tecnicas cromatograficas.

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica

Qumica Analtica Instrumental II

Tcnicas Cromatogrficas

Diciembre de 2007

Introduccin a los mtodos de separacin

Captulo 1 1

Captulo 1.


1.1 Introduccin a la cromatografa

En 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de lo

que hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte

superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ que la

mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la columna a

diferentes velocidades.

Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera

que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo

largo de l (fase mvil). La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que se

mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En el

experimento de Tswett, la separacin de los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno de

ellos tena una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes ms afines a la fase

estacionaria avanzan lentamente (ms retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menos

retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o

papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla,

logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica.

Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos

cromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil:

Cromatografa lquida. La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un

slido que interacta con las sustancias que se desea separar (cromatografa lquido-slido), o bien un

lquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquido-

lquido). Esta forma de cromatografa puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en

columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un

tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor

uniforme; en la cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interior

de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquido-

lquido.


Captulo 1 2

Cromatografa de gases. En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la fase

estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido sostenido por un slido inerte

(cromatografa gas-lquido). Este tipo de cromatografa siempre es en columna, ya que es la nica

manera de que la fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna

puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografa lquida, o bien la fase

estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de dimetro) y largo

(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor

capacidad de separacin. De acuerdo con el mecanismo de retencin, la cromatografa se puede

clasificar en los siguientes tipos:

adsorcin (normal, de fase reversa)

particin lquido-lquido

intercambio inico

permeacin sobre gel

de afinidad

Las reas de aplicacin son muy diversas y abarcan prcticamente todas las actividades en las que

interviene la qumica, por ejemplo: se emplea en:

El anlisis de drogas y frmacos en fluidos biolgicos como la saliva, la sangre, la orina;

Seguir la transformacin de las sustancias responsables de la transmisin neurolgica;

Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente;

Descifrar la composicin de los combustibles fsiles;

Realizar el control de calidad de los productos qumicos y farmacuticos manufacturados; en fin, la lista

de ejemplos es interminable.

1.2 Cromatografa en papel

La cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis

cualitativos ya que pese a no ser una tcnica potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La

fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en

un extremo colocando pequeas gotas de la disolucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente

empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. La separacin se realiza en funcin de la

afinidad de los solutos con las dos fases, las ms solubles en agua se quedarn cerca del punto donde se

aplic la muestra, y las menos solubles en agua y ms solubles en el disolvente llegarn ms lejos. Las

sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos fsicos o qumicos


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La cromatografa en papel es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico cualitativo, permite llevar

a cabo la separacin e identificacin de iones, trabajando con cantidades mnimas de sustancia.

Pertenece al tipo de Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancias problema,

pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno

permanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvil

constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos

de cromatografa, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de

separacin de zonas y sectores.

Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas

manchas caractersticas sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una

lmpara fluorescente, los contornos se marcan con lpiz. Como medida en cromatografa sobre papel se

emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia

por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por

la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S).

=

[1]

En la cromatografa en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de

elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la que

ir disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los componentes

que se pretenden separar.

1.3 Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un

adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para


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aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso

tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un

componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que

los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.

Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo

aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas

La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos

cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El

tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es

generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el

cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea

un mtodo adecuado para fines analticos.

Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del

adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin se

le puede aadir un adherente.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio.

Pureza.

No utilizar mezclas de eluyentes

(reproducibilidad).

No utilizar compuestos muy voltiles.

Evitar que contengan trazas de metales

(catalizadores).

La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y

probar con eluyentes cada vez menos polares.


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Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con

los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo

con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas.

Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los

componentes orgnicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el

tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.

1.4 Cromatografa de permeacin en gel

La cromatografa de permeacin en gel, tambin conocida como cromatografa de exclusin es

una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatogrfica empacada de tal manera que las

partculas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaos de poros o de redes de poros con el fin de

que las molculas de soluto sean retenidas o excluidas basndose en su forma y tamao y no en el peso

molecular.

Bajo este entendido, las molculas de mayor tamao no caben dentro de los poros y son

arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de cama

de vaco de la fase mvil. Por el contrario, las partculas de menor tamao eluyen hasta el final porque

tiene ms espacio de columna que recorrer debido a un fenmeno de difusin haca los poros que tienen

accesibles. Las molculas de tamaos intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la

cantidad de poros por los que puedan pasar.

Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos estn

los polmeros macromoleculares semirgidos, los entrecruzados, las slices rgidas las de poro

controlado. Los materiales semirgidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso

ya que se limitan a una presin de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen

un tamao usual de 5m, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son

compatibles con sistemas no acosos.


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Otro tipo de empacamiento hidroflico poroso es preparado mediante una polimerizacin por

suspensin de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten

presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes

orgnicos polares.

Disolventes. La cromatografa de exclusin requiere un solo disolvente durante el anlisis en el cual se

pueda disolver la muestra. El nico inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la

relacin de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad

de la fase mvil se pueden dar, una distorsin en los picos cromatogrficos y cambios anmalos en los

tiempos de retencin.

1.5 Cromatografa de exclusin de iones

Una variante de la cromatografa de permeacin en gel o cromatografa de exclusin, es cuando

se realiza para la exclusin de iones. Mediante esta modificacin, se tienen separaciones que dependen

de factores como tamao de partcula de la resina, forma inica e incluso distribucin de ismeros. Esto

permite separar especies que de otra forma eluiran al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a cabo

en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, cidos minerales

diluidos.

Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de

muestras fisiolgicas en donde la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, puede ser

hecho fcilmente mediante el uso de una columna de exclusin aninica. El uso de las columnas de

exclusin aninica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separacin de oligosacridos

usando agua como eluyente a una temperatura de 90C, aplicando tambin la separacin por exclusin

estrica.

