SEMINARIO DE TÍTULO - FASE LUMINOSA EN MICROALGAS
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ESCUELA DE RECURSOS NATURALES
INGENIERIA EN ACUICULTURA
Evaluación de la Existencia de Diferencias Significativas en el
Crecimiento de las Microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp.
Con Cambios en el Fotoperíodo
Nombre Katherine Cerna Boassi
Docente: Tatiana Zúñiga
Sigla: STL8301
2011
1 INTRODUCCIÓN
Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el
fitoplancton que abarca desde organismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados
auxótrofos.
Su posición taxonómica ha sido de gran polémica entre botánicos y zoólogos, como
ejemplo se puede mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como
microalgas y por otros como protozoarios.
Las microalgas aportan un alto contenido nutricional para peces, crustáceos y
moluscos, además de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio
como en producción a gran escala con fines comerciales. (FAO)
La producción de microalgas en laboratorio genera costos para la empresa, como es
la energía eléctrica que es necesaria para suministrarles la luz necesaria para el crecimiento.
Si es posible la reducción en los costos sabiendo que necesidades específicas de
tiempo de luz necesita efectivamente las microalgas para su crecimiento se estaría abaratando
costos de las empresas.
Es por esto que el seminario de titulo se abocó a Evaluar si existe diferencias
significativas de crecimiento en las especies de microalgas Isochrysis galbana y
Nannochlorys sp. con cambios en el fotoperíodo. Por lo que se realizará el cultivo de
microalgas creando un sistema para manejar el fotodiodo de 12 horas y 24 horas continua de
luz y un posterior un análisis estadístico de los resultados del conteo que dio el crecimiento de
estas dos microalgas por un tiempo de una semana.
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2 OBJETIVO
Evaluar si existe diferencias significativas de crecimiento en las especies de
microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp. con cambios en el fotoperíodo.
2.1 Objetivos específicos
Describir el cultivo de microalgas
Cultivar microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp.
Determinar crecimiento de las microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp con
manejo de fotoperíodo
Comparar crecimiento de las microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp. con
manejo de fotoperíodo
3 ANTECEDENTES GENERALES
3
3.1 Microalgas
Dentro del conjunto de organismos que forman el zooplancton se distinguen el
fitoplancton y los rotíferos. El fitoplancton está formado por algas minúsculas marinas que se
encuentran suspendidas en la columna de agua. Las microalgas forman la base de la cadena
trófica de los lechos marinos (Fig. 1). Para asegurar cantidades suficientes de fitoplancton para
poder nutrir cualquier otro cultivo es necesario ser capaces de ofrecerles las condiciones de
mantenimiento que requieren. (http://www.aquanovel.com/cultivos_fitoplancton.htm)
Fig. 1, Pirámide de la cadena Trófica marina
Fuente: http://wenarenandaf-ecosistemadelmar.blogspot.com/2010_11_01_archive.html
3.1.1 Parámetros de cultivo
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Los parámetros de cultivos para la productividad microalgal son: Luz, temperatura,
fuente de carbono, nutrientes, ph, evaporación, lluvia, contaminación, salinidad, agitación,
inóculo.
La Luz constituye un factor fundamental en todo cultivo de microalgas, tanto por si
misma como por sus interrelaciones con otros parámetros. La radiación utilizable
fotosintéticamente (PAR) cae dentro del rango de espectro visible (400- 700nm). Representa la
fuente de energía para la fotosíntesis, y tanto la intensidad luminosa como la longitud de onda y
el fotoperíodo (que marca el mecanismo para muchos ritmos circadianos) afectan al
crecimiento y metabolismo microalgal (Lips y Avissar, 1986).
La Intensidad de luz se necesita para que se realice la fotosíntesis. La tasa de fotosíntesis
aumenta con la intensidad luminosa siguiendo una cinética de Michaelis-Menten; donde se
alcanza un nivel de saturación a intensidades variables en función de la especie, después del
cual la intensidad se hace limitante, provoca la disminución de la tasa fotosintética y, por tanto,
del crecimiento.
También la fotoinhibición en un cultivo se puede dar cuando las intensidades de luz son
muy elevadas con frecuencia son inhibitorias para el crecimiento microalgal.
El termino fotoperíodo en biología dice sobre la duración o tiempo relativo de los
períodos de luz y oscuridad diarios a que están sometidos los organismos. En botánica se dice
de la unidad de alternancia de iluminación-oscuridad, específica para cada planta, cuya
repetición orgánica determina la floración de la misma.
El Fotoperíodo en condiciones normales las microalgas están sometidas a periodos de
luz/oscuridad y esta alternancia generalmente se utiliza también en su cultivo.
Muchos aspectos de la fisiología microalgas fluctúan en un ciclo de 24 horas(diario).
Esta periocidad se observó en (Sournia, 1974) :
División celular: en muchas especies la mayoría de las células se dividen en un
momento determinado del día o de la noche, lo que favorece su sincronización; al
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parecer la división nocturna ocurre en muchas especies, especialmente la que se
estudian en cultivo.
Capacidad fotosintética: con frecuencia se observa las tasas máximas de
fotosíntesis se producen en la mañana y las mínimas en el anochecer.
Absorción de nutrientes: las tasas de absorción de N y P son mayores durante el
día que durante la noche, lo que refleja la influencia de la luz sobre la absorción.
Bioluminiscencia: generalmente se detecta un pico nocturno de bioluminiscencia
en las especies que las poseen (dinoflagelados).
Estos ritmos cicardianos diarios persisten bajo condiciones ambientales constantes.
