UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

CLASE 1: TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LACELULA

Blga. ROSA MARIA LIÑAN ABANTO

MICROSCOPIA

Técnica que permite

producir imágenes de

objetos y detalles

demasiados pequeños

para ser percibidos por la

vista.

Permite conocer como

es la forma, tamaño y

estructura de la célula Puede ser M. óptica y M.

electrónica.

EVOLUCION DE LA MICROSCOPIA

MICROSCOPIA OPTICA:

Se basa en el uso de lentes ópticos y un haz luminoso

para generar imágenes amplificadas de un objeto.

Utiliza como herramienta al microscopio de luz

LA LUZ

EL MICROSCOPIO OPTICO

Es un instrumento que sirve paraaumentar el tamaño de un objeto através de un sistema de lentes.

Utiliza como fuente de energía(radiación) a la luz.

Tiene como función además de generaruna imagen magnificada (amplificada)del objeto y apreciar detalles del mismo,es decir que debe tener resolución.

Amplificación:

Genera una imagen de mayor tamaño que

el objeto real,

Se determina mediante el producto del

número de aumentos del objetivo por los

del ocular.

Poder de resolución

Capacidad de distinguir, separar detallespequeños.

Limite de resolución

menor distancia que puede haber entre

dos puntos para ser distinguidos como

dos entidades independientes.

El límite de resolución de una lente

puede calcularse utilizando la ecuación

de Abbé:

Medidas utilizadas en biología celular

mm = milésima parte de un metro (10-3 m)

µm = milésima parte de un mm ( 10-3 mm)

nm = milésima parte de un µm ( 10-6 mm)

A° = 0.1 nm ( 10-7 mm)

TIPOS DE MICROSCOPIA DE LUZ

M. de campo claro:

En este tipo de microscopía la imagen es obtenida por

simple transmisión de la luz a través del preparado.

La luz debe atravesar la muestra, esta puede ser un

aplastado, un dispersado o un corte muy delgado del

espécimen.

Si las muestras no poseen contraste, el mismo se genera

mediante la tinción del espécimen, utilizando colorantes

que poseen afinidad por distintos elementos celulares.

M. de campo oscuro

Es un microscopio óptico ordinario cuyo sistema

condensador ha sido modificado para dirigir la luza la preparación.

Se basa en que los rayos de luz que alcanzan al objetoson tan oblicuos con relación al eje óptico que nollegan a pasar directamente por el objetivo.

Se utiliza para determinar movilidad en cultivos

M. de contraste de fases

Se basa en los distintos índices de refracción para la luz

de los distintos componentes celulares.

Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el

transcurso de ciertos procesos biológicos ya que permite

la observación de células vivas y no es necesario fijar yteñir la muestra para generar contraste.

COLORACIONES CITOLOGICAS

Tinción hematoxilina / eosina es la tinción de rutina más común,

utiliza colorante básico (hematoxilina) y un colorante ácido (eosina). Las

sustancias de naturaleza ácida (como los ácidos nucleicos) tienen

afinidad por los colorantes básicos como la hematoxilina. Por el

contrario, las sustancias de naturaleza básica (la mayor parte del

citoplasma) tienen afinidad por la eosina. Fig A

Tinción con la técnica de PAS (Ácido peryódico schiff) : para

demostración de glúcidos. Por ejemplo para observar glicocálix y

mucina. Fig. C

Método de Feulgen: para demostración de DNA. Fig. D

Técnica del rojo grasa Sudan : para demostrar lípidos en células.

Fig. E

CITOMETRÍA DE FLUJO:

Esta técnica permite la medida simultánea de

múltiples características físicas de una célula.

Estas medidas son realizadas mientras las células

pasan en fila a una velocidad de 4 000 – 5 000

células / seg. a través del aparato de medida en

una corriente de fluido.

Ventajas su alta sensibilidad y análisisindependiente a cada célula.

Desventajas no se puede visualizar a las células

que se analizan, no proporciona información de la

localización celular en tejido.

DIFRACCION DE RAYOS X

Consiste en hacer atravesar un haz fino de rayos X sobre

el material que se analiza y colocar detrás una placa

fotográfica que recoge el espectrograma

Se basa en que las radiaciones se difractan al encontrar

pequeños obstáculos .

Ventajas:

• proporciona mayor resolución que las técnicas mas

perfeccionadas de microscopia electrónica.

• Usa muestras gruesas y sin tratar por el elevado poder de

penetración de los rayos X.

Desventajas:

• Solo se utiliza cuando el material observado posee estructuras

periódicas (cadenas de ADN)

• Estructuras cristalizadas

AUTORRADIOGRAFIA

Esta técnica se basa en la sensibilidad de las emulsionesfotográficas a las radiaciones ionizantes

Aplicaciones: estudio del ciclo celular

Si, por ejemplo, se quiere saber qué células de un tejido estánsintetizando DNA como un paso previo a la división celular, sesuministra timidina tritiada (3H) al tejido durante algún tiempo.Durante ese período, en todo el DNA sintetizado por las células deese tejido se incorporará la timidina marcada radiactivamente.

Al tomar muestras del tejido (p. ej., cortes histológicos), si lalámina que contiene el corte se recubre de una emulsiónfotográfica, en ésta quedará una impresión producida por lasradiaciones emitidas por la timidina tritiada, que activan loscristales de bromuro de plata de la emulsión. Al revelarfotográficamente esta emulsión, aparecerán gránulos negros deplata sobre los núcleos que han que han sintetizado DNA duranteel período de administración de la timidina radioactiva

Marcaje radiactivo con timidina tritiada de un cultivo de

células . Las células que se encontraban replicando el DNA

durante la administración de la timidina radiactiva aparecen

marcadas con gránulos negros. X900. (Cortesía de M.P. de

Miguel)

CITOMETRÍA DE FLUJO:

Esta técnica permite la medida simultánea de

múltiples características físicas de una célula.

Estas medidas son realizadas mientras las células

pasan en fila a una velocidad de 4 000 – 5 000

células / seg. a través del clitómetro en una

corriente de fluido.

Ventajas su alta sensibilidad y análisisindependiente a cada célula.

Desventajas no se puede visualizar a las células

que se analizan, no proporciona información de la

localización celular en tejido.

FRACCIONAMIENTO SUB CELULAR:

Conjunto de métodos y técnicas que tiene como

objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas

de un determinado componente celular.

Implica una:

Homogeneización de células o

tejido

Centrifugación del homogenato

Homogeneización de la muestra:

Se trata de la RUPTURA CONTROLADA de tejidos y

células.

Se debe asegurar no provocar cambios irreversibles en

los componentes celulares.

• Medio isotónico o levemente hipotónico Sacarosa

0.25M

• pH 7.4

• No usar soluciones salinas con alto poder iónico

• Siempre trabajar en frío

METODOS DE HOMOGENIZACION:

Centrifugación del Homogenato

Se basa en el movimiento de una partícula en el seno

de un líquido cuando es sometida a un movimiento

circular que genera una fuerza centrífuga.

Puede ser por:

• Diferencial:

• Centrifugación en gradiente de densidad

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL:

La separación se realiza en función de su coeficiente de

sedimentación (S)

Se obtienen dos fracciones: Un pellet con material

sedimentado y un sobrenadante con el material no

sedimentado

Desventaja: nunca se obtienen fracciones puras

Coeficiente de sedimentación de componentes subcelulares:

CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD

Permite la separación de todos los componentes de la

muestra, también permite realizar medidas analíticas.

Este método implica la utilización de un soporte fluido

cuya densidad aumenta desde la zona superior a la

inferior

RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2