1.6 Cromatografa de intercambio inico

La cromatografa de intercambio inico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene

grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales enlazados

permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retencin ms

comn es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase mvil con el grupo cargado de la

fase estacionaria.

En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catinicas.

Los ms comunes son los sulfnicos, los cuales son fuertemente cidos y tiene las propiedades de los


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cidos fuertes cuando est en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el

intercambio con especies aninicas. Los ms comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son

fuertemente bsicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos

funcionales estn totalmente disociados. As, sus propiedades de intercambio son independientes del pH

de la fase mvil.

La cromatografa de intercambio inico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de

empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor,

sobre una cuenta de vidrio con dimetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen

recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de slice en el que se impregna o

enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja:

0.01- 0.1 meq/g.

El intercambiador puede tambin estar enlazado a macropartculas de slice por medio de reacciones de

sililacin o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso.

El proceso primario en la cromatografa de intercambio inico involucra la adsorcin/desorcin de

materiales inicos cargados en la fase mvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (de

signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solucin

que contiene iones K+, existe un equilibrio:

resina, H + K+ resina, K+ + H+

Las diferencias de retencin estn gobernadas esencialmente por las propiedades fsicas de los iones

solvatados. La fase de resina presenta preferencia por:

1. El ion de carga mayor.

2. El ion con menor radio solvatado.

3. El ion que tenga mayor polarizabilidad.

Aplicaciones de intercambio catinico:

Los cationes inorgnicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietticos bajos

en sodio, y en muestras de orina.

Aplicaciones de intercambio aninico:

Se pueden separar los cidos HCN, carbnico, silcico y brico de los cidos fosfrico, sulfrico y

clorhdrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.


Captulo 1 8

1.7 Cromatografa de fluidos supercrticos

La temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir

en la fase lquida independientemente de la presin. La presin crtica es la presin de vapor de una

sustancia a su temperatura crtica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su

temperatura y de su presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico.

Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre

las caractersticas de esa sustancia en estado gaseoso y en estado lquido.

Comparacin de las propiedades de los fluidos supercrticos con las de gases y lquidos. (Los datos slo

indican el grado de magnitud).

GAS FLUIDO SUPERCRTICO LQUIDO

Densidad (g/cm3) (0,6-2)*10

-3 0,2- 0,5 0,6- 2

Coeficiente de difusin (cm2/s) (1-4) * 10

-1 10

-3 10-4 (0,2 2)* 10-5

Viscosidad (g cm-1 s-

1) (1-3)* 10

-4 (1-3) * 10

-4 (0,2- 3)* 10

-2

Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografa de gases,

lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de fluidos supercrticos. Una propiedad importante

de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su

notable capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de carbono

supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 tomos de carbono. Una segunda

propiedad notable de los fluidos supercrticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser

fcilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la

atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercrticos es que son

baratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la

atmsfera sin efectos ambientales dainos.

La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una modalidad hbrida entre la cromatografa

de gases y de lquidos que combina algunas caractersticas de cada una de ellas. Esta tcnica es una de

los tres tipos importantes de cromatografa en columna, sta permite la separacin y determinacin de

compuestos que no son manipulados ni por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos

no voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es inaplicable y (2) los


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compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las tcnicas espectroscpicas o

electroqumicas empleadas en cromatografa de lquidos.

Los equipos instrumentales para la cromatografa de fluidos supercrticos son bastante parecidos

en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos

diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y

adems proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase mvil; (2) un restrictor o un

dispositivo de contrapresin, que se utiliza para mantener la presin en la columna en el nivel deseado y

para convertir el eluyente, de fluido supercrtico en un gas, y arrastrarlo al detector.

Las variaciones de presin en cromatografa de fluidos supercrticos tienen un efecto muy

marcado sobre el factor retencin o de capacidad, k. Este efecto es una consecuencia del incremento de

la densidad de la fase mvil a medida que aumenta la presin. Tal incremento de la densidad origina un

aumento de la capacidad disolvente de la fase mvil, lo cual acorta los tiempos de elucin. La mayora de

los perfiles de presin utilizados en cromatografa de fluidos supercrticos son: presin constante

(isobrica) para un perodo de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asinttico de la presin hasta

alcanzar el valor de la presin final.

Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque

las primeras son las ms empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de slice fundida

con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas

tienen una longitud de 10 a 20 m y un dimetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la pelcula vara

entre 0.05 1 micrmetro.

Fases mviles. La fase mvil ms utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de

molculas orgnicas no polares. Adems, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no

txica, fcilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases mviles cromatogrficas.

La temperatura crtica del CO2 ES 31 C y su presin crtica 72,9 atmsferas, lo cual permite jugar con una

banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operacin de un equipo de

HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, xido nitroso, diclorodifluorometano, ter dietlico,

amonaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases mviles de cromatografa de fluidos

supercrticos.

Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la

cromatografa de gases, detectores de ionizacin de llama. Este detector es de respuesta universal a

compuestos orgnicos, de elevada sensibilidad. Los espectrmetros de masas tambin se pueden


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adaptar como detectores ms fcilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de

absorcin en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisin de fluorescencia, termoinico y fotomtrico de

llama.

La cromatografa de fluidos supercrticos se ha aplicado a la separacin de un amplio conjunto de

sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, frmacos, alimentos, pesticidas y herbicidas,

tensoactivos, polmeros, aditivos de polmeros, combustibles fsiles y explosivos y propelentes.

