REVENCYT-RedidiCiencia.Indicadores de calidad sanitaria en ...

Molina Noreldy

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado, comercializado en supermercados de la

ciudad de Mérida, Venezuela y caracterización fenotípica y genética de Salmonella enterica

Universidad de Los Andes-Facultad de Farmacia y Bioanálisis-Postgrado en Microbiología. 2009.

p. 92

Venezuela

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS

MAESTRIA EN MICROBIOLOGÍA MENCIÓN ALIMENTOS

MÉRIDA -VENEZUELA

Ul\IVERSIDAD DE LOS Al\DES VtNcLUtLA

INDICADORES DE CALIDAD SANITARIA EN POLLO CRUDO

PROCESADO, COMERCIALIZADO EN SUPERMERCADOS DE LA

CIDDAD DE MÉRIDA, VENEZUELA Y CARACTERIZACIÓN

FENOTÍPICA Y GENÉTICA DE Salmonella enterica

Autor: Farm. Noreldy Molina

Tutor: Dra. María del Carmen Araque

Mérida, Julio de 2009

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS

MAESTRIA EN MICROBIOLOGÍA MENCIÓN ALIMENTOS

MÉRIDA -VENEZUELA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES \'~!'.~ll'lL,'\

INDICADORES DE CALIDAD SANITARIA EN POLLO CRUDO

PROCESADO, COMERCIALIZADO EN SUPERMERCADOS DE LA

CIUDAD DE MÉRIDA, VENEZUELA Y CARACTERIZACIÓN

FENOTÍPICA Y GENÉTICA DE Salmonella enterica

TRABAJO PRESENTADO COMO REQUISITO PARA OPTAR AL GRADO

DE MAGÍSTER EN MICROBIOLOGÍA MENCIÓN ALIMENTOS

Autor: Farm. Noreldy Molina

Tutor: Dra. María del Carmen Araque

Mérida, Julio de 2009

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL ....................................................................... .

ÍNDICE DE TABLAS .................................................................... ..

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................... .

ÍNDICE DE ANEXOS ................................................................ ..

RESUMEN .................................................................................. .

INTRODUCCIÓN .................................................................................... ..

MARCO TEÓRICO ................................................................................... ..

I Inocuidad de los alimentos

PAG

lll

V

VI

vii

Vlll

1

5

5

1.1 Sistemas de inocuidad de alimentos y sanidad animal 5

II Indicadores de calidad sanitaria 7

III Características microbiológicas del género Salmonella 9

ID.1 Epidemiología de la salmonelosis 11

IV Características patogénicas del género Salmonella 15

V El pollo beneficiado como vía de transmisión de Salmonella 20

VI Tipificación de Salmonella 22

VII Susceptibilidad de Salmonella a los agentes antimicrobianos y

desinfectantes 24

VID Control de brotes de salmonelosis 28

HIPÓTESIS... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

OBJETIVOS.......................................................................................... 32

Objetivos generales 32

Objetivos específicos 32

MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................... 34

Recolección de las muestras 34

l. Estudio Microbiológico 34

1.1 Determinación de indicadores de calidad sanitaria 34

1.2 Aislamiento de cepas de Salmonella 31

1.3 Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana 38

iii

l. 4 Prueba de susceptibilidad a desinfectantes 40

2. Estudio Molecular 41

2.1 Extracción del ADN cromosoma! de las cepas de Salmonella 41

2.2 Determinación de genes de invasividad invA y virulencia spvC 42

2.3. Tipificación de cepas de Salmonella por REP-PCR 42

2.4 Electroforesis de los productos de amplificación 43

2.5 Construcción del dendograma. 43

RESULTADOS.......................................................................... 44

DISCUSIÓN.............................................................................. 56

CONCLUSIONES...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

RECOMENDACIONES............................................................... 65

BffiLIOGRAFÍA...................................................................................... 67

ANEXOS................................................................................. 79

lll

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Clasificación de las especies del género Salmonella, según el esquema de Kauffmann - White.

Tabla 2 Estimación anual de las enfermedades de origen bacteriano transmitidas por alimentos en Estados Unidos

Tabla 3 Brotes de salmonelosis de origen alimentario ocurrido en el período 1993-2002 en países latinoamericanos.

Tabla 4 Brotes de salmonelosis por consumo de carne de pollo ocurrido en el período 1993-2002 en países latinoamericanos.

Tabla 5 Genes que codifican los factores de patogenicidad en Salmonella.

Tabla 6 Ubicación y actividad de las islas de patogenicidad de Salmonella spp.

Tabla 7 Algunos brotes causados por consumo de pollo contaminado con Salmonella spp. en los últimos 6 años.

Tabla 8 Determinación de los indicadores sanitarios en las muestras de carne de pollo crudo.

Tabla 9 Distribución del total de muestras de carne de pollo crudo analizadas de acuerdo al resultado del aislamiento de cepas de Salmonella spp.

Tabla 1 O Identificación microbiológica y serológica de cepas de Salmonella spp. aisladas de carne de pollo crudo.

Tabla 11 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) en serotipos de S. enterica aisladas de carne de pollo crudo a 16 antibióticos.

Tabla 12 Distribución de los patrones de resistencia y detección fenotípica de ~-lactamasas de espectro expandido (~LEE) en serovariedades de S. enterica aisladas de carne de pollo.

Tabla 13 Determinación de las características microbiológicas de serotipos de S. enterica aisladas de carne de pollo crudo.

Tabla 14 Detección de genes que codifican para la virulencia en serotipos de S. enterica aisladas de carne de pollo crudo no industrial.

Tabla 15 Límites microbiológicos nacionales e internacionales de los diferentes indicadores sanitarios para pollo crudo de consumo humano.

IV

PAG

10

13

13

14

19

20

21

45

46

47

49

50

51

53

81

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

ÍNDICE DE FIGURAS

Fisiopatología de la gastroenteritis por Salmonella spp

Esquema para la determinación de indicadores de calidad sanitaria de muestras de pollo crudo

Esquema del aislamiento de Salmonella en muestras de pollo crudo

Esquema de la determinación de la CIM de cepas de Salmonella

Plantilla utilizada para la Prueba de Sinergismo de Doble Disco (PSDD) en la determinación fenotípica de ~-lactamasas de espectro expandido (BLEE).

Esquema de la determinación de susceptibilidad a desinfectantes

PAG

17

35

38

39

40

41

Figura 7 Distribución de los serogrupos de Salmonella aisladas de 4 7 pollo crudo

Figura 8 Distribución de las subespecies de Salmonella aisladas de 48 pollo crudo

Figura 9 Gen invA mediante PCR convencional de serotipos de S. 52 enterica aisladas de pollo crudo procesado (no industrial)

Figura 10 Gen spvC mediante PCR convencional de serotipos de S. 52 enterica aisladas de pollo crudo procesado (no industrial).

Figura 11 Patrones REP-PCR de serotipos de S. enterica aisladas de 54 pollo crudo procesado (no industrial).

Figura 12 Dendograma de serotipos de S. enterica aisladas de pollo de 55 crudo procesado (no industrial) con base a los patrones generados por el REP-PCR.

Figura 13 Fotografia representativa de las muestras de pollo crudo 80 (aliñado, sin aliñar y de origen industrial) adquiridas en cada muestreo en los tres supermercados.

Figura 14 Fotografia representativa de la identificación serológica y 82 clasificación de los serogrupos de Salmonella.

Figura 15 Fotografia representativa de la determinación de 83 betalactamasas de expectro expandido mediante la prueba de difusión de doble disco

V

INDICE DE ANEXOS

PAG Anexo 1 Muestras de pollo aliñado, sin aliñar y de empacado industrial

recolectadas de los tres supermercados 80 Anexo 2 Límites microbiológicos nacionales e internacionales de los

diferentes indicadores sanitarios para pollo crudo de consumo humano. 81

Anexo 3 Identificación serológica y clasificación de los serogrupos de Salmonella.. 82

Anexo 4 Determinación fenotípica de betalactamasas de expectro expandido. 83

Vl

INDICADORES DE CALIDAD SANITARIA EN POLLO CRUDO PROCESADO, COMERCIALIZADO EN SUPERMERCADOS DE LA

CIUDAD DE MÉRIDA, VENEZUELA Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y GENÉTICA DE Salmonella enterica

Noreldy Malina 1' 2 y María Araque 2'

3

1Laboratorio de Microbiología de Alimentos, 2Postgrado en Microbiología mención Alimentos y 3Laboratorio de Microbiología Molecular, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida 51 O 1, Venezuela

RESUMEN

Con el objeto de evaluar la calidad sanitaria del pollo crudo que se expenden bajo diversas presentaciones en supermercados del área urbana del Municipio Libertador del estado Mérida, Venezuela y caracterizar fenotípica y genéticamente cepas de Samonella enterica, se estudiaron un total de 45 muestras de pollo crudo, de los cuales 15 correspondieron a pollo sin aliños, 15 con aliños y 15 de origen industrial. Los indicadores de calidad sanitaria evaluados fueron: Bacterias Aeróbicas Mesófilas (BAM), coliformes totales, E. coli y S. aureus, utilizando la metodología de la Comisión Venezolana de Normas Industriales (COVENIN) y pruebas rápidas de cuantificación (Rida Counte®) en el caso de los últimos tres indicadores. El aislamiento, identificación microbiológica y serológica de Salmonella se realizó mediante técnicas convencionales. La susceptibilidad antimicrobiana se determinó por Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y para la detección de f3-lactamasas de espectro extenso (BLEE) se utilizó la prueba del sinergismo del doble disco. La susceptibilidad a desinfectantes se realizó por el método de dilución-neutralización. La genotipificación de las cepas de Salmonella aisladas se llevo a cabo determinado los genes de patogenicidad invA y spvC, así como, la relación clonal mediante REPPCR. Los resultados obtenidos demostraron que independientemente de las características de la muestra de pollo crudo (no industrial) y del establecimiento comercial, los recuentos obtenidos para BAM, coliforme totales, E. coli y S. aureus en la mayoría de las muestras, superaron significativamente los límites de aceptabilidad. Se aislaron cepas de Salmonella enterica en un 20% de las muestras procesadas, de las cuales el serotipo Heidelberg (55,6%) y Enteritidis (22,2%) fueron los más frecuentes. Estos serotipos presentaron multirresistencia y producción BLEE, pero fueron susceptibles a los desinfectantes probados. El gen de invasividad inv A estuvo presente en todas las cepas aisladas y en cuatro de éstas se les detectó el gen de patogenicidad spvC. La tipificación por REP-PCR determinó que las cepas no estaban relacionadas clonalmente y sus índices de similaridad alcanzaron sólo el 42%. Se concluye que el pollo crudo con y sin aliños procesados en los establecimientos comerciales estudiados, no cumplen con la calidad microbiológica

vii

adecuada y puede constituir un vehículo de alto nesgo para la salud de los consumidores.

Palabras clave: calidad sanitaria, pollo, Salmonella, multiresistencia, inv A, spvC, REP-PCR

Vlll

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella entenca.

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ET A) constituyen un importante

problema de salud pública mundial por su magnitud, impacto socioeconómico y

por el surgimiento de patógenos emergentes (Quevedo, 2002; Rodríguez y col. 2005). En

Estados Unidos, donde la etiología de las toxiinfecciones alimentarias está

profundamente estudiada, se estima que las infecciones de origen alimentario

causan anualmente 76 millones de enfermos, con 325.000 hospitalizaciones y

5.000 decesos por año (Mead y col. 1999). De igual forma, se asume que entre un 15-

20% de las ET A, están directamente asociadas al consumo de carne de pollo o sus

derivados (Alexandre y col., 2000; Boscán y col., 2005).

Mundialmente el consumo de carne de origen avícola y sus subproductos se ha

incrementado en los últimos años. En Venezuela, constituye uno de los rubros de

consumo masivo, debido a que es un producto económicamente accesible y

altamente nutritivo (Boscán y col., 2005). La carne de aves en general, y en particular

la de pollo, constituye uno de los vehículos más importante para la transmisión de

enteropatógenos al hombre (OPS, 2003).

La inocuidad microbiológica de los alimentos es una de las condiciónes

indispensable para asegurar la salud de los consumidores (F AO, 2008). En el caso

de los productos avícolas, las operaciones de beneficio tales como: escaldado,

desplume, evisceración y despiece, constituyen puntos susceptibles de

contaminación microbiana. Así mismo, la contaminación cruzada de equipos,

utensilios y la manipulación del producto sirven de vías de transmisión para

microorganismos patógenos, especialmente Salmonella (lCMSF, 2001).

1


En América Latina y el Caribe durante el período 1995-1999, Salmonella fue el

segundo agente causal de brotes de ETA (35,33%), de los cuales el 9,8% fue por

consumo de carne de ave (SIRVETA, 2004). Recientemente en estudios realizados

en Yucatán, México (Zaidi y col., 2006a), han identificado la carne pollo como el

vehículo casi exclusivo de S. Enteritidis y en Bogotá, Colombia las infecciones

de origen alimentario relacionadas con el consumo de productos a base de huevos

han mostrado un alto grado de asociación con la presencia de Salmonella (Uribe y

Suárez, 2006). En Venezuela, la incidencia de las ET A por Salmonella es poco

conocida, excepto algunos casos que se encuentran documentados en el Sistema

Regional de Información para la Vigilancia de la Enfermedades Transmitidas por

Alimentos (SIRVETA, 2004), en donde se reporta que durante el período 1993 -

2002, se registraron 7 brotes de salmonelosis de origen aviar que afectaron a un

total de 72 personas. Sin embargo, paradójicamente se aíslan con frecuencia cepas

de Salmonella causantes de diarreas, especialmente en la población infantil, las

cuales pudieran tener características microbiológicas y serológicas semejantes a

las cepas de Salmonella que circulan en los alimentos y específicamente las

encontradas en pollo (Hohman, 2001; Graham, 2002; Zaidi y col. 2006a; Araque, 2009).

La falta de un sistema de vigilancia con comunicación entre epidemiólogos,

clínicos, y el sector veterinario, así como la ausencia de una infraestructura

adecuada, dificulta que países como Venezuela, tenga la capacidad de identificar

las principales serovariedades de Salmonella en diferentes clases de alimentos, así

como determinar el riesgo que cada una de estas cepas pueda tener para amenazar

la salud del hombre (Mata, 2007; Araque, 2009).

2

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella enterica.

