| Universitas Medica |Colombia | V. 61 | No. 2 | Abril-Junio | 2020 | ISSN 0041-9095 |

Cómo citar: Rubio S, Pacheco-Orozco RA, GómezAM, Perdomo S, García-Robles R. Secuenciación denueva generación (NGS) de ADN: presente y futuroen la práctica clínica. Univ. Med. 2020;61(2). https://doi.org/10.11144/Javeriana.umed61-2.sngs

DOI: https://doi.org/10.11144/Javeriana.umed61-2.sngs

Secuenciación de nueva generación (NGS) deADN: presente y futuro en la práctica clínica

DNA Next-Generation Sequencing (NGS): Present and Future inClinical Practice

Recepción: 10 Octubre 2019 | Aceptación: 04 Diciembre 2019

Santiago RubioMiembro del grupo de investigación en Nutrición,

Genética y Metabolismo, Facultad de Medicina,Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia

Rafael Adrián Pacheco-OrozcoMiembro del grupo de investigación en Nutrición,

Genética y Metabolismo, Facultad de Medicina,Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia

Ana Milena GómezServicio de Genética, Hospital Universitario San

Ignacio, Bogotá, Colombia

Sandra PerdomoMiembro del grupo de investigación en Nutrición,

Genética y Metabolismo, Facultad de Medicina,Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia

Reggie García-RoblesMiembro del grupo de investigación en Nutrición,

Genética y Metabolismo, Facultad de Medicina,Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia. Profesor

departamento de Ciencias Fisiológicas, PontificiaUniversidad Javeriana, Bogotá, Colombia

RESUMENIntroducción: El término secuenciación de nueva generación (NGS) hacereferencia a las tecnologías diseñadas para analizar gran cantidad deADN de forma masiva y paralela. En esta revisión se abordan losconceptos básicos de estas tecnologías, las consideraciones de su usoclínico actual y perspectivas a futuro. Desarrollo: Las pruebas basadasen NGS han revolucionado el estudio de los genomas, pues permitenla lectura de millones de secuencias de ADN de forma masiva yparalela en un menor lapso y a menor costo por base. Estas pruebasincluyen la secuenciación de panel de genes, la secuenciación completadel exoma y la secuenciación completa del genoma. El análisis de susresultados es complejo y requiere un proceso bioinformático y clínicoexhaustivo para su adecuada interpretación. Las limitaciones de laspruebas NGS incluyen aspectos técnicos como cobertura, profundidad ylongitud de las secuencias, las cuales se pueden solventar implementandobuenas prácticas de laboratorio. Conclusiones: Las pruebas basadas en lasecuenciación por NGS son herramientas diagnósticas que deben partirde una aproximación clínica adecuada para su uso razonado, correctainterpretación y toma de decisiones acertadas. Es de gran trascendenciaque los médicos tengan la información básica para poder solicitar einterpretar estas pruebas, dada su relevancia clínica actual.

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Santiago Rubio, Rafael Adrián Pacheco-Orozco, Ana Milena Gómez, et al.

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Palabras clavesecuenciación de nucleótidos de alto rendimiento; análisis desecuencia de ADN; mutación; interpretación de variantes.

ABSTRACTIntroduction: The term Next-Generation Sequencing(NGS) represents the technologies designed to analyzegreat amounts of DNA in a massive and parallel fashion.In this review we present the basic concepts of NGStechnologies, the considerations for its current use andfuture perspectives. Development: NGS-based tests hasrevolutionized the study of the genomes as it allowsthe read of millions of DNA sequences massively andparallelly, in a shorter span of time and at a lesser costper base. These tests include gene panel sequencing, wholeexome sequencing and whole genome sequencing. Resultanalysis can be complex and requires an exhaustive clinicaland bioinformatic process for an adequate interpretation.Among the limitations of NGS testing are the errorsin technical aspects such as coverage, depth and readlength, as well as its limited usefulness for the detection ofstructural alterations. These limitations can be approachedimplementing good laboratory practices. Conclusions:NGS tests are diagnostic tools that must be supportedby an adequate clinical approach for its reasoned use,correct interpretation and appropriate decision-making. Itis of great importance that physicians acquire the basicinformation to be able to order and interpret these testsgiven their current relevance.Keywordshigh-throughput nucleotide sequencing; sequence analysis; DNA;mutation; variant interpretation.

Introducción

La secuenciación de nueva generación (NextGeneration Sequencing [NGS]) es un grupode tecnologías diseñadas para secuenciar grancantidad de segmentos de ADN de formamasiva y en paralelo, en menor cantidad detiempo y a un menor costo por base (1,2).Su uso se dio inicialmente para detectarvariantes de nucleótido único y cada vez se hadesarrollado para otro tipo de variantes, comoinserciones, deleciones y grandes rearreglos.Gracias a los recientes desarrollos en laspruebas basadas en NGS, estas tecnologías seplantean como estrategias de gran utilidad parala prevención, el diagnóstico, el tratamientoy el seguimiento de un amplio espectro deenfermedades, incluidas condiciones genéticas,patologías crónicas y enfermedades infecciosas,y se prevé que en un futuro cercano su

creciente aplicación clínica generará resultadosfavorables para lograr el diagnóstico molecularen un número mayor de pacientes y a unmenor costo (3-5). En la práctica clínica escreciente el uso actual de las pruebas basadasen NGS; sin embargo, aún existe incertidumbresobre aspectos importantes como las indicacionesadecuadas para su uso, limitaciones de latécnica (sensibilidad y especificidad), reporte devariantes, interpretación de resultados, relacióncosto-beneficio y cobertura en el Plan Nacionalde Salud (6).

En esta revisión queremos presentar de maneraclara los conceptos básicos que definen lastecnologías NGS, las consideraciones de su usoactual en la práctica clínica y perspectivas afuturo.

