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SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZ ADORES DE

FOSFATOS EN SUELOS CALCÁREOS DEL VALLE DEL MANTARO

Pablo Alvarez Figueroa1 Sady García Bendezú2

RESUMEN

El fósforo (P) es un elemento limitante para la productividad de ecosistemas terrestres.

Una estrategia para aprovechar eficientemente el P del suelo es el uso de microorganismos

solubilizadores de fosfatos (MSP). El presente trabajo fue planteado para evaluar la presencia

de MSP en suelos calcáreos del valle del Mantaro y su capacidad para solubilizar fosfatos de

calcio in vitro, con énfasis en la roca fosfórica de Bayóvar. Siete suelos agrícolas del valle del

Mantaro y un suelo de La Molina fueron evaluados por su presencia de MSP mediante el

método de placas de dilución empleando el medio de Pikovskaya (PVK). En total, 13 cepas

bacterianas y 7 de hongos promisorias fueron aisladas. Tres cepas bacterianas (Pseudomonas

sp., Bacillus sp. y Clostridium sp.) y una cepa de hongo (Penicillium sp.) fueron seleccionadas

por presentar mayores halos de solubilización. La eficiencia de solubilización in vitro de las

cuatro cepas fue evaluada empleando el medio líquido PKV adicionado con 1000 mg P L-1

como fosfato tricálcico [Ca3(PO4)2] o roca fosfórica de Bayóvar. El P soluble, el pH y la

acidez titulable fueron medidos. Clostridium sp. mostró la mayor eficiencia de solubilización

con 429 mg P L-1 a partir del fosfato tricálcico. Una estrecha relación entre la concentración de

P soluble y la acidez titulable fue encontrada en todas las cepas. La solubilización de P a partir

de la roca fosfórica fue notablemente menor que para el fosfato tricálcico. Clostridium sp. es

promisoria en su capacidad solubilizadora in vitro, pero mayores estudios se requieren para

recomendar su aplicación en campo.

Palabras clave: MSP, Pseudomonas sp., Clostridium sp., roca fosfórica, fosfato tricálcico.

1 Ingeniero Agrónomo, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Loja-Ecuador. 2 Dr. Profesor Principal, Departamento de Suelos, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional Agraria La Molina

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SELECTION AND EVALUATION OF PHOSPHATE SOLUBILIZING

MICROORGANISMS IN CALCAREOUS SOILS OF MANTARO VALLE Y

SUMMARY

Phosphorus is a limiting factor for the productivity of terrestrial ecosystems. A

promising strategy for efficiently using the soil P pools is the use of phosphate solubilizing

microorganisms (PSM). The objective of this work was evaluating the presence of

microorganisms with ability to solubilize calcium phosphates in calcareous soils from Mantaro

Valley, and their efficiency for in vitro P solubilization with emphasis in Bayovar rock

phosphate. Seven soils from Mantaro valley and one from La Molina were screened for

presence of PSM applying the technique of dilution plates with the nutrient medium of

Pikovskaya (PVK). In total, 13 bacterial and 7 fungal isolates with P solubilization capacity

were identified. Three bacterial isolates (Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp.) and

one fungal isolate (Penicillium sp.) were selected due to the appearance of clear solubilization

haloes. For all the isolates, the in vitro P solubilization efficiency was evaluated using the

liquid nutrient medium of Pikovskaya added with 1000 mg L-1 of P as tricalcium phosphate

[Ca3(PO4)2] and Bayovar rock phosphate. The amount of dissolved P, pH and titratable

acidity were measured in the medium at 5, 10, 15 20, 15 and 30 days after inoculation (dai).

The maximum solubilization rates were reached between 15 to 25 dai. Clostridium sp. was the

most efficient, with 429 mg L-1 of P solubilized. A close correlation between soluble P

concentration and titratable acidity was found in all the isolates. Phosphorus solubilization

from Bayovar rock phosphate was noticeably lower than that from tricalcium phosphate.

Clostridium sp. is an isolate with promising capacity for P solubilization in vitro, but further

studies are required to be recommended for field applications.

Keywords: PSM, Pseudomonas sp., Clostridium sp., rock phosphate, tricalcium phosphate.

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I. INTRODUCCIÓN

El fósforo (P) es un elemento escaso en la naturaleza. El contenido total de P en la capa

superior del suelo varía entre 50 a 3000 mg kg-1 (Sims y Pierzynski 2005). El P absorbido por

las plantas alcanza solamente un 0.1% del total (Chen et al. 2006, Sample et al. 1980), y está

representado por los iones ortofosfato H2PO4- y HPO4

2- (Walker y Syers 1976, Foth y Ellis

1997). En la mayoría de suelos el P en solución es insuficiente para cubrir los requerimientos

de la planta (Kirkby y Johnston 2008).