Por otra parte, es importante destacar que el uso indiscriminado de los antibióticos

tanto en animales como en el humano, así como de los desinfectantes en la

sanitización de la industria de alimentos, ha favorecido la selección, circulación y

transmisión de cepas de Salmonella multirresistentes a los agentes

antimicrobianos y desinfectantes (Mata, 2007; Patchanee y col., 2008). Por

consiguiente, la cadena alimentaria ha jugado un papel preponderante en el

incremento del riesgo epidemiológico de las ET A y en la diseminación de genes

de resistencia en la población bacteriana. De manera que, el fenómeno de

resistencia representa actualmente un desafio para la industria de alimentos, por el

hecho de que se debe asegurar y garantizar la calidad de los procedimientos de

sanitización y la inocuidad del producto fmal (Cardoso y col., 2008).

Salmonella se perfila como uno de los principales agentes causales de

enfermedades transmitidas por los alimentos. La detección y el control de los

brotes asociados con este enteropatógeno son complicados, debido a que existen

más de 2.500 serotipos de S. enterica, por lo que surge la necesidad de incorporar

nuevos métodos de vigilancia para las ET A. En consecuencia, el Ministerio del

Poder Popular para la Salud y Protección Social (MPPSPS) platea la introducción

de métodos moleculares para la subtipificación de cepas aisladas de origen

alimentario y el monitoreo de la resistencia antimicrobiana, en el marco de la Red

Internacional de PulseNet en América Latina auspiciado por la Organización

Mundial de la Salud (OMS) (MPPSPS Dirección de Vigilancia Epidemiológica, 2003). Esta

iniciativa permitirá conocer la diversidad y variabilidad clonal de cepas

relacionadas o no epidemiológicamente, reconocer rápidamente la existencia de

3


brotes y facilitar la comunicación para la toma de acciones pertinentes de control

y prevención.

Con base a lo anteriormente expuesto, en este estudio se evaluó inicialmente los

indicadores de calidad sanitaria en muestras de carne de pollo crudo con y sin

aliños que se expenden bajo diversas presentaciones en supermercados del área

urbana del Distrito Libertador del estado Mérida, Venezuela y luego, se

caracterizó fenotípica y genéticamente cepas de Samonella enterica aisladas en

estas muestras.

4


MARCO TEÓRICO

l. Inocuidad de los alimentos

De acuerdo a lo establecido por el Codex Alimentarius, la inocuidad de un

alimento es la garantía de que el mismo no causará daño al consumidor cuando

sea preparado o ingerido de acuerdo con el uso al que se destine. Los alimentos

son la fuente principal de exposición a agentes patógenos, tanto químicos, :fisicos,

como biológicos (virus, parásitos y bacterias). Cuando son contaminados en

niveles inadmisibles de agentes patógenos y contaminantes :fisico-químicos o con

otras características peligrosas, conllevan riesgos importantes para la salud de los

consumidores y representan grandes cargas económicas para las diversas

comunidades y naciones (Panalimentos OPS/OMS, 2002).

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación

(F AO), se enfoca en la cadena alimentaria como objetivo primordial para la

gestión de la calidad e inocuidad de los alimentos, y reconoce la responsabilidad

de todos los participantes de la cadena alimentaria en el suministro de alimentos

inocuos, saludables y nutritivos. El Servicio de Calidad de los Alimentos y

Normas Alimentarias de la F AO (AGNS, por su siglas en inglés) tiene como

propósito, aumentar la calidad e inocuidad de los alimentos a lo largo de la cadena

alimentaria a todos los niveles, con el objeto de evitar las enfermedades

transmitidas por los alimentos, proteger a los consumidores y promover prácticas

apropiadas en el comercio de productos alimentarios (FAO, 2008).

1.1 Sistemas de inocuidad de alimentos y sanidad animal

Los sistemas de aseguramiento de la inocuidad alimentaria permiten aplicar y

5


verificar medidas de control destinadas a asegurar la inocuidad y la calidad de los

alimentos, además están dirigidos a abarcar y fortalecer los diferentes eslabones

de la cadena alimentaria durante las etapas de su producción y fabricación. Entre

estos sistemas de control se encuentran (Díaz, 2008; F AO, 2008): las Buenas Prácticas

Agrícolas (BP A), Buenas Prácticas Pecuarias (BPP), Procedimientos Operativos

Estandarizados de Saneamiento (POES), Buenas Prácticas de Higiene (BPH),

Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), Análisis de Peligros y Puntos Críticos de

Control (HACCP, por sus siglas en inglés) y la Evaluación de Riesgos

Microbiológicos (ERM).

Las BP A y BPP están involucradas en el primer eslabón de la cadena alimentaria

en acciones que aseguran la inocuidad de productos de origen agropecuario y

animal respectivamente, en tanto que los POES definen los pasos a seguir para

asegurar el cumplimiento de los requisitos de limpieza y desinfección, que deben

estar presentes durante toda la cadena de procesamiento de alimentos (FAO, 2008).

Las condiciones en que se manipulan los alimentos desde la producción primaria

hasta su consumo final, así como las normas que regulan las plantas de acopio y

procesadoras de alimentos son determinadas por las BPH y BPF respectivamente

(F AO, 2008).

En el sistema de HACCP identifica, evalúa y controla los peligros importantes

para la inocuidad de los alimentos, para poder implementarse es necesario que

funcionen los programas de BP A, BPF y BPH (F AO, 2008). En tanto que, la ERM

es una herramienta que permite vincular las medidas de control de los alimentos y

gestión de inocuidad, con la repercusión real en la salud de los consumidores,

determinando con base científica si las BPF y HACCP garantizan realmente la

6

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella enterzca.

inocuidad de los productos alimenticios (Díaz, 2008).

Las deficiencias de los sistemas de inocuidad de los alimentos pueden hacer

aumentar la incidencia de las ET A La protección de la salud humana frente a las

enfermedades e infecciones transmisibles directa o indirectamente de los animales

al ser humano (zoonosis) reviste gran importancia. Salmonella entre otros agentes

zoonóticos causan enfermedades en animales que son transmisibles al ser

humano. Una de las principales especies con alto potencial de transmisión son las

aves de corral (Actividades de la Unión Europea, 2007). La Unión Europea (UE),

la Comisión del Codex Alimentarius y la Organización Mundial de la Salud

(OMS), elaboran las medidas sanitarias y fitosanitarias (MSF) para el control de

las aves, entre otros animales, con la finalidad de reducir la prevalencia de

salmonelosis y otras zoonosis a nivel de la producción primaria y en otras fases

de la cadena alimentaria, para así proteger la vida o la salud de éstos y de las

personas (Actividades de la Unión Europea, 2007; FAO, 2007). De éste modo

proporcionan a los países un modelo para la formulación de leyes nacionales. De

manera que, si estas normas y directrices se aplican debidamente, quedará

garantizada la inocuidad de los alimentos, así como la protección del consumidor

(F AO, 2007).

11. Indicadores de calidad sanitaria.

El control sanitario durante la manipulación de alimentos es determinante para

reducir los factores de riesgo que influyen en las ET A Los criterios

microbiológicos ofrecen a la industria alimentaria y a los organismos reguladores

las directrices para controlar los sistemas de elaboración de alimentos (Doyle y col.,

2001).

7

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonel/a enterica.

Los microorganismos indicadores para determinar calidad sanitaria van a

depender de las características intrínsecas y extrínsecas del alimento a evaluar

(Mossel y col, 2003). Generalmente se cuantifican entre otros indicadores: mesófilos

aerobios, coliformes totales (comprende E. coli y diversas especies pertenecientes a

otros géneros de la familia Enterobacteriaceae), coliformes fecales (E. coli),

Staphylococcus aureus, mohos y levaduras, los dos últimos sin relevancia en

alimentos con elevada actividad de agua como el pollo crudo (ICMSF, 1982).

Recuentos elevados de microorganismos aeróbicos mesófilos y coliformes totales

en alimentos perecederos pueden indicar una manipulación sanitaria no

satisfactoria. Por otra parte, condiciones inadecuadas de almacenamiento

(tiempo/temperatura) y un elevado recuento de los indicadores sanitarios, conlleva

a una disminución de la vida útil del alimento, además del favorecimiento de

condiciones para la multiplicación de microorganismos patógenos de origen

humano o animal (ICMSF, 1982).

El recuento de S. aureus, por lo general, es indicativo de contaminación a partir de

la piel, la boca y las fosas nasales de los manipuladores de alimentos y/o del

animal durante el sacrificio en el caso de alimentos de este origen (ICMSF, 1982,

Mossel y col; 2003). Cuando se encuentra un número considerable de esta bacteria en

un alimento, significa por lo general que las prácticas de limpieza y desinfección,

así como el control de la temperatura de almacenamiento no han sido los más

adecuados. En productos frescos y crudos como el pollo, cuando los recuentos de

S. aureus son altos (independientemente de la fuente humana o animal), existe la

posibilidad de encontrarse cepas enterotoxigénicas, que eventualmente pudieran

8


ser agentes etiológicos de intoxicaciones alimentarias (ICMSF, 1982, Mossel y col;

2003).

E. coli tiene como hábitat natural el tracto entérico del hombre y de los animales. La

presencia de este microorganismo en un alimento indica generalmente una

contaminación directa o indirecta de origen fecal, que puede o no estar asociado con

la presencia de uno o más microorganismos patógenos intestinales, entre estos

Salmonella (lCMSF, 1982).

111. Características microbiológicas del género Salttumella

La carne de aves en general, y en particular la de pollo, constituye el vehículo más

importante para la transmisión de enteropatógenos al hombre, especialmente

Salmonella (OPS, 2003).

Salmonella, único género dentro de la tribu Salmonelleae, pertenece a la familia

Enterobacteriaceae (Koneman y col, 1999; Cabello y Benavente, 2002). Son bacilos

gramnegativos, no encapsulados, flagelados y móviles (a excepción de S.

Gallinarum y S. Pullorum que son inmóviles), aerobios o anaerobios facultativos

(Holt y col, 1994; Sánchez y Cardona, 2003).

De acuerdo al sistema propuesto por el Center for Disease Control and Prevention

(CDC) de Estados Unidos, basándose en técnicas con isoenzimas, secuencias de

ARNr e hibridación del ADN, se reconocen dos especies en el género Salmonella:

Salmonella ente rica y Salmonella bongori. Salmonella ente rica ha sido

subdividida en seis subespecies, las cuales son referidas por un número romano y

un nombre (Tabla 1) (Brenner y col, 2000; CDC, 2002; MtUTay y col, 2003). Cada

subespecie, a su vez, está subdividida en serotipos o serovares en función de sus

9


antígenos flagelares ("H") y lipopolisacáridos ("0"), que son moléculas que se

encuentran en la superficie de la célula bacteriana (Chiu y col, 1996, Ochman, 2000;

Gales y col, 2002; Calva, 2003).

Tabla 1: Clasificación de las especies del género Sal1twnella, según el esquema de Kauffmann- White

Especies S. entérica

S.bongori

Brenner y col., 2000.

Subespecies enterica (I) salamae (II)

arizonae (lila) diarizonae (Illb)

houtenae (IV) indica (VI)

Total

N" de serotipos 1504 502 95

333 72 13 22

2541

Hábitat natural Animales de sangre caliente

Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente Animales de sangre fría y ambiente

Con respecto a la nomenclatura, se usan nombres para los serotipos en la

subespecie 1 (por ejemplo: serotipos Enteritidis, Typhimurium, Typhi,

Choleraesuis) y fórmulas antigénicas, para los serotipos sin nombre descritos

después de 1966 en las subespecies II, IV, VI y en S. bongori. Para enfatizar que

ellos no son especies separadas, el nombre del serotipo no se escribe en itálica y

la primera letra es mayúscula (Brenner y col, 2000; Murray y col, 2003).

En el género Salmonella se incluyen más de 2.500 serotipos diferentes, y aunque

todos los serotipos deben ser considerados patógenos potenciales, sólo un número

limitado de ellos son responsables de causar infecciones en los humanos y en los

animales (Baggesen y col, 2000; Gutiérrez-Gogco y col, 2000).

Clínicamente, las infecciones ocasionadas por Salmonella se manifiestan en el

hombre con diarrea, fiebre moderada, calambres abdominales, escalofríos,

náuseas, vómitos, postración, anorexia y malestar general; estos síntomas se

presentan entre las pnmeras 12 a 72 horas posteriores a la adquisición de la

10


bacteria (Navarro y col, 2000). Usualmente, en los adultos y en los niños saludables,

la infección permanece confinada al tracto gastrointestinal como una enfermedad

autolimitada que se resuelve en 5 a 7 días sin requerir tratamiento con

antibióticos. Los estudios al respecto han sugerido que la terapia antimicrobiana

no acorta la duración de los síntomas, por el contrario; puede suprimir la flora

intestinal saprofita y contribuir a prolongar el estado de portador (Zaidi y col, 1999;

Cabello y Benavente, 2002; Mandell y col, 2002; Miriagou y col, 2004; Li y col, 2005).

Excluyendo a S. Typhi, S. Paratyphi (A y C) y S. Sendai, agentes causales de las

llamadas fiebres entéricas que afectan específicamente al hombre, todas las demás

serovariedades de Salmonella se pueden considerar como zoonosis, siendo este

tipo de infecciones las más difundidas en el mundo. Las enfermedades o los

síndromes causados por las serovariedades zoonóticas son denominadas como

salmonelosis (Uribe y Suárez, 2006).

111.1 Epidemiología de la salmonelosis de origen aviar

De manera particular, las bacterias pertenecientes al género Salmonella han

alcanzado una enorme importancia en el ámbito médico, sanitario y económico en

todo el mundo como consecuencia de su amplia distribución en el medio

ambiente, prevalencia creciente en la cadena alimentaria general, virulencia y su

capacidad de adaptación a diversos hospedadores (Manden y col, 2002).

La salmonelosis es una infección considerada de importancia en la salud pública;

mundialmente se estima que se presentan más 16 millones de casos de

salmonelosis y 500.000 muertes anuales (Doyle y col., 2001) En países

subdesarrollados de América Latina, Asia y África; la prevalencia de Salmonella

11


spp oscila entre 200 a 500 casos por cada 100.000 habitantes (Sánchez y Cardona,

2003).

Según cifras del informe de zoonosis 2005 de la European Food Safety Authority

(EFSA), del O al 18% de muestras de carne fresca de pollo (crudo) están

contaminadas con Salmonella. Este patógeno ha sido la segunda causa más

notificada de enfermedad de transmisión alimentaria en humanos en Europa con

176.395 personas víctimas de infecciones en el año 2005 (EFSA, 2007).

