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TEMA 1. Análisis Químico y Análisis Instrumental

Tipos de Análisis.- Campo de aplicación.-Complementariedad de los análisis.- Límites de detección y cuantificación. Rango dinámico.-Interferencias en los análisis: señal y ruido,

integración de señales, solapamiento de señales

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Hechos, situaciones, necesidadesAnálisis del fósforo

Casos y situaciones

Uso 1: Minerales de fósforo como fertilizantes

Fosforita (Ca3(PO4)2) Variedad criptocristalina del apatitoRoca sedimentaria Compuesta fundamentalmente por fosfato cálcico

Especificación Química P2O5 26,88%CaO 33,00%Fe2O3 9,00%SiO2 3,00%Al2O3 5,00%MgO 0,10%

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Hechos, situaciones, necesidadesAnálisis del fósforo

Casos y situaciones

Uso 2: El fósforo como elemento esencial

El P es un elemento esencial para la vidaLas plantas lo necesitan para crecer y desarrollar su potencial genéticoNo es abundante en el suelo

En formas disponibles para la planta

Ligado al Canecesario para el desarrollo del esqueleto y los músculos

0,8 al 1,1% del peso total del cuerpo sales orgánicas e inorgánicas

Se absorbe paralelamente al CaLlega mejor a nuestro organismo si es en compañía de la vitamina D

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Hechos, situaciones, necesidadesAnálisis del fósforo

Casos y situaciones

Uso 2: El fósforo como elemento esencial

El papel que juega el fósforo es muy importante:

metabolismo de los hidratos de carbonocontracción de los músculosabsorción de la glucosa en el intestino, los riñones, equilibrio ácido-base en la sangretejido nervioso, etc

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Importancia y uso del fósforo

Producción de ATPencargado de guardar energía

Nucleoproteínas celulares en conexión con el ADN y los fosfátidos (ej. Fosfoglicéridos)

intervienen en la formación de numerosas enzimas que oxidan la glucosa

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Importancia y uso del fósforo

Alimentos ricos en P:

Almendras, ajo, avena, maíz, lentejas, coles, lechuga, cebolla, manzana, arroz, apio, patata, puerro, fresa, tomate, pepino, castañas, setas, alcachofas, avellanas nueces

Carne, pescado y lácteos (P y Ca)

Proporción necesaria para el ser humano se equilibra con la de Ca:

Lactantes 200 mg diarios Adolescentes 900 mg diariosAdultos y 700 mg

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Importancia y uso del fósforo

Déficit o exceso de P:

debilidad muscularalteraciones óseasRaquitismoafecciones intestinalesHiperparatiroidismoglomerculonefritis.

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Niveles y matrices - Fósforo

FosforitaP2O5 26,88%; CaO 33,00%; Fe2O3 9,00%; SiO2 3,00%; Al2O3 5,00%MgO 0,10%

Suelos (movilidad- biodisponibilidad)100 ppm, total- 10 ppm disponible (citrato)

AlimentosNaranjas 300 mg/Kg

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Métodos analíticos para P según las matrices

Fosforita: 11,7 % de P

Gravimétrico: Mg(NH4)PO4.6H2O (forma de precipitación)Mg2P2O7 (forma de pesada)1 g de fosforita genera 0,4201 g de Mg2P2O7

Precisión 0,2%; tiempo de análisis 5 h

EspectrofotométricoDisolución en H2SO4

Color azul 820 nm con reactivo molíbdicoє = 5000 l.mol-1.cm-1 (~10 – 50 ppm)1 g de fosforita 117000 ppm de P

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Análisis de fósforo

Suelos (movilidad- biodisponibilidad)100 ppm, total- 10 ppm disponible (citrato)

AlimentosNaranjas 300 mg/Kg

Como analizar???Qué métodos???