Diversos investigadores advierten sobre una inminente crisis de fósforo, ya que las

reservas mundiales de fósforo se encuentran en un proceso de agotamiento (Cordell et al.

2009, Vaccari 2009). La distribución de estas reservas es desigual; a lo que se añaden

dificultades de suministro (FAO 2005). Este desequilibrio convierte al fósforo en un recurso

geoestratégico.

El Perú tiene reservas importantes de roca fosfórica (RF) en los depósitos

sedimentarios de Bayóvar, ubicados en la costa norte en el desierto de Sechura, con reservas

potenciales estimadas en 10 mil millones de TM (Alegre y Chumbimune 1991) con una

riqueza de 30.5 % de P2O5 (Aguirre 1993).

Dada la baja solubilidad de este mineral fosfatado, surge la necesidad de investigar en

microorganismos con capacidad para solubilizar RF y fosfatos de calcio. Una cantidad

importante de investigaciones han sido orientadas a mejorar la eficiencia de la nutrición

fosfórica de las plantas a través de microorganismos que solubilizan FePO4 y AlPO4 en suelos

ácidos y Ca3(PO4)2 en suelos básicos.

El objetivo del presente trabajo de investigación fue determinar la presencia de

microorganismos con capacidad de disolución de fosfatos de calcio en suelos calcáreos del

valle del Mantaro y evaluar su potencial para solubilizar la RF de Bayóvar.

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II. MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de suelos para el aislamiento de cepas.

Los suelos empleados para el aislamiento e identificación de cepas fueron

seleccionados de una colección de 50 muestras de suelo obtenidas de las comunidades de

Chacrampa, Aramachay y Sincos (Distrito de Sincos, Provincia de Jauja, Región Junín) en el

valle del Mantaro.

La colección fue preparada entre los meses de julio a agosto del 2011, como parte del

subproyecto 4 del proyecto de investigación en evaluación de sistemas productivos en el

marco del convenio IUC-VLIR-UNALM. Las muestras fueron obtenidas de los primeros 30

cm de campos agrícolas cultivados con papa, cebada, avena y leguminosas de grano,

manejadas bajo un sistema de rotación que incluye periodos de descanso entre 1 a 2 años.

Las propiedades físico-químicas de los suelos relacionadas con su fertilidad fueron

determinadas en el Laboratorio de Análisis de Suelos, Plantas, Aguas y Fertilizantes de la

Universidad Nacional Agraria La Molina (LASPAF-UNALM). Siete suelos fueron

seleccionados por su alto contenido de carbonato de calcio y bajo fósforo disponible. El

fósforo disponible fue medido por el método Olsen (Olsen et al. 1954), después de realizar la

extracción de las muestras de suelo con NaHCO3 0.5 M a pH 8.5.

Un suelo del campo “Libres” ubicado en el campus de la UNALM, con contenido

medio de calcáreo total, fue también incluido en el proceso de selección.

En el cuadro 1, se muestra las características de los ocho suelos utilizados para el

aislamiento de microorganismos solubilizadores de fósforo (MSP)

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Cuadro 1: Descripción de los suelos utilizados para el aislamiento

Suelo Localidad Altitud msnm

pH* CE(1:1)

dS m-1 P2O5

mg kg-1 CaCO3

% Clasificación taxonómica

Soil Taxonomy (2010)

1 Aramachay 3698 7.96 0.26 4.0 33.90 Typic Ustorthents

2 Chacrampa-1 3607 7.81 0.25 3.5 6.30 Typic Ustorthents

3 Chacrampa-2 3588 7.46 0.82 14.7 19.10 Typic Ustorthents

4 Sincos-1 3413 7.91 0.28 3.4 24.80 Typic Ustorthents

5 Chacrampa-3 3605 7.59 0.48 39.2 10.10 Typic Ustorthents

6 Sincos-2 3307 7.57 1.37 16.4 14.30 Typic Ustifluvents

7 Sincos-3 3301 7.49 2.40 13.3 13.40 Typic Ustifluvents

8 La Molina 234 7.33 2.30 28.6 6.30 Ustic Torrifluvents

*Los análisis de caracterización fueron realizados en el LASPAF-UNALM

Aislamiento de microorganismos

Para el aislamiento de MSP, las muestras fueron secadas al aire por 48 horas,

tamizadas a través de una malla de 2 mm de diámetro para remover los fragmentos gruesos;

posteriormente fueron homogenizadas y almacenadas en recipientes herméticos de plástico.