Por otra parte, EFSA ha publicado un estudio sobre los índices de Salmonella

detectados en lotes de pollo asado en toda la Unión Europea (EU) durante el

período 2005-2006. Se estima que Salmonella está presente en uno de cada 4 lotes

(23,7%) de pollo asado. En consecuencia, la Comisión Europea estableció una

meta de reducción de los índices de este patógeno para toda la UE en los lotes de

pollo asado, para los dos serotipos de Salmonella más frecuentes Enteritidis y

Typhimurium, responsables de la mayoría de casos de toxiinfecciones

alimentarias (EFSA, 2007).

En Estados Unidos, Salmonella representa la segunda causa de mayor incidencia

en la estimación anual de las enfermedades transmitidas por alimentos, con

1.340.000 afectados, sólo precedido por Campylobacter jejuni (Tabla 2) (Brooks

col.,2005a).

En Latinoamérica durante el lapso comprendido entre 1993-2002 se han

reportado 964 brotes y 47.941 afectados por salmonelosis de origen alimentario,

tal como se muestra en la Tabla 3 (SIRVETA, 2004).

12


Tabla 2. Estimación anual de las enfermedades de origen bacteriano transmitidas por alimentos en Estados Unidos

Organismo

Bacillu cereus

Campylobacter jejuni

Clostridium peifringens

Escherichia coü 0157:H7

Otras E. coli

Listeria monocyogenes

Sabnonella spp.

Staphylococcus aureus

Streptococcus

Yersinia enterocoütica

Otras bacterias

Total Brooks y col., 2005a.

N" anual

27.000

1.963.000

248.000

63.000

110.000

2.500

1.340.000

185.000

50.000

87.000

102.000

4.177.500

Alimentos

Arróz y alimentos con almidón y azúcar

A ves y lácteos

Carnes precocinadas, productos cárnicos

Carne, especialmente picada

Carne, especialmente picada

Carne y lácteos

A ves, carne, lácteos, huevos

Carne, postres

Lácteos, carne

Carne de cerdo, leche

Tabla 3. Brotes de salmonelosis de origen alimentario ocurrido en el período 1993-2002 en países Latinoamericanos.

País Brotes Enfermos Fallecidos

Argentina 40 665 4 Bah amas 4 24 o Barbados 1 4 o

Bolivia 2 10 1 Brasil 242 11345 3 Chile 36 690 o

Colombia 4 171 o Costa Rica 1 4 o

Cuba 453 27929 4 Ecuador 1 35 o

El Salvador 3 75 o Guatemala 1 3 o

México 36 2409 2 Panamá 5 62 o

Paraguay 2 26 o Perú 27 1640 1

República Dominicana 2 26 o Trinidad y Tobago 10 56 o

Uruguay 63 2173 o Venezuela 7 72 o

Totales 964 47.941 15 Fuente: SIRVETA, 2004

13


De los 964 brotes señalados en la Tabla 3, setenta y seis (76) fueron causados por

el consumo específico de carne de ave contaminada con Salmonella, causando un

total de 3.680 afectados con esta infección bacteriana En Venezuela, se han

registrado dos brotes de salmonelosis (Tabla 4), el primero de ellos afectó a 9

personas; el segundo brote, ocurrió en la isla de Coche en el año 1998

ocasionando la enfermedad a 8 personas que consumieron pollo en un restaurante

del mencionado lugar (SlRVIETA, 2004).

El hecho de que sólo haya registro de dos brotes de salmonelosis durante el

periodo 1993-2002 en Venezuela, no implica que sea la incidencia real de esta

enfermedad. El problema de salud causado por la infección debida a

serovariedades no tifoideas de Salmonella, se agudiza con la falta de reportes

epidemiológicos, la apertura económica y el incremento del consumo de pollo y

subproductos (Suárez y Matilla, 2000; European Food Safety Authority, 2007).

Tabla 4. Brotes de salmonelosis por consumo de carne de pollo ocurrido en el período 1993-2002 en países Latinoamericanos.

País Brotes Enfermos Fallecidos Argentina 2 11 o

Brasil 9 120 o Chile 2 13 o

Costa Rica 1 4 o Cuba 35 2145 o

Ecuador 1 35 o El Salvador 1 25 o

México 6 361 o Paraguay 5 47 o

Perú 4 704 o República Dominicana 1 23 o

Trinidad y Tobago 3 7 o Uruguay 4 168 o

Venezuela 2 17 o Totales 76 3680 o

Fuente: SlRVETA, 2004

14

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Sa/monella entenca.

En Venezuela, no se conoce con exactitud la prevalencia de la salmonelosis

siendo la mayoría de las veces diagnosticada clínicamente, pasando por alto la

confirmación por cultivos bacteriológicos y su relación con los alimentos. En

consecuencia, no existen registros oficiales a nivel nacional que determinen la

frecuencia de aislamiento de este patógeno.

El Ministerio del Poder Popular para la Salud, a través de la Dirección de

Epidemiología y Análisis Estratégico y la Dirección de Vigilancia

epidemiológica, es el ente público encargado de llevar el registro epidemiológico

de las causas de morbilidad y mortalidad en Venezuela, en el que se incluyen las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ET A).

Para el estado Mérida, no existe dato alguno de los índices epidemiológicos de

Salmonella Enteritidis en lo últimos 10 años; salvo dos brotes ocurridos en la

ciudad de Mérida en el año 2005, ocasionando un total de 126 afectados de

gastroenteritis (CORPOSALUD, 2005).

Los escasos datos epidemiológicos de salmonelosis de origen aviar, no significan

que se esté exenta de ella en Venezuela Investigaciones realizadas en diferentes

universidades nacionales sobre el aislamiento, identificación y tipificación de

Salmonella en carne de aves de diferentes presentaciones, han arrojado

aislamientos de Salmonella de diferentes serovariedades (Infante y col., 1991; Sánchez,

1995; León y col., 1996; Boscán y col., 2005).

IV. Características patogénicas del género Salnwnella

El género Salmonella está conformado por bacterias invasoras que ingresan por

vía oral, éstos deben superar varias barreras o líneas de defensa naturales para

15


finalmente localizarse en el íleon terminal y el colon proximal del hospedero

(Kobayashi y col., 1997).

Salmonella habita normalmente en el intestino de los animales y, por ende, en las

aguas residuales, presenta diferencias en cuanto a la especificidad por el

hospedero. La inmensa mayoría de las cepas de Salmonella son patógenas

principalmente en animales que constituyen el reservorio de la infección humana;

aves, cerdos, roedores, bovinos~ mascotas, entre otros. Salvo algunas

serovariedades que son exclusivamente patógenas para el hombre, tales como: S.

Typhi (causante de la fiebre tifoidea), S. Paratyphi A y S. Paratyphi B (Brooks y

col., 2005b)

Entre los factores que contribuyen a la resistencia de la infección por Salmonella

en el hospedero se encuentran el ácido gástrico como primera barrera (Salmonella

tiene la capacidad de adaptarse a éste y puede sobrevivir a pH de 4,0), la flora

microbiana saprófita normal del intestino y la inmunidad intestinal local. Son más

susceptibles los individuos con aclorhidria, flora intestinal alterada y quienes

ingieren antiácidos, así como los niños prematuros, recién nacidos, personas con

bacteriemias prolongadas y pacientes con el virus de inmunodeficiencia humana

(VIH) (Romero, 2002; Sánchez. y Cardona, 2003; Brooks y col., 2005b).

Para evadir con éxito todas estas barreras, Salmonella ha desarrollado

mecanismos específicos. La capacidad para sobrevivir dentro de los macrófagos,

probablemente es esencial en la patogenia de la fiebre tifoidea y en la

diseminación de gérmenes a la circulación sistémica a través del conducto

torácico (Kobayashi y col., 1997; Sánchez y Cardona, 2003).

16

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonel/a enterica.

La bacteria luego que penetra las células epiteliales, migra a la lámina propia de la

región ileocecal, se multiplica en los folículos de la región linfoide presentando

hiperplasia e hipertrofia reticuloendotelial (Fig. 1 ). Los polimorfonucleares

neutrófilos son estimulados y la infección se limita, en el caso de enteritis, a nivel

del tracto gastrointestinal. En relación con su fisiopatología, si son serotipos

productores de fiebre entérica no son retenidas a este nivel smo que migran a

hígado y bazo por circulación hemática La respuesta inflamatoria media también

la liberación de prostaglandina, estimula la producción de AMP cíclico y la

secreción activa de líquidos, produciendo diarrea en el caso específico de la

enteritis (Kobayashi y col., 1997; Sánchez y Cardona, 2003).

Figura l. Fisiopatología de la gastroenteritis por Salmonella spp.

Fuente: Kobayashi y col., 1997; Sánchez y Cardona, 2003.

Cepas de S. enterica ingeridas que logran pasar por el contenido ácido del

estomago sin alterarse, migran por la capa de moco intestinal llegando finalmente

a los intestinos delgado y grueso adhiriéndose a la mucosa intestinal

probablemente mediado por el pili (Ryan y Ray, 2005).

17


La salmonelosis, dependiendo de la especie causal, tamaño del inoculo, factores

de virulencia expresados por la cepa, hospedero involucrado y el estado

inmunológico del paciente, puede ocasionar desde una infección gastrointestinal

media a severa hasta una infección sistémica que compromete la vida del paciente

(Figueroa y Rodríguez, 2005).

Dentro de los pasos que se presentan en el proceso infeccioso se pueden

mencionar: adhesión, invasión, replicación, resistencia a los mecanismos de

defensa y daño al hospedero (Figueroa y Rodríguez, 2005). Tal como se muestra en la

Tabla 5, debido a una regulación coordinada y precisa de los genes de virulencia,

Salmonella logra adaptarse a cambios ambientales que se le presentan durante el

proceso infeccioso (Figueroa y Rodríguez, 2005).

Se ha demostrado que Salmonella causa enfermedad a través de su habilidad para

adaptarse y crecer en ambientes hostiles dentro del cuerpo humano, evadiendo

simultáneamente el sistema inmune. Durante el proceso infeccioso, Salmonella se

encuentra tanto en el ambiente intracelular como en el extracelular, y se ha

determinado que el componente intracelular juega un rol significativo en la

enfermedad (Pfeifer y cols, 1999; Maurer y cols, 2000; ).

La expresión de los genes requeridos para la virulencia de estos patógenos

bacterianos está rigurosamente regulada en respuesta a condiciones ambientales

muy específicas (Pfeifer y cols, 1999). Las variaciones genéticas o polimorfismos de

las cepas de Salmonella son particularmente notables en dos clases de loci: los

genes que codifican las estructuras de superficie, tales como los lipopolisacáridos

(LPS), flagelos y fimbrias; y los genes de virulencia específicos (Tabla 5), que

18


codifican factores que modifican la fisiología de las células del hospedador o que

protegen a la bacteria de los sistemas defensivos de éste (Fierer y Guiney, 2001). Los

determinantes de virulencia específicos parecen estar agrupados en "islas de

patogenicidad" (regiones cromosomales presentes en las cepas patógenas) o

localizados en elementos genéticos transmisibles como plásmidos o fagos (tabla

6), facilitando la transmisión modular de los genes involucrados en la patogénesis

e incrementando la diversidad de los fenotipos de virulencia entre las cepas (Fierer

y Guiney, 2001; Fuchs, 2004).

Tabla 5: Genes que codifican los factores de patogenicidad en Salnwnella

Genes invH

invG invE invA invB invC

invL(spa.M) spaP, Q, R Spas prgH prgLyprgJ prgK orgA

Función Codifica proteína que actúa como factor de adhesión y componente estructural del complejo aguja del aparato de secreción tipo III Codifica proteína estructural del complejo aguja del aparato de secreción tipo III Codifica proteína requerida para la invasión in vitro Codifica proteína necesaria para la invasión Desconocida Codifica proteína que interactúa con otros componentes del aparato de secreción tipo III para facilitar la translocación de proteínas fuera de la célula Codifica proteína necesaria para invasión in vitro Requeridos para invasión y para la secreción de SipB, SipC e InvJ Requerido para la secreción de proteínas Codifica la proteína PGR, componente estructural del complejo aguja Desconocida Codifica proteína componente estructural del complejo aguja Codifica proteína requerida para invasión de células epiteliales en cultivo y para citotoxicidad en macrófagos

Fuente: Sánchez y Cardona, 2003.

Gracias a los avances en el estudio sobre patogénesis molecular y al desarrollo de

las técnicas moleculares, actualmente se han caracterizado por lo menos cinco

islas de patogenicidad en Salmonella (Tabla 6), algunas de las cuales se

encuentran presentes en cepas virulentas y ausentes en cepas no virulentas,

identificadas en zonas específicas del cromosoma bacteriano. La evidencia

experimental sugiere que estas regiones han sido adquiridas mediante

19


transferencia horizontal de material genético proporcionando a esta bacteria

funciones de virulencia complejas de otras especies, lo que le ha permitido la

divergencia y adaptación a nuevos nichos en sus hospederos vertebrados (Figueroa

y Rodríguez, 2005).

Tabla 6. Ubicación y actividad de las islas de patogenicidad de Salmonella spp.

Isla de patogenicidad SPI

ISP-1

ISP-2

ISP-3

ISP-4

ISP-5

Ubicación Actividad

Centisoma 63 Genes involucrados en la invasión, apoptosis de macrófagos y activación de cascadas de fosforilación dependientes de MAP cinasas (Mitogen-activated protein)

Centisoma 30 Requerida para crecimiento intracelular epitelial y sobrevivencia dentro de los macrófagos

Centisoma 82 Al igual que ISP-2, regulan la supervivencia y replicación bacteriana en los compartimientos intracelulares de fagocitos y células epiteliales.

Centisoma 92 Codifica un supuesto sistema de secreción tipo 1 y se cree que participa en la adaptación en ambientes intracelulares.

Centisoma 25 Codifica para factores involucrados en la secreción fluida y reacción inflamatoria en la mucosa intestinal

Fuente: Figueroa y Rodríguez, 2005

V. El poDo beneficiado como vía de transmisión de Salnwnella

La Comisión Venezolana de Normas Industriales (COVENIN), define al pollo

como el ave de la familia Faisanidae, del género Gallus de la especie domesticus

(COVENIN 2407-86, 1986). La Comisión Internacional de Especificaciones

Microbiológicas para Alimentos (por sus siglas en inglés: International

Commission on Microbiological Specifications for Foods-ICMSF) denota que la

carne de ave está constituida por el tejido muscular, piel adherida, tejido conectivo

y órganos comestibles de las especies de aves utilizadas como alimento (ICMSF,

2001).

