Tesis 2014 Doctorado Humberto Reyes Prado.pdf

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS BÚSQUEDA Y ACEPTACIÓN DE LA PLANTA HOSPEDERA EN Copitarsia decolora Guenée (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: DOCTORADO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS PRESENTA HUMBERTO REYES PRADO Yautepec, Morelos Enero, 2015

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

BÚSQUEDA Y ACEPTACIÓN DE LA PLANTA HOSPEDERA

EN Copitarsia decolora Guenée (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTORADO EN CIENCIAS EN

DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

HUMBERTO REYES PRADO

Yautepec, Morelos Enero, 2015

7

Autorizaci6n de uso de ohra

Instituto Polit6cnico NacionalPresente

Bajo protesta de decir verdad el que suscribe Humberto Reyes Prado (se anexa copiasimple de identificaci6n oficial), manifiesto ser autor y titular de los derechos morales ypatrimoniales de la obra titulada 'oBrfisqueda y aceptacirin de la planta hospedera enCopitarsia decolora Guen6e (Lepidoptera:Noctuidae)" en adelante "La Tesis" y de |acual se adjunta copia, por 1o que por medio del presente y con fundamento en el articulo 27fracci6n II, inciso b) de la Ley Federal del Derecho de Autor, otorgo a el InstitutoPolitdcnico Nacional, en adelante El IPN, autorizaci6n no exclusiva para comunicar yexhibir priblicamente total o parcialmente en medios digitales formato digital e impreso "LaTesis" por un periodo de un afio contado apartir de la fecha de la presente autoizaci6n,dicho periodo se renovard autom6ticamente en caso de no dar aviso expreso a "El IPN" desu terminaci6n.

En virtud de lo anterior, "El IPN" deberii reconocer en todo momento mi calidad de autorde"La Tesis".

Adicionalmente, y en mi calidad de autor y titular de los derechos morales y patrimonialesde "La Tesis", manifiesto que la misma es original y que la presente auiorizaci6n nocontraviene ninguna otorgada por el suscrito respecto de "La Tesis", por 1o que deslindo detoda responsabilidad a El IPN en caso de que el contenido de "La Tesis" o la autorizaci6nconcedida afecte o viole derechos autorales, industriales, secretos industriales, convenios ocontratos de confidencialidad o en general cualquier derecho de propiedad intelectual deterceros y asumo las consecuencias legales y econ6micas de cualquier demanda oreclamaci6n que puedan derivarse del caso.

Mexico, D. F., l0 de Diciembre de 2014

Atentamente

Humberto Reyes Prado

I NSTITUTo PoLrcEcl.ttco NAct aNALsEcRErA nin ne NvEsrteAct6tu yposGRADo

CARTA CES/ON DE DERECHOS

En la Ciudad de Yautepec, Morelos el dia l0 del mes de Diciembre del afio 2014, el que

suscribe Humberto Reyes Prado alumno del Programa de Doctorado en Ciencias en

Desarrollo de Productos Bi6ticos con nfmero de registro F101264, adscrito al Centro de

Desarrollo de Productos Bi6ticos, manifiesta que es autor intelectual del presente trabajo

de Tesis bajo la direcci6n del Dr. Angel Ren6 Arzuf{i Barrera y Dra. Norma Reyna

Robledo Quintos cede los derechos del trabajo intitulado "Btlsqueda y aceptaci6n de la

planta hospedera en Copitarsia decolora Guen6e (Lepidoptera:Noctuidae)", al Instituto

Polit6cnico Nacional para su difusi6n, con fines acaddmicos y de investigaci6n.

Los usuarios de la informaci6n no deben reproducir el contenido textual, grdficas o datos

del trabajo sin el permiso expreso del autor yio director del trabajo. Este puede ser obtenido

escribiendo a la siguiente direcci6n Carretera Yautepec-Jojutlao Km. 6, calle CEPROBI

No. 8, Col. San Isidroo Yautepec, Morelosn M6xico. C.P.62731, Apartado Postal 24.

