TECNICA DE FISH

Hibridacin

''in situ''

fluorescente. Gutirrez, Cenia. Gonzales Herrera, Angela. Meja Caldern, Rossario.

Lainez Aguirre, Juan Jos

Es una tcnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la

secuencia de los cidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia

de secuencias gnicas especficas. Se puede aplicar sobre ncleos interfsicos

de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas

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TECNICA

FISH.

Qu es? FISH o hibridacin fluorescente in situ es una tcnica

citogentica de marcaje de cromosomas mediante

la cual estos son hibridados con sondas que emiten

fluorescencia y permiten la visualizacin, distincin y

estudio de los cromosomas as como de las

anomalas que puedan presentar. Esta tcnica

permite la rpida determinacin de aneuploidas,

microdeleciones, duplicaciones, inversiones, as

como la adjudicacin de un marcador gentico a

un cromosoma (cartografa gentica).

La tcnica FISH puede realizarse a los cromosomas

en metafase o en interfase.

Los cromosomas que son usualmente analizados por

FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los ms

propensos a sufrir anomalas. Estn relacionados a

enfermedades como:

el sndrome de Patau (13)

el sndrome de Edwards (18)

el sndrome de Down (21),

el sndrome de Turner (X)

el sndrome del superhombre (Y), etc.

Tipos de sondas de FISH.

1. Sondas especficas de un locus: hibridan a

una regin particular de un gen. Esta

sonda es til cuando se ha aislado una

pequea parte de un gen y se quiere

averiguar en qu cromosoma se

encuentra.

2. Sondas alfoides o centromricas: son

sondas que contienen secuencias

complementarias de las secuencias

OBJETIVOS Puede

identificar un

rango de

mutaciones

La hibridacin

con mltiples

sondas permiten

la deteccin de

productos de

translocacin.

CONCLUSIONES

No puede

detectar

pequeas

mutaciones.

Las sondas no

estas

comercialmnt

e disponibles

para todas las

regiones

cromosmicas.

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repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas.

Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma

puede ser marcado de manera distinta, con lo que se puede averiguar

si un individuo tiene el nmero correcto de cromosomas o si tiene un

cromosoma extra

3. Sondas de pintado cromosmico: son colecciones de sondas de un

tamao reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia

diferente a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas libreras de

sondas, se puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo

espectral. De esta manera, se consiguen imgenes en color que

permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta. Esta tcnica

es particularmente til para examinar anormalidades cromosmicas

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PASOS En primer lugar, la muestra de DNA (cromosomas metafsicos o ncleos en

interfase) se DESNATURALIZA, proceso que separa las hebras

complementarias de la estructura en doble hlice del DNA. A la muestra

desnaturalizada se le aade entonces la sonda de inters, marcada con un

fluorforo, que se asociar al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso

denominado HIBRIDACIN, donde se vuelve a formar una doble hlice. La

seal emitida por la sonda se observa mediante un microscopio de

fluorescencia y as la muestra de DNA se puede clasificar segn la presencia o

ausencia de la seal.

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FISH en metafase Cuando las clulas estn en metafase, sus

cromosomas se encuentran condensados para

la divisin celular. Para detenerlas en metafase,

se emplea COLCHICINA, un agente

despolimerizante de los microtbulos

encargado de separar las cromtidas

hermanas de un cromosoma, impidiendo el

avance de la divisin celular. Este tipo de FISH

se utiliza para detectar microdeleciones

especficas, translocaciones o para identificar

material extra de origen desconocido.

La sensibilidad de estos ensayos es en todos los

casos mejor que la de la citogentica de rutina,

pero depende del sndrome en concreto. Como Sndrome de Williams, donde

el 96% de los pacientes con diagnstico confirmado poseen una delecin en

el gen de la elastina.

Sndrome del maullido (cri-du-chat)

Sndrome de Kallman

Sndrome de Miller-Dieker

Sndrome de Williams

Sndrome de Smith-Magenis

Sndrome de Wolf-Hirschhorn

Deficiencia de esteroide-sulfatasa

Sndrome de Prader-Willi/Angelman

Sndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen

FISH de interfase El FISH en interfase tiene la ventaja de que no

es necesario cultivar previamente las clulas

durante diversos das antes de poder analizar

sus cromosomas. Adems, cuando las clulas

se encuentran en interfase, la cromatina est

en torno a 10 000 veces ms descondensada

que en metafase, lo cual permite una mayor

resolucin a la hora de detectar anomalas

pequeas (24 horas)

Se emplea sobre todo para la deteccin de

aneuploidias o grandes deleciones,

duplicaciones en clulas fetales o tumorales.

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Un buen ejemplo es el ENSAYO DE ANEUPLOIDA, que se realiza sobre clulas

del fluido amnitico cuando hay una fuerte indicacin clnica de una de las

trisomas ms comunes. Se desnaturalizan los ncleos de la muestra, se hibridan

con sondas especficas para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y en 24 horas se

dispone de los resultados. La prueba de aneuploida suele incluir tambin una

citogentica de rutina para confirmar los resultados o detectar cualquier

anomala no detectada por la FISH de interfase.

APLICACIONES EN LA MEDICINA 1. Esta tcnica ha resultado ser muy til en el campo de la medicina

reproductiva, con aplicacin en el diagnstico gentico

preimplantatorio (DGP). forma muy precoz de diagnstico que,

apoyndose en las tcnicas de reproduccin asistida, posibilita el

estudio de embriones antes de ser transferidos al tero materno y, por

consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantacin embrionaria.

2. Anomalas numricas.

Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo

en pacientes implica que, en muchos casos, slo se den defectos leves

en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva con

problemas de fertilidad. Tales son los casos de sndrome de Klinefelter,

trisoma X y monosoma X.

Edad materna avanzada, aborto de repeticin de causa desconocida

y/o fallo de implantacin: Ms de la mitad de los casos son debidos a

alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos,

la seleccin de aquellos embriones normales para los cromosomas

citados, aumenta las probabilidades de conseguir una gestacin a

trmino.

Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar

las alteraciones cromosmicas surgidas en la descendencia de aquellos

grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir

a la tcnica de microinyeccin intracitoplasmtica del espermatozoide

(ICSI).