Desarrollo

Pruebas NGS: desarrollo histórico y conceptosbásicos

Desde 1977, la secuenciación Sanger ha sido laprueba estándar para la detección de variantesen el ADN. Su precisión y relativamente sencilloanálisis de datos han permitido su uso enel diagnóstico de enfermedades monogénicas;sin embargo, en enfermedades que exhibenheterogeneidad genética, donde se requiere lasecuenciación de múltiples genes, el procesode secuenciación se hace largo y tedioso (4),lo que ha generado ansiedad en las familias yretraso en el tratamiento. Además, el preciopara secuenciar todo el genoma humano eramuy elevado, de aproximadamente 300 millonesde dólares, lo que dificultaba su aplicación(7,8). Posteriormente, y debido a la necesidadde analizar fragmentos más grandes de ADN yagilizar el proceso de secuenciación, surgió latécnica de secuenciación en escopeta (shotgunsequencing), a partir de la cual fragmentossuperpuestos de ADN se secuenciaban porseparado y luego se ensamblaban en una solasecuencia continua (9). Este avance, y otros,fueron usados y permitieron la culminación delproyecto de genoma humano (9). Desde el 2005,

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se inició la comercialización de las pruebas NGS(10), las cuales han revolucionado la forma enla que se secuencian los genomas. Esta nuevatecnología ha permitido la lectura de millonesde secuencias de forma masiva y paralela enun menor lapso y a un menor costo por base,facilitando el diagnóstico de enfermedades dealta heterogeneidad genética y su aplicaciónen la práctica clínica (11,12). Adicionalmente,permite, por ejemplo, secuenciar, un panel degenes específicos, la porción genética codificantecompleta (exoma) o todo el genoma completode un individuo en 1 o 2 días con un costoaproximado de 5000 dólares (13).

Hay dos conceptos que son fundamentalespara entender el proceso y los resultados de laspruebas basadas en tecnologías NGS: coberturay profundidad. Existe aún confusión en lautilización de estos términos, que comúnmenteson usados de manera indistinta en la literatura.La cobertura (coverage o breadth of coverage,en inglés) se refiere al porcentaje de basesdel genoma de referencia que están siendosecuenciadas una cantidad determinada de veces(14). Por otro lado, la profundidad (depth odepth of coverage) representa el número promediode veces que cada base en el genoma essecuenciada en los fragmentos de ADN (14)(figura 1). Los valores apropiados de profundidaddependerán de la aplicación de la técnica desecuenciación (panel de genes, exoma o genoma)y la frecuencia alélica de las variantes que seanalizarán (germinales y somáticas).

Figura 1.Cobertura y profundidad

Técnicas actuales de mayor uso de secuenciaciónde nueva generación

Todas las técnicas NGS comparten la capacidadde secuenciar una gran cantidad de fragmentosde ADN de forma paralela en un corto lapso.Para lograr este objetivo, siguen un abordajemetodológico semejante que se puede resumir encinco pasos: 1) segmentación del ADN en variosfragmentos, 2) marcaje del ADN por medio deprimers o adaptadores que indican el punto departida para la replicación, 3) amplificación de losfragmentos de ADN marcados con adaptadorespor métodos basados en reacción en cadena dela polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés),4) secuenciación o lectura de los fragmentosde ADN y 5) reconstrucción de la secuenciacompleta por medio de secuencias de referenciay exportación a ficheros de almacenamientode datos (4,15). En los siguientes apartados serevisarán los métodos de secuenciación Illumina eIon Torrent, que son las dos tecnologías de mayorutilización actualmente (tabla 1).

Tabla 1.Comparación entre plataformas de secuenciación denueva generación

pb: pares de bases; Gb: gigabases. Fuente: Elaboración propia

Santiago Rubio, Rafael Adrián Pacheco-Orozco, Ana Milena Gómez, et al.

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Secuenciador Illumina

La secuenciación por medio de Illumina secaracteriza básicamente por la ejecución de lossiguientes procesos:

a. La amplificación de los fragmentos de ADNpara la generación del clúster (colonias del mismofragmento) se realiza mediante el método de PCRen puente.

b. La detección de bases en la secuenciación sehace a través de etiquetas fluorescentes.

Generación del clústerEste proceso se logra mediante el método

de amplificación en puente (figura 2). Losfragmentos de ADN se colocan sobre unasuperficie sólida de vidrio separada por carriles.Cada carril está completamente recubiertopor oligonucleótidos complementarios a losadaptadores de cada fragmento que se vaa secuenciar, por lo que permiten que cadafragmento se pueda anclar a la celda de flujo.

Figura 2.Generación de hebras mediante PCR en puente.

a) El fragmento de ADN se ancla a la celda deflujo por medio de la unión de sus adaptadores

a los oligonucleótidos complementarios.b) La polimerasa genera una hebra reversa

complementaria y la hebra original es retirada.c) La hebra reversa se pliega y queda en

forma de puente, donde la polimerasa generauna hebra complementaria idéntica a la

original. d) El proceso se repite masivamente.Elaboración propia

Una vez anclados los segmentos, la polimerasainicia el proceso de copia en la hebra de ADNy genera una hebra reversa complementaria. Lahebra original es entonces retirada; mientrasque la hebra reversa, a través de una secuencia

terminal, se pliega y se ancla a su respectivasecuencia complementaria de oligonucleótido, yasí queda en forma de puente. Posteriormente,la polimerasa genera una hebra complementariaidéntica a la original, que resulta en dos hebrasclonadas del segmento inicial. Este proceso serepite masivamente hasta formar millones decopias de cada fragmento (16-18).

SecuenciaciónAl finalizar la amplificación clonal, se retiran

todas las hebras reversas y quedan únicamente lashebras idénticas a las originales. En este punto, enla placa se introducen nucleótidos modificadoscon etiquetas fluorescentes específicas para cadatipo. Los nucleótidos utilizados presentan unamodificación química (terminadores reversibles)que evita la unión de más de un nucleótidomarcado en cada sitio de reacción, de tal maneraque se puede ubicar el que corresponde a cadapunto en la secuencia y se disminuye el riesgo deerrores en la secuenciación. Cada vez que unabase se adhiere emite una fluorescencia propiaque permite su identificación. La etiqueta debeser removida antes de la colocación del siguientenucleótido para evitar que dos bases emitanseñal a la vez. Al finalizar la primera lectura,el fragmento resultante es retirado. Este paso serepite simultáneamente con todas las hebras delmismo clúster de forma paralela hasta completarla secuenciación (16-18).

La exactitud de la secuenciación en elsecuenciador Illumina será determinada por laintensidad de la señal, y la longitud de laslecturas, por el número de ciclos realizados.Actualmente, alcanzan una longitud por lecturade hasta 300 pares de bases (3).

Secuenciador Ion Torrent de Thermo Fisher

La secuenciación en Ion Torrent se lleva a cabo enun chip semiconductor, y se diferencia de Illuminaen los siguientes aspectos:

· La amplificación de los fragmentos de ADNse realiza utilizando la técnica de PCR deemulsión.

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· La detección de las bases en la secuenciaciónse da por medio de la detección de un ionsemiconductor.

