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Seguimiento biológico del efecto de sonicación en EDAR San Jerónimo (Sevilla). GBSGBSGBSGBS Grupo Bioindicacion Sevilla

SEGUIMIENTO BIOLÓGICO DEL EFECTO DE SONICACIÓN EN EDAR MOLINA .

Realizado por: Asociación Científica GRUPO BIOINDICACIÓN SEVILLA


OBJETIVO.

El presente informe tiene por objeto mostrar los efectos de la tecnología ultrasónica, a nivel microbiológico, sobre el fango espesado de alimentación a digestión anaerobia en estaciones depuradoras de aguas residuales. El estudio se realiza en la planta piloto instalada en la EDAR Molina. En lineas generales, los objetivos que persigue una instalación de este tipo, es producir en el fango biológico concentrado de alimentación a la digestión ananerobia los siguiebtes efectos: lisis celular, reducción del tamaño de partícula, disolución de partículas orgánicas refractarias y control del bulking. Con ello se consigue, entre otros beneficios, un mayor rendimiento en la digestión anaerobia de fangos, que se traduce en un incremento en la producción de biogas al mejorar la destrucción de sólidos volátiles. INTRODUCCION.

El fango procedente del proceso biológico de una EDAR tiene como unidad estructural el flóculo, que resulta de la agregación de partículas orgánicas e inorgánicas del agua residual junto con bacterias formadoras de flóculo y filamentosas, esta agregación se ve facilitada por la excreción de polímeros (polisacáridos aminados o fosfatados) extracelulares producidos por las bacterias. La tecnología ultrasónica aplicada a fangos biológicos permite la liberación del material fácilmente asimilable biológicamente, produciendo por tanto, un mayor rendimiento en la estabilización anaerobia posterior, traduciéndose esto en un incremento en la producción de biogás, para un mismo tiempo de retención en digestión. La liberación del material fácilmente biodegradable se produce tanto por la disgregación flocular como por la rotura de membranas celulares de microorganismos que colonizan el fango, dando lugar a solubilización de material en suspensión, permitiendo una mejor o más rápida asimilación del mismo. Los efectos producidos por la sonicación del fango podemos cuantificarlos de varias formas:

• A nivel analítico: mediante el seguimiento de parámetros que se afecten por la solubilización de material, como puede ser la DQO soluble, ácidos grasos volátiles e incluso fósforo (ortofosfato).

• A nivel operacional mediante producción de biogás y rendimiento en digestión anaerobia.

• A nivel microbiológico mediante la observación de la unidad estructural del fango biológico, flóculo, del estado y densidad de los microorganismos presentes (protozoos y bacterias filamentosas).

MATERIAL Y METODOS. Para el seguimiento de los efectos del proceso de sonicación a nivel microbiológico se han estudiado las siguientes muestras puntuales tomadas antes y después del proceso: EDAR Molina . Se trata de una depuradora que trabaja con baja carga másica y edad de fango alta. La concentración del fango biológico se realiza mediante espesamiento mecánico, estas condiciones de explotación del proceso, confieren al cultivo biológico en suspensión unas características totalmente distintas a las del fango estudiado en la EDAR San Jerónimo (Sevilla), en cuanto a microfauna presente y compactación y mineralización del flóculo, entre otros aspectos. Fechas de muestreo y código de muestras: 2/3806 M1 9/3/06 M2 21/3/06 M3 Condiciones de funcionamiento en el momento del muestreo: habituales en cuanto a caudal y potencia de trabajo se refiere. Han sido analizadas en un periodo máximo de 24 horas después de su toma. (Rodríguez et al 2005) Los ensayos realizados se describen a continuación. Para su realización, dada la concentración del fango, fue necesario diluir la muestra. Las diluciones utilizadas fueron 1:20


