SESIÓN DE APRENDIZAJE N°3 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS. Transformación de Saccharomyces...

SESIÓN DE APRENDIZAJE N°3

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS.•Transformación de Saccharomyces cerevisiae.

•Sistemas de vectores en levaduras

•Producción de proteínas

•Cantidad de proteína producida

•Uso de levaduras no convencionales (recombinación homóloga, sistemas inducibles)

•Perspectivas futuras.

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El explosivo desarrollo de la producción de aditivos alimentarios no tradicionales a nivel mundial en los últimos años, ha establecido un importante mercado internacional que alcanza un nivel de operaciones de orden de los miles de millones de dólares anualmente. Esta envergadura comercial es atribuible a diferentes factores entre los que se encuentran la factibilidad de procesamiento de los alimentos en el hogar o centros de consumo colectivo, la necesidad de aumentar la estabilidad de los alimentos en el almacén o en la vidriera de ventas, la satisfacción de necesidades de índole dietética como es el bajo contenido de colesterol entre otros, la disminución de los costos de producción y la suplementación de nutrientes en programas de alimentación masiva subsidiados para sectores de bajos ingresos etc.


• La biomasa microbiana, y en particular la de las levaduras, es una fuente de productos de interés alimentario conocida básicamente por su capacidad de generar CO2 en las industrias panadera y de bebida alcohólicas . Se ha utilizado de forma importante en la producción de extractos como saborizantes lo que compone su segundo uso mayoritario. Sin embargo, la biomasa de levadura es a un mismo tiempo, una fuente interesante de muchos compuestos de interés alimentario y farmacéutico. Entre los componentes de mayor atractivo se encuentran los polisacáridos y las proteínas, que constituyen entre ambos, más del 70% del peso seco de la célula.


Las proteínas como ingredientes alimentarios, han sido objeto de numerosas investigaciones, dadas sus propiedades funcionales, especialmente las derivadas de la soja que están ampliamente extendidas en la industria alimenticia actual.

Los contenidos de proteínas de las levaduras de recuperación de cerveza son superiores a 50% con un perfil de aminoácidos en éstas, comparable a la de la soja y otras fuentes de origen vegetal, es un recurso existente en la mayoría de los países de nuestra región.

Latinoamérica produjo en 1994, más de 12 mil millones de litros de cerveza de los que se derivan alrededor de 20 mil toneladas anuales de proteínas que actualmente se emplean en la producción de saborizantes y en la alimentación animal básicamente.

S. cerevisiae es uno de los modelos másadecuados para el estudio de problemasbiológicos. Es un sistema eucariota, conuna complejidad sólo ligeramente superiora la de la bacteria pero que comparte conella muchas de sus ventajas técnicas. Esutilizada para la elaboración de pan, cervezay vino. Además de su rápido crecimiento, ladispersión de las células y la facilidad conque se replican cultivos y aíslan mutantes,destaca por un sencillo y versátil sistemade transformación de ADN. Por otro lado,la ausencia de patogenicidad permite sumanipulación con las mínimas precauciones.


Saccharomyces cerevisiae

08/10/2012 Jéssica Bardales Valdivia

Ciclo sexual de Saccharomyces cerevisiae

Haploide Diploide

permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad

se pueden realizar estudios de complementación

Rutinariamente se han introducido

genes de eucariotas superiores en

levaduras para el análisis sistemático de

su función. Por estas razones, S.

cerevisiae se ha convertido en una

Importante herramienta a gran escala de

de genómica funcional, proporcionando

un punto de partida para el análisis de

organismos eucariotas más complejos. Al

ser un organismo unicelular con una tasa

de crecimiento rápida, la levadura se

puede utilizar para los estudios de

células que resultarían muy complicados

o costosos en organismos multicelulares.


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Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamentedos horas).

Las fuentes de carbono utilizadas por laslevaduras varían desde loscarbohidratos hasta los aminoácidos.Además, la capacidad de utilizar ciertostipos de azúcares ha sidotradicionalmente empleada para lacaracterización de las distintas razasque esta especie presenta.


Nutrición de S. cerevisiae


Utilidades industriales

producción de cerveza, pan y vino

gracias a su capacidad de

generar dióxidode carbono y

etanol durante el proceso de

fermentación.


Azúcares que se pueden utilizar para la fermentación:

Monosacáridos como la glucosa, fructosa, manosay galactosa, entre otros.

disacáridos como la

maltosa y la sacarosa

trisacáridos como la rafinosa

Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la lactosa, utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis

También es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a carbohidratos y aminoácidos. Entre las másdestacadas se encuentra la capacidad de utilizar tanto etanol como glicerol.

09/10/2012Jéssica Bardales Valdivia.

FERMENTACION ALCOHOLICA

Dos reacciones sucesivas:piruvato --------> acetaldehido + CO2acetaldehido + NADH +H+ -------> etanol + NAD+

09/10/2012 Jéssica Bardales Valdivia.

C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP → 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal


http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=Tc-cdKxitIw

http://biologiarespiracionfermentacion.blogspot.com/

http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=jv3RLmvB0-A

No obstante, la gran mayoría de los organismos son

muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido

como un proceso de competencia por sustrato. Las

levaduras, además de necesitar una fuente de

carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno

como podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos

de aminoácidos— como fuentes de fósforo. Además,

son necesarias vitaminas como la Biotina, también

llamada Vitamina H, y distintos elementos traza.traza.