Se han realizado experimentos en laboratorios utilizando luz continua, pero los resultados
demuestran que son necesarios periodos de oscuridad para conseguir resultados óptimos,
aunque hay discrepancia de datos a este respecto. Ya que se dice que las microalgas se pueden
adaptar a bajas densidades de luz y tienen mas eficiencia en la absorción de energía lumínica
Experiencias con I. galbana en luz continua y en periodos luz-oscuridad, proporcionando
la misma cantidad de luz por día (cantidad de luz=intensidad x tiempo), muestran que si bien
para una temperatura dada el crecimiento es proporcional a la cantidad de luz recibida, se
obtienen mayores tasas de crecimiento en el régimen de Luz-oscuridad (Toro, 1989).
En cuanto a la Longitud de onda que es la calidad de luz se que tiene efectos marcados
sobre el crecimiento y varios procesos metabólicos y pueden afectar también la composición
bioquímica.
Las Fuentes luz pueden ser artificial y natural. La luz natural tiene la ventaja de no
suponer un gasto energético, pero tiene los inconvenientes de que no se puede controlar ni el
fotoperíodo ni la intensidad, asimismo, se producen importantes variaciones diarias,
estacionales, en función del tiempo atmosférico. Por el contrario, la luz artificial puede
controlarse pero supone un gran gasto energético, u por tanto un elevado coste.
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La fuente de luz artificial tiene espectros de emisión que no son necesariamente idénticos
a la luz natural del sol y la calidad de la luz puede afectar al crecimiento, metabolismo,
reproducción y morfología.
Las lámparas de fluorescentes tubulares son la fuente de luz preferida la iluminación de
cultivos interiores. Estas dan menos calor que otros tipos de luz artificial y son igualmente
eficientes en promover tasas de división y crecimiento máximos.
3.2 Fotosíntesis
Las microalgas son responsables de más del 50% de la fotosíntesis del planeta, y
además convierten el CO2 en biomasa verde (Fig. 2), ya que lo incorporan a su propio
organismo. Las microalgas captan la energía solar y la acumulan en sus grasas gracias a la
fotosíntesis, absorbiendo dióxido de carbono y desprendiendo oxígeno.( M. Teresa Bermúdez,
http://www.andaluciainvestiga.com/espanol/noticias/4/microalgas_2924.asp)
Fig. 2, Esquema del almacenamiento de energía en un microalga.
Fuente: http://www.sitiosolar.com/biocombustibles%20de%20microalgas.htm
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3.2.1 Fase luminosa
La fase luminosa, fase clara, fase fotoquímica o reacción de Hill es la primera etapa
de la fotosíntesis, que convierte la energía solar en energía química. La luz es absorbida por
complejos formados por clorofilas y proteínas. Estos complejos clorofila-proteína se agrupan
en unidades llamadas fotosistemas, que se ubican en los tilacoides (membranas internas) de los
cloroplastos. Se denomina fase luminosa o clara, ya que al utilizar la energía lumínica, sólo
puede llevarse a cabo en condiciones de alta luminosidad, ya sea natural o artificial. (
http://es.wikipedia.org/wiki/Fase_luminosa)
8
3.3 Antecedentes de la especie
3.3.1 Nannochlorys sp.
Nannochlorys sp. (Naumman ) (Tabla I) es un alga verde que no posee movilidad ya
que no contiene flagelos, tiene un reducido tamaño, es una célula de forma esférica, tiene un
diámetro de 1,5-2,5µ (Fig, 3), Es una especie unicelular que acumula lípidos y ácidos grasos
polinsaturados (Hoff F.,1999).
Tabla I, Taxonomía Nannochlorys
Fuente: http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=6987
Fig. 3, Nannochlorys.
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3.3.2 Isochrysis galbana
Isochrysis galbana (Parke) (Tabla II) Variedad Tahití es una célula de 4 a 8 m de
tamaño, con dos flagelos móviles situados cerca del final de la célula (Fig 4). Es un flagelo de
color amarillo, que habita en climas templados, su crecimiento óptimo se encuentra a una
temperatura que varia de 16ºC a 20ºC , a una salinidad de 25 o / oo y una iluminación de 4.000
lux. Debido a su tamaño y a que es un flagelado desnudo, es fácilmente digestible por los
consumidores. Se reproducen por simple división y usualmente son empleados como alimento
para rotíferos, almejas, ostras y larvas de camarón.
Isochrysis galbana es rico en ácidos grasos poliinsaturados, que son de alto valor
nutritivo para los las larvas de peces marinos y estadios juveniles de moluscos, se sabe de la
experiencia de crecimiento de esta microalga para la alimentación de larvas de ostras fue un
gran éxito para la alimentación de esta. (http:// www.bashanfoundation.org
/drora/droraoptimalgrowth.pdf)
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Tabla II, Taxonomía de Isochrysis galbana
Fuente: http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=77552
Fig. 4, T iso Isochrysis galbana Variedad Tahití
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3.4 Técnica de cultivo de microalgas
La secuencia de cultivo es bastante simple, y en general, es común para todos los
cultivos de microalgas que se realicen en ambiente controlado. Se inicia con la obtención de la
o las cepas que sean de interés para el hatchery, a través de un tubo de stock, del cual se
realizan varias diluciones con el fin de tener réplicas de las cepas.
Para iniciar el cultivo se selecciona aquel tubo que tenga la mayor concentración, la
cual normalmente se ve a través de la coloración que ésta tenga. De aquí se obtiene el inóculo
para comenzar el cultivo intermedio desde 150 ml, para continuar hasta aproximadamente
2.000 ml. Una vez alcanzada esta etapa, se pasa al cultivo masivo, el cual dependiendo del área
que se tenga, se puede realizar en estanques de fibra de vidrio de aproximadamente 200 litros o
mangas plásticas con volúmenes variables hasta los 25 litros aproximadamente.