para el caso de la V-30 y 1:10 en el resto de los ensayos, y se realizaron mediante pesada de la cantidad necesaria de fango y posterior dilución con agua destilada. (Rodríguez et al 2004. Manual de trabajo para análisis biológicos en fangos activos.) EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL FANGO COMO ÍNDICE DE FANGO Estudio a nivel macroscópico. Se realiza sobre las muestras M1, M2 y M3. La valoración de las características macroscópicas del fango activado se realizó a través del ensayo de la V30, que determina la cantidad de fango activado que decanta en una probeta o cono Imhoff, tras un periodo de 30 minutos. El análisis consiste en dejar que la muestra de fango activo sedimente los sólidos fácilmente decantables, sin necesidad de adición de productos químicos (sin coagulación ni floculación), simplemente dejando decantar durante un tiempo determinado (30 minutos). A través de este ensayo se valora en este caso, fundamentalmente, la turbidez del clarificado obtenido tras sedimentar una muestra de un litro en una probeta y el valor del índice volumétrico de fango. Estudio a nivel microscópico. Se realiza sobre las muestras M1, M2 y M3. El conjunto de características Microscópicas recogidas durante esta observación se refieren al examen del estado morfológico y estructural del flóculo de fango activo (forma, tamaño, estructura, textura, cobertura, etc.) y al examen del componente biótico del "ecosistema fango activo", representado por las poblaciones de bacterias filamentosas y de protozoos (principalmente ciliados). La evaluación de estas características (Fernández et al 2002) proporciona información sobre las propiedades de decantación y compactación del fango activo, así como del nivel y estado de colonización de la microfauna, aludiendo, indirectamente, al grado de actividad biológica del proceso de depuración. Procedimiento operativo: Este procedimiento se destina a la observación, mediante muestra “in vivo”, de la estructura flocular y la disposición del entramado filamentoso. Indicado en la evaluación del estado de formación flocular así como en el reconocimiento de ciertas características morfológicas y estructurales empleadas en la identificación de bacterias filamentosas. Para inmovilizar organismos y observar estructuras visibles sin necesidad de tinción, colocamos el cubreobjetos y prensamos suavemente. Especialmente indicado para la observación cualitativa de protozoos ciliados; también válido para la observación de bacterias filamentosas móviles. 1.- Para observar las características del flóculo y realizar un análisis cuantitativo, agitamos la muestra con suavidad la muestra para homogeneizar. 2.- Para estudiar diversidad de organismos, dejamos decantar y tomamos la muestra de la porción sedimentada. 3.- Tomamos entre 25 y 50 µl con una micropipeta con punta de boca ancha o una pipeta Pasteur, que depositamos en un porta (previamente desengrasado) y cubrimos con un cubreobjetos. En caso de no disponer de micropipeta, se puede pesar una gota de fango sobre un portaobjetos, conociendo previamente el peso de éste y la densidad del fango activado. 4.- Procedemos al análisis microscópico de la preparación utilizando los distintos objetivos. El último objetivo a utilizar es el de 100X con aceite de inmersión, para observar en detalle las distintas estructuras. 5.- Observamos 3 preparaciones de cada muestra.


Las características estudiadas son:

Forma: característica que define la morfología externa del flóculo como regular si aparece de forma redondeada e irregular si difiere de esta configuración.

Tamaño:

• Pequeño: tamaño menor de 150 µm • Medio: tamaño entre 150 y 500 µm ( Incluidos ambos valores) • Grande: tamaño mayor de 500 µm

Estructura:

• Compacto: no existen prácticamente huecos en la estructura interna del flóculo • Medio: se detectan algunos huecos • Abierta: existen bastantes huecos dentro del flóculo que rompen la unidad interna

Textura: característica que alude al grado de cohesión entre las partículas que forman el flóculo, estableciéndose las categorías “fuerte” y “débil” en función a la ausencia o presencia de disgregación de los flóculos, respectivamente, tras punción sobre el cubreobjetos (Manual de laboratorio para el análisis de aguas residuales y lodos de depuración. Ayuntamiento de Madrid, 1997). Cobertura: característica que valora si la unión de todos los flóculos presentes en el ocular de 10X cubren menos del 10 % de su superficie, del 10-50 % o más del 50 %.

