HIDRLISIS DE UNA PROTEINA Y ENSAYOS PARA PROTEINAS Y AMINOACIDOSPOR: EQUIPO 12 Y 14

1.2.

3.

Efectuar la hidrlisis total de una protena. Identificar algunos aminocidos presentes en un hidrolizado de protena, por medio de sus propiedades fsicoqumicas. Identificar por cromatografa en placa fina algunos de los aminocidos presentes en un hidrolizado de protena.2

Largas cadenas de aminocidos unidos por enlaces peptdicos. Constituyentes fundamentales de todas las clulas y tejidos del cuerpo. Constituyentes esenciales de la dieta necesarios para la sntesis de tejido corporal, enzimas, algunas hormonas y componentes protenicos de la sangre.Elemento Carbono (C) Hidrgeno (H) Porcentaje 53% 7%

Oxgeno (O)Nitrgeno (N) Azufre (S)

23%16% 1%

3

Molculas simples formadas por la hidrlisis completa de una protena. Es la unidad principal de las proteinas Un aminocido es esencialmente un cido orgnico que contiene un grupo amnico. Si se substituye un hidrgeno por un grupo amnico en el tomo de carbono que se haya junto al grupo carboxilo se forma un aminocido.

cido actico cido aminoactico o Glicina4

Grupo

amino Grupo carboxilo Un hidrogeno Un grupo de cadena lateral (R)

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Los aminocidos se conducen como bases y como cidos dbiles (grupo carboxilo y amino). Solucin acuosa se ionizan como cidos y bases (anfteras). Forman iones dipolares o zwiteriones. Pueden reaccionar con cidos o bases para formar sales.

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Debido

a esta naturaleza dipolar, los aminocidos poseen caractersticas poco usuales:

Puntos de fusin altos Mas solubles en agua que en ter Momentos dipolares mayores que las aminas o

cidos sencillos.

La unin entre dos aminocidos se lleva a cabo por la reaccin que se presenta entre el grupo carboxilo de un aminocido con el grupo amino de otro formando una amida mediante la prdida de una molcula de agua. Esta unin covalente es a lo que se denomina enlace peptdico, el cual tiene una geometra planar y caractersticas de doble enlace, debido a la resonancia existente.

Las

funciones de las protenas varan entre si, algunas actan como reguladoras, otras como transportadoras como la hemoglobina, otras actan en el cuerpo como encargados de defensa o como tejidos de sostn.

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Hay

4 tipos de estructuras de protenas.

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12

Cuando

estn en solucin las protenas se desnaturalizan rpidamente por contacto con. cidos. Alcalinos. Agitacin. Calentamiento. Agentes reductores. Detergentes. Solventes orgnicos. Exposicin a rayos X y luz.

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Coagulacin Alcohol cidos

mediante calor

inorgnicos concentrados (HCl, HNO3, H2SO4) Sales de metales pesados ( cloruro de mercurio, nitrato de plata) Reactivos de alcaloides (cido pcrico) Separacin salina14

Las protenas pueden desintegrarse por hidrlisis en molculas ms pequeas. Rotura simple de un grupo amida. Fragmenta las protenas en a -aminocidos. cidos (HCl y H2SO4) Hidrolisis cida : Se basa en la ebullicin prolongada de la protena con soluciones cida fuertes Bases (NaOH). Hidrolisis bsica : Respeta los aminocidos que se destruyen por la hidrolisis anterior, pero con gran facilidad, forma racematos. Enzimas (proteasas) Hidrolisis enzimtica : Se utilizan enzimas proteolticas cuya actividad es lenta y a menudo incompleta, sin embargo no se produce racemizacin y no se destruyen los aminocidos; por lo tanto es muy especfica.15

Un

pptido se somete a hidrlisis cida calentando con HCl, bajo stas condiciones los enlaces amida se rompen y se obtiene una mezcla de fragmentos peptdicos y aminocidos libres (HIDRLISIS TOTAL). HIDRLISIS SELECTIVA O PARCIAL , catalizada por enzimas que rompen enlaces amida especficos, dando como resultado aminocidos aislados.16

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DESCRIPCION: Su aspecto es el de un polvo grueso ligeramente amarillento. CARACTERISTICAS: Es una mezcla heterognea de protenas solubles en agua cuya composicin de aminocidos aproximada es: Glicina 25.5 %, Alanina 8.7 %, Valina 2.5 %, Leucina 3.2 %, Isoleucina 1.4 %, Cistina y Cistena 0.1 %, Metionina 1.0 %, Fenilalanina 2.2%, Prolina 18.0 %, Hidroxiprolina 14.1%, Serina 0.4 %, Treonina 0.9 %, Tirosina 0.5 %, Acido Asprtico 6.6 %, Acido Glutmico 11.4 %, Arginina 8.1 %, Lisina 4.1 %, Histidina 0.8 %.

