Sedimentacion
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La sedimentación en la purificación de componentes celulares
• Introducción• Fuerza centrífuga relativa• Velocidad o tasa de sedimentación• Coeficiente de sedimentación• Tiempo de sedimentación• Centrifugación diferencial• Densidad de flotación• Gradientes de densidad y sus aplicaciones
La sedimentación en la purificación de componentes celulares
Sedimentación
Centrifugación
En función de la velocidad:
Centrifugas “normales”
Ultracentrifugas
Rotores y tubos propios
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)
Permite comparar la fuerza a la que está sometida una partícula
centrifugada en distintos rotores
RCF=rw2/gRCF=rw2/gr = radio en mmw = velocidad angular en radianes por segundo g = aceleración de la gravedad (9807 mm/s2)(1 revolución =2π radianes; w=2πrpm/60 ó w=0,10472xrpm)
RCF=1,12r(rpm/1000)2RCF=1,12r(rpm/1000)2
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)
ROTOR RPM RCF
GSA 10000 10240g
SS-34 10000
7796g
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)
¿ A qué fuerza centrífuga relativa centrifugamos una muestra
en el rotor JA 18.1 si seleccionamos 10000 rpm?
Radio=105,3 mm
RCF=1,12x105,3x(10000/1000)2=12000g (aprox.)
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)Determinación del radio
Rotor de
ángulo fijo
Tubo lleno
(cerrado,
tapón)
Rotor TLA 100.3
(ultracentrifuga)
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)Determinación del radio
rmin
Tubo no lleno:
Varian el rmin
y el rmedio
El rmax es invariable
para un determinado
rotor
rmedio
Rotor de
ángulo fijo
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)Determinación del radio
Rotor
Basculante
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)Determinación del radio
Rotor vertical
Usos más restringidos
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)
Rotores de ángulo fijo:
Sedimentación más rápida (recorrido entre rmin y rmax menor)
Partículas sedimentan contra pared externa del tubo y deslizan
formando pellet en el fondo del tubo
Muy empleadosRotores basculantes:
Recorrido mayor que en el caso anterior, más tiempo de sedimentación
Muy empleados
Gradientes
Rotores verticales:
usos más restringidos
Características de los rotores de ultracentrifugas Beckman
“Nomograma”: permite relacionar
condiciones de centrifugación en
distintos rotores
Se traza una recta entre dos puntos
conocidos (radio, RCF o RPM) en
dos de las columnas.
El tercer valor
corresponde a la intersección de
la recta con la tercera columna
VELOCIDAD O TASA DE SEDIMENTACIÓN
La velocidad o tasa de movimiento de una partícula en un campo centrífugo está en función de una serie de factores.
VELOCIDAD O TASA DE SEDIMENTACIÓN
– F centrífuga mw2r– F boyante
w2r x masa de solvente desplazado
w2r x volumen de la partícula (mv) x densidad del solvente (ρ)
– F de fricciónmv=volumen de la partícula
v= volumen parcial específico
(inverso densidad)
m=masa de la partícula
ρ=densidad del solvente
f=coeficiente de fricción
v=w2rm(1-vρ)
f
v=w2rm(1-vρ)
f
v=w2rm- w2rmvρ
f
v=w2rm- w2rmvρ
f
VELOCIDAD O TASA DE SEDIMENTACIÓN
Se incrementa con:– Su tamaño/masa– Su densidad– El campo centrífugo (w2r)
y disminuye con:–La viscosidad y densidad del medio–El grado con el cual su forma se desvía de la forma esférica
v=w2rm(1-vρ)
f
v=w2rm(1-vρ)
f
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN S
S=v/w2r, es igual a dr x 1dt w2r
S=v/w2r, es igual a dr x 1dt w2r
Segundosv=velocidad (cm/s)
w=velocidad angular (rad/s)
r=distancia al eje de rotación (cm)
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN
S =Svedberg 1S = 10-13 s 100S = 10-11 s
S=v/w2rS=v/w2rv = w2 rm(1-vρ)
f
v = w2 rm(1-vρ)
f
S =m(1-vρ)
f
S =m(1-vρ)
f
El coeficiente de sedimentación da información sobre
la masa y la forma de la partícula
El valor del coeficiente de sedimentación depende de la densidady viscosidad de la solución en la que se hace la centrifugación
S20,w valores estándares (muestra en agua a 20 ºC)
Coeficiente de sedimentación (ejemplos)
TIEMPOS DE SEDIMENTACIÓN EN SOLUCIONES ACUOSAS
T = k/S , S en SvedbergsT = k/S , S en Svedbergs
Tiempo requerido para sedimentar una partícula en agua (no gradientes) a lo largo
de la longitud del rotor
k “clearing factor”: factor de clarificación para el rotor. El factor k de un rotor es una medida de la eficiencia de sedimentación del rotor (“rotor’s pelleting efficiency”)
Este factor depende del rotor y de la velocidad. Para un mismo rotor va disminuyendo a medidaque aumenta la velocidad.