Reacción en cadena de la polimerasa en emulsión

Cada fragmento de ADN se deposita enmicromicelas ubicadas en una emulsión deaceite en agua, donde, además, se depositauna microesfera que está recubierta deadaptadores complementarios a los adaptadoresdel fragmento, y una polimerasa que iniciarála PCR (figura 3). Para ser copiada la hebraoriginal se hibrida con los adaptadores ubicadosen la microesfera. Después de la amplificación,se retiran todas las hebras complementarias yse dejan solo las hebras con los adaptadoresligados a la microesfera, y finalmente quedanmiles de copias de un mismo fragmento deADN (17). Este paso se repite en millones deesferas que posteriormente se colocan cada unapor separado en micropocillos que contienentodos los componentes necesarios para iniciar lasecuenciación (19).

Figura 3.Generación de hebras mediante PCR en emulsión.

a) Los fragmentos de ADN están enla emulsión junto con las microesferas

recubiertas con adaptadores. b) El fragmentode ADN hibrida con los adaptadores

de la microesfera para ser amplificado.Elaboración propia

Secuenciación mediante ion semiconductor

Cuando un nucleótido es ligado a la hebraque se va a secuenciar, se forma un enlacecovalente y se libera un ion de hidrógenocargado positivamente. Cada vez que se liberaun ion de hidrógeno, se da un cambio en

el pH de la solución del pocillo y se generauna corriente eléctrica. Este método se basa enla detección del cambio de voltaje por medioun sensor llamado ISFET (Ion-Sensitive Field-Effect Transistor), que indica que el nucleótidose ha incorporado correctamente (20). Para laidentificación del tipo de nucleótido agregado,inicialmente se inserta solo un tipo de base enel pocillo y el sensor ISFET detectará o no elvoltaje dependiendo de la complementariedadde la base. Si esta no es complementaria, seagrega otro nucleótido hasta que se detectevoltaje. En esta técnica, los nucleótidos no estánmodificados con terminadores reversibles, por loque en caso de que haya homopolímeros (dos omás nucleótidos iguales que se repiten), el pHdisminuirá en mayor proporción y la diferencia devoltaje aumentará proporcionalmente al númerode bases añadidas (19). Este proceso ocurre deforma paralela en todos los pocillos del chip yalcanza una longitud de lectura de hasta 400pares de bases (17,19).

Aplicación de las tecnologías basadas ensecuenciación de nueva generación en lapráctica clínica

Secuenciación de panel de genes

Es una prueba que secuencia un númerodeterminado y específico de genes que estánrelacionados con una enfermedad o grupode enfermedades. Supone un ejercicio clínicoprevio que esté enfocado en un grupo depatologías similares y que se beneficie de estaherramienta para el diagnóstico diferencial. Serecomienda su uso cuando en la clínica delpaciente se observe un fenotipo característicoy se sospeche de una enfermedad genéticaque sea causada por una lista determinada degenes candidatos con buena posibilidad paraestablecer el diagnóstico molecular (véase elcaso clínico). Es la prueba de menor costo, serealiza más rápidamente, tiene una profundidadde secuenciación mayor y la interpretación yanálisis de resultados es más sencilla, debido ala existencia de bases de datos de referencia

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que asocian las variantes halladas en los genescon la enfermedad relacionada (15,21). Unadesventaja es que la información genética de lapoblación latinoamericana está subrepresentadatanto en las bases de datos poblacionales comoen las específicas de enfermedad, por lo que sedificulta la interpretación clínica de las variantesencontradas en pacientes con esta ancestría (22).Existen bases de datos como el Genetic TestingRegistry (23), que reúne la información de lospaneles genéticos específicos y validados conla información suministrada por los laboratoriosproveedores. Se han implementado en la prácticaclínica paneles NGS para diferentes condiciones;tal es el caso del panel Hereditary CancerSolutionTM (24), que evalúa 26 genes asociadoscon cáncer de seno y ovario, cáncer colorrectalhereditario no polipósico y síndrome de poliposisintestinal.

Secuenciación completa de exoma

En esta prueba se secuencian todas las regionescodificantes del genoma, es decir, el exoma, elcual representa entre el 1 y el 2 % de la secuenciagenómica completa y donde se hallan hastael 85 % de las variantes genéticas reportadascomo patogénicas (25). Es de gran utilidad enpacientes que padecen enfermedades con granheterogeneidad genética, como el autismo, o quepresenten un fenotipo complejo, donde el cuadroclínico no es lo suficientemente característico deuna variante o de uno o varios genes específicos(26). Comparada con la secuenciación completadel genoma, es menos costosa, su duración esmenor y la interpretación y análisis de datos esmenos compleja. Presenta una amplia capacidadpara la identificación de enfermedades genéticas;sin embargo, se debe tener presente que no estádiseñada para identificar variantes patogénicasque se encuentren en regiones no codificantes(regiones de ADN que no tienen informaciónque codifica para la proteína) como intrones oregiones promotoras (21,27). La interpretaciónde los resultados puede ser más compleja ypuede ser más probable encontrar variantesde significado incierto o variantes que no se

correlacionen con la clínica del paciente, encuyo caso el estudio de familiares —como elexoma trío, es decir, secuenciación de exoma delprobando y sus dos progenitores— podría resultarútil (15). Su uso clínico se ha propuesto, porejemplo, como primera prueba diagnóstica entrastornos del neurodesarrollo (28).

Secuenciación completa de genoma

Esta prueba evalúa todas las bases del genoma,incluyendo las regiones no codificantes. Tienecomo ventaja que es la mejor prueba parala detección de nuevas variantes genéticas yestructurales que no se asociaban previamentecon el cuadro clínico que se iba a estudiar (15).Es de gran utilidad en enfermedades genéticasraras en las que no es posible llegar al diagnósticopor medios convencionales, es decir, en las quehay odisea diagnóstica y cuando el fenotipo delpaciente pueda ser explicado por una variantede novo. Además, es la prueba con menossesgos durante el análisis de genes, debido aque la secuenciación no está dirigida haciagenes específicos (3,16,29). En la actualidad,su uso sigue siendo poco frecuente, debido asu mayor costo, mayor tiempo de entrega deinforme, falta de anotaciones sobre regionesno codificantes y la dificultad en el análisise interpretación de sus resultados (30). Estáen desarrollo su implementación en la prácticaclínica, especialmente en población pediátrica,aunque existe aún debate sobre la utilidad clínicay la costoefectividad de este tipo de pruebas (31).

