Síntesis de oligosacáridos constituyentes de mucinas de T. cruzi (linaje 1). RESUMEN
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Trypanosoma cruzi es el parsito protozoario agente etiolgico de la enfermedad de
Chagas, que afecta a millones de personas en el mundo, siendo la vinchuca (Triatoma
infestans) el principal insecto vector de su transmisin en nuestro pas. El parsito se
caracteriza por utilizar un husped vertebrado y otro invertebrado para completar su
ciclo de vida, sufriendo transformaciones morfolgicas y bioqumicas durante las
diferentes estados.
Estudios biolgicos, genticos, bioqumicos e inmmunolgicos realizados sobre
cepas de diferentes orgenes, permitieron su clasificacin filogentica en dos linajes
principales: el linaje 1, que comprende las cepas con ciclo de vida salvaje, menos
infectivas, y el linaje 2, que agrupa a las cepas ms infectivas, asociadas al ciclo
domstico y, por lo tanto, a la enfermedad de Chagas.
Las glicoprotenas tipo mucina estn ancladas a la superficie de T. cruzi por medio
de glicosilfosfatidilinositol y sus cadenas O-glicosdicas se encuentran unidas a residuos
de Ser Thr de la protena a travs de -N-acetilglucosamina (-GlcNAc), en lugar de N-acetilgalactosamina (-GalNAc), como ocurre en mucinas de vertebrados. La funcin de estas glicoprotenas consiste en la adhesin y proteccin de la superficie celular del
parsito. Asimismo, son aceptoras de cido silico en la reaccin catalizada por la
enzima trans-sialidasa, tambin localizada en la superficie del parsito, que es decisiva
para la infeccin.
La estructura de la porcin glicosdica de las mucinas de T. cruzi depende en gran
medida del linaje y del estado en el que el parsito se encuentra. Se sabe que las
cadenas O-glicosdicas de mucinas de algunas de las cepas del linaje 1 contienen el
core -D-Galf-(1l4)-GlcNAc, que puede estar sustitudo con una varias unidades de Galf y/o Galp, mientras que las estructuras halladas en las cepas ms infectivas del
linaje 2, que provienen del core -D-Galp-(1l4)-GlcNAc, se encuentran sustitudas slo por galactosa piransica. La presencia de galactofuranosa, que no es biosintetizada
por mamferos, en la estructura del glicano sugiere que es posible una relacin entre
estas estructuras y los diferentes grados de infectividad mostrados por cepas de los
distintos linajes.
El objetivo principal de este trabajo de Tesis consisti en la sntesis de
oligosacridos de mucinas del linaje 1 de T. cruzi, que contienen -galactofuranosa en su estructura, dando continuidad a los estudios previamente iniciados en nuestro
laboratorio. Para ello se necesitaban desarrollar estrategias de sntesis que permitieran
la construccin de las estructuras ms complejas con el mejor rendimiento y
diastereoselectividad en la formacin de los enlaces glicosdicos, utilizando adems el
menor nmero de pasos. Esto implicaba contar con un mtodo suave de glicosidacin,
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que conservara intactas las uniones ms lbiles de galactofuranosa y la eleccin
cuidadosa de los grupos protectores, para minimizar la exposicin de los compuestos
intermedios a condiciones rigurosas.
Como primer objetivo, se encar la sntesis del tetrasacrido -D-Galp-(1l3)--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (III) que se describe en el Captulo 2, que haba sido aislado como el alditol correspondiente 40, por -eliminacin de las mucinas de las cepas G, Dm28c y Tulahuen del linaje 1. Teniendo como antecedente la sntesis del
trisacrido -D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (II), se dise una ruta convergente para obtener el tetrasacrido III, por condensacin del derivado de -D-Galf-(14)-D-GlcNAc 28 con su OH-6 libre, con el donor derivado de -D-Galp-(13)-D-Galp 37. El aceptor 2,3,5,6-tetra-O-benzol--D-galactofuranosil-(1l4)-2-acetamido-3-O-benzol-2-desoxi--D-glucopiransido (28) se construy a partir del bencil glicsido de GlcNAc 22, puesto que una vez finalizada la sntesis, conducira por reduccin cataltica
al tetrasacrido libre III que, por reduccin con NaBH4, dara el alditol 40
correspondiente. El compuesto 22 se protegi selectivamente en la posicin 6 primaria con t-butildifenilsilil ter y, posteriormente, fue selectivamente benzoilado en la posicin
3, utilizando N-benzoilimidazol. Una vez obtenido el aceptor de GlcNAc 24, se deba introducir la unidad de Galf en posicin 4, para lo cual se ensayaron dos mtodos de
glicosidacin. En primer lugar, la aplicacin del mtodo que emplea galactofuranosa
perbenzolada (11) como donor y SnCl4 como promotor, que ha sido ampliamente utilizado en nuestro laboratorio, condujo al disacrido 25 buscado, pero con rendimiento moderado. A continuacin, se aplic el mtodo de tricloroacetimidato, que utiliza
condiciones ms suaves durante el paso de glicosidacin. De esta manera, por empleo
del tricloroacetamidato de O-(2,3,5,6-tetra-O-benzol--D-galactofuranosilo) (27) y TMSOTf como catalizador, se obtuvo 25 con mejor rendimiento. La remocin del TBDPS- en 6 de 25 fue realizado con HF diludo en acetonitrilo, puesto que el medio dbilmente cido permiti la obtencin del aceptor 28 sin hidrolizar el enlace galactofuranosdico.