Bacterias y hongos se aislaron a partir de ocho suelos mencionados anteriormente,

mediante la técnica de dilución en placas. El medio PKV fue utilizado para el cultivo de los

microorganismos. Se trabajó con las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 para bacterias y con 10-4, 10-5,

10-6 para hongos; a partir de las cuales se realizó el conteo de colonias totales y colonias que

solubilizan fósforo, y en base a esto se determinó la población.

Selección de cepas con capacidad de disolución en medio sólido

Para la detección selectiva de los MSP se empleó el medio sólido de PKV

complementado con 5.0 g L-1 de fosfato tricálcico grado reactivo ó 7.63 g L-1 de roca fosfórica

de Bayóvar, para aportar 1000 mg L-1 de P inorgánico. Después de 5 días de incubación a 24

°C, se evaluó si los microorganismos desarrollaron zonas transparentes alrededor de las

colonias (halozonas). Las cepas que presentaron esta característica fueron repicadas por un

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procedimiento de picado con punta de aguja y a los 4 días fue determinado el índice de

solubilización. Es importante mencionar que el fosfato tricálcico y la RF se adicionaron en

tratamientos diferentes para determinar la presencia de MSP en ambos medios; ya que

presentan diferente constante de producto de solubilidad (Kps), siendo la RF más difícil de ser

solubilizada.

Las colonias dentro de las placas y sus halos de solubilización fueron fotografiados

mediante una cámara digital Sony Easyshare®. Los diámetros de crecimiento de cada colonia

y los diámetros de los halos de solubilización respectivos fueron medidos con ayuda del

software AutoCAD 2012 en español. Los diámetros fueron determinados utilizando

fotografías de las placas y calibrándolas dentro del programa a un tamaño real usando

referencias de tamaño conocido como el diámetro de la placa, monedas y el tamaño real de las

etiquetas presentes en las placas.

El índice de solubilización (IS) en los repiques fue calculado mediante la fórmula

siguiente (Kumar y Narula 1999):

Donde:

Ø Halo = diámetro del halo de solubilización (diámetro colonia + halozona)

Ø Colonia = diámetro de la colonia

Con el mismo programa y calibrada la fotografía al tamaño real, se determinó el área

del halo de solubilización que corresponde al área total (área de la colonia más área de la

halozona).

Prueba de solubilización in vitro en medio líquido

Las cepas puras que desarrollaron halo en medio sólido y que presentaron el índice más

alto de solubilización y/o mayor área del halo de solubilización se evaluaron en medio líquido.

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En frascos conteniendo 150 mL de medio líquido PVK modificado con 1000 mg L-1 de

fosfato tricálcico o roca fosfórica de Bayóvar, fue inoculado 1 mL de una suspensión de

Bacillus sp., Clostridium sp. y Pseudomonas sp. a una concentración de 3 x 108 ufc mL-1

validada previamente con la escala de McFarland, y Penicillium sp. a una concentración de 1 x

106 esporas mL-1 determinada por conteo de conidios con el hemocitómetro de Neubauer

según el procedimiento descrito por French y Hebert (1980). La temperatura de incubación fue

28 °C.

La concentración de fósforo en la solución nutritiva fue medida a los 5, 10, 15, 20, 25 y

30 días. El muestreo se realizó por descarte tomando una alícuota de las tres repeticiones por

tratamiento y un blanco por cada cepa y fuente de P insoluble. Fue determinada también la

acidez titulable por el método descrito por Cerezine et al. (1988) y el pH de los filtrados.

El ensayo estuvo conformado por cuatro cepas y dos enmiendas que fueron las fuentes

de P insoluble (cuadro 2) con un total de 144 unidades experimentales.

Cuadro 2: Estructura del ensayo de solubilización in vitro

Cepa Fuente de P

insoluble Nº

repeticiones Nº

evaluaciones Total

repeticiones Bacillus sp.

Fosfato tricálcico

3 6 18 Clostridium sp. 3 6 18 Penicillium sp. 3 6 18 Pseudomonas sp. 3 6 18 Bacillus sp.

Roca fosfórica de Bayóvar

3 6 18 Clostridium sp. 3 6 18 Penicillium sp. 3 6 18 Pseudomonas sp. 3 6 18

La cantidad de fósforo soluble fue medida por el método azul de molibdeno (Watanabe

y Olsen 1965), y se expresó en mg P L-1 solubilizado por cada unidad muestreada. Para ello, la

alícuota de caldo microbiano se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos, y posteriormente

se filtró con papel Whatman No. 40.