1.8 Cromatografa de afinidad

La cromatografa de afinidad separa las protenas (analitos) en funcin de su especificidad de

fijacin de ligandos. Los ligandos de afinidad son molculas polimricas que sirven de soporte porque

estn unidas covalentemente sobre la columna cromatogrfica o matriz inerte que debe de tener una

estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes

disociantes, para as, retener y adsorber especficamente a las protenas, la fase estacionaria es slida.

Estos ligandos se clasifican segn su naturaleza qumica o su selectividad para la retencin de analitos,

esta ltima se clasifica en ligandos especficos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las

protenas no especficas se han lavado a travs de la columna, se eluye la protena ligada con solucin

que contiene ligando libre. Despus se introduce una nueva fase mvil que se desactiva, generalmente

por el acoplamiento o alteracin de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible,

se necesita un cambio en el pH, la fuerza inica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican

las caractersticas de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la protena para

continuar con la regeneracin de la columna cromatogrfica.

La cromatografa de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retencin de

protenas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presin, columnas cortas y un campo

restringido para la separacin.

Esquema de cromatografa de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de protenas

que se aaden a la columna, la cual contiene un ligando especfico ligado al polmero, para la protena de

inters. En el segundo matraz se encuentra una solucin de ligando, el cual se aade a una probeta para

que eluya a la protena de inters. La bureta de en medio indica que las protenas deseadas se lavan a

travs de la columna.

Los puntos rojos representan la protena de inters, los negros, el ligando y las bolas beige

unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polmero.


Captulo 1 11

1.9 Cromatografa de lquidos de alta resolucin

La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente

utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas,

es ideal para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y por su gran aplicabilidad a sustancias

que son de inters en la industria. Algunos ejemplos son: aminocidos, protenas, cidos nucleicos,

hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies

organometlicas y gran variedad de sustancias inorgnicas. La fase mvil es un lquido y la fase

estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.

1.10 Electroforesis

Los orgenes de sta tcnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logr separar

mezclas de protenas (micelas cargadas elctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso

al que se aplicaba un campo elctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separacin de cualquier

especie cargada o alrededor de una doble capa elctrica.

El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de

especies cargadas. Por aplicacin de un campo elctrico entre los extremos del soporte poroso las

especies se separan en funcin de sus cargas y su movilidad inica en ese medio. Cuanto ms elevado

sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separacin; sin embargo valores altos de

estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporacin del disolvente y

acumulacin de sales del tampn, lo cual es indeseable.

Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que

son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente

escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han

utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar-agar, gel de slice, etc.


Captulo 1 12

Electroforesis capilar

La seccin transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drstica al realizar

la electroforesis en el interior de un tubo capilar de dimetro interno menor a 0.1mm y una longitud de

50cm a 1m. Es efectivo llevar de sta forma la tcnica porque la resistencia elctrica de la disolucin es

tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes ms altos sin

calentamiento excesivo. La tcnica tiene gran poder de resolucin y se han desarrollado mtodos para

llevar a cabo la electroforesis incluso en molculas neutras no inicas.

Adems, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual

modo que en una cromatografa en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de

muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y despus de la separacin, cada uno de los

analitos est en volmenes inferiores al nanolitro. Con volmenes de lquido tan pequeos, muy pocos

mtodos de deteccin se pueden usar eficazmente.

1.11 Bibliografa

Braithwaite, A. Mtodos cromatogrficos, 4 ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Pginas 216-217, 271-272.

Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jess Hernndez Mndez, Qumica Analtica Cualitativa, Ed. Thompson, Espaa, 2003 pp 321-322.

Garrido, A., Fundamentos de qumica biolgica. Interamericana Mc Graw-Hill. Espaa. 1991.

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Lehninger, Albert. L. Principios de Bioqumica. Segunda Edicin. Ediciones Omega. Barcelona, 1995, pp 137

Fig. 1. Diagrama de las partes bsicas de un

instrumento de electroforesis capilar con deteccin

espectroscpica.

La muestra penetra por la parte de la izquierda

introduciendo el final del capilar en la disolucin de

la muestra y cargndolo, bien hidrodinmicamente,

bien electrocinticamente. Toda la unidad de la

ilustracin funciona a temperatura constante. El

capilar est enrollado alrededor de un soporte.

Durante el anlisis los niveles de las dos disoluciones

tampn deben ser iguales como se indica con la

lnea punteada) para evitar el flujo de masa debido a

una diferencia de presin.


Captulo 1 13

McCABE / SMITH /HARRIOTT. Operaciones Unitarias en Ingeniera Qumica 1991. Cuarta Edicin en Espaol. Editorial McGraw Hill S.A. Espaa

PERRY, ROBERT H. Manual del Ingeniero Qumico 1992. Sexta Edicin. Tercera Edicin en Espaol. Editorial McGraw Hill. Mxico

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http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina

http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel

http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml

Parmetros cromatogrficos

Captulo 2 14

Captulo 2


2.1 Glosario

Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un

separador de banda.

Banda: Es una situacin ideal, es una distribucin gausiana. La cantidad de compuesto que sale de

cromatografico o de una columna electrofortica.

Coeficiente de difusin: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s.

Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribucin de un soluto entre dos fases,

para definir el coeficiente de particin solo se utiliza una forma de un soluto (kD).

Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un mtodo para un interferente dado en

comparacin con su sensibilidad para el analito (KA,I).

Cola: prolongacin final de un pico cromatogrfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy

activos en la fase estacionaria.

Constante de disociacin: constante de equilibrio de una reaccin en la que un complejo metal- ligando

se disocia para formar un in metlico libre y un ligando (kD).

Constante de equilibrio: K Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor

numrico de K depende de la fuerza inica del medio.