k = ln(rmax/rmin) x 1013
w2 3600
k = ln(rmax/rmin) x 1013
w2 3600
(w en rad/s ó w=0,10472xrpm)
TIEMPOS DE SEDIMENTACIÓN EN SOLUCIONES ACUOSAS
Tiempo de sedimentación de la subunidad ribosómica 60S
Rotor TLA 100.3
80000 rpm
K=22
T = k/S=22/60=0,36 h
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
Fuerza centrífuga
Tiempo de centrifugación
1 2 3 4
Las partículas se dirigen hacia el fondo del tubo según su tasa de sedimentación
Pellet o sedimento está enriquecido en las partículas que sedimentan más rápido
Método de enriquecimiento, no purificación
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIALExtracto crudo
600 g, 3 min
Pelletnúcleos
Sobrenadante
Pellet (mitocondriascloroplastos, lisosomas yperoxisomas)
Sobrenadante
Sobrenadantecitosol
Pellet (Memb. Plasmáticafragmentos de Golgiy Ret. Endop.)
Sobrenadante
PelletSubunidadesribosómicas
6000 g, 8 min
40000 g, 30 min
100000 g, 90 min
Fraccionamiento subcelular:
fracciones enriquecidas en
determinados orgánulos
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
Densidad de flotación o
Posición isopícnica
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
Coeficientes de sedimentación
Densidades de flotación
Bandas de material bastante purificado
Gradientes más habituales: sacarosa y CsCl
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
Centrifugación zonal
coeficiente de sedimentación (tamaño, densidad, forma)
GradienteDe densidad
Muestra
gradientes de sacarosa (preformados) continuos o discontinuosmuestra se aplica en la parte superior del tuborotores basculantes (“swinging”)las partículas no alcanzan su densidad de flotación y a tiempos largos sedimentarían en el fondo
Aplicaciones: purificación de componentes
subcelulares
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
Centrifugación isopícnica
densidad de flotación
gradientes de CsCl gradiente se forma durante la centrifugaciónmuestra se mezcla con el CsClrotores fijos (o basculantes) las partículas alcanzan su densidad de flotación
Aplicaciones: purificación de DNA o virus
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
Densidades de flotación en sacarosa
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
Densidades de flotación en CsCl
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONESSeparación de RNAs ribosómicos o desubunidades ribosómicas de levaduras.Localización de 20S RNA (RNA vírico)
Extracto crudo de S. cerevisiaeA +fenol. RNAs ribosómicos
B –fenol. Subunidades ribosómicas
26S18S
60S40S
Gradiente de sacarosa del 10 al 40 %
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONES
+ - + -densidad
(3,4 Kb)
(1,6 Kb)
Localización de 20S RNA+ - + -
densidad
(2,5 Kb)
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONESLocalización subcelular de la proteína chs7
Memb. Plasm.
Ret. Endopl.
A. Golgi
Abajo(más denso)
Arriba(menos denso)
Gradiente de sacarosa del 10-65%
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONES
Determinación del Pm de una proteína encondiciones nativas.
Calibrado con marcadores de Pm conocido:Ovoalbúmina 45 kDaAldolasa 161 kDaCatalasa 244 kDa
Gradiente del 7 al 20% de sacarosa
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONES
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONES
Purificación de plásmidos mediante centrifugación isopícnica
en CsCl
Permite la separación del DNA genómico y plasmídico en función de su
distinta capacidad para unir el agente intercalante bromuro de etidio
La unión del bromuro de etidio baja la densidad del DNA
El DNA cromosómico une mayor cantidad lo que le confiere menor densidad
El DNA plasmídico une menor cantidad lo que le confiere mayor densidad
CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD
APLICACIONES
Purificación de un plásmido mediante centrifugación isopícnica
en CsCl ¡El CsCl no debe precipitar!Tener en cuenta:
Concentración de CsClVelocidad de centrifugaciónTemperatura de centrifugación
Curvas de precipitación del CsCl