3.4.1 Medios de cultivos
Entregar una correcta nutrición a las Microalgas es una de las tareas más
importantes en el cultivo de estos organismos. Las Microalgas son alimentadas mediante los
medios de cultivo, que son recetas formuladas para grupos de especies con características en
común. Cada medio de cultivo varía en sus concentraciones y tipos de nutrientes, existiendo
algunos que son utilizados sobre agua destilada, agua dulce y agua de mar. Para conocer cómo
nutrir a las Microalgas, es importante conocer su composición química para así poder
identificar qué elementos son los necesarios para generar biomasa algal. Los principales
nutrientes en las Microalgas son el Carbono, Nitrógeno y Fosfato.
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3.4.1.1 Medios para Microalgas marinas
El agua de mar es de por sí un medio propicio para el crecimiento de algas. Este
medio marino generalmente es fortalecido cuando se le añaden nutrientes como el nitrógeno, el
fósforo, el hierro y otros. Muchos medios enriquecidos y sintéticos han sido desarrollados para
el cultivo de algas microscópicas planctónicas y algunas especies bénticas han crecido
exitosamente con estos medios. Las dificultades encontradas en el desarrollo de los cultivos
algales están a menudo relacionadas con los problemas de aislamiento, manipulación,
incubación y situación fisiológica del organismo. Un solo medio debe servir para la mayoría de
las necesidades del cultivador. Este es el caso del medio R. Guillard f/2 en el cual un gran
número de especies algales crecen sin dificultad. Un medio sintético puede ser usado igual que
uno enriquecido, pero cualquiera que éste sea, el medio deberá ser tan simple como sea posible
en su composición y preparación. (Stein,1994)
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3.5 Modelo Matemático
3.5.1 Modelo experimental: Modelo bifactorial de efectos fijos con varias muestras por
grupo: (Montgomery, 2002)
El diseño de un experimento tiene como objetivo proporcionar estimadores de los
efectos de los tratamientos o diferencias entre sus efectos, por medio del uso de unidades
experimentales que presenten un comportamiento equivalente frente a un mismo tratamiento,
de modo que las diferencias detectadas en las respuestas sean preferentemente, consecuencia de
los diferentes efectos de los tratamientos y no de las diferencias entre las unidades
(Montgomery, 2002).
Sin embargo, es necesario estimar la variabilidad del material en experimentación, por
medio de una estimación del error experimental, para lo cual cada experimento debe ser
replicado un número suficiente de veces. De esta forma los grados de libertad disponibles para
ese efecto, permiten separar los diferentes componentes de la varianza asociados al
experimento, es decir estimar los distintos componentes del error experimental.
En particular se debe verificar la posibilidad de efectos combinados de dos o más
factores, interviniendo sobre una misma unidad experimental. Este problema se asocia a la idea
de independencia entre los efectos de los tratamientos. Idealmente, sería deseable que el efecto
de la aplicación de un tratamiento A, fuera independiente del efecto de la aplicación de otro
tratamiento B, suponiendo que en principio sólo se está interesado en estimar los efectos puros
de ambos factores, pero como no es posible asegurar tal independencia, se necesita diseñar un
esquema de aleatorización y análisis que permita verificar la existencia de tales interacciones.
A este respecto, los experimentos factoriales, constituyen una forma de definir los tratamientos
de un experimento de modo que sea posible estimar el efecto de dichas interacciones. En un
experimento factorial, los tratamientos consisten en combinaciones de dos o más factores cada
uno en dos o más niveles. Las combinaciones son tales que cada nivel de todos los factores
ocurre junto con cada nivel de todos los otros factores. El número de tratamientos es el
producto del número de niveles de todos los factores.
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Este tipo de generación de tratamientos, que puede estar asociado con cualquier tipo de
aleatorización (o diseño experimental), tiene las ventajas que en él, todos los efectos simples
del factor son iguales al efecto principal. Existen replicaciones escondidas, de modo que cada
efecto principal es estimado con la misma precisión como si el ensayo entero hubiera sido
desarrollado para un solo factor y finalmente, quizás lo más importante, cuando hay
interacciones entre los factores participantes del experimento, los experimentos factoriales
proporcionan un conjunto sistemático de combinaciones de factores para estimar todas las
interacciones, cada una con igual precisión.
Para efectos de este estudio, se consideran diseños completamente aleatorios, con dos
factores y que se llamarán, para efectos de identificación A y B, cuyo modelo es:
donde:
Y ijk = corresponde a la respuesta, densidad (número de células/ml.)
m = es la media general del modelo
a i = es el efecto del i-ésimo nivel del factor A, el que tiene i=1,...,a niveles
b j = es el efecto del j-ésimo nivel del factor B, el que tiene j=1,...,b niveles
(abij ) = es el efecto agregado (interacción) de los factores A y B a sus niveles i y j,
respectivamente.
e ijk = error experimental
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Y ijk = m + a i + b j + (abij) + e ijk
4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Lugar y tiempo de trabajo
La experiencia se desarrolla en el laboratorio de DUOCUC en un tiempo de 2 meses,
desde mayo hasta junio.
4.2 Sistema de fotoperíodo
Para reproducir dos sistemas de fotoperíodo que será de 12 y 24 horas, se diseña y
construye una caja de madera de 30 alto x 40 ancho x 50 cm largo (fig 5 y 6), separadas en dos
secciones de 25 cm. Provistas de un tubo Fluorescente de 8 watts en cada sección conectados a
un Timer o reloj formando un circuito (Fig.7) que esta programado para realizar el fotoperíodo
en la sección 1 de 12 horas realizando la fase luminosa desde las 21 - 9 horas y en la sección 2
realizando la fase luminosa las 24 horas del día.