Filamentos en el flóculo:

• Menos de 5 filamentos por flóculo • Entre 5-20 filamentos por flóculo ( Incluidos ambos valores) • Más de 20 filamentos por flóculo

Filamentos en disolución: característica que cuantifica la existencia de filamentos libres entre los espacios interfloculares del licor mezcla. Si no son observables será “baja” ( Categoría bacteriana <2), mientras que si se observan normalmente será “alta”. (Categoría bacteriana>2) Diversidad de protozoos:

• Menos de 4 especies • De 4-7 especies ( Incluidos ambos valores) • Más de 7 especies

El máximo valor obtenido por las características microscópicas es de 70.(Isaac et al. 2004) Todas estas observaciones se han realizado con un objetivo de 10X.

TEST VISCOSO (Jenkins et al., 2003).

Cuando se añade una gota de Nigrosina a una preparación « in vivo » de un fango activado bien floculado, las partículas de tinta penetran profundamente en el flóculo oscureciendo toda su estructura. Por el contrario, cuando se trata de un fango con gran cantidad de material extracelular, la penetración del la nigrosina en el flóculo se produce de forma digiriforme, rodeando las zonas de mayor cantidad de material exopolimérico. Con esta tinción, por tanto, se pone de manifiesto el material extracelular presente en los flóculos. * REACTIVOS:-

Solución I: nigrosina al 0,25 % (p/v) en solución acuosa * PROCEDIMIENTO:

1.- Colocar una gota de muestra en un portaobjetos y poner cubreobjetos encima 2.- Colocar una gota de solución I en el borde del cubre 3.- Observar el avance del frente oscuro de la nigrosina

* RESULTADOS:


El avance de la tinta sobre el cubreobjetos, determina el grado de viscosidad del fango.

EXAMEN DEL COMPONENTE BIÓTICO REPRESENTADO POR LAS POBLACIONES DE BACTERIAS FILAMENTOSAS Y PROTOZOOS (PRINCIPALMENTE CILIADOS). Los organismos filamentosos ocupan, a baja concentración, un papel fundamental en la formación del entramado adecuado del flóculo. Un crecimiento excesivo de estos microorganismos provoca alteraciones en la relación superficie/volumen del flóculo que se traduce en problemas de sedimentabilidad del fango con el consiguiente empeoramiento de la calidad del efluente. La respuesta de los organismos filamentosos a las Tinciones Gram, Neisser, PHB, etc., realizadas sobre frotis fijos de fango activo, permiten, junto con las características morfológicas y estructurales deducidas de la observación in vivo, su identificación. La proliferación total de filamentos se valorará según la Tabla siguiente (EMASESA, 1997)., en función de la abundancia relativa, principalmente, de los organismos dominante y secundario, aunque dejando constancia de la presencia de otras filamentosas que, por su abundancia, se consideren de interés. La identificación de protozoos y bacterias filamentosas se ha realizado siguiendo las indicaciones definidas en según Isac et al. 2004-2006.

La identificación de bacterias filamentosas y protozoos se realiza sobre las muestras M1, M2 y M3. La densidad de protozoos se valora en la muestra M2 y M3. Se valoran las bacterias filamentosas de forma cualitativa en todas las muestras, realizandose una única cuantificación de filamentos sobre la M3.

VALORACIÓN DE FILAMENTOS EN FUNCIÓN DE LA ABUNDANCIA RELATIVA

VALOR NUMÉRICO

ABUNDANCIA SIGNIFICADO

0 Ninguno

1 Pocos Hay filamentos pero se observan sólo en algunos flóculos

2 Alguno Se ven filamentos en los flóculos, pero no en todos ellos

3 Comunes Se observan filamentos en todos los flóculos pero en pequeña cantidad (1-5 filamentos por flóculo)

4 Muy comunes Se observan filamentos en todos los flóculos, pero con una densidad media (5-20 por flóculo)

5 Abundantes Hay filamentos en todos los flóculos y con densidad alta (>20/flóculo)

6 Excesivos Filamentos presentes en todos los flóculos; hay más filamentos que flóculos


RESULTADOS.