Para la sntesis del disacrido donor se utiliz el compuesto 2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-galactopiranosil-(1l3)-1,4,6-tri-O-acetil-2-O-pivalol--D-galactopiranosa (29p), que ya haba sido sintetizado en nuestro laboratorio a partir de 5,6-isopropilidn-2-O-pivaloil-D-
galactono-1,4-lactona (31), como precursora de la Galp del extremo reductor. El HO-anomrico de 29p se desacetil con un mtodo selectivo y luego se activ por transformacin en el tricloroacetimidato correspondiente 37. Una vez obtenidos el
aceptor de -D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc 28 y el donor de -D-Galp-(1l3)-D-Galp 37, se realiz la reaccin de glicosidacin en condiciones suaves, que dio el tetrasacrido 38
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diastereoselectivamente, con unin (1l6), por la presencia del grupo pivalolo asistente en C-2 del donor. El tratamiento de 38 con metxido de sodio en metanol y su
posterior hidrogenacin cataltica, condujo al tetrasacrido libre -D-Galp-(1l3)--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (III). La reduccin de III con NaBH4 dio el alditol correspondiente 40, cuyas seales espectroscpicas coincidieron con las descriptas
para el producto obtenido por -eliminacin reductiva de las mucinas de T. cruzi, confirmndose as, por sntesis qumica, esta estructura.
Continuando con la sntesis de oligosacridos constituyentes de mucinas de T.
cruzi, se sintetiz el pentasacrido -D-Galp-(1l2)-[-D-Galp-(1l3)]--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (IV), tambin presente en mucinas de las cepas G, Tulahuen y el clon Dm28c. Como se describe en el Captulo 3, para esta sntesis se utiliz una ruta
convergente que condensaba el aceptor derivado de -D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc 28, previamente empleado en la sntesis del tetrasacrido III, con un donor derivado de -D-Galp-(1l2)-[-D-Galp-(1l3)]-D-Galp 42, que era necesario construir. Para ello se consideraron dos caminos de sntesis y se demostr que la ruta sinttica clsica, que
parta del precursor piransico bencil 4,6-di-O-bencilidn--D-galactopiransido (51) para la sntesis del donor 42, dio mejores rendimientos y present menor complejidad en las etapas de purificacin, comparada con la sntesis que parta de 5,6-O-isopropilidn-D-
galactono-1,4-lactona, que haba sido evaluada en primer lugar y que previamente haba
dado muy buen resultado en la construccin de 29p, como sintn para el tetrasacrido
III.
La glicosidacin del tricloroacetimidato de O-(4,6-di-O-acetil-2,3-di-O-(2,3,4,6-tetra-
O-acetil--D-galactopiranosil)--D-galactopiranosilo) (42) obtenido con el aceptor 28 consisti en el paso clave de esta sntesis, pues el donor careca de grupo asistente en
C-2 que favoreciera la formacin del -glicsido. Luego de un primer ensayo empleando CH2Cl2 como solvente, en el que se obtuvo mayoritariamente el glicsido (1l6), la glicosidacin se realiz en acetonitrilo, por sus conocidas propiedades como solvente
participante. Se obtuvo as, de manera diastereoselectiva y como nico producto, el
pentasacrido 57 con enlace (1l6). La desacilacin de 57 condujo al bencil -D-galactopiranosil-(1l2)-[-D-galactopiranosil-(1l3)]--D-galactopiranosil-(1l6)-[-D-galacto-furanosil-(1l4)]-2-acetamido-2-desoxi--D-glucopiransido (58), que ms adelante sera estudiado como aceptor en la reaccin de trans-sialidacin enzimtica.