SOLUBILIDAD: Se disuelve completamente en agua caliente. Insoluble en disolventes orgnicos.APLICACIONES: En la elaboracin de malvaviscos, merengues, gomas duras, gomas blandas, gelatinas, flanes, helado, yogurt, carnes fras y dulces. Fabricacin de cpsulas duras, cpsulas blandas y supositorios. En fotografa, enologa, cosmetologa y fonologa. 18

Apariencia:

lquido incoloro o levemente amarillo. Densidad: 1.12 g/mL Peso molecular: 36.46g/mol Punto de fusin: 247 K (-26 C) Punto de ebullicin:321 K (48 C) Riesgos: Gastritis, quemaduras, irritacin.

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SOLUBILIDAD EN AGUA: Insoluble en agua y solventes orgnicos. APARIENCIA Y OLOR : Grnulos o polvo negro sin olor. INHALACION: Es posible leve irritacin del tracto respiratorio debida a la accin secante y abrasiva del polvo. INCOMPATIBILIDAD: En contacto con oxidantes fuertes tales como ozono, oxgeno lquido, cloro, permanganato, etc. Se usa como auxiliar en la remocin de impurezas(color, olor, sabor).

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10 mL.HCL 1g. Grenetina

10mL. H2O dest

.

Reflujar 35 min.

Adicionar 0.5g carbn activado (2min)

SOLUCIN A (Mezcla de aa, HCl y agua)

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1. Reaccin xantoproteica: Es debida a la formacin

de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro.

CANTIDAD 2.0 ml 2.0 ml 10 ml El Necesario

REACTIVO Solucin A Solucin D Acido Ntrico Concentrado (liquido altamente corrosivo) Hidrxido de Sodio al 10%

2 ml. De Solucin A

5 ml. De Acido Ntrico

Calentamiento Suave y Observar Coloracin

2 ml. De Solucin D

Observar el cambio de Color.

Enfriar cada tubo y agregar a cada uno gota a gota .

En La Reaccin de Precipitacin a partir de nuestra muestra la cual al dejar actuar el Acetato de Plomo y con el calentamiento se va a llevar a cabo una precipitacin; dando as la prueba positiva y dando a entender que hay disulfuros en la estructura de la muestra problema.

CANTIDAD 2.0 ml. 2.0 ml. 2.0 ml. 15 ml. 1.0 ml

REACTIVO Solucin A Solucin D Agua destilada Hidrxido de Sodio al 10% Acetato de Plomo al 10%

2 ml. De Solucin A

2ml. De Solucin D

5 ml. De Hidrxido de Sodio al 10% Y 1 ml de Solucin de Acetato de PlomoEbullicin con Agitacin durante 5 min.

2ml. De Agua Destilada

Observar Los Resultados.

El reactivo de Biuret es empleado para detectar la presencia de protenas o polipeptidos en una sustancia desconocida debido al enlace peptdico (enlace entre el grupo amino (NH2) de un aminocido y el grupo carboxilo (COOH) de otro aminocido) Es una prueba de baja sensibilidad ya que se requiere un mnimo de 0.25mg de proteina, la prueba consta de Hidrxido de sodio y Sulfato de cobre (color azul) el cual nos dar una coloracin indicando la ausencia o presencia de protenas o polipeptidos, tambin es un mtodo colorimtrico ya por medio de la intensidad de color se pude cuantificar la cantidad de proteina presente con una longitud de onda de 540nm para la identificacin de Cu