La carne de pollo está provista de una elevada cantidad de proteínas, entre 20,2-

20,5 %, y el contenido de agua de las porciones comestibles de las canales es de

56- 71 %, características que aunadas a otros factores intrínsecos de la carne de

20


ave, como la actividad de agua, pH y potencial de óxido reducción influyen

favorablemente en el crecimiento de microorganismos como Salmonella (ICMSF,

2001). Además de las características intrínsecas, las condiciones extrínsecas

durante el proceso de cría, sacrificio, manipulación, conservación y

almacenamiento influyen en la contaminación microbiana de la carne de ave.

La carne de ave es un alimento muy contaminado superficialmente, tanto por

microorganismos causantes de intoxicaciones alimentarias humanas como por

saprófitos alterantes (Seguridad Alimentaria, 2007). Frecuentemente, la carne de ave se

ha asociado con la transmisión de Salmonella. En la Tabla 7, se observan algunos

ejemplos de casos de pollo contaminado en varias ciudades del mundo.

La Norma COVENIN 2343-86, establece como requisito en cuanto a la calidad

microbiológica del pollo beneficiado, total ausencia de Salmonella.

Tabla 7. Algunos brotes causados por consumo de pollo contaminado con Salnwnella spp. en los últimos 6 años. Ciudad (País) N" de N" de

Varias ciudades de

España" Palencia

(España)b Murcia

(Españat

afectados Muertes Mas de 1

1200 intoxicados

No especificado 75 personas

4

Ninguna

Causa

Pollo precocido contaminado con Salmonella marcas Pimpollo y Pollo Asado SADA® Salmonella enteritidis hallada en lentejas, pollo y concentrado de carne Consumo de pollo asado envasado al vacío contaminado con Salmonella.

Fecha

Agosto 2005

17/04/05

31/07/05

No se especifica Ninguna

Ninguna 47.174 Kg de alas de pollo importado 27/12/01 de EEUU contaminado con Salmonella

Naco (Honduras)e

Ninguna Brote de gastroenteritis por Salmonella 2004 Enteritidis

a. http://db.dovma.es/cgi-bin/wdbcgi .exeldovmalmrevista.fulltext?pident== 130%561 y http://db.doyma.es/cgibin/wdbcgi.exe/doyma/mrevista.fulltext?pident= 13096561.

b.http://www.abc.es/hemeroteca/historico-06-10-2004/abc/Nacional/hallan-salmonella-en-el-pollo-y-las-lentejas-que-comieron-los-ancianos-fallecidos-en-palencia 9624025224136.html

c. http://www .webdehogar.com/noticias/0507/31134040.htm

d. http://spanish.peopledaily.com.cn/spanish/200202/0llsp20020201 52288.html

e. http://www.bvs.hn/RMH75/pdf/2004/pdfNol72-2-2004-2.pdf

f 21

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Sa/monella enterica.

VI. Tipificación de Salnwllella.

La recuperación de Salmonella a partir de muestras de alimento se realiza en tres

etapas; una primera de preenriquecimiento de la muestra en caldo no selectivo a

una temperatura, pH y tiempo determinado, con la finalidad de recuperar las

células fisiológicamente débiles y favorecer la multiplicación de las mismas.

Luego una segunda etapa de enriquecimiento, mediante la inoculación del medio

de preenriquecimiento en dos caldos selectivos para la multiplicación de

Salmonella y la restricción del crecimiento de la mayoría de la flora

acompañante (COVENIN 1291,2004 yFDA, 2005).

En la tercera etapa de aislamiento e identificación, se inoculan los caldos de

enriquecimiento sobre medios selectivos, los cuales luego de incubados a

temperatura adecuada son examinados para observar la presencia de colonias que

por sus características sean consideradas presuntivas de Salmonella spp.

Para su confirmación se recurre a la determinación de las características

bioquímicas y serológicas de las cepas sospechosas de Salmonella (COVENIN 1291,

2004 y FDA, 2005).

Tradicionalmente, el método utilizado para la caracterización de los aislamientos

de Salmonella es la serotipificación basada en el esquema de Kauffinann-White.

De acuerdo a este esquema, cada serotipo de Salmonella está caracterizado por la

expresión combinada de lipopolisacáridos particulares (antígenos "O") y proteínas

flagelares (antígenos "H"). En la mayoría de los países, la serotipificación está

limitada a los laboratorios de referencia nacionales, por ser una técnica costosa y

laboriosa (Rasschaert y col, 2005). La subtipificación de las cepas de Salmonella

dentro de un serotipo, se lleva a cabo a través de métodos fenotípicos como el

22


perfil de resistencia a los antibióticos y desinfectantes (Millemann y col, 1995; Malorny

y col, 2001; Adaska y col, 2006). Sin embargo, el diagnóstico de las enfermedades

causadas por Salmonella spp y los estudios epidemiológicos requieren del

desarrollo de sistemas de tipificación con mayor poder discriminatorio (Schiaffino y

col, 1996; Malorny y col, 2001).

En los últimos 20 años, el uso de las técnicas moleculares para evaluar las

relaciones entre los aislamientos de Salmonella ha llegado a ser cada vez más

común (Adaska y col, 2006; Kim y col, 2006). Con frecuencia, estos métodos basados

en el ADN son empleados para investigar brotes de enfermedades, para esclarecer

la relación entre la fuente del brote y los casos clínicos, para diferenciar las cepas

relacionadas de las no relacionadas aisladas en un corto período y para monitorear

la difusión de las cepas desde sus fuentes de origen (Millemann y col, 2000; Adaska y

col, 2006).

Entre los numerosos métodos moleculares que han sido desarrollados y utilizados

para subtipificación de los serotipos de Salmonella por su alto poder

discriminatorio, se mencionan particularmente la ribotipificación, el análisis del

polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, restriction

fragment length polymorphism), la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE,

pulsed-field gel electrophoresis), el polimorfismo del ADN amplificado al azar

(RAPD, random amplified polymorphic DNA) y el perfil de inserción del IS200

(Baquar y col, 1994; Millemann y col, 1995; Stanley y col, 1995; Schiaffino y col, 1996;

Millemann y col, 2000; Malorny y col, 2001; Rasschaert y col, 2005; Adaska y col, 2006).

Las secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (repetitive extragenic

palindromic, REP) y las secuencias consenso repetitivas intragénicas de

23

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Sa/monel/a enterzca.

enterobacterias (enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC), son

algunas de las secuencias que más han sido utilizadas en estudios epidemiológicos

de brotes de salmonelosis (Liebana, 2002; Femández-Cuenca, 2004).

En la actualidad, no hay acuerdos de cuál método es el más idóneo para la

diferenciación entre serotipos de Salmonella. Sin embargo, la combinación de la

información epidemiológica convencional y molecular ha brindado elementos

importantes para la comprensión de la epidemiología de muchas enfermedades

infecciosas tales como la salmonelosis, en la que ha sido utilizada técnicas

moleculares para rastrear cepas específicas e identificar los brotes causados por

Salmonella no tifoideas de origen animal o de alimentos (Liebana, 2002; Betancor y

col., 2004).

VII. Susceptibilidad de Salnumella a los agentes antimicrobianos y

desinfectantes

El uso indiscriminado e irracional de los agentes antimicrobianos en la terapia

médica, en la agricultura y en la cría de animales se ha convertido en una nueva

presión selectiva sobre las poblaciones bacterianas (Hmmdt y Ochman, 2000; OMS,

2000; Sussmann y col, 2005). La resistencia bacteriana es un problema de distribución

mundial, que obliga a la producción inmediata de nuevos antibióticos; sin

embargo, el descubrimiento y desarrollo de éstos se produce lentamente (Martin,

2002; Sussmann y col, 2005).

La aparición de cepas de Salmonella que muestran resistencia a uno o más agentes

antimicrobianos se está incrementando continuamente. Esta situación se está

convirtiendo en un problema grave de salud pública, que conlleva al fracaso

24


terapéutico en la mayoría de los casos (Cabrera y col, 2004). Se ha reportado, con

frecuencia la resistencia de las cepas de Salmonella para algunos antimicrobianos,

tales como los 13-lactámicos, la tetraciclina, el cloranfenicol y el

trimetoprima/sulfametoxazol, especialmente en países de África, Asia y

Sudamérica (Mandell y col, 2002; Cabrera y col, 2004). Incluso cepas de Salmonella

aisladas de carne y vísceras de ave, han mostrado un perfil de resistencia a los

antibióticos antes señalados (Arroyo y col, 2002; INFOSAN, 2005). Esta resistencia

puede deberse bien a la administración indiscriminada de antibióticos tanto al

hombre como a los animales, a la utilización de estos compuestos en dosis

subterapéuticas en la prevención de enfermedades en animales y en piensos para

engorde animal (Arroyo y col, 2002).

Desde el año 2000, la incidencia de los aislamientos de Salmonella resistentes al

ácido nalidíxico se ha incrementado constantemente. El aumento en la resistencia

a este agente antimicrobiano se ha correlacionado con el uso extensivo de las

quinolonas para el tratamiento de infecciones en amplias regiones de la India y

América Central (Cabrera y col, 2004). Un estudio de vigilancia epidemiológica,

llevado a cabo entre 1994 y 1995 en los Estados Unidos, reportó un 0,5% de

resistencia al ácido nalidíxico y un 0,2% de resistencia a la ciprofloxacina en un

total de 4.008 aislamientos de Salmonella evaluados; en Inglaterra se ha reportado

que la incidencia de resistencia a las quinolonas aumentó del 0% en 1993 hasta el

14% en 1996 (Walker y col, 2001; Mandell y col, 2002).

Otros estudios reportan que más del 70% de las 13-lactamasas de espectro

extendido (BLEE) son producidas por las bacterias del género Klebsiella. Sin

25


embargo, en los últimos cinco años, estas enzimas han sido detectadas con una

frecuencia cada vez mayor en otras especies tales como E. coli, Proteus mirabilis,

Salmonella sp (especialmente S. Typhimurium y S. Heidelberg) y Shigella sp. A

finales de 1989, en 12 provincias argentinas, se detectó un brote causado por S.

Tyhpimurium multirresistente que provocó infecciones graves (bacteriemia y

meningitis) a 210 niños, de los cuales al menos 80 murieron (Casellas, 2001). El

repunte de cepas de Salmonella productoras de BLEE ha sido asociado con la

introducción del ceftiofur, una cefalosporina de uso veterinario (Patchanee y col.,

2008).

En el año 2004, el Grupo Mystic publicó un resumen estadístico de la

susceptibilidad de cepas de Salmonella a los principales antibióticos utilizados en

la terapéutica de las infecciones producidas por esta bacteria. El conjunto de cepas

de Salmonella que fueron recolectadas durante el período 2001 - 2003

provenientes de Argentina, Brasil y Colombia, mostraron una sensibilidad del

100% a la arnikacina, la cefepima, la cefotaxima, la ceftazidimal ácido

clavulánico, el imipenem y la tobramicina. Se observó una disminución de la

sensibilidad de las cepas para la ceftazidima, ciprofloxacina, meropenem y

piperacilinaltazobactam y, en el caso específico de la gentamicina, la sensibilidad

a este antibiótico se redujo en 50% (Mystic Group, 2004).

El programa de enfermedades transmisibles de la OPS (en colaboración con el

Centro de Laboratorios para el Control de Enfermedades del Canadá) ha

patrocinado en los últimos años un proyecto para fortalecer la vigilancia de la

resistencia a los antimicrobianos en Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae. El

principal objetivo de este proyecto es definir la magnitud del problema de la

26


resistencia a los antimicrobianos en los países Latinoamericanos, y así lograr la

formulación adecuada de programas nacionales de prevención y control de esta

problemática. Entre los países que han participando en este proyecto se encuentra

Venezuela, donde se observó que durante el período 1997 - 1998, las cepas de

Salmonella mantuvieron una sensibilidad del lOO% a la ciprofloxacina, pero una

resistencia cada vez mayor a la ampicilina, la cefotaxima y la gentamicina (OPS,

2002).

Se ha demostrado que dosis subletales de algunos desinfectantes como cloro,

nitrato de sodio, ácido acético y benzoato de sodio, pueden inducir la expresión de

genes (operon marRAB en Salmonella) que confieren resistencia cruzada a

antibióticos como cloranfenicol, tetraciclinas, ciprofloxacina y ácido nalidixico

(Potenski y col., 2003). Además, Braoudaki y Hilton (2005) afirman que cambios en

la hidrofobicidad de la superficie celular y la presencia de una o más bombas de

eflujo en cepas de Salmonella, reducen la susceptibilidad de esta bacteria a

representantes del amonio cuaternario y al triclosan. Por lo tanto, el uso

inadecuado de los desinfectantes y antisépticos pueden ejercer una presión

selectiva sobre la población bacteriana, favoreciendo la circulación de cepas

multirresistentes a los antibióticos y desinfectantes (Sheldon, 2005).

En vista de esto, el Ministerio del Poder Popular para la Salud y Protección Social

(MSPS) plantea la necesidad de implementar al sistema de vigilancia de ET A, el

monitoreo rutinario de la resistencia antimicrobiana a fin de tomar las medidas

pertinentes en cada caso (MSPS. s/f Necesidad de nuevos métodos de vigilancia;

MSPS. s/f). De igual manera, la evaluación de la eficacia de los desinfectantes en

el control bacteriano incluyendo Salmonella, en las concentraciones

27


recomendadas por el fabricante, es de gran relevancia para garantizar un efectivo

proceso de sanitización en las empresas procesadoras de alimentos.

VIII. Control de brotes de salmonelosis

El control de Salmonella en la cadena alimentaria resulta dificil, debido a las

interrelaciones existentes entre la contaminación medioambiental, los animales de

consumo, los animales domésticos y el hombre. Sin embargo, Existen numerosos

modos de controlar el acceso y diseminación de la Salmonella en alimentos de

origen animal. Estos incluyen la implementación y cumplimiento de los sistemas

de inocuidad de los alimentos (BPA, BPP, BPF, BPH, POES, HACCP, ERM,

etc.), la regulación de la importación de animales vivos o ya sacrificados, y el

empleo de pienso (alimento para animales) exentos de enteropatógenos (OMS,

2000; Díaz, 2008,). La disminución de la colonización de Salmonella en animales de

granja asegura un proceso salubre adecuado de los alimentos derivados de éstos

(Romero y Herrera, 2002).

La educación de los consumidores y manipuladores de alimentos en el manejo

higiénico y seguro de carnes de ave, huevos y otros ingredientes crudos

potencialmente peligrosos es de gran importancia Por otra parte, el conocimiento

de las técnicas básicas de elaboración y manipulación de alimentos, tales como la

adecuada refrigeración y el cocinado completo deberían extenderse a todos los

niveles de población (WHO, 2007).