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¿Está mi proteína fosforilada? ¿Dónde?Ejemplo

Un péptido de secuencia p-KRPSQRHGSKY-amida

Tripsinarompe las cadenas C-terminales de la arginina (R) origina dos fragmentos de péptido

¿Cuál está fosforilado?

m/z 591 HGSKY-amidam/z 852 KRPpSQR

MALDI-MSm/z 591 se mantiene no contiene el fosfato no existe m/z 852 sino m/z 772, (852-80 u) fosforilado

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FosfoproteínasSerina, treonina, tiroxina fosforilación

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Límites de detección y cuantificación. Rango dinámico

Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos

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Límite de detección

“La concentración que proporciona una señal instrumental (y) significativamente diferente del blanco o señal de fondo”

LOD y = yB + 3sB

LOQ y = yB + 10sB

Sensibilidad (y) = a + 3sy/x

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Límite de detección

Sensibilidad (y) = a + 3sy/x = 1,52 + 3 × 0,433 = 2,189 y = bx + a x = LOD = (y-a)/b = (2,189-1,52)/1,93 = 0,67 pg

Por tanto, LOD = (3 sy/x)/b y LOQ = (10 sy/x)/b

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Parámetros de calidad analítica a partir de la curva de calibrado

LOD = límite de detección; LOQ = límite de cuantificaciónLOL = limite de respuesta lineal o rango lineal.

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Límite de detección y límite de cuantificación

Recta de calibrado: y = bx +a

Límite de detecciónLD= SB + 3 s B

LD = a + 3sy/x

CLD = (LD-a)/b

Límite de cuantificaciónLQ= SB + 10 s B

LQ = a + 10 sy/x

CLQ = (LQ-a)/b

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Exactitud y precisión

IMPRECISO E INEXACTO

PRECISO PERO INEXACTO

PRECISO Y EXACTO

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Exactitud

Se analizan uno o varios materiales estándar de referencia

Para evitar errores aleatorios y sistemáticos:n = 20 o 30 análisis repetidos

Exactitud = media – valor verdadero

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Parámetros de calidad para la precisión

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Características de los métodos analíticos de uso habitual

15 min∼ 5 %µg ml-1/pg ml-1

(ppm/ppt)Gas/vaporRelación masa/carga Espectrometría de

masasBasado en la medida de masas

15 min1-5 %10-3-10-5DisueltaCantidad de electricidad

Culombimetría

15 min1-5 %1-10-5 MDisueltaDiferencia de potencial

Potenciometría

30 min1-5 %10-3-10-5 MDisueltaIntensidad de corriente

PolarografíaBasados en el intercambio de electrones en una interfase

15 min1-5 %µg ml-1

(ppm)SólidaRayos XFluorescencia

rayos X

10 min1-5 %µg ml-1/ng ml-1

(ppm ó ppb)DisueltaRadiación

UV-visibleFluorimetría(emis. molecular)

3-5 min1-5 %µg ml-1/ng ml-1

(ppm ó ppb)Disuelta

(multielemental)Radiación UV-visible

Espectr. EmisiónAtómica

Emisión

3-5 min1-5 %µg ml-1/ng ml-1

(ppm ó ppb)DisueltaRadiación

UV-visibleEspect. Absorción Atómica

30 min< 5%mganálisis cualitativo

Sólida o disueltaRadiación IREspectroscopia Infrarroja (molecular)

5 min1-5 %µg ml-1

(ppm)DisueltaRadiación

UV-visibleEspectroscopia UV-visible (molecular)

AbsorciónBasados en radiaciones Electromagnéticas

15 min< 1%1- 10-3 MDisueltaVolumetría

1 – 3 h< 1%1-10-3 MDisueltaGravimetríaBasados en la reacción

TiempoPrecisiónRangoMuestraSeñalMétodos

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Señal analítica y método analíticoTécnicas espectroscópicas

basadas en la interacción de la radiación electromagnética con las moléculas o especies:

Tipos de señalesEspectros de bandas

Interacción de moléculas con radiación policromáticaAbsorción o Emisión

Espectros de líneaÁtomos-radiación electromagnéticaInteracciones más restringidas en cuanto al rango de la longitud de onda que las originan Absorción o Emisión

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Espectros de banda

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Espectros de línea

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Área y altura de la señalEl área de un pico o señal es una medida de la cantidad de un analito presente en la muestra, siempre que la detección se produzca de forma lineal

Ruido en la línea base. La ausencia de ruido y la estabilidad de la línea base son indicadores de la calidad de la medida

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Altura de la señal

La altura de los picos es una medida alternativa, siempre que le pico sea gaussiano

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Asimetría de la señal

Indica la intervención de otras interacciones no previstas

Anchura de la señal

Es un indicador de la selectividad de la interacción

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Resolución de las señalesEs el grado de separación de dos señales próximas

Resolución elevada Buena calidad del análisis y de los resultados

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Resolución

Resolución= Rs = 2(tR2 –tR1)/(w1 + w2)

Si los picos son simétricos, se utiliza la anchura a la mitad de la altura del pico de la señal, w0.5:

Rs ≈ (tR2 –tR1)/(w0.5,1 + w0.5,2)

R = 1los picos están resueltos al nivel de la línea base pueden medirse de forma precisa

En la práctica los picos no suelen ser iguales ni simétricos, y se precisa una resolución próxima a 2, o superior.