Aspectos éticos y normatividad sobre elreporte, interpretación y validación dehallazgos

Para la correcta interpretación de datos, enprimer lugar, se debe verificar la calidadde los datos secuenciados, mediante el usode un genoma de referencia validado yconocido. Cuando este se alinea con lamuestra secuenciada, permite identificar errorescometidos durante la secuenciación y el análisisde los datos (32). Posteriormente, se deben

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identificar las variantes genéticas y definir si estasse asocian con alguna enfermedad.

El Colegio Americano de Genética yGenómica Médica recomienda el uso de lasiguiente terminología para el reporte dedatos de las variantes genéticas identificadas:patogénica: variantes que tienen evidencia fuertede asociación con enfermedad. Probablementepatogénica: variantes que probablemente estánimplicadas con enfermedad, pero no hayevidencia suficiente para demostrar asociación.De significado incierto (VUS): variantes conposibles cambios funcionales, pero con evidenciacontradictoria o insuficiente como paraconsiderarla benigna o patogénica. Probablementebenigna: variantes con evidencia que sugierebenignidad, pero con datos débiles en laliteratura que no descartan impacto biológicoy eventualmente clínico. Benigna: variantesgenéticas que no alteran funcionalidad (21,33).

La interpretación de cada resultado enlas pruebas NGS es compleja, ya que, alsecuenciar una mayor cantidad de genes,se pueden evidenciar un mayor númerode variantes genéticas incidentales que nopresentan significado conocido para la definiciónde un plan de acción (34). La mayoría deestas variantes desconocidas pueden no concederriesgo en un individuo sano, pero tambiénexiste la posibilidad de que sea una nuevavariante patogénica (35). Se ha reportado que,en un individuo sano, del 100 % de variantesencontradas, solo el 60 % tiene probabilidadesreales de asociarse a enfermedad (36). Las VUS,aunque actualmente no pueden ser clasificadascomo causales de enfermedad, pueden cambiarsu clasificación según la aparición de nuevaevidencia que las clasifique como patogénicas obenignas.

Los laboratorios deben seguir un plan claroy adecuado para la clasificación de significadoclínico de las variantes, que incluya eluso de programas predictivos computacionales,búsqueda de variantes en bases de datos,literatura de casos clínicos relacionados con lasvariantes y evidencia de su efecto biológicoen estudios funcionales. Los programas debioinformática (por ejemplo, SIFT, PolyPhen o

MutationTaster) utilizan algoritmos especialesque intentan predecir el efecto de la variante enla proteína y su posible impacto en la función(37,38). Los programas también evalúan si lavariante interfiere o no en el proceso de splicing(corte de intrones y empalme de exones). Elporcentaje de predicción de estos programases de aproximadamente del 65 % al 80 % paravariantes localizadas en regiones codificantes,lo que no garantiza que la predicción seaun 100 % correcta (39). En consecuencia, noes recomendable usar un solo algoritmo y sedebe considerar evidencia adicional para realizaruna afirmación clínica. Se debe identificarla variante encontrada en bases de datos yexaminar su frecuencia y si presenta evidencia deestar asociada o no a patogenicidad. GnomAD,ClinVar, OMIM, COSMIC y Human GeneMutation Database son bases de datos confiablespara examinar la asociación de una variantea enfermedad (tabla 2) (33). Este proceso deinterpretación deberá ser realizado idealmentepor el laboratorio como parte de su servicioy explicado al paciente por profesionales conentrenamiento calificado en asesoría genética(40). En caso de que todavía existan dudas sobrela significancia clínica de los hallazgos o aún nose hayan identificado variantes que expliquen laclínica del paciente, se puede considerar comoopción la secuenciación de los familiares delpaciente para ayudar a clarificar la relación de lapresencia de una variante con la presentación dela enfermedad (41). Además, se debe contemplarla recomendación de no entregar resultadosdefinitivos basados en una solo prueba NGS,para disminuir la probabilidad de error, y eneste sentido tener presente la posibilidad deconfirmación de hallazgos con secuenciaciónSanger u otras técnicas ortogonales, según elhallazgo (42,43).

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Tabla 2.Bases de datos para análisis bioinformático

Recientemente, la Food and DrugAdministration (FDA) publicó su guía para eldiseño, el desarrollo y la validación analíticade las pruebas basadas en NGS, diseñadaspara el diagnóstico de enfermedades de líneagerminal (44). Para la entrega de resultados,la FDA recomienda que las interpretacionesse seleccionen de bases de datos que esténcorrectamente validadas, curadas y actualizadas(43). Estas bases de datos deben posibilitar elacceso al público, con el fin de que tantopacientes como profesionales de la salud reviseny comparen los datos. Todos los resultados debencumplir con regulaciones federales, donde secertifique la seguridad de los datos y la privacidaddel paciente. Adicionalmente, es mandatorioemplear una nomenclatura que se encuentreestandarizada para el reporte de resultados, conel propósito de facilitar su comparación condiferentes fuentes (43).

Es de suma importancia que sea confiable yclaro el informe que reciba el paciente, juntocon una explicación por parte del profesional acargo sobre la implicación de este resultado, ycon la posibilidad de brindar educación sobre laenfermedad y apoyo emocional, si es necesario(45). Es precisa una asesoría pretest antes deordenar la prueba, con el fin de explicar alpaciente en qué consiste y aclarar los alcancese implicaciones de su ejecución. Además, en laconsulta inicial se deben obtener datos como:antecedentes personales y familiares, riesgospsicosociales relevantes, nivel de educación,conocimiento sobre la enfermedad, y llevar a

cabo un proceso de consentimiento informadoprevio a la prueba (46). Al obtener los resultados,se deberá realizar asesoría postest, en la cualse clarifique el reporte obtenido a través deuna atención personalizada que se adecúe a lacondición de cada paciente y se exponga unclaro significado clínico, enfocado en las posiblesdecisiones terapéuticas, indicando beneficios ycomplicaciones, y se solucionen dudas (figura 4).Las consultas generalmente tienen una duraciónde 30 a 60 minutos, aunque podrían llegar anecesitarse hasta 90 minutos para cubrir unaatención apropiada (47-49). Esto dependerá delcontexto individual de cada paciente.

Figura 4.Pasos para el correcto análisis, interpretación yentrega de resultados de NGS

MLPA: amplificación de sondasdependiente de ligandos múltiples.

Elaboración propia

MLPA: amplificación de sondas dependientede ligandos múltiples. Fuente: elaboraciónpropia.