En particular, el minucioso anlisis de los espectros de RMN mono y bidimensionales
permiti la asignacin de las seales de los H-3 de las Galp terminales de 58, que sera decisivo para determinar el sitio de sialilacin en dicha reaccin. Por hidrogenlisis de
58, se obtuvo el pentasacrido libre IV, objeto de sntesis, que a continuacin se redujo
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con NaBH4 dando el alditol correspondiente 59, cuyas seales en los espectros de RMN 1H y 13C, resultaron coincidentes con las del alditol obtenido de fuente natural.
En el Captulo 4 de esta Tesis se describe la sntesis del hexasacrido -D-Galp-(1l2)-[-D-Galp-(1l3)]--D-Galp-(1l6)-[-D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (VIII), presente en cepas G, Dmc28 y Tulahuen del linaje 1, como as tambin la de dos
trisacridos de estructuras parecidas, -D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VI) y -D-Galf-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VII), que ms recientemente se haban encontrado en mucinas de la cepa Tulahuen. Dado que la estructura del trisacrido VI
se encuentra contenida en la del hexasacrido VIII, se pens en una ruta convergente
que involucrara algn precursor comn a ambos oligosacridos. La ruta que se dise
para la sntesis de VIII consideraba al tricloroacetimidato donor 42 y a un trisacrido
aceptor con el HO-6 libre, derivado de -D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc 60, de manera similar a la estrategia utilizada para el pentasacrido IV.
El desafo principal de esta etapa consisti en la sntesis del aceptor 60 de difcil construccin, pues la estructura contena una Galf interna unida a la posicin 4 menos
reactiva de la GlcNAc. Para ello se utilizaron el derivado de D-galactono-1,4-lactona con
el HO-2 libre 69, como precursor de la Galf interna, el donor 33 para la Galp terminal del extremo no reductor y el aceptor derivado de GlcNAc 24, con el HO-4 libre, ya utilizado
en la sntesis del tetrasacrido III. As, por empleo del mtodo de la aldonolactona se
obtuvo el tricloroacetimimidato derivado de -D-Galp-(1l2)-D-Galf 61, listo para condensarse con el aceptor 24. Este paso era interesante, pues consista en la
construccin del enlace (1l4) a partir de un donor furansico que careca de grupo asistente en C-2 y se encontraba sustitudo por una -Galp en dicha posicin. Puesto que no se encuentra descripto el uso de solventes participantes con donores furansicos
sin asistencia anquimrica, se procedi a estudiar la glicosidacin de 61 con el aceptor 24 en diferentes solventes y condiciones, para obtener diastereoselectivamente el
trisacrido con unin . Dicha reaccin se ensay primeramente en CH2Cl2, como solvente no participante de baja polaridad, y luego en acetonitrilo y ter etlico para
analizar el efecto de estos solventes participantes. Este estudio permiti sintetizar el
compuesto bencil 2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-galactopiranosil-(1l2)-3,5,6-tri-O-benzol--D-galactofuranosil-(1l4)-2-acetamido-3-O-benzol-6-O-tert-butildifenilsilil-2-desoxi--D-glucopiransido (78) con buena diastereoselectividad, empleando acetonitrilo como solvente de reaccin. La desproteccin selectiva del TBDPS- en -6 de 78, permiti obtener el compuesto 60, clave para ambas sntesis. Una parte del producto se
desprotegi totalmente, siguiendo la metodologa descripta para los oligosacridos III y
IV, dando el trisacrido VI buscado, mientras que otra parte se glicosid con el donor 42
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en acetonitrilo para generar diastereoselectivamente el hexasacrido con enlace
(1l6). Las posteriores reacciones de desproteccin por los mtodos habituales condujeron al hexasacrido libre VIII, objeto de sntesis. Los azcares libres VIII y VI
se redujeron en el extremo reductor para dar los respectivos alditoles, 84 y 81, cuyas caractersticas espectroscpicas se compararon con las descriptas y coincidieron con
ellas.
Como se mencion anteriormente, junto con -D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VI) se haba aislado otro trisacrido de estructura -D-Galf-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VII). La semejanza entre ambas estructuras determin que se sintetizara VII a travs de una estrategia similar a la utilizada para el trisacrido VI, en
la que se reemplaz el donor de Galp por un donor de Galf. Nuevamente se realiz un
estudio de glicosidacin en CH2Cl2, acetonitrilo y ter etlico como solventes, para
analizar sus efectos en el curso de la glicosidacin hacia el enlace Galf-(1l4). En estos ensayos se comprob que el uso de solventes participantes no mejor la
diastereoselectividad ni el rendimiento obtenido inicialmente al emplear CH2Cl2. El
trisacrido alditol 90, derivado de esta ltima sntesis mostr propiedades espectroscpicas coincidentes con las descriptas para el alditol natural.