Resumimos los resultados obtenidos de las muestras analizadas, tres en total, para los distintos apartados anteriormente expuestos. Macroscopía. Tras realizar el ensayo de la V-30, las valoraciones obtenidas son:

• Antes de sonicar: buena sedimentabilidad y compactación. Turbidez media del clarificado.

• Después de sonicar: ligero aumento de la V-30, consecuencia de la ruptura del flóculo

originando a su vez un ligero aumento en la turbidez del clarificado, originado por liberación de microflóculos. (Figura 1)

Figura 1: Aumento de la turbidez del clarificado tras la sonicación del fango. En las tres fotografías, la probeta de la izquierda corresponde al fango sin sonicar y la de la derecha, sonicado. Microscopía. Se valora principalmente la morfología y estructura del flóculo. En las tres muestra observadas las características generales fueron:

• Antes de sonicar: flóculo irregular, de tamaño grande (≥ 500 µm), estructura compacta. Practicamente no se detectan huecos en el entramado flocular. La textura, característica que alude al grado de cohesión entre partículas que forman el flóculo, es fuerte. La cobertura es baja, es decir, la unión de los flóculos presentes en el ocular de 10X cubren menos del 10% de su superficie. (Figura 2).

V-30 diluida

CODOGO MUESTRA ANTES DE SONICAR

DESPUES DE SONICAR

M1 180 200 M2 120 150 M3 130 150


Baja diversidad y densidad protozoaria.

Figura 2.: Fan go sin sonicar. Aspecto de la compactación del fango (muestra M3 “in vivo”).

• Después de sonicar: el flóculo es irregular, de tamaño medio (entre 150 y 500 µm), consecuencia de la ruptura y disgregación de los flóculos. La estructura, en cuanto a compactación se refiere, es media, es decir, existen algunos huecos dentro del flóculo que rompen la unidad interna. E Esta ruptura del flóculo y disgregación del mismo, provoca un aumento de su superficie traduciéndose en valores más altos en la V-30 . De forma general no se aprecia una variación importante en la actividad protozoaria. Si una liberación de bacterias libres en el espacio interflocular. La cuantificación de estos parámetros se resume en la tabla siguiente, en la que se aprecia un valor inferior en los tres casos estudiados despues de sonicar. Esto se debe fundamentalmente, a la rotura del flóculo y pérdida de cohesión del flóculo.

MICROSCOPIA


DESPUES DE SONICAR

M1 40 33 M2 40 33 M3 47 33

GBSGBSGBSGBS Grupo Bioindicacion Sevilla



Figura 3.: Aspecto de la compactación del fango. Fotografía tomada en muestra despues de sonicar (muestra M3 “in vivo”), donde se pone de manifiesto la rotura flocular. Test “viscoso”. El resultado de este test que pone de manifiesto el material extracelular fue:

• Antes de sonicar: No se detectan exopolisacáridos. Deficiencia de nutrientes en el sistema, asociada a alta concentración de material de reserva, principalmente gránulos PHB.

• Después de sonicar: La rotura de la microestructura flocular libera material

extraceleular asociado a flóculo, si bien la liberación es menor que en la EDAR San Jerónimo. El flóculo presenta, por una parte, un aumento de superficie tras la sonicación, mientras que otros flóculos disminuyen de tamaño, debido a la fragmentación.

Las características de esta muestra (oxidación total), presenta una entrada parcialmente digitiforme, en la muestra sin sonicar, tras la aplicación del test de viscosidad. Este efecto de debe fundamentalmente a la consistencia de lso flóculos y a su tamaño, que hace que el reactivo los rodee, mostrando una apriencia falsamente viscosa. Al aplicar este test a la muestra sonicada, se acrecenta la apariencia digitiforme, debido a la ruptura celular. Este efecto no es tan patente como en la EDAR San Jerónimo, ya que la diferencia de edad de ambas muestras es muy importante. Los flóculos jóvenes (EDAR San Jerónimo), disponen de más material polisacrido para reforzar la unión de las bacterias y la materia orgánica. Sin embargo, en muestras de edades avanzadas, la floculación se debe sobre todo, a la mineralización de la materia orgánica y en menor medida a la presencia de polisacaridos de unión. Este hecho se observa claramente en los resultados del test viscoso para ambas EDAR




Figura 4: Test “viscoso”. A la izquierda muestra sin sonicar, a la derecha muestra sonicada presentando material extracelular que impide la penetrción en el flóculo del reactivo.