Cromatografa: separacin en la que los solutos se distribuyen entre fase mvil y estacionaria.

Cromatografa gaseosa: tcnica cromatogrfico en la que la fase mvil es un gas.

Cromatograma: registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin o del volumen.

Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatogrfico, se suele

expresar en trminos de la altura H, de los platos o del nmero N de platos tericos. En la medida en que

la distribucin del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos est dada por la varianza

dividida entre la longitud de la columna del empacado.


Captulo 2 15

Ensanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza

desde el punto de inyeccin al detector.

Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k).

Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad

de la columna para uno de ellos ().

Factor de separacin: medida de la eficacia de una separacin en lo que se refiere a la separacin entre

el analito y el interferente.

Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posicin fija.

Fase mvil: fase extractarte que se desplaza a travs del sistema.

Nmero de platos tericos: caracterstica de una columna cromatogrfica que se emplea para medir su

eficiencia.

Plato terico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una

columna, como si estuviera compuesta de pequeas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto

entre las fases mvil y estacionaria

Relacin de distribucin: cociente que expresa la concentracin total de soluto en una fase en relacin

con una segunda fase; en su definicin participan todas las zonas del soluto (D).

Resolucin: separacin entre dos bandas cromatogrficas (R).

Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un mtodo que se mide ante el cociente de

selectividad del mismo.

Tiempo de retencin: es el tiempo entre la inyeccin en una columna cromatogrfica y la llegada a un

pico de analito al detector.

Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a travs de la columna.


Captulo 2 16

Un parmetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso,

una operacin o un resultado. La parametrizacin de datos en cromatografa, como en otros mtodos

facilita la tabulacin y la comunicacin de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posicin y la

resolucin de las bandas de una cromatografa. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con

descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separacin.

2.2 Constantes de Distribucin

Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un

fenmeno de distribucin, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases.

De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La

constante asociada es la llamada constante de distribucin, que se define para un soluto A como:

= 1 2

donde [A]1 y [A]2 son la concentracin de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, en

cromatografa la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase mvil y el soluto A es el analito de

inters. Esta constante es especfica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fase

mvil.

2.3 Factores de influencia en la retencin

La retencin que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia

de polaridades entre las fases estacionaria y la mvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas

segn su coeficiente de distribucin. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con

polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribucin distintos, la retencin ser diferente para

cada uno.

En la cromatografa de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo de

retencin del pico de aire. En la cromatografa de lquidos, cualquier compuesto no retenido puede

usarse como muestra para medir el to.

El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retencin

ajustado o corregido, tR.

t'R = tR to


Captulo 2 17

Una medida conveniente y til de la retencin del soluto est dada por el factor de capacidad (o

factor de retencin), k

=0

FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retencin diferentes, as como el tiempo muerto.

Los valores de k no tienen un significado simple en un gradiente de elucin o en temperatura

programada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de k

pueden ser determinados a partir del tiempo de retencin, tR.

En los modos de retencin de cromatografa se tiene: k > 0, que significa que no hay bandas

eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es til expresar el tiempo de retencin o el volumen en

trminos del factor de capacidad, k.

tR = to (1+ k)

VR = Vm (1 + k)

La retencin del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan

afectar a la misma. El fenmeno de adsorcin depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea sta

se fomentar la desorcin, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del anlisis.

2.4 Retencin y Equilibrio en Cromatografa

El soluto se encuentra en un equilibrio de distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y

dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retencin del mismo. Una separacin

cromatogrfica tpica se muestra en la figura 2. La separacin est fuertemente afectada por la

proximidad de bandas adyacentes en el cromatograma.


Captulo 2 18

Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separacin, , donde

dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2:

= k2 / k1

El factor de separacin, , es usualmente identificado con la selectividad del sistema

cromatogrfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retencin para dos

compuestos especficos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significara que no hay

separacin, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retencin muy largos se

traducen en tiempo desperdiciado durante la operacin experimental. Los valores de depende de los

dos solutos y de

1) La composicin qumica de la fase estacionaria.

2) La composicin qumica de la fase mvil (excepto en cromatografa de gases).

3) La temperatura.

En cromatografa de fluidos supercrticos, la presin tambin puede afectar a al cambiar la densidad de

la fase mvil.

FIG. 2. Separacin de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografa de lquidos.

2.5 Eficiencia de separacin de una columna

Las columnas cromatogrficas consisten en un nmero de zonas adyacentes en cada una de las

cuales hay suficiente espacio para que un analito est en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas

zonas se conoce con el nombre de plato terico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una

columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El


Captulo 2 19

valor numrico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La

altura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de

la columna, X:

=2

X

donde es un estndar de desviacin de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simtricos la

anchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tanto

el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.

El nmero de platos tericos en la columna entera viene dado por:

=

=

2

donde L es la longitud de la columna.

Si consideramos la posicin del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ,

obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms pendiente del pico, es igual a 4, la

ecuacin anterior se convierte en

=16 2

W2

Si en lugar de medir L y en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuacin quedar:

= 16 2

La medicin del ancho del pico es ms confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico,

con lo cual se puede utilizar

= 5.545 1/2

2

Tambin puede hacerse en funcin de la altura y rea del pico

= 2

2

Es importante que tanto , W W1/2

se expresen en las mismas unidades ya

que N es adimensional.


Captulo 2 20

Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelcula delgados y

columnas de poco dimetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la

fase mvil tambin afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad ptima para obtener el

mximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de ste para no perder demasiado

tiempo en anlisis.

