante la fermentación primaria. Si después de la fermentación primaria quedan azúcares fermentables, estos azúcares pueden permitir una:

Fermentación Secundaria:

Dominada esencialmente por levaduras. Estos microorganismos son bastante tolerantes al ácido por lo que su actividad fermentativa continúa aún después de que las bacterias lácticas han sido inhibidas por los bajos valores de pH y pueden continuar hasta agotar los carbohidratos fermentables.

Post – Fermentación

Este estadio comienza cuando los carbohidratos fermentados se han agotado.

FERMENTACION ACETICA

Estrictamente hablando la fermentación acética no es una fermentación, sino que metabólicamente es una oxidación y las fermentaciones, tanto la

alcohólica como la láctica, se caracterizan por llevarse a cabo en condiciones de anabolia o al menos de baja presión parcial de oxígeno.

El sustrato de la fermentación acética es el alcohol etílico, presente en el vino o la sidra. Sin embargo, también se encuentra de forma natural en frutas y flores, que emplean la volatilidad de este compuesto para atraer a sus polinizadores o dispersores del fruto. La transformación del alcohol etílico en ácido acético se lleva a cabo en la bacteria mediante una cadena de 3 enzimas.

El primer enzima, llamado alcohol deshidrogenasa tiene como sustrato el alcohol etílico y lo transforma en acetaldehido. Durante este paso del metabolismo del etanol se elimina un hidrógeno del etanol que pasa a reducir al NAD, una molécula de almacenamiento de energía. De esta manera el alcohol, al perder un hidrógeno se oxida, es decir, el balance oxígeno/ hidrógeno de la molécula tiende al oxígeno. En este proceso el NAD queda reducido a NADH. Este paso supone una “vuelta atrás” pues el paso de acetaldehído a etanol forma parte de la fermentación etílica que llevan a cabo otras bacterias.

En el segundo paso del metabolismo el acetaldehido es hidratado. Para ello la bacteria emplea una molécula de agua H2O. Convirtiendo el acetaldehido en acetaldehído hidrato.

Finalmente el tercer paso para la obtención de ácido acético es una segunda oxidación ésta se lleva a cabo mediante la enzima acetaldehído deshidrogenasa que libera otra molécula de hidrógeno que será captada por otro NAD y producirá una molécula de ácido acético.

FERMENTACION BUTIRICA

El ácido butírico se lleva a cabo en condiciones anaerobias absolutas. La bacteria CLOSTRIDIUM: Es un género de bacterias anaerobias, bacilos grampositivas, parásitas en algunas de ellas, se caracterizan porque son organismos que se observan solos, en parejas o a lo máximo en cadenas cortas, dichas bacterias crecen a una temperatura de 37° C y aun pH entre 7 y 7.4, de modo que son fácilmente inactivas a pH ácidos o básico.

Esto contribuye a la aparición de olores pútridos y desagradables, esto se lleva a cabo durante el proceso de ensilado, el ensilado es un proceso de conservación del forraje basado en una fermentación láctica del pasto que produce ácido láctico y una disminución del pH 5 si la cantidad de azúcares en el pasto no es lo suficiente grande como para producir una cantidad de ácido láctico que garantice un pH a 5.

-Fermentación butírica. Una vez establecida en la masa la fermentación láctica, el ácido láctico o sus sales pueden ser objeto del ataque por diferentes variedades de bacterias, con la producción de ácido butírico y desprendimiento de anhídrido e hidrógeno

4. Condiciones requeridas para la fermentación alcohólica.

-Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae

-Ausencia de O2 y presencia de fosfatos.

pH. La fermentación se realiza entre un rango de pH entre 3.0 a 4.0., con este rango no permite que en él se desarrollen agentes patógenos.

TEMPERATURA. La actividad de las levaduras es intensa entre 20o y 25 0 Centígrados, máxima a 30 0 C y por encima de los 40o C disminuye. Nunca se debe permitir que un mosto fermente por encima de los 40o C.

PRESION. En la actividad fermentativa se forma etanol y se desprende gas carbónico, en la medida que su concentración aumenta en el recipiente de fermentación, la presión aumenta y trae como consecuencia una disminución de la actividad celular

AZUCARES. Es la materia prima para las levaduras, la concentración del mosto debe estar entre 14 a 20 grados brix.

Condiciones óptimas para la fermentación acética

Sustrato

CONCENTRACION DE ALCOHOL: 6 8 5% con tolerancia hasta 12%. Exceso (impide formación de capa gelatinosa fermentación incompleta)

Bajo: perdida del vinagre

ACIDES INICIAL: 3.0 A 3.5% (para inhibir bacterias perjudiciales)

Proceso

TEMPERATURA: 26-28 0C

AIREACIÓN: El éxito depende la cantidad de oxígeno.

PH OPTIMO: De 4 A 5.