Fig.5 , Diseño y medidas del sistema de fotoperíodo.
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Fig. 6, Caja terminada con instalación de iluminación tubos fluorescentes 8 Watts.
FIg. 7, Circuito del sistema
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4.3 Obtención de las cepas de microalgas
Las 2 cepas fueron suministradas del Stock que posee el laboratorio DUOCUC que
son las siguientes:
Isochrysis galbana
Nannochlorys sp.
4.3.1 Medio de cultivo para microalgas
Se emplea el medio de cultivo de Guillar “f/2” (Fig. 8 y Tabla III), las cantidades de
las preparaciones son las siguientes :
Para un litro:
1 ml. Nitrato
1 ml. Fostato
1 ml. Traza
0.5 ml. Vitamina
2 ml. Triz
Fig. 8 , Preparados de nutrientes.
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Tabla III , Medio de Cultivo F/2 de Guillard
Cantidades para la preparación de nutrientes.
Fuente: Manual cultivo de bivalvos en criadero (FAO)
4.3.2 Desinfección y esterilización en el cultivo de microalgas
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La Desinfección es muy necesaria para evitar contaminaciones externas sólo en las
manos como en el mesón.
Para la preparación del material se debe realizar un lavado previo, con un detergente
no abrasivo, y secado en la estufa por período de 45 minutos aproximadamente. Una vez frío el
material se procede a envolver el material a utilizar con papel “reciclado” del laboratorio, se
debe dejar siempre la cara escrita hacia fuera del material de vidrio.
La esterilización, para material de vidrio en la estufa a 180° por 1 hora. Por medio de
calor seco. Es muy importante destacar que el retiro de los materiales se debe hacer con
guantes de seguridad para evitar posibles quemaduras
El agua que es reservada en el estanque de acopio es tratada para su remoción de
microorganismos con el esterilizador UV por un período de 56 hrs. continuas, luego de ese
período es posible ocupar el agua para cultivo de las microalgas.
Posteriormente se hace factible contener el agua en un matraz de aproximadamente 2
lts. Cubierto con un algodón hidrófobo y papel reciclado en la boquilla.
El agua es autoclavada equipo que esteriliza por medio de calor húmedo, equivalente
al proceso de una olla a presión. Por un período de 15 minutos a 121°C o 1.2 atm.
4.4 Cultivo de microalgas
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La experiencia se inicia con la obtención de cepas entregadas por el laboratorio, se
prepara el material de vidrio que son dos matraces de 250 ml., se autoclave agua de mar luego
con la preparación del medio que se uso F/2. se prepara un stock de microalgas (Fig. 9).
Se realizó un litro de solución y se preparó dos matraces de 250 ml cada uno, se le
adiciona 4 ml. de tubos de ensayo inicial que contaba el laboratorio de Duoc Uc.
Fig. 9, Stock de cada microalga Isochrysis y Nannochlorys
después de 2 semanas de crecimiento.
Se replica a tubos de ensayo 4 ml. de cada stock de microalgas y se rellena con 6 ml.
de agua preparada con el medio F2.
Durante una semana se dejan las microalgas creciendo en el sistema de fotoperíodo
agitando diariamente las muestras (Fig. 10) .
Fig. 10, Sistema con dos secciones diferentes de fotoperíodo
4.5 Recuento de microalgas
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Para el recuento de microalgas se utiliza la Cámara de Neubauer (Fig. 11) es un
herramienta utilizada en medicina y biología para realizar el recuento de células en un medio
líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, etc.
Fig. 11, Cámara de Neubauer
Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste
de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el
fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones
conocidas. Se cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por simple tensión
superficial.
La fórmula de valoración del número de células (válida universalmente) es la
siguiente: Partículas por μl=(partículas contadas)/(superficie contada (mm²)∙profundidad de la
cámara(mm)∙ dilución)
4.5.1 Protocolo para conteo de microalgas
1. Mantener el lugar de trabajo limpio y ordenado, previamente desinfectado con alcohol
lugar de trabajo.
2. Sacar una muestra con la pipeta y depositar en la cámara Neubauer, colocando sobre
esta un cubre objeto (Fig. 12)
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3. Se lleva al microscopio con un aumento de 10x, ubicando primero la cámara en imagen
general, luego se aumenta a 40x comenzando la ubicación del primer cuadrante de
conteo que según figura 2 están demarcados por la letra L
Fig.12, Cuadricula de la cámara neubauer
4. Una vez ubicados los cuadrantes de conteo, se procede a contar todas las microalgas
visibles, obteniendo cinco lecturas con las cuales se calculara un promedio (Q).
5. Una vez realizados estos pasos (Fig. 13), se utilizara la siguiente formula para calcular
la densidad celular (Células/ml)
Donde:
D: densidad celular (Cel/ml)
Q: promedio de células
¼: numero de divisiones del cuadrado central
106: factor de disolución
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Fig. 13, Pasos para el conteo de microalgas
24
4.6 Análisis Estadístico de los datos
4.6.1 Diseño experimental
Explicar si hay diferencia significativa en crecimiento celular de las microalgas
Nannochlorys s sp. y Isochrysis Galbana, manteniendo fotoperíodo (12 horas) y 24 horas
continuas respectivamente, considerando los factores A y B que son los siguientes:
Factor A: Tipo de Microalga
Este factor cuenta entonces con dos niveles:
a1, Microalga Nannochlorys sp.
a2, Microalga Isochrysis.
