Tecnología del ADN recombinante1
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8/9/2019 Tecnologa del ADN recombinante1
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TECNOLOGA DEL ADN
RECOMBINANTE
Curso : TPICOS EN BIOLOGIA
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Principales metas de la biotecnologa
del ADN recombinante Entender mejor los procesos de la herencia y su
expresin gentica.
Proporcionar un avance en el conocimiento ytratamiento de diversas enfermedades,especialmente enfermedades genticas.
Generar beneficios econmicos, creando plantasy animales mejorados y para la produccineficaz de molculas biolgicas valiosas.
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Secuencia de procedimientos que se utilizan
para producir un producto especfico.
a) Producir una biblioteca de ADN de unorganismo.
b) Identificar los genes individuales de inters.c) Producir una copia o preferentemente
muchas copias del gen.
d) Insertar el gen dentro del organismodeseado y regular la expresin del mismo deuna manera til.
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Enzimas de restriccin
Las enzimas derestriccin separan elDNA de dos hebras ensecuenciasnucleotdicasespecficas.
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CLONACIN Un clon es una estirpe celular o serie de individuos
pluricelulares nacidos de una misma y que songenticamente homogneos.
Hall y Stillman (1993) obtuvo clulas humanas
clonadas genticamente homogneas. La clonacin del DNA se basa en un aumentoprogramado del nmero de copias de secuencias deDNA seleccionadas. De qu manera se logra esto?.
1) Clonando el DNA en sistemas celulares (in vivo) usandobacterias.
2) Clonando en sistemas libres de celulas (reaccin in vitro)mtodo puramente enzimtico a travs de l reaccin encadena de la polimerasa (PCR)
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AAAAAAAm7Gppp
AAAAAAAm7GpppTTTTTTT
TTTTTTTAAAAAAAm7Gppp
AAAAAAATTTTTTT
Sntesis de laprimera cadena
Oligo dTAMV reverse transcriptase
Sntesis de lasegunda cadena
RNAsa HDNA polimerasa I
mRNA/DNA duplex
AAAAAAATTTTTTT
T4 DNA polim.dNTPs
Rellenadode extremos
cDNA duplex
T4 Ligasa
Construccin de una biblioteca de cDNA:
Sntesis de cDNA
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Construccin de una biblioteca de cDNAAAAAAAATTTTTTT
EcoRI
AAAAAAATTTTTTT
Me
CGAATTCCGCTTAAGG
AAAAAAATTTTTTT
Me
CGAATTCCGCTTAAGG
AATTCCGG
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MeCGGCTTAA
AATTCCGG
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CGGCTTAACTTAA
G
G
AATTC
Me
G
AATTC
CTTAAG
DNA metilasa
CGAATTCCGCTTAAGG
CGAATTCCGCTTAAGG
Ligacin de linkers EcoRI
Digestin EcoRI
Digestin EcoRI
Ligacin
Empaquetamiento in vitro
Infeccin deE. coliy propagacin
de la biblioteca
Recogida de fagosy almacenamiento
GAATTCCTTAAG
EcoRI
Pgt10
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Anlisis de una biblioteca de cDNA
Infectar E. coli
Placas con calvas
de lisis
Aplicarmembrana
Fagos adheridosa la membrana
Sondamarcada
con 32P
Hibridacin
LavadosAutoradiografa
Recuperacin del fago
y anlisis del inserto
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Clonacin de genes
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Clonacin del DNA en sistemas celulares
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Intentos de clonacin en animales
J. Gurdon (1967) ganador del Premio Nobel, logrdesarrollar embriones de la rana Xenopus laevisclonando huevos irradiados no fecundados con ncleosde clulas intestinales ya diferenciadas de la misma
especies, luego sigui experimentando con ratones. En la dcada de los 80s S. Williansen del Instituto de
Fisiologa Animal en Cambrige logr la clonacin deovinos adultos a partir de clulas embrionarias.
El Fisilogo N. First de la Universidad de Madison enWisconsin (USA) tomando una clula de embrin debovino d 6 das de gestacin consigui clonar un ovocitoanucleado por medio de la descarga elctrica y obtuvoclones viables. El embrin fue implantado en una vacadel que naci un ternero natural.
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En 1993 J. Halt y R. Stillman dela escuela de Medicinade la Universidad de George Washington (USA) dividiembriones en varias partes antes de la implantacinpara aumentar la probabilidad de embarazos.
Un 27 de febrero de 1997 en la revista Nature sepublic el nacimiento de la oveja Dolly llevado acabo por el escocs J. Vilmut y col. En el institutoRoslim de Edimburgo. En sus resultados logr
demostrar que el material gentico de las clulas deun tejidos adulto conserva la capacidad de dar origena un nuevo organismo.
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Clonacin de las clulas de sapo
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Clonacin por disgregacin de clulasembrionarias.