• Genoma de S. cerevisiae

El genoma de esta levadura contiene un conjunto de

dieciséis cromosomas completamente caracterizados.

Sus tamaños oscilan desde 200 a 2.200 kb. Se calcula

que aproximadamente debe contener unos 6200 marcos

abiertos de lectura, o genes.

• Patogenia

Saccharomyces cerevisiae no se considera un patógeno

común. Actualmente cobra importancia su papel

oportunista en sepsis en enfermos de leucemia y otras

infecciones oportunistas en enfermos de sida.


VECTORES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS

HETERÓLOGAS EN S. cerevisiae.

El vector de expresión es uno de los aspectos que ha recibido una mayor atención en el campo de la expresión de proteínas heterólogas, existiendo en la actualidad un amplísimo número de vectores de diferentes características que permiten llevar a cabo la expresión de una proteína de la forma más adecuada en cada caso.

En el desarrollo de un vector de expresión son varios los factores a tener en cuenta para su diseño:

El tipo de promotor y de terminador Las modificaciones en el gen heterólogo y• Por último la estabilidad del vector en la célula.


• Sistemas de promotores.

Tras la descripción de los sistemas detransformación de S. Cerevisiae seiniciaron rápidamente los estudios sobrela expresión de genes heterólogos. Losprimeros intentos se realizaron empleandolos promotores de la proteína que setrataba de expresar; esto causaba fallos enla iniciación de la transcripción dando lugara moléculas de mRNA aberrantes.


Un ejemplo lo representa el primer intento de producciónde una proteína heteróloga, la β-globina de conejo. Trasesta observación se llegó a la conclusión acerca de lanecesidad de emplear promotores de levadura paradirigir la transcripción de los genes heterólogos. Siendoel primer ejemplo de proteína heteróloga producida deforma eficiente en S. cerevisiae, la producción de ainterferón bajo el promotor de la alcohol deshidrogenasa 1.

Los promotores para dirigir la expresión de proteínasheterólogas deben de ser unos promotores fuertes, es decirpertenecientes a genes de la levadura con un alto nivel deexpresión.


Las características de los promotores de levadura, así como

los factores que regulan la eficiencia y el inicio de la

transcripción son ampliamente descritos por Struhl (1989). En

un primer momento se centraron los esfuerzos en el

aislamiento de promotores de genes de la ruta glicolitica. Ya

que eran genes de un alto nivel de expresión; más adelante se

comprobó la necesidad de regular la expresión por lo que se

buscaron promotores de expresión regulable. Recientemente

se han desarrollado promotores híbridos que combinan varias

características de los anteriores.

• Promotores de la ruta glicolítica.• Promotores regulables.• Promotores híbridos.


Ejemplos de proteínas heterólogas de interés expresadas en S. cerevisiae.


Producción de biomasa celular (PRODUCCIÓN DE LEVADURA DE

PANIFICACION)

Existe la evidencia de que el pan era conocido alrededor del año 2600 a.C. en Babilonia, y ya en el siglo 12 a.C. era producido normalmente con una tecnología establecida. Lógicamente esto implica que el hombre dominaba ya el uso de la levadura para levar la masa preparada con harina y producir así el pan.

En las primeras épocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricación de cerveza primero y de las destilerías después, hasta que finalmente se establecieron las plantas de producción de levadura durante el siglo 19.


Inicialmente fue la levadura de cerveza, el Saccharomyces uvarum, syn S. carlsbergensis, el empleado con fines de panificación. Posteriormente se la reemplazó por la levadura de las destilerías, y por la llamada levadura de panificación, que es el Saccharomyces cerevisiae. Se han ensayado también muchas otras cepas, no sólo del mismo género sino también las pertenecientes a distintas especies de Candida, Hansenula y Zygosaccharomyces, aunque ninguna de ellas demostró poseer ventajas sobre el Saccharomyces cerevisiae.

Las propiedades fundamentales son aquellas relacionadas con la producción, que resultan en un crecimiento rápido y altos rendimientos a partir de las melazas con el mantenimiento de las propiedades de panificación exigidas, que son el poder fermentativo y la estabilidad del producto.


Estas propiedades dependen de muchos genes que intervienen en los ciclos de la glicolisis y de los ácidos tricarboxilicos, como así también en el metabolismo del nitrógeno y en la síntesis de hidratos de carbono de reserva.

Algunas cepas de interés industrial se han obtenido utilizando técnicas de hibridación. La obtención de híbridos para mejorar una cepa no es siempre exitosa, ya que los productos de fusión (híbridos) tienen que cumplir con todas las características exigidas por las levaduras comerciales.


Las técnicas de ingeniería genética han abierto una nueva área de interés industrial en el campo de las levaduras. Sin embargo, hasta el presente esas técnicas no han sido de utilidad en la industria de la levadura de panificación, porque los logros alcanzados incluyen solamente propiedades bioquímicas relacionadas con pocos genes. Las cepas de levadura que han sido desarrolladas en los últimos años, permiten la producción de productos de interés farmacológico como la insulina, hormona de crecimiento bovina, interferón, vacuna contra la hepatitis B, se han originado en cepas de laboratorio definidas genéticamente y no en cepas de levaduras industriales.


GRACIAS


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