En el cuadro 1 se muestra un caso clínico realen el que se describe el manejo adecuado de unpaciente que se somete a una prueba de NGS.

Cuadro 1. Caso clínicoUna paciente de 63 años de edad asistió a

consulta de genética médica, remitida por elservicio de Oncología con el resultado de unpanel NGS. Tiene historia personal de cáncerde ovario diagnosticado a los 33 años, manejadocon cirugía y quimioterapia. A los 62 años, lefue diagnosticado cáncer de mama, con reportepatológico de carcinoma ductal in situ de altogrado de patrón comedo con microcalcificacionessin evidencia de microinfiltración. Recibiómanejo con cuadrantectomía más radioterapiaadyuvante. En el momento de la consulta recibía

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tratamiento con tamoxifeno. También tenía unahistoria familiar recurrente de cáncer (madre,hermana, sobrina y tía materna con historia decáncer de mama).

Se realizó un estudio mediante panel NGS de28 genes relacionados con síndromes de cáncerhereditario. El reporte evidencia la presenciade la variante c.1188del (p.Val397Phefs*17)heterocigota en el gen CHEK2, reportadacomo patogénica para síndrome de cáncer demama y ovario hereditario. Adicionalmente,se encontraron las variantes c.511A>G(p.Ile171Val) en el gen NBN y c.1564C>T(p.Pro522Ser) en el gen PALB2, ambasclasificadas como VUS.

El resultado de este reporte debe entregarse ala paciente, explicándole las implicaciones quetiene y los cambios que se pueden realizar en laprevención y el tratamiento, siempre brindandoapoyo emocional. Se debe explicar que, auncuando esta mutación del gen CHEK2 no tieneimplicación farmacogenómica actual, sí es útilpara establecer el plan de vigilancia y seguimientode la enfermedad y permite realizar consejeríagenética a la familia. La paciente tiene riesgode un segundo cáncer de mama dentro de losprimeros diez años del primero de hasta un 29 % y un riesgo posiblemente elevado para cáncercolorrectal. Este resultado también representauna probabilidad del 50 % para cada uno de loshijos de la paciente de tener la misma mutación,lo que se podría traducir en un riesgo mayor detener cáncer de mama para sus descendientes.Hay que tener en cuenta que el manejo en estoscasos no debe estar basado en una sola prueba,sino que además se debe tener en cuenta lahistoria personal y familiar de cada paciente.

Las VUS, aunque actualmente no se puedenclasificar como causales con la evidenciadisponible, pueden cambiar su clasificación segúnla aparición de nueva evidencia que las clasifiquecomo patogénicas o benignas, por lo que esimportante establecer un plan de reanálisis dedatos con cierta periodicidad.

Fuente: elaboración propia.

Limitaciones

Las pruebas basadas en tecnologías NGS,como cualquier prueba de laboratorio, tienenlimitaciones que deben ser conocidas para unaadecuada interpretación de los resultados. Elcosto de una secuenciación veloz, masiva yparalela es el aumento de errores en relacióncon la cobertura o profundidad con la quese secuencia el gen. En las pruebas NGS, lacobertura de lecturas de un mismo fragmentoes más baja en comparación con Sanger,por lo que hay más probabilidad de que seomitan regiones con variantes considerables paraproporcionar un diagnóstico adecuado. Por otraparte, en el proceso de amplificación basadoen PCR también se pueden generar errores,especialmente en regiones con alto contenidode guanina y citosina, que finalmente puedenterminan por afectar el posterior análisis dedatos (50). Otra limitación es la reducción dela longitud de las secuencias (de 800-1000 pben Sanger a 40-400 pb en NGS), lo que generamayor dificultad en el análisis de datos (48).Dependiendo del diseño de la prueba, las pruebasbasadas en NGS pueden presentar limitacionesen la identificación de deleciones, inserciones,mosaicismos y traslocaciones de gran tamañoo en la detección de variantes de número decopias, en los que serían de mayor utilidad otraspruebas más específicas como la amplificaciónde sondas dependientes de ligandos múltiples, lahibridación fluorescente in situ o la hibridacióngenómica comparativa (21). Adicionalmente, enlos últimos años, con el uso de estas tecnologías,es cada vez mayor el reporte de variantesgenéticas de significado clínico incierto, lo quesuscita incertidumbre al analizar la informaciónpara determinar un diagnóstico y tratamientoapropiados (51,52). Estos errores se puedendisminuir implementando buenas prácticas delaboratorio que garanticen técnicas de buenacalidad y a partir de la utilización de estándaresespecíficos con evidencia científica válida entodas las bases de datos.

En Colombia, se espera que a futuro se realicenmás estudios epidemiológicos que permitanidentificar la asociación entre variantes genéticas

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propias y la enfermedad que se va a estudiar, y quese generen datos genómicos de consulta abierta.Actualmente, en Colombia solo se dispone deinformación genómica de nuestra población enuna base de datos pública, perteneciente alproyecto 1000 genomas, que contiene variantesalélicas identificadas a partir de 148 muestrasindividuales de ADN, recolectadas en la ciudadde Medellín (53). Todas las pruebas aquínombradas están cubiertas por el Plan deBeneficios en Salud (PBS) y se pueden solicitarsin costos adicionales para el paciente. Deacuerdo con la última Clasificación Única deProcedimientos en Salud, Resolución 5851 del 21de diciembre del 2018. Las pruebas disponiblespara genética se pueden ubicar desde el código90.8.4 hasta el código 90.8.4.41 (54).

Perspectivas

La secuenciación de nueva generación es unaherramienta que ya se está utilizando y que apoyael diagnóstico de pacientes con enfermedadescomunes como el cáncer hasta pacientes conenfermedades raras o huérfanas. En la prácticaclínica, su implementación genera retos quedeben considerarse para que el impacto positivode estas tecnologías sea aún mayor. Estosincluyen reducir el tiempo de entrega deresultados, generar guías para el manejo clínicode las variantes, aumentar la representaciónpoblacional en las bases de datos y estandarizarlas prácticas de laboratorio y de análisis dedatos (55). Asimismo, es importante que existalegislación sobre el uso de las tecnologías desecuenciación en el ámbito clínico, con el fin deque se estandaricen los procesos y se promuevala implementación e investigación sobre el tema.Los gobiernos de algunos países, como Chinay Estados Unidos, han adelantado medidasregulatorias y guías con esta finalidad (56).