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III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento

Fueron encontradas 13 cepas de bacterias y de 7 de hongos con capacidad para disolver

P insoluble. La población de bacterias solubilizadoras de P en el medio adicionado con RF fue

de 0.55 % del total; mientras que la población de estas en medio con fosfato tricálcico (FTC)

fue 9.25%. La población de hongos solubilizadores en medio de cultivo con RF fue de 15.50

% mientras que en medio con FTC la población de solubilizadores fue de 28.40 %. En general,

la población fue más alta en el medio adicionado con FTC en comparación con la población

encontrada en medio con RF, ya que esta última es un compuesto de difícil solubilización, y al

no proveer P al medio nutritivo la población fue notablemente menor.

Fue realizada la identificación de las cepas mediante pruebas bioquímicas.

Índice de solubilización

El índice de solubilización (IS) in vitro en medio sólido presentó alta diferencia

significativa entre las 20 cepas seleccionadas para su estudio por su capacidad de disolución

de P inorgánico. La mejor cepa bacteriana fue Pseudomonas sp. que supera ampliamente a las

demás alcanzando 3.05, seguida por Clostridium sp. y la CBact6, que fueron el segundo grupo

con 1.94 y 1.75 respectivamente. En relación a las cepas fúngicas la que destacó sobre las

demás fue Penicillium sp. con 1.45. Es importante mencionar que lo que pretende el trabajo es

aportar con cepas promisorias que solubilicen P, en este sentido el objetivo fue seleccionar tres

cepas bacterianas para realizar pruebas en la siguiente fase, y de acuerdo al índice de

solubilización se seleccionó a la Pseudomonas sp. y Clostridium sp. por presentar los valores

más altos.

Área del halo de solubilización

Se realizó para diferenciar entre bacterias que presentando índices de solubilización

similares pueden presentar diferentes áreas de solubilización, es decir, una bacteria pequeña

puede presentar el mismo índice de solubilización que una bacteria de mayor tamaño y en este

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sentido el área del halo de solubilización nos permitió diferenciar cepas que solubilizaron una

mayor área y por lo tanto son más promisorias.

Las cepas bacterianas con el mayor área de halo de solubilización fueron Clostridium

sp., Pseudomonas sp. y Bacillus sp. con 196.8, 186.4 y 144.4 mm2 respectivamente.

Relacionando las mejores cepas por la mayor área de halo de solubilización y el alto

índice de solubilización, se observa que Pseudomonas sp. y Clostridium sp. presentan los

mejores resultados en ambas mediciones y por lo tanto constituyen las cepas más promisorias.

Estas dos bacterias fueron seleccionadas para estudios posteriores.

Aunque Bacillus sp. presentó un área del halo solubilización menor que las dos

bacterias mencionadas, también fue considerada para la siguiente fase de laboratorio, ya que el

área de halo solubilizado en medio sólido fue uno de los más altos.

La CBact6 considerada dentro de las tres mejores por su alto IS, no fue considerada

para la siguiente prueba ya que el área del halo de solubilización estuvo entre los más bajos, es

decir presentó uno de los menores diámetros totales.

Aunque las cepas fúngicas CFung2, CFung4, CFung5 y CFung1 fueron las que

presentaron la mayor área de halo de solubilización; durante los repiques, las tres primeras

redujeron gradualmente el área del halo de solubilización, llegando incluso a dejar de ser

visible; mientras que la CFung1 siempre presentó la misma área de halo de solubilización y se

mantuvo así durante todo el ensayo, por tanto, la cepa fúngica más promisoria de acuerdo al

área del halo de solubilización fue la CFung1 que corresponde a una especie de Penicillium

sp., que presentó además el mayor IS.

Por las razones mencionadas, las bacterias Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium

sp. y el hongo Penicillium sp. fueron considerados como microorganismos solubilizadores de

fosfatos promisorios.

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Prueba de solubilización in vitro en medio líquido

Se encontró una alta variabilidad temporal en la concentración de P que las cuatro

cepas mencionadas solubilizaron in vitro. Se determinó además una relación entre la acidez

titulable, pH, y el P solubilizado en medio liquido adicionado con RF y FTC, pero la

intensidad de cada uno de estos varía en función de la cepa y la fuente de P insoluble utilizada.

Diferencias altamente significativas fueron encontradas para los efectos principales

cepas microbianas y enmienda; así como para los efectos de interacción respectivos. En los

diferentes tiempos de medición también se encontraron diferencias altamente significativas, es

decir que el P solubilizado para una misma cepa y enmienda varió notablemente a través de las

evaluaciones realizadas. En el cuadro 3 se puede observar la separación de medias para la

fuente de variación cepa.