Tel6fonos: (735) 394 20 200 3941896, (55) 57 29 69 00 f,xt. 82500 / 82505. Fax 82512,

82521, e-mail: [email protected] (http:\\rvww.ceprobi.ipn.mx). Si el permiso se otorga, el

usuario deber6 dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.

Humberto Reyes Prado

Nombre del alumno

DECLARACION DE RESPONSABILIDAD

Con base en el articulo 57 fracci6n I del Reglamento de Estudios de Posgrado vigente y en

la Secci6n IV del C6digo de Etica del IPN, hacemos constar que el trabajo de tesis

u'Bfsqueda y aceptaci6n de la planta hospedera en Copitarcia decalora Guen6e

(tepidoptera:Noctuidae)" es responsabilidad del Dr. Angel Ren6 Arzuffi Barreran Dra.

Norma Reyna Robledo Quintos y llumberto Reyes Prado, y que ni los datos

experimentales ni el texto han sido usados para obtener otro grado acaddmico en el pafs o

en el extranjero. Cualquier colaboraci6n o cita textual fue declarada y reconocida en el

documento-

Yautepec, Morelos; a 10 de Diciembre de2Al4

ATENTAMENTE

Humberto Reyes PradoAlumno

Director de tesis Director de tesis

El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Ecología Química de Insectos del

Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos

Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección del Dr. Ángel René Arzuffi

Barrera y la Dra. Norma Reyna Robledo Quintos. Para la realización de los estudios se

contó con el apoyo económico de CONACyT (No. Becario 225566) y del Programa

Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado

(SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado a los

proyectos de la SIP (No. 20100397, 20110762, 20121192, 20130883 y 20141203).

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional (IPN), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CONACYT) y al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del

Instituto Politécnico Nacional (IPN), por el apoyo financiero para realizar mis estudios de

Doctorado.

Al Dr. René Arzuffi Barrera y la Dra. Norma Robledo Quintos por la asesoría, la confianza,

el tiempo y la paciencia, muchas gracias.

A los profesores que revisaron mi tesis; el Dr. René Arzuffi Barrera, Dra. Norma Robledo

Quintos, Dra. Gabriela Trejo Tapia, Dr. Víctor Rogelio Castrejón Gómez, Dr. Federico

Castrejón Ayala, Dr. Alfredo Jiménez Pérez y Dra. Kalina Bermúdez Torres; gracias por

sus pertinentes sugerencias y comentarios que enriquecieron este trabajo de tesis.

Al Dr. Julio Rojas de ECOSUR, por aceptarme y permitirme trabajar en su laboratorio

durante la estancia de investigación.

A mi padres, mis hermanas y a Lety. Gracias por su apoyo incondicional. Estoy en deuda

con ustedes.