Factor B: Fase Lumínica
Este factor cuenta entonces con dos niveles:
b1, Fotoperíodo 12 horas
b2, Fotoperíodo 24 horas contínuas
Por lo tanto el modelo propuesto se esquematiza como:
Tabla IV. Modelo bifactorial de efectos fijos con varias muestras por grupo:
(Montgomery, 2002)
Nivel b1 b2a1 Y111 Y121
. .
. .Factor A Y11k Y12k
a2 Y211 Y221. .. .
Y21k Y22k
FactorB
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Y ijk = corresponde a la respuesta Tabla V, densidad (número de células/ml.)
Tabla V : Desglose de la respuesta
i = es el efecto del i-ésimo nivel del factor A i = (1,2)
j = es el efecto del j-ésimo nivel del factor B j = (1,2,3)
k = numero del dato dentro del grupo k = (1....12)
4.6.2 Supuestos y límites del diseño de experimento
Las inferencias estadísticas sobre los parámetros del modelo, son válidas bajo ciertos
supuestos, que son los siguientes:
4.6.2.1 Normalidad:
En general la distribución de frecuencia de los errores debería tener la siguiente
forma: simétrica y acampanada campana de Gauss (Neuling, 1988), haciendo un histograma de
residuales, si se satisface el supuesto N(0,2) para los errores, una grafica de residuales
deberá aparecer como una muestra de distribución normal con centro en cero (Montgomery,
2002).
Por lo tanto se hará la comprobación de normalidad gráficamente para lo cual se
analiza la frecuencia acumulada (%) vs residuales y se ve si se ajustan a una regresión lineal,
más un histograma de frecuencia relativa (n°) v/s densidad (número de células/ml.) para ver si
los datos se ajustan a la forma simétrica (Campana de Gauss). Esto se comprobará mediante la
Prueba de Lilliefors con un umbral de significación =0,02 si es que se puede rechazar o no la
hipótesis nula según la cual la muestra sigue una ley normal.
26
4.6.2.2 Aleatoriedad de las muestras:
Se aplica para comprobar si la multiplicación celular por tipo de microalga se
comporta en forma aleatoria en cada una de las fases lumínicas analizadas, para esto se aplicará
la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.
Cabe señalar que la distribución F de la teoría normal es una buena aproximación de
la distribución de aleatorización exacta (Montgomery, 2002), esto quiere decir que valores
grandes de F indica que los datos no son consistentes con la hipótesis Ho: µ1 = µ2 o sea, las
medias muestreales generan diferencia de multiplicidad celular entre microalgas.
4.6.3 Planificación diseño de experimento
Teniendo el dato de los recuentos de microalgas a través de la Cámara de Neubauer, se
calcula el promedio de células Q, a través de este se calcula la densidad celular por tubo de
ensayo “d”, por tipo de Microalga y fase lumínica analizada.
Posteriormente los datos recopilados son ordenados, seleccionados y tabulados según
los dos tipos de Microalga (Iso-Nano) y fase lumínica (12-24 horas contínuas). Esta
información es procesada por el programa estadístico XLSTAT-PRO 2010, el cual desarrolla
los test estadísticos.
En la parte de análisis de datos de Microsoft Excel se procede a utilizar la función de
análisis de varianza con varias muestras por grupo, el cual da el resultado de la tabla ANDEVA
II. También se procede a analizar la diferencia de multiplicación celular entre los dos tipos de
microalgas gráfico de células/ml vs fotoperiodo (12-24 horas contínuas), Todo esto para saber
cuál es la tendencia % de multiplicidad celular en las fases lumínicas analizadas, saber si es
necesario tener en cultivo 12 o 24 horas contínuas ambos tipos de microalgas.
27
4.6.4 Numero de réplicas para el diseño propuesto
Este número está definido por el diseño experimental. En la práctica tratándose de
experimentos multifactoriales, lo que realmente interesa es el número de grados de libertad
destinados a estimar el error experimental, mostrado en la siguiente tabla de análisis de
varianza.
Tabla VI: Gratos de libertad
Fuente
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrados
medios Test-F Valor-p
Modelo
Error (r-1)(ab-1)
Total rab-1
A partir de este modelo es posible separar los grados de libertad del modelo de acuerdo a la
siguiente tabla VII
Tabla VII: grados de libertad
Fuente
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrados
medios F Pr>F
A a-1
B b-1
A*B (a-1)(b-1)
La tabla anterior permitirá establecer la significancia de las interacciones de primer y
segundo orden, como también de los efectos principales, utilizándose como valor crítico un
nivel no superior a 0,02. Los grados de libertad del error se obtienen como función del número
de niveles de los factores del modelo.
Ya que el modelo posee dos factores (2x2) niveles cada uno con 2 réplicas cantidad de
grupos anidados entre tratamientos, el total de grados de libertad para estimar el error es (2-1)
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(2x2-1) = 5. Esto equivale a una muestra de tamaño n=5 calculada en un enfoque regular, los
que en términos generales son suficientes para este efecto.
La cantidad final de muestras por modelo bifactorial serian n=16, (4 grupos anidados
por 4 unidades experimentales (tubos de ensayo) por matriz, Para poder tener el mínimo
muestreal se contará con una réplica matricial de 2, con esto en total se tendría n=32 ≥30, que
es el mínimo muestreal para poder inferir estadísticamente el diseño experimental propuesto.
4.6.5 Numero de datos a considerar en el diseño experimental
Cada tubo de ensayo corresponde a una unidad experimental en la que se han colocado
ambos tipos de microalgas La cantidad de tubos de ensayo son calculadas mediante el producto
del numero de niveles de los factores que da la cantidad de muestras mínimas por grupo (a*b =
2*2 = 4), por lo tanto se tendrán 4 tubos el tipo a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y 4 del tipo
a2 (Microalga Isochrysis Galbana.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12
horas) y b2 (24 horas continuas).