Las infecciones por Salmonella se desencadenan frecuentemente tras el consumo

de ciertos alimentos crudos o no cocidos, en los que las bacterias están a menudo

naturalmente presentes. Una cocción adecuada, por lo común, elimina el riesgo de

28

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella enteríca.

infección. Debe destacarse que los métodos apropiados de cocinado han de ser

acompañados de una sólida higiene en la cocina, que prevenga la contaminación

cruzada desde los alimentos crudos hacia los ya cocinados, que constituye otra

fuente importante de infecciones (WHO, 2007).

Desde el punto de vista epidemiológico, en todo brote de salmonelosis es

recomendable llevar a cabo una exhaustiva investigación, en la cual se tengan en

cuenta aspectos como la búsqueda de una fuente común de infección, la

realización de encuestas a los afectados y manipuladores de alimentos, el cierre

del local de donde se sospecha provino el alimento contaminado y de los

proveedores del mismo. Así mismo, la realización de análisis de laboratorio a los

alimentos implicados en el brote, incluyendo a su vez cultivos de materia fecal y

sangre de los afectados y manipuladores del alimento, y estudios serológicos

cuando el caso así lo amerite (OPS, 2000).

El control efectivo de Salmonella exige la declaración oficial rápida y eficaz de

brotes, tanto a nivel nacional como internacional. Esta información es necesaria

especialmente por el creciente movimiento de alimentos, de piensos y de materias

primas para éstos en el comercio internacional, así como de personas entre unos y

otros países (Máttar y col., 2002).

La salmonelosis es una infección generalmente autolimitada, la terapia antibiótica

no es indicada en los casos leves o no complicados (Brooks y col., 2005a). Cuando la

enfermedad es grave y se torna sistémica se recomienda el uso de antibióticos que

alcancen concentraciones en el sistema linfático, como el cloranfenicol y la

ampicilina. Para el tratamiento de portadores crónicos se emplean antibióticos que

29 l


tienen buena biodisponibilidad y excreción biliar como la ampicilina o la

amoxicilina (Máttar y coL, 2002).

El conocimiento de la epidemiología de la salmonelosis es uno de los pilares

fundamentales para su control sanitario. La distribución y circulación de los

serotipos en Salmonella, la determinación de los perfiles de susceptibilidad y las

relaciones genéticas o clonales entre las cepas aisladas en una población o área

determinada, hacen posible detectar las fuentes de infección y las vías de

propagación de esta bacteria, así como permite evaluar la eficacia de las medidas

sanitarias adoptadas para controlar y prevenir las infecciones por Salmonella.

30


IDPOTESIS

La carne de pollo comercializada en algunos supermercados del municipio

Libertador del Estado Mérida, es de deficiente calidad microbiológica y vehículo

de cepas de Salmonella con características genéticas que favorecen su transmisión

y colonización en el hospedero humano para originar Enfermedades Transmitidas

por Alimentos (ET A).

31


OBJETIVOS

Objetivos generales

• Determinar los indicadores de calidad sanitaria en muestras de carne de

pollo crudo con y sin aliños (no industrial) y procesados de origen

industrial, que se expenden bajo diversas presentaciones en supermercados

del área urbana del Municipio Libertador del estado Mérida, Venezuela

• Caracterizar fenotípica y genéticamente cepas de Salmonella aisladas en

muestras de pollo crudo con y sin aliños (no industrial) y procesados

industrialmente.

Objetivos específicos:

• Seleccionar los establecimientos comerciales de acuerdo a la ubicación

geográfica, atención masiva de la población y la disponibilidad de venta de

diversas presentaciones de carne de pollo crudo con y sin aliños (no

industrial) y procesados industrialmente.

• Seleccionar las muestras de carne de pollo crudo a analizar de acuerdo a la

presentación, tipo de pieza, con y sin aliños (procesado no industrial) y una

muestra procesada industrialmente.

• Determinar los indicadores de calidad sanitaria: bacterias aerobias mesófilas

(BAM), coliformes totales, E. coli y S. aureus.

• Aislar e identificar microbiológica y serológicamente las cepas de

Salmonella.

• Establecer los perfiles de susceptibilidad de las cepas de Salmonella a los

agentes antimicrobianos y desinfectantes.

32


• Detectar fenotípicamente en las cepas de Salmonella resistentes a los f3-

lactámicos, la producción de f3-latamasas de espectro expandido.

• Determinar el perfil de virulencia de las cepas de Salmonella mediante la

detección de los genes invA (invasividad) y spvC (patogenicidad).

• Establecer la relación clonal y diversidad genética de las cepas de

Salmonella por REP-PCR.

33


MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección de las muestras: Se recolectaron aleatoriamente, un total de 45

muestras de pollo crudo, distribuidas de la siguiente manera: 15 sin aliños, 15 con

aliños (no industriales) y 15 de empaques preparados de tipo industrial (Anexo

1 ). Estas muestras se obtuvieron de 3 supermercados ubicados en las zonas norte

(supermercado A), centro (supermercado B) y sur (supermercado C) del área

urbana del Municipio Libertador del estado Mérida, Venezuela.

La cantidad de muestra recolectada osciló entre 250 a 500 g por presentación. El

muestreo se realizó durante el período de julio a septiembre 2008, realizando una

recolección cada 15 días en 5 oportunidades en forma simultánea para cada

establecimiento. Las muestras fueron transportadas al laboratorio en cavas

portátiles a una temperatura< 5 oc y procesadas en un período menor a 4 horas

después de su recolección.

l. Estudio microbiológico

1.1 Determinación de indicadores de calidad sanitaria: El procesamiento de las

muestras de carne de pollo para la determinación de calidad sanitaria, se realizó

según la norma 1126 de la Comisión Venezolana de Normas Industriales

(COVENIN, 1989). A partir de 1 O g de cada muestra de pollo homogenizados en 90

mi agua peptonada al 0,1% (dilución 10-1), se prepararon 5 diluciones (10-2 a w-5

)

bajo las mismas condiciones (Fig. 2). De cada una de estas diluciones se tomó un

1 mi y se inocularon los siguientes medios por duplicado:

34

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonel/a entenca.

Placas con agar para conteo estándar (HiMedia), para la determinación

de Bacterias Aeróbicas Mesófilas (BAM), de acuerdo a la norma 902

(COVENIN, 1987). Estas placas se incubaron a 32 oc por 48 horas.

• Placas rehidratables para el recuento de coliformes y E. coli (RIDA

Counte E. coli/Coliformes, R-Biopharm [certificación AOAC

110402]) y para el conteo de Staphylococcus aureus (RIDA Counte S.

aureus, R-Biopharm). Estas placas se incubaron a 35 oc por 24 horas,

siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Nota: Es importante destacar que las placas rehidratables para el recuento de

coliformes/E.coli y S. aureus, fueron previamente sometidas a un estricto control

de calidad con cepas de referencia E. coli ATCC 10536 y S. aureus ATCC 25923

respectivamente, con el objeto de confirmar la confiabilidad del sistema (RIDA,

R-Biopharm) para la determinación de los indicadores calidad sanitaria

estudiados.

10g

Pollo Ll 10•1 10•2 10"3 10-4 10-5

90mL Agua 9mL Agua Peptonad.a 0,1% por tubo peptonada 0,1%

1ml c/dilución para: Placa BAM, Placa rchidratable de E. cofi/coliforrncs

y placa rchidratablc de 5. aureus

-~-;;;;~-~~ 32±~~x48h t~

2

, ¡;:;.T ~~~ ~~ IWtl ltUt:l IWtl t:m:l E. coiVColif"orrnes

35±1°C x 24H 10"2 10•3

~~ 10-2 10•;!.

S. aureus

35±10C X 24H

Figura 2. Esquema para la determinación de indicadores d calidad sanitaria de muestras de pollo crudo.

35


Luego del período de incubación, utilizando un contador de colonias, se cuantificó

el crecimiento bacteriano. En todos los indicadores, el rango para el conteo de

colonias se realizó entre 30 a 300 colonias según lo indicado en la norma 902

(COVENIN 1987) para BAM y de acuerdo al proveedor R-Biopharm para el caso de

las placas rida counte. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de

colonias por gramo de muestra (ufc/g muestra).

El conteo de coliformes y de E. coli se realizó identificando en primer lugar todas

aquellas colonias de color violeta con presencia de gas, lo cual es indicativo de E.

coli. Posteriormente, otras colonias de coliformes de color azul y asociadas a gas

también fueron cuantificadas. De manera que, la determinación de coliformes

totales consistió en la sumatoria de colonias azules y violetas.

Para la cuantificación S. aureus se contaron todas aquellas colonias azul verdosas

que aparecieron durante las primeras 24 horas, estas se marcaron y la placa fue

reincubada nuevamente por 6 horas más a 35 °C. Todas aquellas colonias que al

inicio (24 horas de incubación) eran azul verdosas y que posteriormente (30 horas

de incubación) perdieron su coloración (viraje del indicador por acidificación del

medio) fueron consideradas como S aureus, de acuerdo al proveedor R

Biopharm.

La interpretación de los resultados del análisis de la calidad microbiológica de las

muestras de carne pollo, específicamente para las BAM, se realizó de acuerdo a

los parámetros establecidos por la norma 2343 (COVENIN, 1986). Para el resto de

los indicadores evaluados ( coliformes total es/ E. coli y S aureus ), se utilizaron

normativas vigentes en otros países latinoamericanos (NTON 03-041-03, 1999;

36


NTP201-054, 2001; Código Alimentario Argentino SAGPyA, 2005; DGNTI-COPANIT 33-480,

2007) y de la Unión Europea (Comisión Europea, 2005) (Anexo 2). Los resultados al

compararse con las normas antes señaladas fueron expresados de la siguiente

manera:

• Aceptables: cuando los valores se ubicaron dentro de los límites

normales descrito por la norma

• Rechazables: cuando los datos superaron los rangos establecidos por la

norma.

1.2. Aislamiento de cepas de Salttwnella: Para la determinación de cepas de

Salmonella en carne de pollo se siguieron las recomendaciones de la

Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA, 2005) y la

norma 1291 (COVENlN, 2004). Se pesaron asépticamente 25 g de cada muestra de

pollo y se homogenizaron en 225 ml de caldo lactosado. Estos caldos se incubaron

a 35 oc por 24 horas (Fig. 3). Luego, de este cultivo se tomaron 2 mL y se

colocaron un 1 mL en caldo selenito (HiMedia) en sustitución de caldo

Rappapport V assiliadis, y el mililitro restante en caldo tetrationato (Merck) con

2% de solución de iodo-iodurada. Estos caldos se incubaron a 42 oc por 18 a 24

horas y posteriormente, de cada uno de estos, se tomó una asada para subcultivar

en medios selectivos (HiMedia): agar Hektoen Entérico (HE), agar Xilosa Lisina

Desoxicolato (XLD) y agar Sulfito de Bismuto (SB), los cuales se incubaron a 35

oc por 24 horas. Por cada medio selectivo se seleccionaron 5 colonias típicas o

sospechosa de Salmonella y se sometieron individualmente a una batería inicial de

pruebas bioquímicas especificadas por la norma 1291 (COVENIN, 2004).

( 37

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella ente rica.

Posteriormente, la identificación de las cepas fue confirmada utilizando las

galerías API 20E (BioMerieux) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor.

La identificación serológica de las cepas de Salmonella se realizó mediante

ensayos de aglutinación con antisueros polivalente O y específicos para los

serogrupos, utilizando el sistema comercial Remel Wellcolex Colour Salmonella,

siguiendo las recomendaciones del fabricante. La serotipificación definitiva de las

cepas de Salmonella se llevo a cabo en el Instituto Nacional de Higiene "Rafael

Rangel", Caracas-Venezuela.

Preenriquecimiento

Preenriquecimiento \

pH a 6 .3 Temp Amb 1 h incubar a 35° C x 24h

25g 225iñTCaldo Lactosa do

En dq uecimiento .:n:L / "'"l 1 S~C11'1 bl".l COn

A su e n c.l'd.J p 1.c)C.c.1

Aislamiento

Confirmación

1 i 1 f¡1¡ 43°C x 24h

ll iOml lllJ lOml

'

Caldo , .. Caldo Selenita Tc trationa to

©©©©©© BS XLO HE SS XLD rtE ··---····---- ·--··-·------------__j

·~ Identificación media nte pruebas bioqu irn icasy scf"o iC.gicas

Figura 3. Esquema del aislamiento de Salmonella en muestras de pollo crudo.

1.3. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana: La susceptibilidad

antirnicrobiana de las cepas de Salmonella se realizó utilizando la técnica de

Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) en agar Mueller Hinto (BBL) (Fig. 4),

de acuerdo a los criterios de Clinical and Laboratory Standards lnstitute (CLSI,

2009). Los antimicrobianos evaluados fueron: ampicilina (V almorca), cefazolina

38

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Sa/monella enterica.

(Chemferm), cefadroxilo (Vivax), cefotaxima (Genven), ceftazidima (Valmorca),

piperacilina/tazobactam (Wyeth-Lederle), aztreonam (Squibb), meropenem

(Richet) ciprofloxacina (Bayer), gentamicina (Farmachem), tobramicina

(Valmorca), amikacina (Renochem-AG), netilmicina (Shering-Plough),

trimetoprim/sulfarnetoxazol (Roche), doxiciclina (Calox), cloramfenicol (BioGer).

Se consideraron como fenotipos multirresistentes todas aquellas cepas que

presentaron resistencia a más de dos antibióticos de grupos diferentes.

Todas las cepas con resistencia a los antibióticos ~-lactárnicos de amplio espectro

fueron evaluadas fenotípicamente para la presencia de ~-lactarnasas de espectro

expandido (BLEE), utilizando la prueba del sinergismo del doble disco (PSDD)

de acuerdo a lo descrito por Jarlier y col. (1998) (Fig. 5).

Para las pruebas de susceptibilidad y la detección de fenotípica de BLEE, se

utilizó como cepa control E. coli ATCC 25922.

Salmonella ajustada a Macfarland 0,5

900ulagua estéril

Agar Mueller Hinton ajustado a las diferentes concentraciones de cada antibiótico ensayado

Incubación 37°Cx24 horas

Figura 4. Esquema de la determinación de la CIM de cepas de Salmonella.

39

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Sa/mone/la enterica.

Figura 5. Plantilla utilizada para la Prueba de Sinergismo de Doble Disco (PSDD) en la determinación fenotípica de ~-lactamasas de espectro expandido (BLEE). AMP+AC.CLA V: ampicilina más ácido clavulánico, CTZ: ceftazidima, AZT: aztreonam, CFP: cetlpima, CFX: cefotaxime.