La investigación en tecnologías desecuenciación de ADN se encuentra en continuodesarrollo. Actualmente, se enfoca en mejorar lainterpretación de los datos y la clasificación delas variantes, para lo cual existen, por ejemplo,iniciativas dirigidas al uso de la inteligencia

artificial en la detección de variantes y lapredicción de su efecto (55). Han surgidotambién tecnologías llamadas secuenciación detercera generación, como la secuenciación porNanopore, que se caracteriza por la generaciónde fragmentos de lectura largos (de hasta 1 Mb)sin necesidad de amplificación por PCR, lo queevita sesgos y permite una cobertura mucho máshomogénea del genoma (57). Estos avances severán implementados en la práctica clínica en unfuturo no muy lejano.

Conclusiones

Las NGS son pruebas paraclínicas que siempredeben partir de una aproximación clínicainicial adecuada y de una visión integral delpaciente que incluye resultados de otras pruebasparaclínicas para su uso razonado, correctainterpretación y toma de decisiones acertadasen la práctica médica. En la última década, laspruebas NGS han establecido su valor comoprueba diagnóstica, dado su buen rendimientopara la detección de enfermedades genéticas y eldescubrimiento de nuevas variantes patogénicas.Esta tecnología ha permitido facilitar eldiagnóstico molecular, al ser una herramientamás eficiente y veloz en la secuenciación degenes, y ha facilitado la identificación y laclasificación de múltiples variantes genéticasjunto con su respectiva asociación patológica.Adicionalmente, se han disminuido los costosde la secuenciación y la duración en la que sedefine el diagnóstico, lo que permite estableceroportunamente medidas de prevención enpacientes con alto riesgo a futuro.

Las pruebas basadas en NGS representanretos y desafíos, como la comprensión de suutilización de forma adecuada, su validación apartir de estándares de calidad y la interpretacióncorrecta de variantes reportadas, junto con unaasesoría acertada para el paciente, con el finde lograr que el diagnóstico de enfermedadesde base genética sea cada vez más oportunoy adecuado. Es de gran trascendencia que losmédicos tengan la información básica para poder

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solicitar e interpretar estas pruebas, dada surelevancia clínica actual.

Referencias

1. Green ED, Guyer MS. Chartinga course for genomic medicinefrom base pairs to bedside. Nature.2011;470(7333):204-13.2. Lander ES. Initial impact of thesequencing of the human genome.Nature. 2011;470(7333):187-97.3. Zhang W, Cui H, Wong L-JC. Application of next generationsequencing to molecular diagnosis ofinherited diseases. Top Curr Chem.2014;336(1):19-45.4. Santillán S, Álvarez D, Buades C,Romera-López A, Pérez-Cabornero L,Valero-Hervás D, et al. Diagnósticomolecular de enfermedades genéticas:del diagnóstico genético al diagnósticogenómico con la secuenciación masiva.Rev Médica Clínica Las Condes.2015;26(4):458-69.5. Van Dijk EL, Auger H, JaszczyszynY, Thermes C. Ten years of next-generation sequencing technology.Trends Genet. 2014;30(9):418-26.6. Gallo JE. Actualidad de la genómicaclínica en el área cardiovascularen Colombia. Rev Colomb Cardiol.2017;24(1):1-2.7. Faure D, Joly D. Next-generationsequencing as a powerful motorfor advances in the biological andenvironmental sciences. Genetica.2015;143:129-32.8. Tucker T, Marra M, Friedman JM.Massively parallel sequencing: the nextbig thing in genetic medicine. Am JHum Genet. 2009;85(2):142-54.9. Heather JM, Chain B. Thesequence of sequencers: The historyof sequencing DNA. Genomics

[Internet]. 2016;107(1):1-8. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003.10. Voelkerding K, DamesSA, Durtschi JD. Next-generationsequencing: from basic researchto diagnostics. Clin Chem.2009;55(4):641-58.11. Mardis ER. Next-generationDNA sequencing methods. AnnuRev Genomics Hum Genet.2008;9:387-402.12. Shendure J, Ji H. Next-generationDNA sequencing. Nat Biotechnol.2008;26(10):1135-45.13. Lewis T. Human Genome ProjectMarks 10th Anniversary. Live Science.2013;1-7.14. Sims D, Sudbery I, Ilott NE,Heger A, Ponting CP. Sequencingdepth and coverage: key considerationsin genomic analyses. Nat Rev Genet.2014;15:121.15. Rodríguez-Santiago B, Armengol L.Tecnologías de secuenciación de nuevageneración en diagnóstico genéticopre- y postnatal. Diagnóstico Prenat.2012;23(2):56-66.16. Morozova O, MarraMA. Applications of next-generation sequencing technologiesin functional genomics. Genomics.2008;92(5):255-64.17. Goodwin S, McPherson JD,McCombie WR. Coming of age: Tenyears of next-generation sequencingtechnologies. Nat Rev Genet.2016;17(6):333-51.18. Illumina. Illumina SequencingTechnology; 2015. Disponible en: http://illumina.com19. Buermans HPJ, den DunnenJT. Next generation sequencingtechnology: advances and applications.Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis.2014;1842(10):1932-41.

https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003http://illumina.comhttp://illumina.com

Santiago Rubio, Rafael Adrián Pacheco-Orozco, Ana Milena Gómez, et al.

| Universitas Medica | V. 61 | No. 2 | Abril-Junio | 2020 |12

20. Pennisi E. Genomics:SEMICONDUCTORS inspire newsequencing technologies. Science.2010;327(5970):1190.21. Hulick PJ. Next-generationDNA sequencing (NGS): principlesand clinical applications [internet].UpToDate. 2018. Disponible en: https://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applications22. Briceño Balcázar I. Medicinagenómica en Cardiología. Rev ColombCardiol. 2017;24(1):3-4.23. Rubinstein WS, Maglott DR, LeeJM, Kattman BL, Malheiro AJ, OvetskyM, et al. The NIH genetic testingregistry: a new, centralized databaseof genetic tests to enable accessto comprehensive information andimprove transparency. Nucleic AcidsRes. 2013;41(1): 925-35.24. Hereditary Cancer Solution™by Sophia Genetics [Internet].Sophia Genetics; 2019 [citado2 dic 2019]. Disponibleen: https://www.sophiagenetics.com/hospitals/solutions/hereditary-cancer-solution.html25. Choi M, Scholl UI, Ji W, LiuT, Tikhonova IR, Zumbo P, et al.Genetic diagnosis by whole exomecapture and massively parallel DNAsequencing. Proc Natl Acad Sci U S A.2009;106(45):19096-101.26. Worthey EA, Mayer AN,Syverson GD, Helbling D, BonacciBB, Decker B, et al. Makinga definitive diagnosis: successfulclinical application of whole exomesequencing in a child with intractableinflammatory bowel disease. GenetMed. 2011;13(3):255-62.27. Biesecker LG, Green RC.Diagnostic clinical genome and