29
4.7 Métodos estadísticos empleados
Para el análisis del diseño de experimento propuesto se analiza que cada muestra
cumpla la condición de normalidad, aleatoriedad y homogeneidad de varianzas para ello se
tendrá los siguientes métodos de cálculo a emplear.
4.7.1 Análisis de normalidad (Análisis de Residuales & Prueba de Lilliefors)
Gráficamente se analiza la frecuencia acumulada (%) v/s residuales si se ajustan a una
regresión lineal, mas un histograma de frecuencia relativa (n°) v/s densidad (número de
células/ml.) para ver la forma simétrica (Campana de Gauss), si se satisface el supuesto
N(0,2), esto quiere decir que la muestra se ajusta a una distribución normal con centro en
cero, con una respectiva varianza.
Para la comprobación formal de la normalidad se hará la Prueba de Lilliefors, este test
detecta si las muestras, sigue o no una distribución normal. El supuesto básico es que la
muestra debe ser aleatoria.
Las hipótesis para este test son las siguientes:
H0: Datos células/ml se ajustan a una distribución normal.
H1: Datos células/ml no se ajustan a una distribución normal.
4.7.2 Aleatoriedad (Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis)
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Esta consiste en probar la hipótesis nula de que los tratamientos son idénticos contra la
hipótesis alternativa de que algunos de los tratamientos generan observaciones que son
mayores que otras. Este procedimiento esta diseñado para ser sensible al probar las diferencias
en las medias muestreales en comparación de los tipos de microalgas a1 (Microalga
Nannochlorys sp.) y del tipo a2 (Microalga Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1
(Fotoperíodo 12 horas) y b2 (24 horas contínuas).
Las hipótesis para este test son:
H0: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo a2 (Microalga
Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo
24 horas contínuas), generan multiplicación celular iguales.
H1: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo a2 (Microalga
Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo
24 horas contínuas), generan multiplicación celular distintas.
H0: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas
contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo
a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular iguales.
H1: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas
contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo
a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular distintas.
El cálculo de este test lo hará el software estadístico XLSTAT-PRO-2011
31
4.7.3 Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo & (Prueba de
Bartlett)
El análisis multifactorial de la varianza se presenta cuando dos o más factores
(variables independientes) afectan a la variable de respuesta (variable dependiente). Para cada
factor tendremos varios niveles, que dividen la población total en grupos de tratamiento.
Un concepto importante a tener en cuenta en el modelo multifactorial de la varianza
es el análisis de la interacción entre las variables (factores). Se dice que hay interacción cuando
una variable independiente A afecta a la variable dependiente de manera distinta según los
diferentes niveles de otra variable independiente B. En síntesis se trata, por tanto, de analizar si
las variables independientes (factores) producen efectos distintos en función de los niveles de
las otras variables independientes.
Por lo tanto el diseño experimental propuesto sigue el siguiente modelo factorial de
efectos fijos:
donde:
Y ijk = corresponde a la respuesta, densidad (número de células/ml.)
m = es la media general del modelo
ai = es el efecto del i-ésimo nivel del factor A, el que tiene i=1,...,a niveles
bj = es el efecto del j-ésimo nivel del factor B, el que tiene j=1,...,b niveles
(abij ) = es el efecto agregado (interacción) de los factores A y B a sus niveles i y j,
respectivamente.
e ijk = error experimental
32
Y ijk = m + a i + b j + (abij) + e ijk
Los términos ai y bj representan los efectos de los factores A (tipos de microalgas) y B
(faces lunínicas) que son los efectos principales, y son constantes sujetas a las restricciones:
Los términos ABij representa el efecto de interacción entre los factores A y B, y son
constantes sujetas a las restricciones:
El error experimental (eijk), corresponde a una variable aleatoria normal de media cero
y varianza (2) constante para cada k, las variables (eijk) han de ser independientes.
Por lo tanto los datos quedan representados como lo muestra la siguiente Tabla VIII.
Tabla VIII. Análisis de varianza diseño factorial, grupo de datos.
Nivel b1 b2a1 Y111 Y121
. .
. .Factor A Y11k Y12k
a2 Y211 Y221. .. .
Y21k Y22k
FactorB
5 RESULTADOS
33
i = 1.....tj = 1.....rk= 1....n
5.1 Conteo de microalgas (Anexo 1 y 2)
5.2 Resultados del Análisis de normalidad (Análisis de Residuales & Prueba de
Lilliefors)
En el cálculo de la normalidad, mediante el uso de análisis de residuales para el cultivo
de las Microalgas Isochrysis y Nannochlorys sp. mediante las fases lumínicas de 12 y 24 horas
contínuas, se pudo constatar que los datos de densidad cel/ml por tubo de ensayo, como lo
muestra el modelo bifactorial (Anexo), si satisface el supuesto N(0,2), esto quiere decir que
la muestra se ajusta a una distribución normal con centro en cero, con una respectiva varianza.
En el análisis gráfico de frecuencia acumulada (%) v/s residuales se puede constatar que
los datos para la Microalga Iso (Fig. 14). se ajustan a una regresión lineal muestra (n = 8) que
en total ocuparon 5 muestras de densidad de células, por prueba analizada.
En la matriz del modelo bifactorial, se puede apreciar que los residuales se ajustan a una
regresión lineal con un R2 = 0,85, con una pendiente b0 = 5,11.
En el análisis gráfico de frecuencia acumulada (%) v/s residuales para la Microalga
Nanno (Fig. 15), se puede constatar que también se ajustan a una regresión lineal muestra (n =
8) que en total ocuparon 5 muestras de densidad de células, por prueba analizada.