1.4 Prueba de susceptibilidad a desinfectantes: La susceptibilidad de las cepas

de Salmonella frente a los desinfectantes, se realizó utilizando el método de

dilución-neutralización de acuerdo a la técnica normalizada por la Asociación

Francesa de Normalización (AFNOR, 1995) y la Asociación Española de

Normalización y Certificación (AENOR, 1997) (Fig. 6). Los desinfectantes

evaluados fueron: bromuro de laurildimetil bencilarnonio (Gerdex), hipoclorito de

sodio (marca de uso comercial) y ácido acético (marca de uso doméstico). El

rango de diluciones evaluadas fueron: 1:20, 1:50 y 1:100. Los tiempos de acción

estudiados para los tres desinfectantes fueron 30 segundos, 1, 2, 3, 5, 10, 15 y 20

minutos a 20 °C.

Los ensayos se realizaron en caldo Letheen (HiMedia), partiendo de un inóculo

inicial estandarizado de l a 3 x l 08 ufc/ml, y el recuento de colonias se realizó en

40

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genetica de Sal mane/la enterica.

placas con agar para conteo estándar (HiMedia). Como control de la viabilidad

bacteriana se empleo la cepa de S. typhi LabMM-8, bajo el mismo esquema de

trabajo sin desinfectante y el control negativo, así como el de esterilidad de las

pruebas, se utilizó la dilución del desinfectante en el caldo Letheen sin inocular.

La inhibición bacteriana o efecto biocida se consideró positivo cuando las ufc/ml

iniciales se redujeron en S unidades logarítmicas (1 05) en S minutos de contacto

con el desinfectante a 20 oc.

30seg 1min 2min 3min 5min 10min 15min 20min

~ -~:

0,5mL 1-3 x1oa

-i ',,

5uL - -1 1 ,,

- - - - - -i 1 ! ;i

5mLCaldo Letheen en cada tubo 4,5mL dilución del

biocida ] 1mL : 1mL h mL 1

1mL 1 m L J 1mL : 1mL !1mL

Incubación a 37°Cx48H en agar plate counte

-!J Contaje de las placa

Figura 6. Esquema de la determinación de susceptibilidad a desinfectantes

2.- Estudio molecular

2.1 Extracción del ADN c.-omosomal de las cepas de Salnwnella. A partir de

un cultivo fresco de 18 horas en agar Tripticasél; Soja (HiMedia) se tomaron varias

colonias y se resuspendieron en 200 f..Ll de TE (1 OmM Tris, 1 mM EDT A). Estas

se sometieron a ebullición en baño de María por 1 O minutos. Luego este producto

se agitó en un vortex y se centrifugó por 1 minuto a 14.000g. De esta manera, el

ADN bacteriano quedó en el sobrenadante y separado del resto de los

componentes que se depositaron en el fondo del tubo. El sobrenadante se

transfirió a tubos eppendorf estériles y se almacenó a -20 oc hasta su uso.

( 41


2.2 Determinación de los genes illvA y spvC: La detección de estos genes se

realizó por separado, a través de la amplificación por PCR convencional,

utilizando los siguientes iniciadores (Bioneer): INVA-Fl

S'ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3' y INVA-R2

5 'AGACGACTGGTACTGATCGAT AA-3 ', SPVC-Fl 5 'ACTCCTTGCACAA

CCAAATGCGGA-3' y SPVC-2R 5TGTCTTCTGCATTTCGCCACCATCA 3'

Chiu y Ou (1996). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un volumen final de

25 ¡..tl y la mezcla estuvo compuesta por 5 ¡..tl de cada iniciador (5 pmol/¡..tl); 5 ¡..tl

agua bidestilada ultrapura; 12,5 f.ll LPU (contiene MgCh, dNTPs y Taq

polimerasa) (Fundaim) y 2,5 f.ll de ADN. Las condiciones de amplificación fueron

las descritas por Chiu y Ou (1996); Rubino y col. (1998). El control positivo de

estos ensayos fue la cepa SE52-MMULA (invA+, spvC+). La mezcla de

amplificación sin ADN se utilizó como control negativo. El tamaño de los

productos esperados fueron: invA 244 pb y spvC 571 pb.

2.3 Tipificación de cepas de Saboollella por REP-PCR. Se amplificaron por

PCR las secuencias repetitivas del ADN: REP-PCR a partir del ADN total. Para

ésta amplificación se utilizaron los iniciadores (Bioneer) descritos por Lozario y

col. (2002): REP-1F 5 'IIIGCGCCGICATCAGGC 3' '

REP-2R

5 'ACGTCTT ATCAGGC-CT AC; la mezcla de reacción se llevó a cabo en un

volumen final de 25 ¡..tl y estuvo compuesta por 5 f.ll de cada iniciador (5

pmol/f.ll); 5 f.ll agua bidestilada ultrapura; 12,5 f.ll LPU (Fundaim) y 2,5 f.ll de

ADN. Las condiciones de amplificación empleadas, fueron las utilizadas por

Snelling y col. (1996) y Lozario y col. (2002) con ligeras modificaciones:

42 ~


desnaturalización a 94 oc por 2 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturalización

a 94 oc por 1 minuto, alineación a 40 oc por 1 minuto y amplificación a 65 oc por

8 minutos, la extensión se hizo a 65°C por 16 minutos (Snelling y col., 1996).

2.4 Electroforesis de los productos de amplificación: Todos los productos de la

amplificaciones realizadas fueron visualizados en corridas electroferéticas en

geles de agarosa al 1,5% (Promega), teñidos con bromuro de etidio y

fotografiados con el equipo UVP Biodoc-It. El tamaño de los productos de

amplificación fue estimado por comparación con el marcador de peso molecular

100 pb Ladder (Bioneer).

En el caso de los ensayos de tipificación por REP-PCR, los patrones de bandas

resultantes fueron interpretados por inspección visual por más de dos

observadores según los criterios de Tenover y col. (1995): Las cepas con patrones

indistinguibles fueron considerados pertenecientes a un mismo don principal. Los

patrones que difirieron por 1 a 3 bandas del clon principal fueron considerados

estrechamente relacionados y los que diferían por 4 a 6 bandas, se describieron

como probablemente relacionados. Los patrones con una diferencia de más de 6

bandas se consideraron como cepas diferentes o no relacionadas.

2.5 Construcción del dendograma. La construcción del dendograma o árbol de

similaridad y para establecer las relaciones entre las cepas estudiadas, se utilizó el

programa de análisis de imágenes GuefastScan (Neuronic S.A) mediante el uso

del Coeficiente de Similaridad de Dice y el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair

Group Method with Aritmetic Averages). Los patrones con coeficientes de Dice

superior al 80% fueron considerados relacionados clonalmente.

f 43


RESULTADOS

En la tabla 8, se muestran los resultados de la determinación de los indicadores

sanitarios estudiados en las muestras de pollo de crudo. Los resultados obtenidos

indican que independientemente del lugar de expendio del producto, casi todas

las muestras de pollo con y sin aliños (no industriales) fueron consideradas

rechazadas para el recuento de BAM, de acuerdo a los valores de referencia

descritos en la normativa nacional (COVENIN), las cuales indican como rango

aceptable 5xl06-107 ufc/g (6,70-7,70 Log10 ufc/g). Aunque en Venezuela, no se

han definidos los criterios para categorizar los recuentos de coliformes totales, E.

coli y S. aureus en pollo, los resultados obtenidos de estas determinaciones fueron

comparados con las normativas de otros países. De manera que, los valores

obtenidos para coliformes totales en la mayoría de las muestras (no industriales)

superaron los criterios de aceptabilidad para las normas de Argentina, Nicaragua y

Perú (2-2,69; 2,70-3 y 0-2 Log10 ufc/g respectivamente). En cuanto a los

resultados obtenidos para las determinaciones de E.coli, se pudo observar que

aproximadamente 1 O de las 15 muestras de pollo con aliños tuvieron valores

aceptables para este indicador, de acuerdo a las normas de los países antes

señalados e incluso con los de Panamá y la Comisión Europea (3; 1,69-2,70 Logw

ufc/g respectivamente). Por el contrario, más de la mitad de las muestras de pollo

sin aliños mostraron resultados que superaron los valores de aceptabilidad para el

recuento de E.coli. La mayoría de las muestras de pollo con o sin aliños fueron

consideradaras rechazadas al comparar los resultados de los recuentos para S.

aureus con las normativas de Argentina, Nicaragua y Perú (2-2,69; 2,70-3, 0-2,

Logw ufc/g). ( ' 44

Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella enteríca.

Tabla 8. Determinación de los indicadores sanitarios en las muestras de carne de pollo crudo

Tipo de ?rigen BAM Coliformes totales E. coli S. aureus muestra Rango No/% Rango No/% Rango Rango No/%

Logto Ac R Log10 A e R Logto A e R Logto A e R UFC/g UFC/g UFC/g UFC/g

Pollo A 6,58-8,26 1/20 4/80 o- 5,18 1/20 4/80 o -4,34 4/80 1/20 4,32-6,60 0/0 5/100 con B 7,26 -7,73 0/0 5/100 o -7,49 1/20 4/80 0-0 5/100 0/0 4,56-5,68 0/0 5/100

aliños e 6,89-8,42 1/20 4/80 3,43-5,15 0/0 5/100 o- 4,32 1/20 4/80 o- 4,99 1/20 4/80

Pollo A 6,10-6,75 5/100 0/0 o -4,90 1/20 4/80 o -4,88 2/40 3/60 o -4,46 1/20 4/80 sin B 6,95-7,95 2/40 3/60 5,20-6,95 0/0 5/100 o -4,04 2/40 3/60 o- 5,68 1/20 4/80

Aliños e 6,07-8,11 1120 4/80 o- 6,74 2/40 3/60 o -4,48 3/60 2/40 o -4,43 1/20 4/80

Pollo A 2,08-6,19 5/100 0/0 0-0 5/100 0/0 0-0 5/100 0/0 0-0 5/100 0/0 empacado B 3,90-6,17 5/100 0/0 o- 3,08 4/80 1/20 o -3,08 4/80 1/20 o- 4,78 3/60 2/40 industrial e 4,16-6,56 5/100 0/0 0-0 5/100 0/0 0-0 5/100 0/0 0-0 5/100 0/0

Ubicación del establecimiento comercial (supermercado) donde la cepa fue aislada: A, zona norte; B, zona centro; C, zona sur. BAM: bacterias aeróbicas mesófilas; i\c: aceptable;ll: rechazado


Todas las muestras de pollo industrial provenientes de los supermercados estudiados

presentaron valores para BAM, coliformes totales, E. coli y S. aureus aceptables,

independientemente de la norma con la cual se comparó. Sólo en el caso del

supermercado B, cuatro (4) muestras de pollo procesado industrial presentaron

valores superiores a los permitidos para los siguientes indicadores: coliformes totales

y E. coli (una muestra cada uno) y S. aureus, (dos muestras).

Todas las muestras de pollo fueron analizadas microbiológicamente para la

caracterización de cepas de Salmonella. El 20% de las muestras procesadas (9/45)

fueron positivas para este enteropatógeno. Seis de estas cepas (13,33%), se

encontraron en muestras de pollo sin aliños en los tres supermercados estudiados (2

cepas en cada uno) y 3 fueron aisladas de pollo con aliños (6,66%), distribuidas 2

cepas en el supermercado A y una en el establecimiento C (Tabla 9)

Tabla 9. Distribución del total de muestras de carne de pollo crudo analizadas de acuerdo al resultado del aislamiento de cepas de Salnwnella spp.

Supermercado N° de No de muestras positivas N° /%de (ubicación)* muestras para Salnwnella positividad

Pollo Pollo SA Pollo CA industrial

A (norte) 15 2 2 o 418,89 B (centro) 15 2 o o 214,44 e (sur) 15 2 1 o 3 16,67

Total 45 6 3 O 9 1 20,00 * Ubicación en el Distrito Libertador del estado Mérida, Venezuela. Pollo SA: pollo sin aliños; Pollo CA: pollo con aliños

46


En la tabla 10, se muestran los resultados de la identificación microbiológica y

serológica de las cepas de Salmonella aisladas. Todas fueron identificadas como S.

enterica, 6 cepas pertenecieron al subgrupo B, 2 al Dl y una al El (fig. 7) (anexo 3).

Tabla 10. Identificación microbiológica y serológica de cepas de Salmonella spp. aisladas de carne de pollo crudo.

Origen Tipo Cepa Perfil Especie Serogrupo Serotipos * muestra No API20E A Pollo SA 170 670455257 S. enterica Dl Enteritidis A Pollo CA 175 670455257 S. enterica B Heidelberg A Pollo CA 179 670455257 S. enterica B Heidelberg A Pollo SA 218 670455257 S. enterica Dl Enteritidis B Pollo SA 182 670455257 S. enterica B Heidelberg B Pollo SA 288 670455257 S. enterica B Heidelberg e Pollo SA 105 670455257 S. enterica B Heidelberg e Pollo CA 120 670475257 S. enterica B Typlúmurimn

e Pollo SA 300 670475257 S. enterica El Meleagridis * Ubicación del establecimiento comercial (supermercado) donde la cepa fue aislada: A, zona norte; B, zona

centro; C, zona sur; Pollo SA: pollo sin aliños; Pollo CA: pollo con aliños.

• Se rogrupo B , Serogrupo Dl Serogr upo E

Figura 7. Distribución de los serogrupos de Salmonella aisladas de pollo crudo.

lndicadores de calidad sanitari a en pollo cmdo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonella enterica.

Se reconocieron 4 serotipos: Heidelberg (5/55,6%), Enteritidis (2/22,2%),

Typhimurium (1/11,1 %) y Meleagridis (1/11,1 %) (Fig. 8). En el supermercado A, se

encontraron los serotipos Enteritidis y Heidelberg en muestras de pollo con y sin

aliños en igual proporción (2 para cada uno), mientras que en muestras de pollo sin

aliñar del supermercado B, sólo se identificó el serotipo Heidelberg. En las muestras

provenientes del supermercado C, se encontraron 3 de los 4 serotipos identificados

(Heidelberg, Typhimurium y Meleagridis).

¡;¡ S.He ide lberg l!?l S. Ente rit idis S. Typhim ur ium !!ll S. Me leag ridis

Figura 8. Distribución de las subespecies de Salmonella aisladas de pollo crudo.

Los resultados de la determinación de la susceptibilidad de las cepas de Salmonella a

los agentes antimicrobianos se muestran en la tabla 11. Todas las cepas fueron

sensibles al meropenem y al grupo de aminoglucósidos probados (amikacina,

gentamicina, netilmicina y tobramicina) y resistentes al trimetoprirn/sulfametoxazol

con CIM superiores a 16/304 ¡.tg/ml. El 66,67% de las cepas mostraron resistencia a

ampicilina, cefazolina con rangos inhibitorios de 2-~128 ¡.tg/ml y a docixiclina con

>.