2.6 Procesos de ensanchamiento de banda

El nmero de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de la

banda cromatogrfica. Cuando inyectamos un pequeo volumen de analito en una columna forma una

banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchura

de pico aumenta con la raz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Segn la ecuacin de Van

Deemter

= +

+

A representa el trmino de caminos mltiples. Esto es porque las molculas no siguen

nicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la fase

estacionaria y afecta segn el tamao y forma de la partcula.

B representa la difusin axial, la cual depende de la movilidad de las molculas en las fases. El

soluto se difunde desde la zona central que es la ms concentrada hacia las regiones ms diluidas. En

esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el trmino

A. Para encontrar la velocidad ptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en funcin

de v.

Por ltimo, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario ste trmino porque en

realidad los fenmenos que ocurren estn fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase

mvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las molculas de

analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la

transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.

2.7 Resolucin

La separacin relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolucin, Rs. La resolucin se define

como


Captulo 2 21

=2 1

12(1 + 2)

Aqu, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retencin (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2

son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separacin de dos bandas adyacentes como una

funcin de sus valores de Rs y su tamao relativo. Se observa que la separacin mejora sistemticamente

a mayores valores de Rs, y la separacin es generalmente mejor para dos bandas de igual tamao (y el

mismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirn normalmente para la separacin de las

bandas desiguales.

Fig 3. Separacin de dos bandas como una funcin de la resolucin (Rs) y el tamao relativo de banda.

La resolucin depende de la retencin y selectividad de manera proporcional. A mayor

selectividad y retencin k, mayor resolucin. Para tener una buena separacin se recomienda utilizar k

> 2, y generalmente se trabaja con 1.

Para el anlisis cuantitativo es deseable (pero no siempre prctico) alcanzar la resolucin de al

menos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separacin a la lnea base de bandas de tamao similar.

La separacin de la lnea base hace que los sistemas de datos midan el tamao de cada banda

apropiadamente y esto significa una cuantificacin fiable.

Una resolucin pobre puede deberse a que el mtodo utilizado no es apropiado, pues no

discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporcin a la columna cromatogrfica.


Captulo 2 22

2.8 Cuantificacin en cromatografa

Para llevar a cabo un anlisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables,

tanto para la construccin de la curva de calibracin como para el tratamiento del analito mismo.

Primero es necesario llevar a cabo un anlisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones

ptimas. Para evaluar esto, se calculan los parmetros cromatogrficos de cada ensayo que sirven como

referencia. De sta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones

posibles, acercndose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo ms exactos que sta tcnica

nos permite.

Si no se obtiene una buena resolucin, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de

muestre, sino puede probarse utilizando una fase mvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra

fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo,

y analizar la naturaleza qumica de las distintas fases as como solutos, para probar con otra fase sea

estacionaria o mvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operacin mejor, y que una vez

encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse.

Para realizar la curva de calibracin puede usarse el mtodo de estndar externo o interno,

siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operacin.

2.9 Resumen

La cromatografa es una tcnica de separacin que se basa en la diferencia de distribucin que

existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y mvil. As, cada soluto tendr un

tiempo de retencin distinto y podrn analizarse por separado.

Los parmetros cromatogrficos son claves para el diseo de un anlisis, pues son herramientas

que ayudan a evaluar las condiciones en las que se est llevando a cabo.

Cada soluto tendr asociado un tiempo de retencin distinto que se puede expresar como el

factor de capacidad, y la relacin de los tiempos de retencin o factores de capacidad de los solutos nos

indicar si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolucin se podr evaluar si la separacin

entre los tiempos de retencin se los solutos es suficiente o excesiva. El clculo de los platos tericos nos

indicar la eficiencia del sistema.

Una vez evaluados los parmetros cromatogrficos, se podr determinar si el cromatograma

obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condicin para optimizarlo.


Captulo 2 23

2.10 Bibliografa

Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related

differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edicin, EUA, 1992, pp. 2-14

Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Qumica UNAM,

Mxico 2002

http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia

http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-

14/skoog/26d.html

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Captulo 3 Pgina 24

Captulo 3


3.1 Procedimientos de empaquetamiento

En cromatografa de fase lquida, la fase mvil es un lquido y ste desciende a travs de la

columna. La fase estacionaria es frecuentemente un lquido que recubre el interior de un tubo capilar o

la superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas

partculas slidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el

reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.

Fig 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad

que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.

Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena

con partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de las

columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil.

Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase

estacionaria cubriendo las paredes interiores.

En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran rea superficial,

inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varan,

entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas de

intercambio inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de someterse a un

tratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es caracterstico que


Captulo 3 Pgina 25

el tamao de las partculas y de los poros deben ser lo ms uniforme posible. El procedimiento del

empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos:

1. Colocacin de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y

compacta en la columna (longitud y dimetro apropiados).

2. Verificacin de ausencia de espacios vacos en la columna (para evitar que los picos del

cromatograma sean ms anchos y de menor eficiencia.

2.2 Aplicacin de la muestra

Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicacin de

la disolucin de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, sta se

queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el

desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco

y, empujado por la disolucin que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el

disolvente utilizado para la elusin es el mismo que la disolucin problema, los platos tericos

comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase mvil en equilibrio con ellos y las

concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona slo es aparente en sus extremos

por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene ms espesor de un plato

terico.

2.3 Procedimientos de elucin

La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es

prcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como el

desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.

Para el caso especfico de cromatografa de adsorcin, existe una ordenacin de los disolventes de

acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie

eluotrpica. La fuerza eluyente es una medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto valor

cero para el sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente

respecto a la slice en cromatografa de adsorcin.

Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la

columna.


Captulo 3 Pgina 26

La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal,

que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms

polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se

caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un

disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografa de fase inversa elimina las colas

de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn soluto

originando colas. La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a impurezas polares (como

el agua), que pueda haber en el eluyente.