Cuadro 3: Promedio total de P solubilizado por cepa durante el periodo evaluación

Cepas P soluble (mg P L-1) Clostridium sp. 196.77 a Bacillus sp. 147.89 b Pseudomonas sp. 74.55 c Penicillium sp. 48.93 d

Se observa que cada cepa forma un grupo estadísticamente distinto en relación a la

cantidad de P solubilizada en medio líquido. Clostridium sp. presenta la mayor capacidad para

solubilizar P con 196.77 mg P L-1, seguida por Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp.

respectivamente, siendo esta ultima la que presenta menor solubilización de P con 48.93 mg P

L-1. Es importante mencionar que el cuadro 3 considera el promedio de todos los valores

registrados en las 6 evaluaciones para cada cepa con valores muy bajos en sus inicios y

también con valores muy altos de P liberado en los picos de solubilización.

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Fósforo soluble

La variación temporal de la concentración de P soluble en el medio nutritivo para las

cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 1.

Figura 1: Variación de la concentración de P soluble en medio nutritivo adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica

Con Bacillus sp. la mayor concentración de P soluble se alcanzó a los 15 días en las

dos fuentes de P insoluble, sin embargo la concentración de P liberado a partir del fosfato

tricálcico fue de 304 mg P L-1 mientras que de la roca fosfórica se liberaron solamente 99 mg

P L-1. Es importante mencionar que aunque el pico de solubilización para el fosfato tricálcico

ocurrió a los 15 días, la concentración de P soluble disminuyó en las dos evaluaciones

subsecuentes, pero en la última evaluación realizada, se produjo un incremento de la

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concentración de P soluble alcanzando esta vez 280 mg P L-1 de P solubilizado que si bien es

inferior al pico encontrado, no deja de ser un valor importante. Esta variación en la

concentración de P, se explicaría por la incorporación de P soluble al metabolismo de la

bacteria, pero luego de este periodo, se comienza nuevamente a liberar P al medio, es decir la

bacteria empieza nuevamente a solubilizar P. En la roca fosfórica luego del pico de

solubilización encontrado a los 15 días, no ocurre este proceso y el P soluble en el medio

presenta valores similares a los registrados antes del valor más alto, esto debido a que la roca

fosfórica al tener la constante de producto de solubilidad más alta, es más difícil que se

solubilice y por lo tanto la cantidad de P liberado en el medio es escasa.

En el medio inoculado con Clostridium sp. se observa que la concentración de P

solubilizado a partir de la roca fosfórica a lo largo del tiempo es casi similar durante todo el

periodo de evaluación y la máxima concentración liberada a partir de esta fuente de P

insoluble fue 59 mg P L-1. En el medio con fosfato tricálcico se observó que a los 20 días

ocurrió la mayor liberación de P soluble registrándose una concentración de 429 mg P L-1.

Cabe resaltar que las diferencias en las concentraciones P solubilizado a partir de ambas

fuentes de P insoluble son mucho mayores que en las otras cepas y que claramente se observa

que esta cepa es la que solubilizó la mayor cantidad de P a partir del fosfato tricálcico en

comparación con las demás. Además se observó que la concentración de P soluble en el medio

líquido adicionado con fosfato tricálcico varió notablemente durante todo el ensayo, lo cual

coincide con lo encontrado por Illmer y Schinner (1994), incrementándose gradualmente hasta

alcanzar su máximo valor a los 20 días pero luego disminuyó en las dos últimas evaluaciones.

Esta disminución puede deberse a que este microorganismo puede utilizar una parte del P

soluble que se encuentra en el medio líquido e incorporarlo a su metabolismo.

En la solubilización del FTC y la RF realizada por el hongo Penicillium sp. se observa

un patrón similar en la concentración P soluble liberado a partir de estas dos fuentes de P

insoluble en todo el periodo de evaluación. La máxima concentración de P liberado a partir del

fosfato tricálcico fue de 102 mg P L-1 y es el menor valor registrado en esta fuente de P

insoluble; mientras que a partir de la roca fosfórica se liberaron 57 mg P L-1, que igualmente

es el valor más bajo para esta fuente de P. Ambos valores se registraron 25 días. Por lo tanto,

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esta cepa fúngica solubilizó la menor cantidad de P en comparación con las tres cepas

bacterianas en ambas fuentes de P insoluble.