5. Se le denomina crecimiento microbiano al incremento en el número de célula o aumento de la masa microbiana (no en tamaño)

6. la curva de crecimiento es la tasa de crecimiento de una población analizada en un sistema cerrado, monofásico, medida como el logaritmo del número de células vs. El tiempo de incubación.

En una curva de crecimiento normal se distinguen una serie de fases:-Fase de latencia: después de la inoculación. En esta fase existe mucha actividad metabólica (se sintetizan enzimas, proteínas, RNA), pero apenas se produce un incremento de la población. Es la fase de adaptación del microorganismo al medio de cultivo.-Fase exponencial: En esta fase cada célula se divide en dos por fisión binaria, manteniéndose constante la velocidad del crecimiento(o tiempo de generación)-Fase estacionaria: En esta fase, la velocidad de crecimiento disminuye progresivamente hasta igualarse a cero es decir, el crecimiento exponencial se detiene. Esto ocurre por agotamiento de los nutrientes o acumulación de metabolitos, inhibitorios, falta de espacio. En esta fase se pueden sintetizar metabolito como antibióticos. -Fase de muerte: en esta fase las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. A veces la muerte va acompañada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo.

7. Un metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del microorganismo. Es decir, son Producidos por células en crecimiento. Es producido por el metabolismo normal del microorganismo.

 Mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca del final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase de deceleración o fase

estacionaria del crecimiento del microorganismo, generalmente durante el estrés celular provocado por condiciones adversas.

8. tipos de fermentación y metabolitos primarios

Tipo de fermentación Producto primario Microorganismos Fermentación homoláctica (homofermentativa)

Ácido láctico, también se producen pequeñas cantidades de acetato, etanol y formiato y CO2

estreptococos, enterococos pediococos y lactobacilos

Fermentación heteroláctica

El piruvato se descarboxila para producir acetaldehído y CO2 , el primero es reducido por NADH2 y alcohol deshidrogenasa para formar etanol.

Leuconostoc y algunos lactobacilos y levaduras.

Acido-mixta Ácido acético, etanol, acido succínico, ácido fórmico. Algunas bacterias pueden oxidar formiato y producir gas hidrogeno y CO2.

Bacterias entéricas(Escherichia, Salmonella)

F. de Butanediol. 2,3 butanediol, ácido láctico, acético, CO2 e H2

Klepsiella, enterobacter , Serratia, Hafnia. (Enterobacteriaceae)

Acetona-Butanol Acetona, etanol, butanol, butiriato, acetato, CO2 e H2

Clostridium

F. del ácido propiónico

Ácido propiónico y CO2

Microrganismos anaerobios.

Alcohólica Etanol + CO2 Levaduras (Sacharomyces)

Ácido propiónico Ácido propiónico Levaduras (Sacharomyces)

9. Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano:

Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos:

1. Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y denominados cámaras de recuento. Existen varios tipos de cámaras de recuento, una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. Es poco preciso.

2. Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. Cada célula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados electrónicamente dando una medida directa del nº de células en el medio. No diferencia entre células viables y no viables ni entre células o partículas inertes.

3. Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única célula. Si se multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo. Sólo detecta viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay que utilizar para que los resultados sean significativos.

4. el cálculo del número más probable (NMP).

Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc..). Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. Entre los métodos indirectos se encuentran:

1. Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta.

2. Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteíco del cultivo.

3. Determinación del DNA4. Determinación de una actividad metabólica según el tipo de

microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la concentración de alguna

enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material radiactivo, etc.

5. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro.Este instrumento mide la relación de intensidad entre la luz incidente y la emergente después de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo o densidad óptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. Por tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo, esto es así dentro de ciertos límites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares y producirse un efecto “pantalla” de unas células sobre otras Por tanto, en algunos casos será necesario diluir la muestra antes de realizar la medida.

10. FACTORES INTRINSECOS10.1. NUTRIENTES

El mayor o menor contenido de cierto tipo de nutrientes (azucares, proteinas, entre otros) van a detrminar el crecimiento de cierto tipo de microorganismos, por ejemplo, la presencia de nutrientes como vitaminas, aminoacidos, etc. Va a permitir el crecimiento de microorganismos más exigentes, por el contario si el sustrato es pobre en nutrientes seguramente creceran micoorganismos menos exigentes como hongos y mohos.

10.2. PH

El desarrollo de cada uno de los diferentes tipos de microorganismos solo se realiza dentro de una franja de pH determinada, a pH fuera de esas escalas el crecimiento microbiano se inhibe o peor aun mueren los microorganismos.

10.3. AGUA DISPONIBLE

El agua es un bien esencial para el crecimiento microbiano. Sin embargo hay diferentes grados de tolerancia a su mayor o menor disponibilidad. La disponibilidad de agua es, uno de los princiales factores que determina la facilidad con la que un determinado microorganismo puede crecer. Un factor importante en la disponibilidas de agua es la presencia de solutos, por ejemplo, cuanto mayor sea la cantidad de azúcar o sal, menor será la cantidad de agua disponible y menor será la posibiliad de crecimiento microbiano. Tal y como ocurre con otros factores, tambien en lo que

respecta al agua disponible, las exigencias mínimas para cada microorganismo son diferentes. De manera general, los mohos y las levaduras soportan ambientes con menos agua disponible que la mayoría de las bacterias.