2.4 Elucin isocrtica y gradiente

La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un

disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una

elucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,

produciendo un gradiente contino.

Fig 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activos

de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.

2.5 Cromatografa de absorcin y de particin de columna

Estas son dos tcnicas de anlisis cromatogrfico, la diferencia entre ellas es que la retencin del analito

en la columna depende de la naturaleza de su interaccin con la fase estacionaria.

En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito,

con la fase estacionaria, en la de absorcin, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de

particin de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.


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2.6 Cromatografa de adsorcin

La absorcin es un fenmeno de superficie, por lo tanto fsico, en el cual diversas sustancias son

atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie

interfacial, formndose una pelcula del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea

slido o lquido, aunque este proceso implica una interaccin de diferentes fuerzas, sean estas fsicas o

qumicas, por ello se habla de fisisorcin, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es

solo fsica, y quimisorcin, cuando la retencin implica enlaces con el adsorbente. As pues, en la

cromatografa de adsorcin, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si

es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el

analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los dems componentes se eliminen.

Durante la separacin, se filtra una solucin a travs de una columna de adsorbente, que es la

fase mvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria slida, formando una cama de

partculas que se dividen de modo que el rea de absorcin sea mxima, o sea, se distribuyen a lo largo

del slido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorcin.

El equilibrio entre la fase estacionaria y mvil permite la separacin del analito. Si vemos la

ilustracin de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la

fase slida, los huecos en ella son los sitios de absorcin, donde el analito interacciona con la fase

estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque

generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de

magnesio.


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Aplicaciones. Esta es una de las tcnicas cromatogrficas mas antiguas, su uso depende del

tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza qumica, en particular se usa para la

separacin de compuestos isomricos, especies no polares, hidrocarburos alifticos, y para compuestos

con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrgeno fuertes, por ello es utilizada para

separar azcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas as como oligosacridos, y tambin

se ha usado para obtener protenas biliares.

2.7 Cromatografa de particin de columna

Esta tcnica se basa en la retencin del analito en una columna slida como granos de fibra o

cualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente

afn al analito; y una fase mvil liquida o gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, el

equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al

final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase

mvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay una

capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,

donde este se disuelve.

Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llama

particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entre

las dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la

matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el

analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa


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de solvente adherida a la matriz slida, y como vemos tambin, el analito se distribuye entre la capa de

solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta

sobre una columna, por ello se le llaman particin de columna.

La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de particin, KD:

=

Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene

diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezcla

se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la

columna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil.

Aplicaciones. Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidos

inmiscibles.

2.8 Cromatografa en gel.

La separacin basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga

durante una migracin osmtica a travs de geles. La filtracin en gel es el mtodo de separacin que

consiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas.

En la cromatografa en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimrica cuyos poros se

llenan con el solvente que se usar en la fase mvil.

El flujo de la fase mvil provocar que molculas mayores pasen a travs de la columna

libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo en

salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen

de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.


Captulo 3 Pgina 30

El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del lquido afuera de la matriz de gel

(V0, volumen de la fase mvil que eludir a una molcula completamente excluida ), el volumen del

lquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).

El volumen de elusin (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: ide VKVV 0

Kd es el coeficiente de distribucin volumtrica: ied VVVK /)( 0

Kd caracteriza el comportamiento de retencin del soluto. Representa la fraccin del volumen del gel

que es accesible a la molcula en cuestin. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una

serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:

En un rango pequeo de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una lnea recta:

MBAKd log

La separacin por cromatografa en gel est influenciada por las propiedades de los poros de la

red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material

para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polmeros

entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente

suave. Los aerogeles son slidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el

vidrio y silica porosos. El nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel


Captulo 3 Pgina 31

Aplicaciones. Desalinizacin: Largas molculas de origen biolgico son separadas de especies

ionizables o inorgnicas. Un ejemplo en la separacin de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex.

La cromatografa en gel se utiliza para separar protenas, pptidos, cidos nuclicos,

polisacridos, enzimas, hormonas y los qumicos en polmeros, para determinar distribuciones de pesos

moleculares en mezclas de polmeros.

2.9 Cromatografa de intercambio inico.

El intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone en contacto

con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies

inicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solucin y

un slido esencialmente insoluble en contacto con la solucin.

Las resinas cambiadoras de iones estn constituidas por una red tridimensional de cadenas

polmeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase

insoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se

mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condicin de

que se mantenga la electroneutralidad. Una resina tpica se prepara por polimerizacin de estireno y

divinilbenceno.

Cambiadores catinicos. Los grupos funcionales cidos se pueden introducir fcilmente, tienen el

protn disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones

positivos.

Cambiadores aninicos. Si se introducen grupos funcionales bsicos, la resina intercambia aniones. Los

cambiadores aninicos se preparan con aminas, obtenindose in grupo amonio, y por tanto, un medio

bsico.

Las propiedades ms importantes que determinan el funcionamiento de una resina:

o Tamao de las partculas velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna.

o Naturaleza de los grupos funcionales tipo de los iones intercambiables.

o Fuerza de los grupos funcionales coeficiente de distribucin.

o Nmero de grupos funcionales capacidad de la resina.


Captulo 3 Pgina 32

A partir de la sustitucin de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienen

equilibrios de intercambio. Se aplica la ley de accin de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es la

constante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribucin KD:

][

][

H

HRKKD

Efecto del pH del eluyente. La carga elctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir

por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relacin de distribucin o evitar un

intercambio total. El efecto del pH sobre la elusin:

Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metlicos dando iones complejos

de carga negativa. En esta forma, los cationes metlicos que se separen mal en cambiadores catinicos,

se pueden complejar y separar en cambiadores aninicos.