En el medio inoculado con Pseudomonas sp. la mayor concentración de P solubilizado

fue 151 mg P L-1 la cual se alcanzó a los 15 días en el medio adicionado con fosfato tricálcico;

mientras que cuando se utilizó roca fosfórica la mayor concentración de P solubilizado fue 116

mg P L-1 pero esto ocurrió a los 25 días. Para esta cepa bacteriana, las concentraciones de P

liberado al medio a partir del fosfato tricálcico fueron las más bajas en comparación con las

otras dos cepas bacterianas, pero superior a las registradas para la cepa fúngica. En relación a

la roca fosfórica, aunque Pseudomonas sp. alcanzó el pico más alto en solubilización de P

superando a las demás cepas bacterianas y a la fúngica, esta cantidad es baja en comparación

con el P liberado a partir del fosfato tricálcico.

pH

El valor inicial de pH para el medio de cultivo antes de la esterilización fue 6.98 para

el fosfato tricálcico y 7.26 para la roca fosfórica; después de la esterilización el pH para en el

medio con fosfato tricálcico varió ligeramente hasta 6.90, mientras que en el medio con roca

fosfórica el pH se mantuvo exactamente en el mismo valor.

El pH promedio durante todas las evaluaciones en medio adicionado con fosfato

tricálcico fue de 4.22, 4.43, 4.59 y 5.26 para Clostridium sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. y

Penicillium sp. respectivamente.

El pH promedio en medio con roca fosfórica fue de 4.09, 4.21, 4.24 y 4.61 para

Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium sp., y Penicillium sp. respectivamente.

Las diferentes variaciones en el pH son como resultado de la producción de acidez

realizada por las diferentes cepas microbianas y explicada por la producción de ácidos

orgánicos como el glucónico, cítrico, málico, láctico entre otros, la liberación de H+ que se

produce en la asimilación del amonio, o por la producción de H2CO3 que se supone es una

ayuda inicial.

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La variación temporal del pH en el medio nutritivo para las cuatro cepas microbianas,

puede apreciarse en la figura 2.

Figura 2: Variación del pH en medio nutritivo adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica

A los 5 días después de la inoculación (ddi) el pH disminuyo drásticamente, el cual

para Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp. estuvo en el rango de 4.24 a 4,10 en el

medio con fosfato tricálcico y de 4.08 a 4.17 en el medio con roca fosfórica. Para

Pseudomonas sp. y Bacillus sp. el pH fue ligeramente menor en el medio con roca fosfórica,

pero en Clostridium sp. ocurre lo contrario ya que el pH es ligeramente inferior para el medio

adicionado con fosfato tricálcico. En el medio inoculado con Penicillium sp. el pH fue de 5.36

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para el fosfato tricálcico y de 5.08 para la roca fosfórica, observándose por lo tanto que el

menor valor de pH fue observado en el medio con roca fosfórica.

Relacionando el pH con el P solubilizado (figura 3) a los 5 ddi en el medio con fosfato

tricálcico, la variación de pH no es alta entre las tres cepas bacterianas, a pesar de esto,

Clostridium sp. tiene la mayor cantidad de P solubilizado con 255 mg P L-1, seguida por

Bacillus sp. con 228 mg P L-1 y Pseudomonas sp. con 57 mg P L-1; mientas que Penicillium

sp. que registró un pH notablemente más alto que las tres cepas mencionadas anteriormente,

solubilizó únicamente 32 mg P L-1; lo cual quiere decir que la cepa fúngica está generando

menor acidez que las otras cepas y esta es considera como uno de los factores responsables de

la solubilización, debido a la relación inversamente proporcional que se ha reportado entre el

pH y la cantidad de P liberado; pero en las tres cepas bacterianas el pH es similar y por lo

tanto no es únicamente el pH el factor que interviene como mecanismo de solubilización.

Figura 3: Relación entre el pH y concentración de P soluble en medio adicionado con fosfato tricálcico

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En relación al fosfato tricálcico, es importante hacer énfasis que para Pseudomonas sp.,

Bacillus sp. y Clostridium sp. el valor más bajo de pH se registró a los 5 ddi y aunque se

produjeron variaciones de pH durante las evaluaciones subsiguientes la tendencia siempre fue

a incrementarse ligeramente el pH. En relación a Penicillium sp. se observa claramente que el

pH a los 25 ddi fue más bajo que en la otras evaluaciones y es aquí donde se observó la mayor

cantidad de P solubilizado. Para Clostridium sp. al igual que con Penicillium sp. se observa

que la mayor solubilización ocurrió cuando el pH disminuyó, mientras que para Pseudomonas

sp. y Bacillus sp. cuando se alcanzaron los picos más altos de P solubilizado, no se registraron

necesariamente los valores más bajos de pH, por lo que otro mecanismo tiene que estar

involucrado en la solubilización de P realizada por estas dos cepas bacterianas cuando fosfato

tricálcico fue utilizado como fuente de P insoluble.