En la matriz del modelo bifactorial, se puede apreciar que los residuales se ajustan a una
regresión lineal con un R2 = 0,91 con una pendiente b0 = 6,49.
Esto quiere indicar que los datos de ambas microalgas son consistentes al tipo de
distribución normal, y que la variabilidad de los datos respecto a la media es normal, para la
totalidad de los datos en la muestra analizada.
34
Fig. 14. Análisis frecuencia acumulada (%) v/s residuales cultivo Microalgas Isochrysis
Figura 15. Análisis frecuencia acumulada (%) v/s residuales cultivo
Microalga Nannochlorys sp.
35
A su vez el histograma de frecuencia relativa (n°) v/s densidad (número de
células/ml.) (Fig. 16 y 17), muestran la forma acampanada de la distribución normal de las
respectivas frecuencias relativas, por ende los datos muestran visualmente que se ajustan a
una distribución Normal. Cabe destacar que el ajuste para los datos de distribución de
frecuencia relativa para la Microalga Nanno, (Fig. 15), muestra una distribución normal-
bimodal, para los intervalos de 410-420 y 440-450 (cel./ml), respectivamente en los
extremos de la distribución, eso no quita que no se pueda inferir sobre la respuesta global de
la matriz del modelo.
Figura 16. Histograma de frecuencia relativa (%) v/s densidad (número de células/ml.)
Microalga Iso.
36
Figura 17. Histograma de frecuencia relativa (%) v/s densidad (número de células/ml.)
Microalga Nanno.
En lo que respecta a la prueba estadística de normalidad (Prueba de Lilliefors) se tiene
que las hipótesis para este test son las siguientes:
H0: Datos células/ml se ajustan a una distribución normal.
H1: Datos células/ml no se ajustan a una distribución normal.
En el cual se rechaza H0: cuando P-value es inferior al umbral =0,02. A través de la
resolución del programa estadístico XLSTAT-2011 (Tabla IX) para los datos de la
Microalga Iso, se puede apreciar que p-value es del orden del 0,269 que es > al umbal
=0,02, por lo tanto cae en la zona de aceptación de H0, esto quiere decir que
estadísticamente la muestra analizada se considera que sigue una distribución normal.
37
Tabla IX . Resolución Prueba de Lilliefors, programa XLSTAT-2011
Microalga Iso
Para los datos de la Microalga Nanno (Tabla X), se puede apreciar que p-value es del
orden del 0,410 que es > al umbal =0,02, por lo tanto cae en la zona de aceptación de H0,
esto quiere decir que estadísticamente la muestra analizada se considera que sigue una
distribución normal.
Tabla X. Resolución Prueba de Lilliefors, programa XLSTAT-2011
Microalga Nanno
38
5.3 Resultados Aleatoriedad (Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis)
En la verificación de que la multiplicidad celular por el tipo de microalga se comporta
en forma aleatoria en cada una de la fases lumínicas, se obtienen los resultados para cada una
de las matrices en forma independiente, o sea tanto para el factor A Tipo de Microalga con a1
(Microalga Nannochlorys sp..), como para el factor a2 (Microalga Isochrysis.) y entre las
distintas fases lumínicas factor B (12 y 24 horas contínuas).
En la primera prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, se tiene las siguientes
hipótesis:
H0: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp..) y del tipo a2 (Microalga
Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo
24 horas contínuas), generan multiplicación celular iguales.
H1: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp..) y del tipo a2 (Microalga
Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo
24 horas contínuas), generan multiplicación celular distintas.
El resultado para la primera matriz (Tabla XI), muestra el Factor A tipos de microalgas
con sus respectivos niveles tipo a1,a2 (Iso. Y Nanno) analizado entre las distintas fases
lumínicas b1, b2 (12 y 24 horas contínuas), en el cual se calcula mediante el programa
XLSTAT-2011, si existe diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los dos tipos
de microalgas analizando los distintos grupos o muestras independientes K, generada por un
total (n = 16 datos definidos por el diseño de experimento).
Se acepta H0 y se rechaza H1, ya que el p-value bilateral 0,958 > alpha 0,05 dicho de
otra manera se rechaza H0 cuando el K (valor observado) es > a K (crítico) que en este caso no
se cumple ya que 0,003 < 3,841. Esto quiere decir que no existe diferencia significativa en la
multiplicidad celular entre las dos especies de microalgas analizadas (Nannochlorys sp.. y
Isochrysis).
39
Tabla XI. Resolución Prueba de Kruskal-Wallis, Factor A (Tipos de Microalga)
programa XLSTAT-2011
40
En la segunda prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, se tiene las siguientes
hipótesis:
H0: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas
contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo
a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular iguales.
H1: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas
contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp..) y del tipo
a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular distintas.
El resultado para la segunda matriz (Tabla XII), muestra el Factor B Fases lumínicas
con sus respectivos niveles b1, b2 (12 y 24 horas contínuas) analizado entre los distintos tipos
de microalgas a1, a2 (Iso. Y Nanno), en el cual se calcula mediante el programa XLSTAT-
2011, si existe diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los dos tipos de fases
lumínicas analizando los distintos grupos o muestras independientes K, generada por un total
(n = 16 datos definidos por el diseño de experimento).
Se rechaza H0 y se acepta H1, ya que el p-value bilateral 0,001 < alpha 0,05 dicho de
otra manera se acepta H0 cuando el K (valor observado) es > a K (crítico) que en este caso se
cumple ya que 10,615 > 3,841. Esto quiere decir que existe diferencia significativa en la
multiplicidad celular entre los dos distintos tipos de Fases Lumínicas (12 y 24 horas
contínuas).