Los oligosacridos y sus respectivos alditoles, sintetizados en nuestro laboratorio
podran resultar de utilidad para la identificacin de cepas de Trypanosoma cruzi.
Para completar los objetivos de este trabajo de Tesis, se estudi la trans-sialidacin
del bencil pentasacrido 58, como modelo del pentasacrido IV que es la estructura
mayoritaria en las mucinas de la cepa G, que presenta dos unidades de -D-Galp terminales para ser sialiladas por la enzima TcTS. En el Captulo 5 se describe en
primer lugar la sntesis de bencil 2,3-di-O--D-galactopiranosil--D-galactopiransido (91), cuya estructura se encuentra contenida en el pentasacrido IV y en el
hexasacrido VIII, para ser utilizado como modelo ms simple en la determinacin del
sitio preferido de sialilacin. La reaccin de trans-sialidacin de 91 se realiz a escala preparativa y el producto aislado se analiz por espectroscopa de masa y de RMN
mono y bidimensional. De esta manera, la determinacin del sitio de sialilacin se
simplific, concluyndose que se incorporaba una nica molcula se cido silico en la
unidad terminal de Galp-(1l3), menos impedida estricamente y ms expuesta. Por su parte, la trans-sialidacin preparativa sobre el bencil glicsido 58 tambin
produjo un nico producto de sililacin S-58, que fue aislado y su estructura determinada por metodos espectroscpicos. As, por espectroscopa de masas se determin que se
encontraba monosialilado y por medio de un minucioso anlisis de los correspondientes
espectros de RMN mono y bidimensionales (COSY, HETCOR, TOCSY y NOESY) se
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pudo concluir que el sitio preferido de sialilacin result ser la unidad terminal de Galp
unida en (1l3) a la Galp interna, tal como haba sido demostrado para el bencil trisacrido 91, empleado como modelo.
La sntesis de 2,3 di-O-(-D-galactopiranosil)-D-galactitol (92) y el posterior anlisis de la selectividad de la enzima en un ensayo preparativo con dicho compuesto,
demostr que la estructura abierta en zig-zag del D-galactitol dejara a ambas Galp
accesibles, siendo reconocidas casi de igual manera por la TcTS.
En conclusin en este trabajo se present:
- Un panorama de las funciones, estructuras y diversidad de las glicoprotenas tipo
mucina en Trypanosoma cruzi y su relacin con la enzima trans-sialidasa.
- La descripcin detallada de la sntesis de cinco oligosacridos de estructura
novedosa y sus correspondientes alditoles, que permiti corroborar las estructuras
descriptas para los oligosacridos aislados de fuente natural.
- La determinacin del sitio de sialilacin en un derivado del pentasacrido IV y en
dos trisacridos modelo ms pequeos, por la enzima TcTS recombinante.
Parte de este trabajo dio lugar a las siguientes publicaciones:
1. Synthesis of -D-Galp-(1l3)--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc, a tetrasaccharide component of mucins of Trypanosoma cruzi.
Carola Gallo-Rodriguez, M. Agustina Gil Libarona, Vernica M. Mendoza, Rosa M.
de Lederkremer
Tetrahedron, 2002, 58, 9373-9380.
2. Synthesis of 2,3-di-O-(-D-Galp)-D-Galp, a synthon for the mucin oligosaccharides of Trypanosoma cruzi.
Vernica M. Mendoza, Carola Gallo-Rodriguez and Rosa M. de Lederkremer
Arkivoc 2003, X, 82-94. (Commemorative Issue in Honor of Prof. Roberto A. Rossi on his 60th Anniversary and Prof. Edmundo A. Rveda on his 70th Anniversary).
3. Selective sialylation of 2,3-di-O-(-D-galactopyranosyl)-D-galactose catalyzed by Trypanosoma cruzi trans-sialidase.
Rosala Agusti, Vernica M. Mendoza, Carola Gallo-Rodrguez and Rosa M. de
Lederkremer. Ambos autores contribuyeron de igual forma a este trabajo. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 541-552.
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4. Synthesis of the pentasaccharide, O-linked in glycoproteins of Trypanosoma
cruzi, and selective sialylation by recombinant trans-sialidase.
Vernica M. Mendoza, Rosala Agusti, Carola Gallo-Rodrguez and Rosa M. de
Lederkremer.
Carbohydrate Research 2006, 341, 14881497.
5. Comparative rates of sialylation by recombinant trans-sialidase and inhibitor
properties of synthetic oligosaccharides from Trypanosoma cruzi mucins-
containing galactofuranose and galactopyranose.
Rosala Agusti, M. Eugenia Giorgi, Vernica M. Mendoza, Carola Gallo-
Rodriguez and Rosa M. de Lederkremer.
Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007, 15, 26112616.
FG