exome sequencing. N Engl J Med.2014;371:1170.28. Srivastava S, Love-Nichols JA,Dies KA, Ledbetter DH, Martin CL,Chung WK, et al. Meta-analysis andmultidisciplinary consensus statement:exome sequencing is a first-tier clinicaldiagnostic test for individuals withneurodevelopmental disorders. GenetMed. 2019;21(11):2413-21.29. Bainbridge MN, Wiszniewski W,Murdock DR, Friedman J, Gonzaga-Jauregui C, Newsham I, et al. Whole-genome sequencing for optimizedpatient management. Sci Transl Med.2011;3(87):87re3.30. Kuhlenbaumer G, HullmannJ, Appenzeller S. Novel genomictechniques open new avenues in theanalysis of monogenic disorders. HumMutat. 2011;32(2):144-51.31. Smith HS, Swint JM, LalaniSR, Yamal J-M, de Oliveira OttoMC, Castellanos S, et al. ClinicalApplication of Genome and ExomeSequencing as a Diagnostic Toolfor Pediatric Patients: a ScopingReview of the Literature. Genet Med.2019;21(1):3-16.32. Endrullat C, Glökler J, FrankeP, Frohme M. Standardizationand quality management in next-generation sequencing. Appl TranslGenomics. 2016;10:2-9.33. Richards S, Aziz N, Bale S,Bick D, Das S, Gastier-Foster J, etal. Standards and guidelines for theinterpretation of sequence variants: Ajoint consensus recommendation of theAmerican College of Medical Geneticsand Genomics and the Associationfor Molecular Pathology. Genet Med.2015;17(5):405-24.34. Taylor JC, Martin HC, Lise S,Broxholme J, Cazier J-B, RimmerA, et al. Factors influencing success

https://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applicationshttps://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applicationshttps://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applicationshttps://www.uptodate.com/contents/next-generation-dna-sequencing-ngs-principles-and-clinical-applicationshttps://www.sophiagenetics.com/hospitals/solutions/hereditary-cancer-solution.htmlhttps://www.sophiagenetics.com/hospitals/solutions/hereditary-cancer-solution.htmlhttps://www.sophiagenetics.com/hospitals/solutions/hereditary-cancer-solution.html

Secuenciación de nueva generación (NGS) de ADN: presente y futuro en la práctica clínica

| Universitas Medica | V. 61 | No. 2 | Abril-Junio | 2020 | 13

of clinical genome sequencing acrossa broad spectrum of disorders. NatGenet. 2015;47(7):717-26.35. O’Roak BJ, Deriziotis P, Lee C,Vives L, Schwartz JJ, Girirajan S,et al. Exome sequencing in sporadicautism spectrum disorders identifiessevere de novo mutations. Nat Genet.2011;43(6):585-9.36. Lam HYK, Clark MJ, Chen R,Chen R, Natsoulis G, O’HuallachainM, et al. Performance comparison ofwhole-genome sequencing platforms.Nat Biotechnol. 2011;30(1):78-82.37. Tavtigian S V, Greenblatt MS,Lesueur F, Byrnes GB. In silicoanalysis of missense substitutions usingsequence-alignment based methods.Hum Mutat. 2008;29(11):1327-36.38. Thompson BA, Greenblatt MS,Vallee MP, Herkert JC, TessereauC, Young EL, et al. Calibration ofmultiple in silico tools for predictingpathogenicity of mismatch repair genemissense substitutions. Hum Mutat.2013 Jan;34(1):255-65.39. Thusberg J, Olatubosun A,Vihinen M. Performance of mutationpathogenicity prediction methods onmissense variants. Hum Mutat. 2011Apr;32(4):358-68.40. Ahram M, Soubani M, AbuSalem L, Saker H, Ahmad M.Knowledge, Attitudes, and PracticeRegarding Genetic Testing and GeneticCounselors in Jordan: A Population-Based Survey. J Genet Couns.2015;24(6):1001-10.41. Roach JC, Glusman G, SmitAFA, Huff CD, Hubley R, ShannonPT, et al. Analysis of geneticinheritance in a family quartet bywhole-genome sequencing. Science.2010;328(5978):636-9.42. Strom SP, Lee H, Das K, Vilain E,Nelson SF, Grody WW, et al. Assessing

the necessity of confirmatory testing forexome-sequencing results in a clinicalmolecular diagnostic laboratory. GenetMed. 2014;16(7):510-5.43. U. S. Food and DrugAdministration. Use of public humangenetic variant databases to supportclinical validity for genetic andgenomic-based in vitro diagnosticsguidance for stakeholders and food anddrug administration staff [internet].2018. Disponible en: https://www.fda.gov/media/99200/download.44. U. S. Food and DrugAdministration. Considerations fordesign, development, and analyticalvalidation of next generationsequencing (NGS) - based invitro diagnostics (IVDs) intendedto aid in the diagnosis ofsuspected germline diseases. Guidance[Internet]. 2018;(April). Disponibleen: https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129.45. Houfek JF, Soltis-vaughan BS,Atwood JR, Reiser GM, SchaeferGB. Adults’ perceptions of geneticcounseling and genetic testing. AppNurs Res. 2015;28(1):25-30. https://doi.org/10.1016/j.apnr.2014.03.00146. Berliner JL, Fay AM. Riskassessment and genetic counseling forhereditary breast and ovarian cancer:recommendations of the NationalSociety of Genetic Counselors. J GenetCouns. 2007;16(3):241-60.47. Laine C, Davidoff F. Patient-centered medicine: a professionalevolution. JAMA. 1996;275(2):152-6.48. Vig HS, Wang C. The evolution ofpersonalized cancer genetic counseling

https://www.fda.gov/media/99200/downloadhttps://www.fda.gov/media/99200/downloadhttps://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM509838.pdf?utm_campaign=FDAfinalizesguidancesforNextGenerationSequencingTests&utm_medium=email&utm_source=Eloqua&elqTrackId=2E86C2A3704E9129https://doi.org/10.1016/j.apnr.2014.03.001https://doi.org/10.1016/j.apnr.2014.03.001

Santiago Rubio, Rafael Adrián Pacheco-Orozco, Ana Milena Gómez, et al.