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Distorsión de las señalesLas señales que finalmente se observan en un registro se obtienen generalmente a partir de la respuesta del detector que, en los instrumentos actuales se encuentra digitalizada

La señal (generalmente en forma de pico) se suaviza electrónicamente o mediante un programa adecuado, y se reconstruye con un convertidor D/A para su representación final

Estas operaciones distorsionan el perfil inicial

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Señal y ruidoRuido

gran importancia en la medida de la señal

En el caso de una señal pequeña de 10-15 ALa eliminación del ruido mejora la señal

A veces es difícil eliminar el ruido cuando este tiene su origen en efectos termodinámicos y cuánticos imposible de evitar en la medida

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Señal y ruidoGeneralmente

El valor promedio del la señal correspondiente al ruido, RConstanteIndependiente de la magnitud de la señal, S

El efecto del ruido en el error relativo de una medidaaumenta al disminuir el valor de la cantidad medida

La relación señal/ruido (S/R) para describir la calidad de un método analítico o el funcionamiento de un instrumentoparámetro de calidad mucho más útil que el ruido solo

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Señal y ruido

Para una señal de corriente continua, la magnitud del ruido se define como:

“la desviación estándar de numerosas medidas de la intensidad de la señal, la cual viene dada por la media de las medidas”

S/R = media/desviación estándar

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Señal y ruidoLa relación señal/ruido es la inversa de la desviación estándar relativa RSD del conjunto de medidas

S/R = 1/RSD

Es imposible la detección de una señal cuando S/R < 2 ó 3

Espectro RMN de la progesterona A) S/R = 4,3B) S/R 43

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Fuentes de ruido en análisis instrumental

Ruido químico:

Variaciones de temperatura o presión afectan al equilibrio químico

Fluctuaciones en la humedad relativa modifica el contenido de humedad de las muestras

Vibraciones Produce estratificación de los sólidos pulverulentos

Cambios de la intensidad de la luz afectan a materiales fotosensibles

Humos del laboratorio interaccionan con las muestras o los reactivos

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Fuentes de ruido en análisis instrumental

Ruido instrumental:

Asociado a los componentes de un instrumentoEl ruido de los componentes puede tener distinto origen Es una mezcla compleja difícil de caracterizar

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Tipos de ruido instrumental

Ruido térmico o JohnsonRuido de disparoRuido de parpadeo o 1/fRuido ambiental

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Ruido térmico, o ruido Johnson

Origen: Agitación térmica de los electrones u otros transportadores de cargas en las resistencias, condensadores, detectores de radiación, celdas electroquímicas y otros elementos resistivos de un instrumento

Se produce aleatoriamente

Origina periódicamente heterogeneidades de cargaCrean variaciones de tensión que aparecen como ruido en la lectura

Existe incluso en ausencia de corriente de un elemento resistivo y solo desaparece en el cero absoluto (0 K, -273 ºC)

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Ruido térmico

raíz cuadrática media o valor eficaz del ruido de la tension dentro de un ancho de banda de frecuencia de ∆f Hz, K: constante de Boltzmann (1,38 x 10-23 J/K)T: temperatura en kelvin R: resistencia del elemento resistivo en ohmios

Relación entre el tiempo de ascenso t y el ancho de banda ∆f en un amplificador:

t: (t de ascenso) tiempo de respuesta, en segundos, a un cambio brusco de la señal de entrada - se toma como el tiempo necesario para que la señal de salida aumente del 10 al 90 % de su valor final

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Ruido térmico

Estas variables también se utilizan para determinar la capacidad de los instrumentos completos para detectar y transmitir información

El ruido térmico puede disminuir al estrecharse el ancho de banda

Sin embargo, cuando el ancho de banda se estrecha

el instrumento tarda más en responder a una variación de la señal y se necesita más tiempo para realizar una medida fiable

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Reducción del ruido térmicoEl ruido térmico se puede reducir:

Disminuyendo la resistencia eléctrica de los circuitos instrumentalesLa temperatura de los componentes de los instrumentos:

Al reducir T de un detector desde T ambiente a la T del nitrógeno liquido (77 K) reducirá el ruido térmico a la mitad

El ruido térmico depende del ancho de banda de la frecuencia pero es independiente de la propia frecuencia

A veces se denomina ruido blanco por analogía con la luz blanca, la cual contiene todas las frecuencias visibles

El ruido térmico es independiente del tamaño físico de la resistencia

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Ruido de disparoSe origina siempre que se produce un movimiento de electrones o de otras partículas cargadas a través de una unión

En un circuito electrónico característicoLas uniones se encuentran en las interfases pn

fotocélulas tubos de vacío

la unión es el espacio vacío entre el ánodo y el cátodo

Las corrientes en tales dispositivos implican una serie de procesos cuantizados

transferencia de electrones individuales a través de la unión

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Ruido de disparoSin embargo, hay una componente aleatoria y la velocidad a la cual ocurren esta sujeta, por tanto, a fluctuaciones estadísticas que se describen con la ecuación

irms: raíz cuadrática media o valor eficaz de las fluctuaciones de corriente relacionadas con la corriente continua promedio, I, e: carga del electrón, 1,60 x 10-19 C ∆f : ancho de banda de las frecuencias consideradas

Al igual que el ruido térmico, el ruido de disparo es un ruido blanco

Sólo puede minimizarse reduciendo el ancho de banda

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Ruido de parpadeoEs inversamente proporcional a la frecuencia de la señal que se observa

A veces, se le denomina ruido 1/f

Causas no muy bien conocidasSe reconoce por su dependencia de la frecuenciaEs significativo para f < 100 Hz

Ejemplo:deriva con el tiempo observada en amplificadores de corriente continua, medidores y galvanómetros

Puede reducirse bastante usando en vez de resistencias de carbón habituales

Resistencias de filamento enrollado o resistencias de película metálica

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Ruido ambientalMezcla de distintos tipos de ruidos procedentes del entorno

Cada conductor de un instrumento actúa como una antena potencial capaz de captar radiación electromagnética y convertirla en una señal eléctrica

En el entorno existen numerosas fuentes de radiación electromagnética

Líneas de alimentación de corriente alternaEmisoras de radio y de televisiónSistemas de encendido de los motores de gasolinaConmutadores de arco eléctricoEscobillas de motores eléctricosAlumbradoPerturbaciones ionosféricas (ionosfera: parte de la atmósfera ionizadapermanentemente debido a la fotoionización que provoca la radiación solar)

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Ruido ambientalAlgunas fuentes, como las líneas de alimentación y las estaciones de radio

originan ruidos con anchos de banda de frecuencia relativamente limitada

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Aumento de la relación S/RExisten métodos de hardware y software para mejorar la relación señal/ruido de un método instrumental:

Hardware :filtros, cortadores, escudos, moduladores.Eliminan o atenúan el ruido sin afectar de manera significativa a la señal analítica

Software:utilizan distintos algoritmos de ordenador permiten extraer las señales de entornos ruidososNecesitan suficiente hardware para acondicionar la señal de salida del instrumento y transformarla de analógica a digital

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ANEXO

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Calibrado mediante adición estándar

Se añaden cantidades conocidas de analito al problema, cuyo contenido en analito se quiere determinar

A partir del aumento de señal se deduce cuanto analito había en la muestra problema

Este método requiere una respuesta lineal frente al analito

La adición de patrón es especialmente apropiada cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica

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Ejemplo de adición estándarAnálisis por emisión atómicaUna muestra de concentración inicial desconocida de analito [X]ida una intensidad de emisión Ix. Se añade una concentración conocida de patrón, S, a una alícuota de la muestra y se mide la intensidad de emisión Is+x de esta segunda disolución. La adición del patrón a la muestra modifica la concentración original del analito debido a la dilución, [X]f,, es la concentración diluida del analito, donde f significa "final". Designamos la concentración del patrón en la disolución final como de [S]fLa emisión es directamente proporcional a la concentración del analito

final disolución la de Señalinicial disolución la de Señal

final disolución laen patrón analito deión Concentracinicial disolución laen analito deión Concentrac

=+

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Ecuación de la adición estándar