Bacterias filamentosas. La cuantificación de bacterias filamentosa se realizó en una de la muestras (M3). Para los tres casos observados se realizó una valoración cualitativa (Categoría numérica)y se observó, además, los posibles daños producidos en las mismas.

• Antes de sonicar: Se valoraron las tres muestras en torno a las categorías 3-4. Parte del entramado filamentoso colabora en la estructura base. Se generan puentes interfloculares, efecto de la concentración de bacterias filamentosas. Las especies encontradas han sido varias, con dominancia de T021N y Nostocoida limícola, encontrándose también en cantidades importantes otras especies como T0041 y T0675, asociadas a deficiencia de nutrientes. Se detectan algunas deterioros en determinadas bacterias filamentosas, como fragmentación del filamento (T021N) y ausencia de células (T 0041).

Figura 5: Fango antes de sonicar. A la izquierda presencia de bacterias filamentosas estableciendo puestes interfloculares. (muestra M3 “in vivo”). A la derecha, reacción a la tinción de Neisser, positiva en los filamentos T0675 (dentro del flóculo) y negativa para T021N. (muestra M2).





• Después de sonicar: La categoría numérica del fango se mantiene, es decir, no se detectan cambios apreciables ni significativos en la densidad de bacterias filamentosas, aunque si es fácilmente apreciable la rotura del entramado filamentoso, que se encuentra ahora más disperso. El efecto apreciado tras la sonicación, a nivel óptico es similar a la apariencia de un fango con crecimiento de bacterias filamentosas asociadas a flóculo: La estructura flocular se abre, dando apariencia de ruptura flocular. Quedan algunos filamentos libres en el espacio interflocular. Las especies encontradas son por tanto las mismas que antes de someter el fango al proceso de sonicación. Al igual que en el fango antes de sonicar, encontramos algunas deterioros en determinadas especies, como fragmentación del filamento y ausencia de células, presentando un ligero aumento, que no llega a ser significativo. La tinción de PHB, que pone de manifiesto las sustancias de reserva acumuladas en el interior de las células (gránulos lipídicos), indica una disminución de este material intracelular despues del sonix. La ruptura del flóculo y bacterias presentes en él, genera una solubilización de estos productos, que inicialmente se encontraban incorporados a las células. La densidad de filamentos en la muestra analizada fue de 854 m/ml antes de sonicar y 908 m/ml después, no apreciándose por tanto efecto apreciable sobre este parámetro.



GBSGBSGBSGBS Grupo Bioindicacion Sevilla GBSGBSGBSGBS

Grupo Bioindicacion Sevilla


Figura 6: Fango despues de sonicar. Arriba izquierda, rotura de puentes interfloculares y liberación al medio de filamentos. (muestra M3 “in vivo”). Arriba derecha, tinción de PHB sobre muestra M2. Abajo, ausencia de células en bacteria filamentosa (Izquierda, tinción sobre muestra M1. Derecha, muestra M3 “in vivo”). Protozoos. Se valoró tanto la densidad (ind/l) en dos muestras y la identificación de especies en las tres muestras analizadas.

• Antes de sonicar: Los grupos presentes fueron en los tres casos los típicos de un fango de edad alta: ciliados reptantes (Acineria), ciliados sésiles (Voticellas microstoma y Epistylis) en poca proporción. Rotíferos y restos de amebas testáceas. Presencia de amebas desnudas. En general se trata de una muestra de baja densidad, aunque igualmente repartida, lo que permite índices de Shanon superiores a 1 (1,16 bit para la muestra M2).

Figura 7.: Fango antes de sonicar. Muestra “in vivo” M3 con presencia de protozoos pertenecientes al grupo de Vorticellas, a la izquierda y restos de testáceas a la derecha.