La reaccin se basa principalmente el la formacin de un compuesto de color violeta debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ del CuSO4 y los pares no compartidos del nitrgeno contienen los aminoacidos que formana a la proteina o a los polipeptidos, en el cual el Cu se reduce a Cu2O, cambiando el color azul del reactivo de Biuret a un violeta a una prueba positiva

Las protenas tiene dos formas la fibrosa y la globulares Al tener una protena o polipptido estos estn constituidos por una serie de elementos como es el carbono, hidrogeno, nitrgeno y oxigeno y casi la mayora de tambin contienen azufre en poca cantidad., as que al adiciona el NaOH este forma un medio bsico el cual propicia un cambio en el pH de la protena produciendo la desnaturalizacin de la protena dejandola expuesta para la interaccin del Cu con los electrones de N que no estn ocupados cuando se adiciona el CuSO4 formando un compuesto coordinado de una coloracin violeta

Protenas a emplear Grenetina.- Solido (polvo amarillo) Constituido por: Glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, cistina, cisteina, metionina, fenilalanina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, tirosina, acido aspartico, acido glutamico, arguinina, lisina, histidina, solubles en agua Albumina Hay diversos tipos de albumina Seroalbmina: Es la protena del suero sanguneo. Ovoalbmina: Es la albmina de la clara del huevo, . Lactoalbmina: Es la albmina de la leche.

Tubo 30.5ml de solucin de albumina

Tubo 4

0.5ml de solucin de grenetina hidrolizada sin neutralizar

0.5ml de solucin de hidrxido de sodio al 10%

Tubo 5

0.5ml de solucin de albumina

0.5ml de hidrxido de sodio al 10%

Tubo 6

0.5ml de solucin de grenetina sin neutralizar

2ml de solucin de hidrxido de sodio al 10%

H20 + NaOH + CuSO4 Grenetina sin hidrolizar + NaOH + CuSO4 *Albumina + CuSO4 Grenetina hidrolizada neutra + NaOH + CuSO4 Albumina + NaOH + CuSO4

Es una de las reacciones caractersticas del grupo -amino Por calefaccin de un -aminoacido con dos molculas de ninhidrina da un producto intensamente coloreado

Aparece un color purpura con todos los aminocidos y pptidos que poseen grupos -amino libres, el cual es un anin violeta estabilizado por resonancia llamado purpura de Ruhemann.En presencia de prolina y la hidroxiprolina aparece un color amarillo caracterstico debido a que el grupo -amino se encuentra sustituido.

Preparar 5 tubos de ensayo con las soluciones preparadas

Agregar a cada tubo 0.5 mL de solucin de ninhidrina al 3% y calentar a bao mara

Observar y Concluir

Las

propiedades qumicas de los aminocidos, van asociadas a sus grupos funcionales, de manera que existen varias reacciones especificas para el grupo amino La reaccin con acido nitroso, es una reaccin de desaminacion.

El

acido nitroso reacciona de manera diferente con cada tipo de amina, permitiendo usarse con ellos su diferenciacin. Con las aminas primarias el acido reacciona formando un hidroxicido y liberando nitrgeno gaseoso. esta reaccin se pueden determinar volumtricamente los aminocidos en funcin del nitrgeno formado.

Para

El

acido nitroso, se encuentra en diversos agentes qumicos que causan mutaciones, ya que convierte los grupos amino de las bases pirimidicas y puricas en grupos hidroxilo.

En cuatro tubos de ensayo colocar 3 ml de HCl, agregar:

2ml de solucin A 2 ml de Solucin B 2 ml de solucin C Tubo testigo

Enfriar y agregar a los cuatro tubos de ensayo , 1 ml de solucin acuosa de nitrito de sodio al 5% Observar y concluir.

Solucin B + 6 gotas de rojo congo

+ HCl (hasta virar)

H2O+ 6 gotas de rojo congo

+ HCl (hasta virar)

Solucin B + 6 gotas de fenolftalena

+NaOH (hasta virar)

H2O + 6 gotas de fenolftalena

+ NaOH (hasta virar)

6) Cromatografa en placa fina

Colocar las muestras: a) Sol. Patrn a.a. 1 al 1% b) Sol. B al 1%

c) Sol. Patrn a.a. 2 al 1% Dejar secar y eluir en sol. De alcohol terbutilico-agua 3:1

a

b

c

Rf= frente de la muestra/ frente del disolvente

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