48 ~-


CIM de 2-64 J..Lg/ml, siguiéndole en orden de frecuencia la resistencia a cefradoxilo y

cefotaxima (55,56%). En tercer lugar, con el 44,44% se ubicaron las cepas con

resistencia a ceftazidima y aztreonam. Los fenotipos con sensibilidad intermedia más

frecuentes fueron observados con la piperacilina/tazobactam y el cefradoxilo.

Tabla 11. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) en serotipos de S. enterica aisladas de carne de pollo crudo a16 antibióticos.

Antibiótico CIM N° de Cepas % Resistencia Rango (!g/mL S 1 R (n=9)

Ampicilina 2- ~128 3 o 6 66,67 Piperacilina/Tazobactam 4- ~128 4 4 1 11,11

Cefazolina 2- ~128 3 o 6 66,67 Cefadroxilo 16- 128 o 4 5 55,56 Cefotaxima 0,25- ~256 4 o 5 55,56 Ceftazidima 0,25-32 4 1 4 44.,44 Aztreonam 0.5-64 5 o 4 44,44 Meropenem 0,062-0,125 9 o o o Amikacina 2-8 9 o o o

Gentamicina 0,5-1 9 o o o N etilmicina 1-4 9 o o o

Tobramicina 0,25-0,5 9 o o o Ciprofloxacina 0,062-4 6 1 2 22,22

Doxiciclina 2-64 2 1 6 66,67 Cloranfenicol ~0.25- ~128 8 o 1 11,11

Trimetoprim/Sulfametoxazol >16/304 o o 9 100 S: sensible; I: intermedia; R: resistente.

En la tabla 12, se observó que 6 cepas presentaron patrones de resistencia múltiple,

los cuales se distribuyeron de la siguiente manera: 2 cepas (serotipos Heildelberg y

Meleagridis) fueron resistentes a 3 antibióticos de grupos diferentes (CFZ-DXC-

TMP/SLF), y 5 cepas, todas del serotipo Heildelberg demostraron combinaciones de

resistencia a ampicilina, piperacilina/tazobactam, cefalosporinas (lera, 2da y 3era

generación), aztreonam, ciprofloxacina, doxiciclina y trimetoprim/sulfametoxazol.

r 49


Cuatro cepas del serotipo Heildelberg y una Enteritidis {N° 105, 175, 179, 288 y 170,

respectivamente) con resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro se les detectó

fenotípicamente la producción de 13-lactamasas de espectro expandido (Tabla 13)

(Anexo 4). Del mismo modo, se evaluó el efecto inhibitorio de tres desinfectantes

representados por el hipoclorito de sodio (NaClO), el bromuro de lauridimetil

bencilamonio (BLBA), y el ácido acético (CH3COOH) (tabla 13).

Tabla 12. Distribución de los patrones de resistencia y detección fenotípica de (3-lactamasas de espectro expandido (l3LEE) en serovariedades de S. enterica aisladas de carne de pollo.

Cepa Serovariedad Patrón de resistencia BLEE No

PSDD

Resistencia a dos antibióticos 120 Typhimurium CLF-TMP/SLF NA 218 Enteritidis AMP-TMP/SLF NA

Resistencia a tres antibióticos 182 Heidelberg CFZ-DXC-TMP/SLF NA 300 Meleagridis CFZ-DXC-TMP/SLF NA

Resistencia a cuatro antibióticos 170 Enteritidis AMP-CFD-CFX-TMP/SLF +

Resistencia a ocho antibióticos 105 Heidelberg AMP-CFZ-CFD-CFX-CTZ-AZT -DXC-TMP/SLF +

Resistencia a nueve antibióticos 175 Heidelberg AMP-CFZ-CFD-CFX-CTZ-AZT-CPF-DXC- +

TMP/SLF 179 Heidelberg AMP-CFZ-CFD-CFX-CTZ-AZT -CPF-DXC- +

TMP/SLF 288 Heidelberg AMP-PPC/T AZ-CFZ-CFD-CFX-CTZ-AZT -DXC- +

TMP/SLF PSDD: Prueba del sinergismo del doble disco; NA: no aplicable; +: detección positiva AMP: ampicilina; CFZ: cefazolina; CFD: cefadroxilo; CFX: cefotaxima; CTZ: ceftazidima; AZT: aztreonam; PPC/TAZ: piperacilina/tazobactam; CLF: cloramfenicol; DXC: doxiciclina; CPF: ciprofloxacina; TMP/SLF: trimetoprim/sulfametoxazol.

Los resultados obtenidos demostraron que todas las cepas estudiadas fueron inhibidas

por los 3 desinfectantes en las tres diluciones evaluadas (1 :20, 1 :50 y 1:1 00) en un

tiempo menor o igual a 5 minutos. Exceptuando siete cepas {N° 170, 175, 179, 182,

f 50


288, 120 y 300) que a la dilución mayor del ácido acético (1: 100), la inhibición de las

mismas se realizó entre 15 y 20 minutos.

Tabla 13. Determinación de las características microbiológicas de serotipos de S. enterica aisladas de carne de pollo crudo.

N° Cepa/ Perfil BLEE Susceptibilidad a Origen Serotipo de resistencia PSDD biocidas

diluciones/tiempo de inhibición

NaCIO BLBA CH3COOH

AMP-CFD-CFX- 1:20/30" 1:20/30" 1:20/2'

A 170/ Enteritidis TMP/SLF + 1:50/30" 1:50/30" 1:50/5' 1:100/30" 1:100/2' 1:100/20'

AMP-CFZ-CFD-A 175/ Heidelberg CFX-CTZ-AZT- + 1:20/30" 1:20/30" 1:20/3'

CPF-DXC-1:50/30" 1:50/1' 1:50/5' 1:100/30" 1:100/2' 1:100/20'

TMP/SLF AMP-CFZ-CFD-

A 179/ Heidelberg CFX -CTZ-AZT- + 1:20/30" 1:20/30" 1:20/2'

CPF-DXC-1:50/30" 1:50/1' 1 :50/5' 1:100/30" 1:100/2' 1:100/20'

TMP/SLF 1:20/30" 1:20/30" 1:2011'

A 218/ Enteritidis AMP-TMP/SLF NA 1:50/30" 1:50/30" 1 :50/5' 1:100/30" 1:10011' 1:100/5'

CFZ-DXC- 1:20/30" 1:20/30" 1:20/2'

B 182/ Heidelberg TMP/SLF NA 1:50/30" 1 :50/2' 1 :50/5' 1 :100/30" 1:100/2' 1:100/20'

AMP-PPC/T AZ-B 288/ Heidelberg CFZ-CFD-CFX- + 1:20/30" 1:20/30" 1:20/2'

CTZ-AZT -DXC-1:50/30" 1:50/30 1:50/20' 1:100/30" 1:100/3' 1:100/20'

TMP/SLF AMP-CFZ-CFD-

e 105/ Heidelberg CFX-CTZ-AZT- + 1:20/30" 1:20/30" 1:20/3'

DXC-TMP/SLF 1:50/30" 1:50/1' 1 :50/5' 1 :100/30" 1:100/3' 1:100/5' 1:20/30" 1:20/30" 1:20/3'

e 120/ CLF-TMP/SLF NA 1:50/30" 1:50/4' 1:50/5'

Typhimurium 1:100/30" 1:100/4' 1:100/15'

CFZ-DXC- 1:20/30" 1:20/1' 1:20/2'

e 300/ TMP/SLF NA 1:50/30" 1:50/2' 1:50/5'

Meleagridis 1:100/30" 1:100/3' 1:100/15'

AMP: ampicilina; CFZ: cefazolina; CFD: cefadroxilo; CFX: cefotaxima; CTZ: ceftazidima; AZT: aztreonam; PPC/TAZ: piperacilina!tazobactam; CLF: cloramfenicol; DXC: doxiciclina; CPF: ciprofloxacina; TMP/SLF: trimetoprim/sulfametoxazol; BLEE PSDD: 13-lactamasa de espectro expandido prueba del sinergismo del doble disco; NA: no aplicable; +: detección positiva; NaClO: hipoclorito de sodio; BLBA: bromuro de laurildimetil bencilamonio; CH3COOH: ácido acético.

r s1


El estudio genético de las Salmonella reveló, que todos los serotipos de Salmonella

estudiados demostraron una banda de amplificación de 244 pares de base (pb)

confirmando la presencia de la región inv (Fig. 9 y Tabla 14). Sólo cuatro cepas; 2 S.

Enterica, una S. Heidelberg y una S. Typhimurium, produjeron amplicones con los

iniciadores específicos spvC, indicando la presencia del plásmido de virulencia en

Salmonella (Fig 10 y Tabla 14).

M C+ 1 2 3 4 S 6 7 8 9 e-

Figura 9. Gen invA mediante PCR convencional de serotipos de S. enterica aisladas de pollo crudo procesado (no industrial). 1: 105, S. Heidelberg; 2: 120, S. Typhimurium; 3: 170, S Enteritidis; 4: 175, S Heidelberg; 5: 179, S Heidelberg; 6: 182: S. Heidelberg; 7: 218, S Enteritidis; 8: 288, S Heidelberg; 9: 300, S Meleagridis. M: Marcador de tamaño molecular (Ladder ADN 100 pb); C+: control positivo cepa SE52-MMULA C-: Control negativo.

M 1 2 3 4 S 6 7 8 9

571 pb

Figura 10. Gen spvC mediante PCR convencional de serotipos de S. enterica aisladas de pollo crudo procesado (no industrial). 1: 105, S Heidelberg; 2: 120, S Typhimurium; 3: 170, S Enteritidis; 4: 175, S Heidelberg; 5: 179, S. Heidelberg; 6: 182: S. Heidelberg; 7: 218, S Enteritidis; 8: 288, S Heidelberg; 9: 300, S Meleagridis. M: Marcador de tamaño molecular (Ladder ADN 100 pb).

52


Tabla 14. Detección de genes que codifican para la virulencia en serotipos de S. enterica aisladas de carne de pollo crudo no industrial.

Cepa No Serotipo Salmonella Genes de Virulencia

invA spvC 105 Heidelberg + 175 Heidelberg + + 179 Heidelberg + 182 Heidelberg + 288 Heidelberg + 170 Enteritidis + + 218 Enteritidis + + 120 Typhimurium + + 300 Meleagridis +

Los ensayos de REP-PCR permitieron demostrar que cada cepa de Salmonella

desplegó un patrón REP-PCR diferente. El número de bandas observado por cepa

osciló entre 2 y 8 con tamaños moleculares de <200 y 1600 pb. Dos bandas, una de

aproximadamente 700 pb y otra de 500 pb fueron comunes en la mayoría de las cepas

estudiadas (fig 11).

El análisis dendográfico de los patrones REP-PCR permitieron evidenciar que las

cepas constituyeron clones independientes o no relacionadas, cuyos coeficientes de

similaridad no superaron el42% (fig.12).

( 1 53


2000 1600

1200 1000 800

600 500 400 300

200

M e 1 2 3 4 s s 1 a 9

Figura 11. Patrones REP-PCR de serotipos de S. enterica aisladas de pollo crudo procesado (no industrial). 1: 105, S. Heidelberg; 2: 120, S. Typhimurium; 3: 170, S. Enteritidis; 4: 175, S. Heidelberg; 5: 179, S. Heidelberg; 6: 182: S. Heidelberg; 7: 218, S. Enteritidis; 8: 288, S. Heidelberg; 9: 300, S. Meleagridis. M: Marcador de tamaño molecular (Ladder ADN 100 pb); C: controlE. coli ATTCC 25922.

54


C- 120 S. Typhimurium

A- 218 S. Enteritidis

-A- 170 S. Enteritidis (BLEE+)

B- 182 S. Heidelberg

- C- 300 S. Meleagridis

B- 288 S. Heidelberg (BLEE +)

A- 175 S. Heidelberg (BLEE+)

A - 179 S. Heidelberg (BLEE +)

C- 105 S. Heidelberg (BLEE +)

9 16 ~ :l; IOO'.i.

Figura 12. Dendograma de serotipos de S. enterica aisladas de pollo de crudo procesado (no industrial) con base a los patrones generados por el REP-PCR. A: supermercado zona norte; B: supermercado zona centro; C: supermercado zona sur; BLEE+: B-lactamasa de espectro expandido.

55


DISCUSIÓN

Los alimentos son la fuente principal de exposición a numerosos agentes

contaminantes, especialmente los biológicos, donde se incluyen los parásitos, hongos,

virus y bacterias. Esta contaminación conduce a riesgos sustanciales para la salud de

los consumidores (Uribe y col., 2006). De manera que, un alimento inocuo es aquel que

no genera efectos adversos sobre la salud, ni en la calidad de vida del consumidor ni

presenta riesgos físicos, químicos o biológicos (FAO, 2008).

En este estudio se utilizaron 4 indicadores microbiológicos para valorar las

características higiénicas del pollo crudo con y sin aliños (no industriales), que se

expende en 3 diferentes supermercados ubicados el área urbana del Municipio

Libertador del estado Mérida, Venezuela. Los resultados obtenidos demostraron que

independientemente del establecimiento comercial, los valores obtenidos para BAM,

coliformes totales y S. aureus en la mayoría de las muestras de pollo con aliños,

superaron significativamente los recuentos límites de aceptabilidad (6,58-8,42; 0-7,49

y 4,32-6,60 Logw ufc/ml respectivamente), no sólo los vigentes para Venezuela, sino

también los criterios válidos para otros países de Latinoamérica (NTON 03-041-03, 1999;

NTP201.054, 2001; Código Alimentario Argentino, SAGPyA, 2005; DGNTI-COPANlT 33-480,

2007) y Europa (Comisión Europea, 2005). Sin embargo, se pudo observar que casi todas

las muestras de pollo con aliños provenientes de los supermercados A y B,

demostraron recuentos de E. coli aceptables. Por el contrario, cuando se analizaron

las muestras de pollo sin aliños (no industrial), casi la mitad de estas tuvieron

elevados recuentos de BAM, y en su mayoría, estas mismas muestras fueron

consideradas como rechazadas para los indicadores coliformes totales, E. coli y S.

( ' 56 J


aureus. Estos resultados avalan el hecho que durante el procesamiento artesanal de

alimentos, los riesgos de contaminación bacteriana aumentan debido a la realización

de un mayor número de etapas en forma manual, es decir una manipulación extensiva

favorece los riesgos de contaminación cruzada (Alexandre y col., 2000; Valero y col., 2008).