En relación al pH y el P solubilizado en el medio con roca fosfórica (figura 4) se

observa que inicialmente, a los 5 ddi, Bacillus sp y Clostridium sp. solubilizaron la mayor

cantidad de P con 56 y 53 mg P L-1 respectivamente, seguidas por Pseudomonas sp. con 28

mg P L-1 y Penicillium sp. que solubilizó únicamente 9 mg P L-1. Bacillus sp. que es la que

más solubiliza tiene el menor valor de pH con 4.08 y Penicillium sp. que es la que solubiliza la

menor cantidad de P tiene el pH más alto con 5.08. Clostridium sp. presentó valores de pH y P

similares a Bacillus sp., pero Pseudomonas sp. aunque también logró disminuir el pH

signicativamente hasta 4.14, la cantidad de P liberado fue mucho menor con 28 mg P L-1.

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Figura 4: Relación entre la concentración de P soluble y el pH en medio con roca fosfórica

En Bacillus sp. no se observa una relación entre la máxima cantidad de P solubilizado

y el pH. En el medio inoculado con Clostridium sp. el P soluble liberado al medio se mantiene

prácticamente constante al igual que el pH durante todo el ensayo y se constituye en la cepa

con el pico más bajo de solubilización. En Penicillium sp. se observa claramente que la mayor

cantidad de P solubilizado ocurrió cuando el pH presentó el valor más bajo, por lo tanto en el

medio adicionado con roca fosfórica el pH es el mecanismo que mayor influencia tiene sobre

la solubilización, sin embargo en comparación con las cepas bacterianas no logró disminuir el

gran medida el pH y por lo tanto el P liberado es menor.

En el medio inoculado con Pseudomonas sp. se observa que la mayor cantidad de P

liberado a partir de la roca fosfórica fue determinado cuando el pH del medio estuvo en 3.72

que está entre los dos valores más bajos registrados durante todo el ensayo. Además se aprecia

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claramente en las cepas bacterianas que la disminución en la concentración de P en las ultimas

evaluaciones se debe principalmente a que el pH se incrementó, mientras que con Penicillium

sp. en las tres últimas evaluaciones ocurrió lo contrario, es decir se produjo la disminución

más notable del pH y la concentración de P se incrementó. De las cuatro cepas microbianas,

Pseudomonas sp. y Penicillium sp. presentaron una evidente relación inversamente

proporcional entre el P solubilizado y el pH en el pico de solubilización. En Bacillus sp. y

Clostridium sp. la máxima disminución de pH no coincide con el valor más alto de P liberado,

pero en comparación con el pH inicial del medio, la disminución del pH si sería la responsable

de la solubilización.

Acidez titulable

Con Bacillus sp., Clostridium sp. y Penicillium sp. se observa claramente que la mayor

cantidad de acidez titulable se produce en el medio adicionado con fosfato tricálcico aunque

con algunas particularidades. Bacillus sp. produjo acidez titulable en forma irregular con dos

picos pero siempre en mayor cantidad que cuando se utilizó roca fosfórica; Clostridium sp.

incrementó gradualmente la acidez titulable (a excepción de penúltima evaluación) y presenta

los valores más altos registrados para esta medida; y Penicillium sp. fue quien produjo la

menor cantidad de acidez titulable en comparación con todas las cepas, pero igualmente en

cantidades superiores al medio con roca fosfórica. En Pseudomonas sp. la mayor cantidad de

acidez titulable se produjo en el medio adicionado con roca fosfórica y su valor más alto se

registró entre los 20 y 25 ddi, mientras que con fosfato tricálcico la AT muestra una ligera

disminución lineal desde la segunda evaluación. La variación temporal de la AT en el medio

nutritivo para las cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 5.