• Después de sonicar.Los grupos presentes son similares a los citados antes, si bien se aprecia una disminución del género Vorticella y Epistylis, un ligero aumento de la especie Acineria y leves daños en los restos de las tecas. Esta disminución en la biodiversidad, hace que el índice de Shanon, disminuya a valores inferiores a 1 (0.46 bit para la muestra M2) Las densidades encontradas se reumen el la tabla siguiente:




Figura 9.: Fango despues de sonicar. Muestra “in vivo” M3, en la que se aprecia rotura de teca.

CONCLUSIONES.

Tras el analisis óptico de las muestras tratadas con ultrasonido , se detectan varios grados de alteraciones, según el parámetro estudiado: estructura flocular, bacterias filamentosas y protozoos. Los resultados guardan relación con los obtenidos en las muestras anteriormente estudiadas, procedentes de la EDAR San Jerónimo (Sevilla), si bien se ven afectados por las distintas edades de fango. Tal como se comprobó anteriormente, en la EDAR San Jerónimo, la valoración cualitativa de filamentos no parece alterarse tras el proceso, aunque se detectan pérdidas celulares y fragmentación de los mismos, no muy importantes. Mientras esta fragmentación liberaba hacia los espacios interfloculares los filamentos originalmente atrapados en el flóculo, repercutiendo esto directamente en la turbidez del clarificado de la muestra de la EDAR San Jerónimo, en este caso la liberación a los espacios interfloculares es menor, debido a la cohesión del flóculo y el filamento. Respecto a la población protozoaria, al igual que los filamentos, no se detectan variaciones en los efectivos poblacionales antes y después del tratamiento. El efecto sobre este grupo de organismos parece centrarse en la destrucción, en algunos casos de los citoplasmas y leves daños en las tecas de las testáceas. La escasa diversidad y densidad de organismos no nos permite aclarar mucho sobre el efecto sobre especies determinadas. Sería interesante ampliar el estudio de estos organismos para otras EDAR con procesos de sonicacion a fin de comparar el efecto producido en distintas especies de protozoos y confirmar la existencia o no de variación en la densidad de la microfauna.

DENSIDAD PROTOZOOS (ind/L)


DESPUES DE SONICAR

M2 800000 800000 M3 esto seria del m2 300000 360000



Si el efecto más palpable del Sonix sobre el fango activo en la EDAR San Jerónimo era la de disgregación flocular, en este caso es la ruptura. La alta densidad de los flóculos de oxidación total, hace que el efecto del ultrsonido sea más acusado en la ruptura del flóculo. Mientras que en la EDAR San Jerónimo los flóculos presentaban una alta flexibilidad, estos flóculos son muy inertes , y por lo tanto, poco flexibles. Las ondas ultrasónicas rompen bacterias y liberán material extracelular en el primer caso estudiado, mientras, que en estas muestras el flóculo no es capaz de asumir esta vibración y se fragmenta. El efecto de ruptura de bacterias cocales y bacilares se detecta en una disminución en la proporción de gránulos de PHB, antes y después del proceso. El Sonix genera, en este tipo de muestras la ruptura del flóculo, que es más clara en el tipo de fango estudiado en este caso, compacto y mineralizado, que en situaciones anteriores, como era el caso de la EDAR San Jerónimo, dónde nos encontramos con un fango procedente de una EDAR convencional. Si bien en en la EDAR San Jerónimo el aumento de producción de gas, podria achacarse a una solubilización de los exopolisacaridos adheridos al floculo, en este caso la fragmentacion del flóculo permite un mayor acceso a los interiores flocular por parte de las bacterias anaerobias, facilitando el trabajo de degradación al disminuir la superficie de ataque. Concluyendo, de los análisis realizados se detecta que el efecto sobre esta EDAR de oxidación total es el de ruptura flocular, y ligeros daños en bacterias filamentosas y protozoos, que posibilita, que las bacterias fermentativas del digsetor anaerobio,.degraden con mas facilidad este material

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Faltaria articulos de tecnología rotífero y el de residuos.

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