| Universitas Medica | V. 61 | No. 2 | Abril-Junio | 2020 |14

in the era of personalized medicine.Fam Cancer. 2012;11:539-44.49. Sukenik-Halevy R, Ludman MD,Ben-Shachar S, Raas-Rothschild A.The time-consuming demands of thepractice of medical genetics in the eraof advanced genomic testing. GenetMed. 2016;18(4):372-7.50. Chen Y-C, Liu T, Yu C-H, ChiangT-Y, Hwang C-C. Effects of GC biasin next-generation-sequencing data onde novo genome assembly. PLoS One.2013;8(4):e62856.51. Ulahannan D, Kovac MB,Mulholland PJ, Cazier J-B, TomlinsonI. Technical and implementation issuesin using next-generation sequencing ofcancers in clinical practice. Br J Cancer.2013;109(4):827-35.52. Basho RK, EterovicAK, FundaMeric-Bernstam. Clinicalapplications and limitations of next-generation sequencing. Am J HematolOncol. 2015;11(3):17-22.53. Gibbs RA, Boerwinkle E,Doddapaneni H, Han Y, Korchina V,Kovar C, et al. A global referencefor human genetic variation. Nature[Internet]. 2015;526(7571):68-74.Disponible en: http://www.nature.com/articles/nature1539354. Ministerio de Salud y ProtecciónSocial. Resolución 5851 del 21de diciembre de 2018, por lacual se establece la ClasificaciónÚnica de Procedimientos enSalud-CUPS [Internet]. Disponibleen: https://www.minsalud.gov.co/Normatividad_Nuevo/Resolución5851de2018.pdf55. Liu Z, Zhu L, Roberts R, TongW. Toward clinical implementationof next-generation sequencing-basedgenetic testing in rare diseases:where are we? Trends Genet.2019;35(11):852-67.

56. Jin Y, Zhang L, Ning B, Hong H,Xiao W, Tong W, et al. Applicationof genome analysis strategies inthe clinical testing for pediatricdiseases. Pediatr Investig. 2018 Jul16;2(2):72-81.57. Van Dijk EL, Jaszczyszyn Y, NaquinD, Thermes C. The third revolution insequencing technology. Trends Genet.2018 Sep;34(9):666-81.

Glosario

Acido desoxirribonucleico (ADN): ácido nucleico de doble hebra, encargado del almacenamiento a largo plazo y la transmisión hereditaria de la información necesaria para la síntesis de macromoléculas.

ADN polimerasa: enzima que se encarga de sintetizar la nueva hebra complementaria de ADN.

Amplificación génica: producción de varias copias de un fragmento de ADN en particular.

Cobertura: porcentaje de bases del genoma de referencia que se están secuenciando una cantidad determinada de veces.

Enfermedad genética: trastorno debido a la alteración de uno o varios genes, los cuales sintetizan proteínas defectuosas.

Enfermedades monogénicas: son enfermedades causadas por la alteración en la secuencia de un solo gen.

Enfermedades poligénicas: son enfermedades causadas por la alteración en la secuencia de varios genes, y bajo la influencia de múltiples factores ambientales.

Exoma: porción del genoma conformada por exones.

Exón: región del gen que codifica aminoácidos.

Fenotipo: conjunto de características que son visibles en un individuo, las cuales son el

http://www.nature.com/articles/nature15393http://www.nature.com/articles/nature15393https://www.minsalud.gov.co/Normatividad_Nuevo/Resoluci�n5851de2018.pdfhttps://www.minsalud.gov.co/Normatividad_Nuevo/Resoluci�n5851de2018.pdfhttps://www.minsalud.gov.co/Normatividad_Nuevo/Resoluci�n5851de2018.pdf

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resultado de la expresión de genes, más los factores del medio ambiente.

Frecuencia alélica: medición de la abundancia de un alelo en una población particular.

Gen: serie de nucleótidos que contienen la unidad de información requerida para la síntesis de una molécula funcional.

Genoma: totalidad de material genético contenido en un organismo.

Genotipo: conjunto de genes de un individuo, que contribuyen en la definición de sus características visibles.

Hibridación de ácidos nucleicos: proceso por el cual, dos hebras complementarias de ácidos nucleicos se unen entre sí, formando una molécula de estructura bicatenaria y de doble hélice.

Intron: región del gen que no codifica aminoácidos. Se cree que ayudan a la regulación y a la protección de la expresión génica.

Longitud de lectura de la secuenciación: se refiere al número de pares de bases que se alcanzan a secuenciar a partir de un fragmento de ADN. Entre más largas sean las lecturas, más fácil será el acoplamiento de las secuencias y habrá menos posibilidad de errores en la detección de variantes.

Mosaicismo: presencia de dos o más poblaciones celulares con material genético distinto en el mismo organismo.

Nucleótido: unidad básica de los ácidos nucleicos. Están compuestos por una cadena de azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada.

Panel de genes: examen genético que estudia simultáneamente un conjunto de genes determinado, los cuales están asociados a una patología específica.

Primer (cebador): cadena de oligonucleótidos que actúa como molde de inicio, para que la ADN polimerasa pueda adicionar nucleótidos y comenzar con la replicación de la nueva hebra.

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Profundidad: número promedio de veces que cada base en el genoma es secuenciada en los fragmentos de ADN.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): técnica mediante la cual se obtiene una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN de interés.

Secuenciación: determinación del orden de los nucleótidos de una molécula de ADN o ARN.

Secuenciación de nueva generación: grupo de tecnologías diseñadas para secuenciar gran cantidad de segmentos de ADN de forma masiva y en paralelo, en menor cantidad de tiempo y a un menor costo por base.

Splicing: mecanismo por el cual se eliminan los intrones transcritos de un gen, y posteriormente se unen los exones.

Variante genética: cambio en la secuencia de nucleótidos del gen, que conlleva una alteración en la función biológica de la proteína codificante. Puede ser causal de enfermedad, conceder susceptibilidad o ser parte de la diversidad poblacional.

Variante germinal: afecta las células reproductoras del individuo; por lo tanto, la mutación se transmite a su descendencia.

Variante somática: afecta las células somáticas del individuo, pero no las células reproductoras. La mutación no se transmite a su descendencia.

Variante de nucleótido único: cambio en la secuencia de ADN que solo altera un nucleótido.

Variante de número de copias: alteración que consiste en la pérdida o ganancia de uno o más nucleótidos de un trozo de ADN.

Notas

Conflictos de interés: los autores declaramos que no tenemos ningún conflicto de interés.