[ ][ ] [ ] XS

X

ff

i

II

XSX

+

=+

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EjemploEl contenido en Na+ de un suero dio una señal de 4,27 mV en un análisis por emisiónatómica. A continuación se añadieron 5,00 ml de NaCl 2,08 M a 95,0 ml suero. Este sueroenriquecido dio una señal de 7,98 mV. Hallar la concentración original de Na+ en elsuero. Los moles de NaCl añadidos son (5,00 x 10-3 l) x (2,08 M) = 0,0104 mol, y la concentraciónfinal de NaCl añadido es 0,0104 mol/0,100 = 0,104 M. A partir de la ecuación 27:

[ ][ ] [ ] [ ] MNa

mVmV

NaMNa

ii

i 113,098,727,4

950,0104,0=⇒=

++

+

+

[ ]fNa + =95 ml x [ ]iNa+ /(95 + 5 ml), porque 95,0 ml de suero se diluyeron con 5,0 ml depatrón. A menudo debemos calcular la concentración de una muestra, después de diluirla desdeun volumen inicial Vi a Vf. En el ejemplo anterior la disolución de NaCl 2,08 M se diluyódesde un Vi= 5,00 ml a un Vf = 5,00 + 95,0 = 100,0 ml. La concentración del NaCl sediluye, pues, de 2,08 M a (Vi/Vf) x (2,08 M) = 0,104 M. La cantidad (Vi/Vf) se llamafactor de dilución. Por lo general, se usan factores de dilución en lugar de cálculos máslaboriosos de moles y litros.

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Procedimiento gráfico para la adición estándar

La ecuación de la recta es y = mx + b. La abcisa en el origen se obtiene haciendo y = 00 = mx + bX = -b/mLa incertidumbre de la abscisa en el origen (la desviación estándar de [X]f, sXf ) es

( )∑ −+ 22

21

xxm

ynm

S

i

y

donde Sy es la desviación estándar de y (Sy/x), m es la pendiente de la recta de mínimos cuadrados, n es el número de puntos (5), es el valor medio de los 5 datos de y, y es el valor medio de los 5 valores de x.

yx

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Calibración mediante adición de un patrón interno

Un patrón interno es una cantidad conocida de un compuesto, diferente del analito que se añade a la muestra desconocida.

La señal del analito se compara con las del patrón interno, y de ese modo se determina el analito presente en el problema.

En la adición estándar, el patrón es la misma sustancia que el analito. En la calibración con patrón interno este es una sustancia distinta al analito.

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Calibración mediante adición de un patrón internoLos patrones internos son especialmente útiles cuando la cantidad de muestra analizada o la respuesta del instrumento varían algo de experiencia a experiencia, por razones que son difíciles de controlar.

Por ejemplo, una variación de los caudales de gas o de líquido en una experiencia cromatográfica, puede variar la respuesta del detector.

Una curva de calibrado solo es valida si se mantiene el conjunto de condiciones como se obtuvo.

Sin embargo, la respuesta relativa del detector para el analito y el patrón es normalmente constante en un amplio intervalo de condiciones.

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Calibración mediante adición de un patrón interno

Si la señal del patrón aumenta en un 8,4%, a causa de un cambio en el caudal del disolvente, la señal del analito de ordinario aumenta también en un 8,4%.

Mientras sea conocida la concentración de patrón, se puede deducir la concentración correcta del analito.

Cuando la respuesta relativa del instrumento al analito y el patrón permanece constante a lo largo de un intervalo de concentraciones, decimos que hay una respuesta lineal.

En trabajos rigurosos, esta suposición debe verificarse, porque no siempre es verdadera.

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Calibración mediante adición de un patrón interno

Si el detector responde de igual manera al estándar que al analito, F = 1. Si el detector con intensidad doble al analito que al estándar, F = 2. Si el detector responde con una intensidad mitad al analito que al

estándar, F = 0,5.

[ ] [ ]

=

SA

FXA SX

=

patrón deión Concentracpatrón del señal la de ÁreaF

analito deión Concentracanalito del señal la de Área :respuesta deFactor

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CUESTIONES1.- Realizar el análisis de regresión y calcular sensibilidad, LD y

LC para los siguientes datos. Para un absorbancia de 1,582, calcular la concentración y el error asociado:

2.- En el análisis de Fe en un material de referencia certificado de suelo se determinó mediante espectroscopía atómica una concentración media (n=30) de 15 ± 0,2 mg/kg. Si el valor certificado es de 18 mg/kg, calcular la exactitud y %RSD

2,59210

1,2965

0,532

0,2991

0,1540,5

Yi(absorbancia)

Xi(µg/l As)

y