Resumen DNA total DNA de plasmidio DNA de fagos Aislamiento de DNA de bacteria Las bacterias se...
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Purificación de DNADra. Esther Z Vega
Universidad de Puerto Rico Humacao
ResumenDNA total
DNA de plasmidio
DNA de fagos
Aislamiento de DNA de bacteria
Las bacterias se cultivan en medio favorable a temperatura óptima
Se lisan las células y se libera el contenido
Tratamiento del extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA
Se concentra la solución de DNA
DNA Purification > Total Cell
Crecimiento de la bacteria
Crecimiento de medio líquido Medio definido Medio complejo
Crecimiento en medio sólido
Growth can be monitored by optical density
Monitoreo del crecimiento
Growth can be monitored by optical density
Monitoreo del crecimiento
Separación de célulasColecta de células
Centrifugación
Monitoreo del crecimiento
Preparación del extracto celular Las células deben lisarse para liberar el DNA
Métodos Físicos Fuerza mecánica es aplicada para romper la
pared y la membrana Mortero, sonicación
Métodos Químicos Ataque químico a la pared y membrana celular Pared- lisozima, EDTA o ambos Membrana- detergente (SDS)
Lisis celular
Rompimiento de la pared
La lisozima digiere los polisacáridos, componentes estructurales de la pared
EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de magnesio esenciales en preservar la estructura de la célula e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA
Rompimiento de la membrana
SDS es un detergente que remueve las moléculas de lípidos
DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell
Centrifuge removes insoluble cell debris
DNA Purification > Total Cell
Purificación del DNAAdemás del DNA, todavía se encuentran una
gran cantidad de proteínas y de RNA
La remoción de éstas es importante para evitar interferencia en el análisis
Remoción de proteínas y RNA
Extracción orgánica Adición de fenol ó fenol/cloroformo Se precipitan las proteínas; formación de una
capa blanca en la interfase entre la capa orgánica y la acuosa
Se remueve la solución acuosa
Organic Extraction
DNA Purification > Total Cell > Purification
Extracción orgánica¿Qué tal si hay un exceso de proteínas?
Se repiten las extracciones con fenolNo favorable; destrucción del DNA con el
movimiento Rompimiento con proteasa antes de la extracción
Pronasa o proteinasa K
Extracción orgánicaParte del mRNA es removido con el tratamiento
a fenol.
El remanente del RNA puede ser digerido con ribonucleasas (si es necesario).
Concentration of DNA
DNA Purification > Total Cell
Extracción por SilicaGuanidium thiocyanate
Desnaturaliza el material que no es DNA Hace que el DNA se enlace a las partículas de
silica
Se añade silica directamente o la muestra se pasa por una columna de silica
Remoción de DNA al añadir agua
Purificación de DNA con partículas de silica
DNA Purification > Total Cell > Purification
Extracción de DNA de otros tipos de células
Células vegetales: alto contenido de carbohidratos Lisozima no tienen efecto Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une
a los ácidos nucléicos y los precipita Se centrifuga y se remueve el sobrenadante
Células animales: no tienen pared, lisan con SDS
Purification of Plant DNA
DNA Purification > Total Cell
DNA de plasmidioSe crece la bacteria y se colecta
Se rompen las células y se libera el contenido
Se trata el extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA de plasmidio
Se concentra la solución de DNA
DNA de plasmidioSeparación basada en diferencias entre el
plasmidio y el DNA bacterial tamaño- plasmidios son mucho más pequeños
Separación por tamañoEn orden de maximar las diferencias,
rompimiento mínimo del DNA bacterial
Cuando el rompimiento es mínimo, el DNA formará parte del debris celular
Rompimiento mínimo se logra utilizando técnicas de rompimiento suave
Rompimiento suave de la célula
Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa evita el rompimiento inmediato
Al formar esferoplastos, la célula puede lizarse con la adición de detergentes no-íonicos
DNA Purification > Plasmid DNA
Separación basado en conformación
Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños plasmidios circulares
Separación basada en conformación
Rango de pH más estrecho cuando el DNA ¨superenrrollado¨es desnaturalizado y el DNA regular no.
Se usa un lisado claro Al añadir base; DNA regular es desnaturalizado Al añadir ácido; DNA regular es una masa
¨enredada¨ El DNA ¨enredado¨es ¨pellet¨
DNA Purification > Plasmid DNA
Separación basado en conformación
DNA ¨superenrrollado¨ también puede ser separado del DNA regular utilizando bromuro de etidio en asociación con un gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCl)
Separación basado en conformación
Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero sólo en cantidad limitada a DNA ¨superenrrollado¨
Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de DNA ¨normal¨
DNA Purification > Plasmid DNA
DNA Purification > Plasmid DNA
DNA de fagosEl DNA de fagos puede estar fuera de la célula;
no hay que comenzar con un extracto celular
Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el fago en suspensión
La dificultad es obtener una concentración grande de fagos por ml de cultivo
Para obtener títulos altosEl fago debe estar en fase lítica
Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el ciclo de crecimiento
Purificación de DNA fagos
Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno (PEG)
Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver.
Purificar por gradiente de densidad de CsCl.
www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web S572,FL06,MPurifyDNA.pdf