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Clonacin por transferencia nuclear
1. El vulo recin eclosionado, obtenido, por ejemplo,de una oveja, es manipulado bajo microscopio agrandes aumentos, para hacer succin del materialnuclear.
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Clonacin por transferencia nuclear
2.- la clula donante se obtiene de un cultivode clulas embrionarias de una ovejapreada.
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Clonacin por transferencia nuclear
3.- El material nuclear de la clula donante esinyectado al vulo vaci. Con impulsos elctricos selogra la fusin y el inicio de la divisin celular. Lamrula inicial es colocada en el tero de una madre
sustituta.
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El experimento de lo oveja Dolly
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Dolly fue desarrollada por Wilmut y colaboradores (Nature 385:810-813, 1997) en elInstituto Roslin de Edinburgo, Escocia.
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Esquema general de la clonacin de Dolly
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Etapas para realizar una clonacinnuclear ( De la oveja Dolly)
1. Se provee una clula somtica especializada.2. Esta clula contiene la copia de cada gen necesario
para la creacin del ser vivo especfico que sepretenda clonar.
3. Como slo estn activo los genes para sintetizar lasprotenas indispensables para dicha clula somticaepecializada, entonces las clulas crecen y se dividencopindose a s mismas.
4. Si se disminuyen los nutrientes durante el cultivo invitro de dichas clulas, se logra que entren eninactividad.
5. En este momento todos los genes pueden ser activa
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6. Un ser vivo de la misma especie aporta el vulo uovocito y se mantiene vivo in vitro.
7. Se le saca el ncleo con toda la informacin gentica alvulo.
8. La clula somtica y el ncleo se funden con una chispade electricidad. Y las molculas de vulo programangenes en las clulas somticas especializada paraproducir el embrin.
9. Se desarrollan las clulas embrionarias y se implantanlos embriones en una madre portadora.10. El nuevo ser vivo es idntico al donante de la clula
somtica especializada.
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Novedades de la clonacin de Dolly1) No se trata de una divisin (escisin gemelar) sino de una
reproduccin asexual encaminada a producir producirindividuos biolgicamente iguales al individuo adulto queproporcion el patrimonio gentico.
2) Se crea que el DNA de clulas somticas de los animalessuperiores al haber sufrido la diferenciacin no podranrecuperar su potencialidad original. Es decir la cpacidad deseguir desarrollando un nuevo individuo.
El xito de los trabajos de Wilmut, es haber encontrado unmtodo para resolver la compatibilidad entre citoplasmareceptor y el ncleo donante tomando una clula somtica detejido adulto diferenciado.
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Clonacin de terneros y cerdos
En diciembre (1998) en la revista Science se publico elnacimiento de 8 terneros de las clulas de una vacaadulta, trabajo dirigido por Y. Tsunada de la universidadde Kinki en Nora (Japon) usando la tcnica de Wilmut
soo que utilizo clulas de tracto reproductivo de unaanimal sacrificado. Una de las mas recientres investigaciones respecto a la
clonacin de animales es el nacimiento de 5 cerditos enVirginia (2000); Millie (nuevo milienio), Christe
(C.Bernard) Alexis y Correl (nombre de un premio Nobel)y Dotcom (lenguaje del internet). En diciembre del 2000 dieron a conocer la manipulacin
de gallinas para encontrar en lo huevos sustancias para eltratamiento del cncer (ovario, mama y piel).
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La primera oveja transgnica Polly que lleva clulasgenticamente transformadas con un gen humano nosolamente es clnica sino tambin transgnica.
Las vacas Holly y Belly fueron clonadas con la
finalidad de producir leche con alto contenido deLactoferritina (protena human utilizada en tratamientode enfermedades infecciosas). Es otro avance de labiotecnologa.
En diciembre 2001 en el instituto Roslin de Edimburgose han producido cerdos clonado y se proponedesactivar los genes responsables del rechazoinmunolgico entre las especies utilizando labiotecnologa para de esra manera resolver el problemade transplante de rganos.
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Caso A. MUJER INFERTIL QUE DESEA CLONARSE Y US A A SU HERMANA COMOUNA PROVEEDORA DEL VULO Y A SU MADRE COMO RECEPTORA Y MADRESUSTITUTA
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Caso B
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Caso C
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Principales usos de clonamientos degenes
La produccin de grandes cantidades de protenas especficas.
Las sntesis de vacunas ( protenas virales pueden utilizarsepara utilizarlas como vacunas)
El diagnstico de enfermedades genticas (anemia, Tay Sachs,Huntington , la distrofia muscular, etc.)
La modificacin del ADN en organismos intactos (produciendobacterias, animales y plantas transgnicas) para usosespecficos.
La modificacin del ADN de las clulas de organismosespecficos en seres humanos para corregir defectos genticos(terapia gnica).
Por lo tanto los genes duplicados pueden utilizarse co nfines
de investigacion industriales mdicos o en agricultura.
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