Aplicaciones. Eliminacin de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasndola a

travs de un cambiador de cationes, y despus a travs de un cambiador de aniones.

Separacin de aminocidos. La naturaleza anftera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o

eliminar la carga neta, de modo que un cido determinado se puede intercambiar en una resina

aninica, en una resina catinica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solucin.

2.10 Cromatografa covalente

Es un sistema especial de cromatografa, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se

forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolcula a separar, las

separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular; por lo cual es

muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo inconveniente de que al ser tan selectiva, solo

se puede separar un solo analito.


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2.11 Conformacin de la cromatografa covalente

a) Ligandos: Se trata de biomolculas que se encuentran en una base slida, siendo estas las

responsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2

maneras: Ligandos especficos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y

los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las

lectinas y nucletidos.

b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe

poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carcter suficientemente

hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas, estabilidad mecnica,

en especial para trabajar a alta presin, estos soportes generalmente geles orgnicos derivados de los

polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.

2.12 Fundamento de la cromatografa de afinidad

Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la

columna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado

covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo existe interaccin especfica entre este

ligando y un soluto-analito (protena) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a la

elusin de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que no influye en el

acoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase mvil que desactiva el acoplamiento por

alteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos;

generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos de esta

manera se eluye el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la

columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase mvil siendo una etapa

rpida.


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2.13 Cromatografa Flash

Es un mtodo cromatogrfico, el cual nos permite separar de una manera rpida, fiable y econmica;

principalmente utilizada para la separacin y purificacin de protenas.

La Cromatografa Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la

separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez.

El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuracin de las columnas (variables por el

usuario), una bomba peristltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiacin

ultravioleta para detectar las biomolculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de

elusin, las vlvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyeccin de la muestra, la seleccin

de la columna o corriente de inversin, y un controlador con una funcin de integracin

computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el anlisis.

Aplicaciones. En farmacia la cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) se utiliza para la

depuracin de grandes cantidades de diferentes biomolculas (es decir, las protenas y el ADN).

2.14 Resumen

Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con

partculas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho

con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de

dos sencillos pasos: a) colocacin de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)

Verificacin de compactacin (no espacios vacos).

El desplazamiento de la muestra a travs de la columna, depende de la afinidad por sta y del disolvente

empleado para el proceso.


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La elucin es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos

de elusiones: Elusin por gradiente (cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de

aumento de fuerza eluyente) y elusin isocrtica (un solo disolvente).

Cromatografa de adsorcin: esta tcnica aprovecha el fenmeno de la absorcin de sustancias en una

superficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un material

adsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a travs de su superficie.

Cromatografa de particin de columna: sta tcnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una

columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente qumicamente similar al analito, en el que este

queda disuelto y retenido cuando pasa la fase mvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases,

en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna.

Cromatografa en gel: consiste en la filtracin en gel que consiste en la separacin de molculas basado

en el tamao relativo de las mismas. El flujo de la fase mvil del sistema provocar que molculas

mayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas

ms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el mismo.

Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.

Cromatografa de intercambio inico: el intercambio inico es un proceso donde una solucin de un

electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son

remplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitios

inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su

alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga.

Cromatografa covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la

biologa molecular; por lo cual es muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo

inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separacin de

anticuerpos y enzimas.

Cromatografa Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la

separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una tcnica muy utilizada en el rea de

bioqumica ya que nos permite separar biomolculas y protenas.


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2.15 Bibliografa

BERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma

edicin, Madrid 1991.

HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001.

SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Qumica Analtica - 7 ed - McGraw Hill Mxico, 2001.

ROUESSAC - Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Anlisis Qumico - McGraw Hill USA, 2003.

SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosntesis and Functions - Addison-Wesley - New

York, 1975.

PECSOK, Robert Mtodos Modernos de Anlisis Qumico Editorial Limusa Mxico, 1981.

BRAITHWAITE, SMITH Chromatografic Methods 4 edicin - Chapman & Hall UK, 1994.

http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm

http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf

http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf

http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm

www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/

www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes

www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes

www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm

Cromatografa de gases

Captulo 4 37

Captulo 4


Esta tcnica permite el anlisis rpido y exacto de gases, vapores lquidos; permite identificar los

componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado

notablemente en separacin, identificacin y determinacin de compuestos voltiles (gases y lquidos)

de puntos de ebullicin de hasta 350-400C. El mtodo tiene las ventajas de ser sensible, rpido y

sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra informacin cuantitativa exacta con cantidades

muy pequeas de muestra.

En cromatografa de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna

cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de un fase mvil de un gas inerte a diferencia de los

otros tipo de cromatografa, la fase mvil no interaccionan con la molculas del analito; su nica funcin

es la de transportar el analito a travs de la columna.Existen dos tipos de cromatografa de gases:la

cromatografa Gas-Slido (GCS) y la cromatografa gas liquido (GLC).La cromatografa gas liquido tiene

gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como

cromatografa de gases (GC).

En la cromatografa gas slido se produce la retencin de los analitos de una fase estacionaria

como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas slido ha tenido una aplicacin limitada

debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de

elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de absorcin),

de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas

especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas lquido se basa en la distribucin del

analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquido inmovilizada sobre la superficie de un slido

inerte.

4.1 Instrumentacin

Los componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de gases se muestran a

continuacin, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposicin se utiliza

cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la

presencia de las molculas de analito.