Tabla XII. Resolución Prueba de Kruskal-Wallis, Factor B (Tipos de Fases Lumínicas)
programa XLSTAT-2011
Cabe destacar que el proceso aleatorio no sólo protege contra el sesgo sistemático,
sino que tiende a neutralizar los efectos de todos aquellos factores externos que no se
encuentran bajo el control del investigador (J.Araya, 2007), esto implica que las
condiciones bajo las cuales se desarrollo el experimento es observada la respuesta en este
caso la diferencia de multiplicidad entre las microalgas entre las distintas fases lumínicas,
son las mismas durante todo el experimento.
5.4 Resultados Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo &
(Prueba de Bartlett)
En la prueba de Bartlett (Tabla XIII) se rechaza la hipótesis nula (H0) cuando 20
(obs.) > 2α,b-1 (cri.) prueba unilateral a la derecha, con un nivel = 0,05 que en este caso da
que 0,495 < 3,841, por lo tanto se acepta la hipótesis nula Ho de igualdad de varianza para los
distintos grupos de datos analizados (K), esto quiere decir que el tipo de microalga Nanno a1,
no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los distintos tipos de
42
fases lumínicas (12 y 24 horas contínuas), ya que a 12 horas con fotoperiodo de las 21:00 PM
a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 95% del crecimiento, en comparación de tener
en cultivo 24 horas contínuas en la misma semana que solo crecería un 5% más.
Tabla XIII . Resolución Prueba de Bartlett, Microalga Nanno. (a1)
programa XLSTAT-2011
En la prueba de Bartlett (Tabla XIV) se rechaza la hipótesis nula (H0) cuando 20
(obs.) > 2α,b-1 (cri.) prueba unilateral a la derecha, con un nivel = 0,05 que en este caso da
que 1,019 < 3,841, por lo tanto se acepta la hipótesis nula Ho de igualdad de varianza para
los distintos grupos de datos analizados (K), esto quiere decir que el tipo de microalga Iso
a2, no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los distintos
tipos de fases lumínicas (12 y 24 horas contínuas), ya que a 12 horas con fotoperiodo de las
21:00 PM a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 96% del crecimiento, en
comparación de tener en cultivo 24 horas contínuas en la misma semana que solo crecería
un 4% más.
Tabla XIV . Resolución Prueba de Bartlett, Microalga Iso. (a2)
programa XLSTAT-2011
43
6 DISCUSIÓN
De acuerdo a la experiencia realizada a dos tipos de microalgas (Nannochlorys sp. y
Isochrysis galbana) con distintas fases luminosas no existe diferencia significativa en la
multiplicidad celular, no lo mismo pasa entre los dos distintos tipos de Fases Lumínicas (12 y
24 horas continuas) que si existe una diferencia.
44
La microalga Iso no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular entre
los distintos tipos de fases lumínicas (12 y 24 horas continuas), ya que a 12 horas con
fotoperiodo de las 21:00 PM a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 96% del
crecimiento, en comparación de tener en cultivo 24 horas continuas en la misma semana que
solo crecería un 4% más.
La microalga Nanno , no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular
entre los distintos tipos de fases lumínicas (12 y 24 horas continuas), ya que a 12 horas con
fotoperíodo de las 21:00 PM a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 95% del
crecimiento, en comparación de tener en cultivo 24 horas continuas en la misma semana que
solo crecería un 5% más.
7 CONCLUSIÓN
Se puede concluir que las microalgas pueden crecer con fotoperíodo sin incurrir en
gastos mayores energéticos para obtener máximos óptimos en lo que tiene que ver con la luz,
porque puede pasar que por otras cosas las microalgas puedan no crecer, por se le tiene que
brindas las condiciones adecuadas para su crecimiento como sus nutrientes apropiados, evitar
la contaminación de los cultivos y una agitación diaria predice un buen stock de microalgas.
45
8 BIBLIOGRAFÍA
Araya, J. 2007. Determinación del Tipo de Trampa y Tiempo de Reposo Diurno para la
Captura de Anguila Babosa (Eptatretus polytrema), en la Región de Valparaíso. Tesis de
Ingeniería Pesquera, Escuela de Ciencias del Mar (ECM), Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso (PUCV), 75 pp.
46
Derner, R. 1996. Cultivo de microalgas. Curso internacional de postlarvas de camarón
marino. Laboratorio de camarones marinos U.F.S.C, Florianópolis, Brasil.
Montgomery, D. 2002. Diseño y análisis de experimentos. Iberoamericana S.A. Washington,
589 pp.
Pérez, G. 2002. Estadística a través de Excel. Universidad Complutense de Madrid (UCM).
Univ. Complutense, Madrid, 314 pp.
Abalde, Cid, Fidalgo, Torres, Herr. 1996. Microalgas cultivo y aplicaciones
Páginas de Internet:
1 Cultivos de fitoplancton:
Nannochlorys sp.. y Chlorella sp.
Técnicas y equipos acuariófilos
http://www.aquanovel.com/cultivos_fitoplancton.htm
2 medios de cultivos:
https://www.ucursos.cl/faciqyf/2010/1/FCQF628/1/material_alumnos/previsualizar?
id_material=5258
3 Taxonomias de microalgas; http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=6987 ;
4 http://www.bashanfoundation.org/drora/droraoptimalgrowth.pdf ; Optimal Growth
Conditions for lsochrysis galbana Opt
5 http://blogs.mdp.utn.edu.ar/mpersico/files/2010/04/Manual-medios-cultivo.pdfimal
Growth Conditions for lsochrysis galbana
9 ANEXOS
TABLA DE DATOS 1
47
TABLA DE DATOS 2
48