10.4. OXÍGENO DISPONIBLE

La presencia de oxígeno tiene tambien influencia en el tipo de microorganismos que pueden crecer en un determinado medio y en la velocidad a la que se multiplicarán. Por ejemplo; el hervido hace que el oxígeno disponible se pierda. Por otro lado picar o remover la carne provoca un aumento en la concentración de oxígeno. Por lo que simples acciones como las antes mencionadas afectan el crecimiento micobiano.

FACTORES EXTRINSECOS

10.5. TEMPERATURA

Todos los microorganismos necesitan de una determinada temperatura para desarrollarse a su velocidad máxima. Si la temperatura a la que los microorganismos son expuestos baja o aumenta, el crecimiento sera más lento. Por encima de la temperatura maxima o por bajo de la minima el crecimiento para, pero no siempre ocurre la muerte de los microorganismos. El calor mata los microorganismos pero el frío sólo inhibe o retrasa su crecimiento

10.6. HUMEDAD RELATIVA

Una humedad relativa muy elevada favorece el crecimiento de los microorganismos.

10.7. OXÍGENO ATMÓSFERICO

El oxígeno es para muchos organismos fundamental para su supervivencia. Sin embargo existen otros microorganismos que no toleran su presencia y que pueden hasta morir si se exponen durante algún tiempo. Los primeros son denominados aerobios y los segundos anaerobios

11. Se denomina crecimiento aeróbico cuando el microorganismo o el proceso de fermentación se realiza en presencia de oxígeno. Y el crecimiento anaeróbico es cuando se realiza en ausencia de oxígeno.

12. CÓMO SE PRODUCE ALCOHOL UTILIZANDO Zymomonas mobilis Y Saccharomyces cerevisiae.

Zymomonas mobilis: este microoganismo produce alcohol por la via de Entner DoudoroffSaccharomyces cerevisiae: este microorganismo produce alcohol por la via de Embden Meyerhoff Parnas (EMP)

13. SUSTRATO: un Sustrato es una materia prima, con una composición química y condiciones adecuadas, sobre la que actúa Un microorganismo.

14. ¿ QUÉ ES UN MEDIO DE CULTIVO?

Son una mezcla de nutriente en concentraciones adecuadas, factores de crecimiento necesarios y una serie de condiciones (temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad) que permite el crecimiento de los microorganismos y que debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Es el material alimenticio en el que crecen los microorganismos.

15. ESTEQUIOMETRIA MICROBIANA

Estudia las relaciones aritméticas entre las masas o volúmenes de los reactantes y los productos en una reacción química llevada a cabo por los microorganismos.

Los cálculos estequiométricos permiten determinar las relaciones másicas y molares entre los reactantes y los productos finales en los procesos fermentativos.

La estequiometría es de aplicación en bioprocesos porque permite:

1. El balance de masa y energía2. Determinar el rendimiento teórico y compararlo con el rendimiento actual

del producto.3. Chequear la consistencia de datos de la fermentación experimental4. Formulación del medio de nutrientes

EJEMPLO

EI crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, en un cultivo continuo con glucosa como fuente de carbón y energía, consume 4.26 mol-C de glucosa por cada mol de biomasa producida. Además, se originan 1.92 mol-C de etanol. Calcular el consumo de oxígeno, si la fuente de nitrógeno es amonio. La composición elemental de la biomasa seca de la levadura es CH 1.8 0 0.56 N 0.17

Donde:

Flujos de biomasa (Φx),

Sustrato (Φs)

Y producto (Φp)

Rendimiento biomasa / sustrato = Yx/s = ΦxΦs

Φp= producto

Rendimiento biomasa / producto = Yx/p= ΦxΦp

Solución

Para resolver el ejercicio se realiza un Balance por grado de reducción, este puede definirse como el número de electrones disponibles para ser transferidos al oxígeno en la combustión del Compuesto.

Los electrones disponibles para ser transferidos al oxigeno durante un cultivo aerobio, de cada elemento considerado aquí son:

Estos valores se deducen de la valencia de los elementos. En el caso del nitrógeno, se supone que el grado de reducción es -3 porque esta es la valencia predominante en la biomasa y es la misma que se encuentra en el amonio. Para un compuesto de composición elemental CHaObNc, su grado de reducción sera:

La siguiente es un balance general del grado de reducción

Como

Y Si la fuente de nitrogeno es NH3, entonces no queda

σ  O= 2 x (-2) = - 4 .

Remplazando 10.6 y 10.9 en 10.19 obtenemos

Determinamos los grados de redcuucion y Entonces Usando la ecuacion 10.22,