Captulo 4 38

Gas portador. Entre los gases portadores deben ser qumicamente inertes, se encuentran el helio, nitrgeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de

presin, manmetros y medidores de caudal. Adems el sistema de gas portador contiene a menudo un

tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente

mediante un regulador de presin de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algn tipo de

regulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo.

Sistema de inyeccin de muestra. La eficacia de la columna requiere que la muestra

sea de un tamao adecuado y que sea introducida como un de vapor, la inyeccin lenta de la

muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolucin .El

mtodo mas comn de inyeccin de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una

muestra liquida o gaseosa a travs de un diafragma o de goma de silicona en una cmara de

vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna (la cmara demuestra normalmente esta

unos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.

Configuracin de la columna y del horno para la columna. En cromatografa de

gases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la

mayor parte de las cromatografa de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la

actualidad esta situacin est cambiando rpidamente y parece probable que en un futuro prximo,


Captulo 4 39

excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas

abiertas ms eficaces y rpidas. Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 hasta 50m de

longitud o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln.

La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de

regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de

temperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullicin de la

muestra y del grado de separacin requerida.

Sistemas de deteccin. El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientes

caractersticas.

1.- adecuada sensibilidad

2.- buena estabilidad y reproducibilidad

3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud

4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos

400C

5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal

6.-alta fiabilidad y manejo sencillo

7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente

predecible para uno o ms tipos de soluto

8.-no destructivo de la muestra.

Resolucin (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolucin de la columna y

que se denomina resolucin de la columna y se define:

=2 2 1

1 +2

Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuacin queda:

=2 2 1

Para los picos que estn prximos entre s Wb1 y Wb2 sern lo suficientemente parecidos como

para que baste medir slo uno.


Captulo 4 40

Como lo muestra la figura, la resolucin 1.5 nos da una separacin prcticamente completa de

los solutos, mientras que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una resolucin de 1, la zona X contiene

casi 4% de Y y viceversa, a una resolucin de 1.5 la superposicin es de aproximadamente 0.3%. Para el

mismo tipo de empaque, la resolucin puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto

aumentando el nmero de platos tericos.

Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares o

semicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separacin cromatogrfica

Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y tefln; con un

dimetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia est en torno a 1.000-2.000

(platos tericos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, mximo 10 componentes. La

columna est rellena de un material slido (soporte), finamente dividido y homogneo; recubierto, por

una capa de 0,05-1 m de espesor, de fase estacionaria lquida. Est configurada en forma helicoidal, con

un dimetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado

Fase estacionaria. Eleccin de la fase estacionaria de una columna cromatogrfica ha de reunir

una serie de requisitos como:

Baja volatilidad, su punto de ebullicin debe de ser por lo menos 100o

C superior a la

temperatura mxima de operacin de la columna.

Estabilidad trmica.


Captulo 4 41

Inercia qumica.

Los valores del factor de capacidad (k) y del factor de selectividad () de los analitos deben estar

dentro de los intervalos aconsejados.

La separacin en cromatografa gas-lquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto del

analito entre la fase mvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los

compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una caracterstica muy importante de la fase estacionaria

es la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen

ms en las fases lquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones.

Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las

compuestas por polister son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separacin, los

alcoholes, cidos y aminas son polares; los steres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y

son de baja polaridad los hidrocarburos saturados.

Otro factor a tener en cuenta son los lmites de temperatura que puede soportar la fase

estacionaria, el lmite inferior ser el punto de fusin o temperatura a la que la viscosidad de la fase

lquida es muy elevada, lo que hara disminuir la eficacia. El lmite superior es la temperatura a la que la

presin de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250o

C inferior al punto de ebullicin) por encima de esta

temperatura se produce arrastre de la fase lquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,

suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna.

En una fase lquida cualquiera, una serie homloga se eluye segn orden creciente de nmero de

tomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen segn orden creciente de punto

de ebullicin. En una fase polar se retendrn ms los solutos polares que los no polares a igualdad de

puntos de ebullicin.

Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte slido empleado en las

columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase

lquida en forma de pelcula muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase

mvil y fase estacionaria.

Las caractersticas de los soportes slidos son, una elevada superficie especfica (1m2

/g); una

superficie homognea; estabilidad trmica; geometra adecuada; baja dispersin de tamao de las

partculas, entre 150-250 m; dureza mecnica; inercia qumica y naturaleza porosa.


Captulo 4 42

Los soporte, ms generalizados, son los de silceo como las tierras de diatomeas o sintticos; de

vidrio y de polifluorocarbonados (tefln). Los soportes de diatomeas estn constituidos por residuos de

algas unicelulares diatomceas que se unen formando filamentos.

Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen

una superficie especfica de 1 m2

/g. El constituyente mayoritario es de anhdrido silcico SiO2

(90%),

tratado con un fundente alcalino a 1.600o

C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb

W de superficie poco adsorbente por lo que es muy til para separar compuestos polares.

Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,

tiene mayor resistencia mecnica y superficie especfica que el anterior, pero es muy activo y no se

puede utilizar con compuestos polares.

Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de slice fundida, en las

columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado

picos cromatogrficos distorsionados.

Se ha demostrado que este fenmeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la

superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las molculas orgnicas

polares. Este proceso puede desactivarse por sililacin con dimetilclorosilano , Cl2Si(CH

3)

2, que elimina el

H del silanol formando ClH.

Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: WCOT, de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto.

Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto

con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte

interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de

relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a

las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores

cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en

primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno.

Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares

abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin


Captulo 4 43

apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo

proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede

enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de

2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con dimetros de

10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja

reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas.

Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m y 150-200 m para

columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms

sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asim

tecnicas cromatograficas.

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