Es probable que en las muestras analizadas, algunas de las etapas susceptibles de

contaminación microbiológica hayan sido durante el desollamiento, despiece,

condimentación y/o empaque del pollo. Además, el recuento elevado en los

indicadores microbiológicos predice el deterioro precoz del producto estudiado. Por

el contrario, cuando los mismos criterios microbiológicos fueron aplicados a las

muestras de pollo crudo de origen industrial, se observó que todas las muestras

resultaron aceptables para las determinaciones realizadas. Exceptuando algunas

muestras provenientes del supermercado B, que de acuerdo a las normas aplicadas,

demostraron valores superiores de recuento para coliformes totales, E. coli y S.

aureus. Es posible, que fallas en la cadena de frio, incluso en el establecimiento

comercial, haya favorecido el crecimiento bacteriano.

En investigaciones previas realizadas en el país se han reportado resultados similares

a los encontrados en este estudio, donde la calidad sanitaria deficiente de algunos

productos avícolas que se expenden comercialmente constituye un riesgo para la

salud de los consumidores (León y col., 1996; Zea y col., 2004; Boscán y col. 2005, Valero y

col., 2008). Los resultados obtenidos a partir de los indicadores microbiológicos

estudiados, puso en evidencia la deficiente calidad microbiológica y los posibles

riesgos que tienen las muestras analizadas para la salud. De hecho, se logró aislar en

las muestras de pollo procesadas (no industriales) cepas de Salmonella enterica en un

57


20%, de las cuales el serotipo Heidelberg y Enteritidis fueron los más frecuentes.

Resultados similares fueron reportados por Pérez y coL (2004) y Boscán y coL (2005)

quienes aislaron Salmonella en muestras de pollo en un 23% provenientes de plantas

procesadoras en el estado Zulia. En Venezuela no se conoce con exactitud la

frecuencia de los serotipos de Salmonella en muestras de alimentos. Sin embargo,

Boscán y col (2005) en un estudio realizado en muestras de pollo beneficiado,

reportaron al serotipo Heidelberg, como el segundo más frecuentemente aislado

(31 %). Por otra parte, Foley y coL (2007) realizaron una revisión sobre la

seroprevalencia de Salmonella en alimentos de origen animal desde el año 1997,

encontrando que el serotipo Heidelberg se aisla en más de un 50% en pollos

enfermos y es el tercer serotipo más frecuentemente aislado en brotes de infección

por alimentos en humanos en Estados Unidos. Los serotipos Enteritidis y

Typhimurium fueron aislados en este estudio en un 22,2% y 11,1% respectivamente.

Estos serotipos clasicamente son los que con mayor frecuencia se aislan en muestras

humanas, no obstante su origen animal o alimentario ha sido confirmado (Hohman,

2001; Graham, 2002; Zaidi y col. 2006a; Araque, 2009). En este estudio, por primera vez en

Venezuela, S. Meleagridis ha sido reportada en muestras de pollo crudo (no

industrial) para consumo humano. Zaidi y coL (2006b ), en un trabajo de revisión

realizado en Yucatán, México en el período 2000-2002, encontraron S. Meleagridis

ocupando el primer lugar en muestras de carne de cerdo (15,2%) y bovina (27,9%) y

en un cuarto lugar en piezas de pollo (9,8%) comercializadas al detaL

Es importante destacar que la presencia de Salmonella en alimentos de origen avícola

altera la inocuidad del producto. Este peligro microbiológico puede incrementarse al

r 58


tratarse de cepas multirresistentes producto del uso indiscriminado de

antimicrobianos para tratar las infecciones en aves o para promover el engorde del

animal. En este estudio todas las cepas permanecieron sensibles a los

aminoglucósidos y al meropenem, sin embargo mostraron resistencia a otros grupos

de antibióticos. Resaltando el hecho que el 100% de las cepas fueron resistentes al

trimetoprim/sulfametoxazol y más de la mitad de éstas, presentaron diversas

combinaciones de resistencia. Cinco cepas, ( 4 del serotipo Heidelberg y una

Enteritidis) que incluyeron en sus patrones de resistencia a las cefalosporinas de

amplio espectro se les detectó fenotípicamente BLEE. Miriagou y col. (2004),

afirman que desde los años 80 se han detectado diversos serotipos de Salmonella

productoras de BLEE, y sugieren que una variedad de plásmidos que portan genes

que codifican para estas enzimas se han establecido en Salmonella en todo el mundo.

Patchanee y col. (2008), afirman que el incremento de la resistencia de S. Heidelberg

a cefalosprorinas de tercera generación, puede estar condicionada por el uso del

ceftiofur, una cefalosporina de uso veterinario. Recientemente los estudios realizados

por Zhao y col. en el 2007 y 2008, han confirmado la circulación frecuente de S.

Heidelberg multirresistente y productora de BLEE en productos avícolas y de otras

fuentes de origen animal.

El uso adecuado de los desinfectantes en hospitales y en las industrias procesadoras

de alimentos ha sido una de las medidas más utilizadas para contener la diseminación

de microorganismos y prevenir la contaminación cruzada de patógenos transmitidos

por alimentos (Sheldon, 2005). Los resultados de este estudio permitieron evidenciar

que todas las cepas de Salmonella aisladas fueron inhibidas por los tres desinfectantes

t' ¡ 59


probados (hipoclorito de sodio, bromuro de lauridimetil bencilamonio y ácido

acético), incluso a diluciones mayores a las utilizadas rutinariamente. Por lo tanto, la

utilización de estos desinfectantes a las concentraciones adecuadas, conjuntamente

con buenas prácticas en la manufactura de los productos avícolas podrían disminuir la

carga microbiana y, eventualmente evitar los problemas de contaminación cruzada

con Salmonella, entre otros enteropatógenos.

Salmonella ha sido reconocido como uno de los principales agentes etiológicos

involucrados en las ET A. La gravedad de la infección está determinada por el estado

inmunológico del hospedero y de los factores de virulencia presentes en la bacteria

(Bessa y col., 2007; Araque, 2009). La virulencia en Salmonella está ligada a una

combinación de genes que se encuentran en regiones específicas en el cromosoma

(islas de patogenicidad) y en plásmidos (Sánchez y Cardona, 2003). En este estudio se

pudo demostrar que el gen invA., responsable de la invasión y supervivencia

intracelular estuvo presente en todas las cepas estudiadas. Adicionalmente, los

resultados obtenidos avalan las afirmaciones hechas por varios autores, los cuales han

señalado que este gen también es un marcador eficiente para detectar Salmonella

enterica en muestras de diferentes fuentes, tales como humano, animal y de alimentos

(Salehi y col., 2003; Nucera y col., 2007). Los genes spv se encuentran en los llamados

plásmidos de virulencia de Salmonella, éstos son los responsables de la

multiplicación intracelular y su presencia en diversos serotipos de Salmonella le

confiere a esta bacteria la capacidad de producir infección extraintestinal severa (Soto

y col., 2006; Bessa y col., 2007). Sólo 4 cepas (tres, S. Heidelberg y una S. Typhimurium)

se les detectó el gen spvC. Es probable que estas cepas portadoras del gen spv tengan

f 60


potencialmente mayor capacidad de producir infección sistémica, además de la

intestinal.

La tipificación molecular ha incrementado el entendimiento de la epidemiología en

las infecciones por Salmonella, al facilitar el conocimiento de las relaciones genéticas

entre las cepas (Lim y col., 2005). Las variaciones en el número de fragmentos obtenidos

a partir de los ensayos REP-PCR y sus localizaciones en el cromosoma bacteriano,

permitieron establecer que cada cepa estudiada constituyó un patrón único. Estos

patrones variaron notablemente incluso dentro de un mismo serotipo y los índices de

similaridad no superaron el 42%, lo que sugiere que las cepas de Salmonella

estudiadas no tienen una relación clonal. Sin embargo, es importante resaltar que 2

bandas una de aproximadamente 700 pb y otra 500 pb, estuvieron presentes en la

mayoría de las cepas estudiadas, lo que podría indicar un origen ancestral común

entre éstas.

Los hallazgos obtenidos en esta investigación permiten concluir que el pollo crudo

con y sin aliños procesados en los supermercados estudiados, no cumplen con la

calidad microbiológica adecuada. La detección de diversos serotipos de Salmonella

resistentes a los agentes antimicrobianos, con características genéticas que

incrementan su virulencia hacen del producto un vehículo de alto riesgo para la salud

de los consumidores.

Los resultados de este estudio proporcionan una valiosa información epidemiológica

que revela la circulación de diversos serotipos no relacionados clonalmente de S.

enterica en pollos procesados (no industrial), que se expenden comercialmente en

supermercados de la ciudad de Mérida.

( 61


Por otra parte, se destaca la necesidad de intensificar los controles higiénico

sanitarios, asi como la adopción de buenas prácticas de manufactura y la aplicación

de procedimientos basados en los principios de HACCP en toda la cadena

alimentaria. Además, la implementación de estrategias que garanticen el uso

adecuado de los agentes antimicrobianos en la medicina veterinaria, y la utilización

de desinfectantes en los protocolos de higiene y sanitización en las industrias de

alimentos, ayudaran a contener y minimizar la selección, transmisión y diseminación

de genes de resistencia en la población bacteriana.

62


CONCLUSIONES

Realizado éste estudio se puede concluir:

1.- Las muestras de pollo crudo (no industrial), independientemente de su

presentación comercial (aliñado o sin aliñar), no cumplieron con los indicadores

microbiológicos de calidad sanitaria nacionales e internacionales, haciendo del pollo

estudiado, un producto perecedero a corto plazo y un nicho favorecedor de patógenos

importantes que amenazan la salud de los consumidores.

2. En el 20% de las muestras de pollo crudo analizadas, se logró detectar nueve (9)

cepas de Salmonella, las mismas se caracterizaron en género, especie, serogrupo y

serotipos reconociéndose Salmonella enterica: Heidelberg (5/55,6%), Enteritidis

(2/22,2%), Typhimurium (1/11,1%) y Meleagridis (1/11, 1%).

3.- Por primera vez en Venezuela, Salmonella Meleagridis es reportada en carne de

pollo crudo no industrializado de consumo humano.

4.- Todas las cepas de Salmonella enterica, presentaron marcadores de resistencia

antimicrobiana y cuatro ( 4) de ellas estuvieron asociadas a la producción de

betalactamasas de espectro extenso.

5.- Todas las cepas de Salmonella enterica fueron susceptibles a los diferentes

desinfectantes ensayados.

6.- La caracterización genética reveló que todas las cepas de Salmonella tuvieron el

gen de invasividad invA y 4 de éstas el gen de virulencia spvC.

) 63 ,


7.- La tipificación por REP-PCR determinó que cada cepa de Salmonella entérica

constituyó un patrón único, con índices de similitud de sólo 42%, por lo que no se

consideraron relacionadas clonalmente. Este hecho refleja desde el punto de vista de

la salud pública, una situación compleja para la prevención y control de las

infecciones causada por los miembros de este género.

64


RECOMENDACIONES

Se enfatiza en la necesidad de revisar las Normativas Nacionales para el pollo

beneficiado en cuanto al establecimiento de indicadores y límites microbianos más

rigurosos de manera que su cumplimiento garantice la inocuidad de este producto de

consumo masivo. De igual forma, se debe intensificar por parte de los entes

gubernamentales, la vigilancia de las medidas higiénico-sanitarios y cumplimiento de

los sistemas mínimos de aseguramiento de la calidad en toda la cadena alimentaria de

modo que se asegure la correcta implementación de las mismas en todas las fases de

la producción hasta que llega al consumidor final.

La vigilancia en el uso adecuado de los agentes antimicrobianos en la medicina

veterinaria, y la utilización de desinfectantes en los protocolos de higiene y

sanitización en las industrias de alimentos, ayudaran a disminuir la selección y

diseminación de genes de resistencia en la población bacteriana.

En cuanto a estudios futuros, se recomienda profundizar la investigación realizada en

vista a:

• Determinar los genes que están mediando la producción de betalactamasas de

espectro extenso en las cepas de Salmonella que resultaron positivas ante la

prueba fenotípica de difusión en doble disco.

F 65


• Implementar otras técnicas genotípicas, como el RFLP o campo pulsado, que

ayuden a elucidar con mayor certeza la relación clonal entre las cepas de

Salmonella aisladas.

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Indicadores de calidad sanitaria en pollo crudo procesado y caracterización fenotípica y genética de Salmonelia entenca.

ANEXOS

79


ANEXO 1

Figura 13. Fotografía representativa de las muestras de pollo crudo (aliñado, sin aliñar y de origen industrial) adquiridas en cada muestreo en los tres supermercados.

80


ANEX02

Tabla 15. Límites microbiológicos nacionales e internacionales de los diferentes

indicadores sanitarios para pollo crudo de consumo humano.

Norma BAM CT E. coli S. aureus Ufc/g y log10ufc/g Ufclg y log¡oufc/g Ufc/g y log¡oufc/g Ufc/g y log¡oufc/g

COVENIN n= 5 c=3 Venezuela 5x106 107 y

6,7 - 7,0 Argentina n= 5 c=2 n=S c=2 Ausencia n=5 c=1

5x104 105 y 100 500 100 500 4,7 -5,0 2,0 -2,7 2,0 - 2,7

Nicaragua n=5 c=2 n=5 c=2 n=5 c=2 n=5 c=2 5x105 106 y 5x102 1x103 5x102 1x103 5x102 1x103

5,7-6,0 2,7-3,0 2,7-3,0 2,7-3,0 Perú <106 y <102 <102 <102

<6,0 <2,0 <2,0 <2,0 Panamá 1x10°y 1x103

6,0 <3,0 Comisión n= 5 c=2 n=S c=2 Europea 5x105 106 50 500

5,7-6,0 1,7-2,7

Fuente: COVENIN 2343, 2004; DGNTI-COPANIT 33-480, 2007; NTON 03 041-03, 1999; NTP 201.054,2001; Comisión Europea, 2005; Código alimentario Argentino. SAGPyA N' 79/04 y 500/04.

81 J


ANEX03

E1

Figura 14. Fotografía representativa de la identificación serológica y clasificación de los serogrupos de Salmonella. Aglutinación roja con fondo azul: S. enterica serogrupo B. Aglutinación verde con fondo rojo-rosado: S. enterica serogrupo Dl . Aglutinación azul con fondo rojo-rosado: S. entérica serogrupo El .

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ANEX04

Figura 15. Fotografia representativa de la determinación de betalactamasas de expectro expandido mediante la prueba de difusión de doble disco.

83

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