19

Figura 5: Variación de la acidez titulable en medio adicionado con fosfato tricálcico y roca fosfórica

Relacionando la acidez titulable y el P solubilizado en el medio adicionado con fosfato

tricálcico (figura 6), se observa una relación directamente proporcional y muy evidente entre

la cantidad de P solubilizado y la AT, es decir que para todas las cepas, a mayor cantidad de

acidez titulable se observa mayor concentración de P solubilizado. Se puede apreciar que la

línea de variación del P soluble en todo el periodo de evaluación tiene el mismo

comportamiento que la línea de variación de la acidez titulable. Por lo tanto la variable que

mayor incidencia tiene sobre la solubilización, o que explicaría de mejor forma la

solubilización del fosfato tricálcico es la acidez titulable y en menor medida el pH. La menor

cantidad de acidez titulable fue determinada en Penicillium sp. y Pseudomonas sp. y estos dos

cepas se registra también la menor cantidad de P soluble. La mayor cantidad de acidez

20

titulable se registró en Clostridium sp. y es en esta cepa donde se encontró la mayor cantidad

de P soluble en comparación con las demás cepas, luego le sigue Bacillus sp. que produjo una

cantidad menor de acidez titulable y fue la cepa que ocupo el segundo lugar en solubilización

de P a partir del fosfato tricálcico.

Figura 6: Relación entre la concentración de P soluble y la acidez titulable en medio adicionado con fosfato tricálcico.

En relación a la acidez titulable y el P solubilizado en el medio con roca fosfórica, se

observa, al igual que en el caso del fosfato tricálcico, una relación directamente proporcional

entre la cantidad de P solubilizado y la acidez titulable. El pico más alto de producción de

acidez titulable en medio con roca fosfórica lo produjo Pseudomonas sp. y es aquí donde

también se registró la mayor cantidad de P solubilizado, lo cual ocurrió entre los 20 a 25 ddi,

la que le sigue es Clostridium sp. que si bien no alcanzó un pico tan alto de acidez titulable,

esta se mantuvo prácticamente sin mayor variación durante todas las evaluaciones pero con

21

promedio más alto que el determinado para Pseudomonas sp. en todo el periodo de

evaluaciones y como resultado la concentración de P soluble también se mantuvo sin

variaciones importantes. Le sigue Bacillus sp. y finalmente Penicillium sp. con la menor

producción de acidez titulable y por lo tanto la menor cantidad de P solubilizado. Por lo tanto,

también para la roca fosfórica la variable que mayor incidencia tiene sobre la solubilización es

la acidez titulable y no únicamente el pH (figura 7).

Figura 7: Relación entre la concentración de P soluble y la acidez titulable en medio adicionado con roca fosfórica.

A los 20 ddi se registró el valor más alto de solubilización en Clostridium sp. en medio

de cultivo con FTC, seguida por Bacillus sp., Penicillium sp. y Pseudomonas sp. Además

Clostridium sp. fue la cepa que mayor cantidad de P solubilizó en todas las evaluaciones

realizadas a partir del FTC. En la RF se observó poca variabilidad entre el P que puede

solubilizar cada cepa. Las cuatro cepas microbianas evaluadas son más efectivas en la

solubilización del fosfato tricálcico en comparación con la roca fosfórica (figura 8).

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Figura 8: Solubilización de fosfato tricálcico y roca fosfórica a los 20 días después de la inoculación

En el cuadro 4 se resume los valores más altos de solubilización alcanzados por cada

cepa, la disminución del pH y la acidez titulable producida en la evaluación respectiva.

Cuadro 4: Solubilización de fosfato tricálcico y roca fosfórica en medio líquido por las cepas microbianas

Cepa Fuente de fósforo Fosfato tricálcico Roca fosfórica pH

final Acidez titulable meq L-1

P mg L-1

pH final Acidez titulable meq L-1

P mg L-1

Clostridium sp. 4.11 31.69 429.11 4.32 11.76 58.90 Bacillus sp. 4.38 28.42 304.42 4.18 12.41 99.34 Pseudomonas sp. 4.47 11.43 151.40 3.72 13.72 115.73 Penicillium sp. 4.87 12.09 101.91 4.01 9.47 56.94

23

IV. CONCLUSIONES

• Fueron aisladas 13 cepas de bacterias y 7 de hongos con capacidad para solubilizar

fosfatos. De acuerdo al índice y el área del halo de solubilización se consideró como

las cepas promisorias la CBact1, CBact2 y CBact3 y la CFung1.

• La cepa bacteriana CBact1 corresponde a Pseudomonas sp. (fluorescente), la CBact2 a

Bacillus sp. y la CBact3 a Clostridium sp. La CFung1 corresponde a una especie de

Penicillium sp.

• Clostridium sp. fue la cepa con mayor eficiencia de solubilización in vitro, mientras

que Penicillium sp. resultó en los valores más bajos a partir del fosfato tricálcico.

• La solubilización de fósforo a partir de la roca fosfórica fue notablemente menor en

comparación con el fosfato tricálcico.

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