i

Contenido

Relación de cuadros

vi

Relación de figuras

vi

Resumen

ix

Abstract

x

I. Introducción general

1. Selección de la planta hospedera por noctuidos adultos

2

1.1. Búsqueda de la planta hospedera por adultos

3

1.2. Aceptación de la planta hospedera por adultos 5

2. Selección de la planta hospedera por larvas 7

3. Emisión de volátiles por las plantas 9

4. Factores que influencian la selección en adultos

12

5. Manejo de insectos plaga con semioquímicos 14

6. Copitarsia decolora como modelo de estudio

16

7. Objetivos

18

II. Atracción de hembras de C. decolora apareadas a compuestos volátiles de

la col

1. Introducción

20

2. Materiales y Métodos

21

2.1. Insectos

21

2.2. Plantas

22

2.3. Extracción de volátiles de la col sin daño y con daño

22

2.4. Respuesta de atracción en túnel de viento a extractos de col

23

2.5. Análisis estadístico

25

ii

3. Resultados

26

3.1. Respuesta de atracción en túnel de viento a volátiles de la col

26

4. Discusión 28

III. Identificación de los compuestos volátiles de la planta de col

1. Introducción

31

2. Materiales y Métodos

32

2.1. Insectos

32

2.2. Plantas

32

2.3. Extracción de compuestos volátiles de la col

32

2.4. Análisis químico e identificación de los compuestos

33

2.5. Respuesta electroantenográfica al extracto y a la mezcla de sintéticos

34

2.6. Respuesta de atracción en túnel de viento al extracto y a la mezcla de

sintéticos

34

2.7. Análisis estadístico

35

3. Resultados

35

3.1. Identificación de los compuestos volátiles

35

3.2. Respuesta electroantenográfica al extracto y a la mezcla de sintéticos

35

3.3. Respuesta de atracción en túnel de viento al extracto y a la mezcla de

sintéticos

37

4. Discusión

38

iii

IV. Factores que afectan a las hembras de C. decolora en la búsqueda de la

planta de col y a los machos en la búsqueda de pareja

1. Introducción

41

2. Materiales y Métodos

43

2.1. Insectos

43

2.1.1. Edad al apareamiento en hembras

43

2.1.2. Edad y estado de apareamiento en los machos 44

2.1.3. Acondicionamiento de los insectos para evaluar el efecto de pre-

exposición a los volátiles de col y a la feromona sexual

44

2.1.4. Efecto de pre-exposición a los volátiles de planta hospedera

y al extracto glandular de feromona sexual.

45

2.2. Plantas 45

2.3. Extracción de compuestos volátiles de la col 45

2.4. Extracción de feromona sexual 46

2.5. Respuesta de atracción en túnel de viento al extracto 46

2.6. Análisis estadístico 47

3. Resultados 47

3.1. Efecto de la edad al apareamiento en hembras 47

3.2. Edad y estado de apareamiento en los machos 48

3.3.- Efecto de la pre-exposición 51

3.3.1. Acondicionamiento de los insectos para evaluar el efecto de

pre-exposición

51

3.3.2. Pre-exposición de hembras apareadas a volátiles de col

53

3.3.3. Pre-exposición de machos vírgenes a feromona sexual 55

iv

4. Discusión

58

V. Preferencia de oviposición por C. decolora

1. Introducción 65

2. Materiales y métodos

67

2.1. Insectos

67

2.1.1. Preferencia de oviposición

67

2.2. Plantas

67

2.3. Determinación de preferencia de oviposición

67

2.4. Análisis de datos

68

3. Resultados

69

3.1. Preferencia de oviposición

69

4. Discusión

70

VI. Atracción de larvas de C. decolora a volátiles de la col

1. Introducción

74

2. Materiales y métodos

75

2.1. Insectos

75

2.1.1. Respuesta de larvas a plantas de col

75

2.2. Plantas

76

2.3. Determinación de la respuesta de larvas en plantas de col

76

2.4. Extracción e identificación de volátiles de col

76

2.5. Respuesta de larvas a extractos de col

76

2.6. Análisis de datos

77

3. Resultados

78

3.1. Respuesta de larvas a plantas de col

78

v

3.2. Respuesta de larvas a extractos de col

79

4. Discusión

80

VII. Discusión general

84

1.- Atracción de hembras de C. decolora a volátiles de col sin daño y con daño

2. Efecto del estado fisiológico y la experiencia sobre la respuesta a los volátiles

de planta hospedera y feromona sexual de C. decolora

3.- Preferencia de oviposición por C. decolora

4. Atracción de larvas de C. decolora a volátiles de la col

Conclusiones

84

85

87

88

91

Bibliografía 92

Anexos 112

vi

Relación de cuadros

Cuadro 1. Compuestos químicos identificados en CG-EM del extracto de col.

36

Relación de figuras

Figura 1. Eventos de búsqueda y aceptación de la planta hospedera por las

hembras.

4

Figura 2. Eventos de búsqueda y aceptación de la planta hospedera por las larvas.

8

Figura 3. Sistema de extracción de volátiles de plantas de col, en diferentes

condiciones.

23

Figura 4. Túnel de viento para evaluar la respuesta de hembras a volátiles de col.

25

Figura 5. Respuesta (%) de hembras apareadas a volátiles de col con diferentes

disolventes.

27

Figura 6. Respuesta (%) de hembras apareadas a volátiles de col sin daño y con

daño, en túnel de viento.

28

Figura 7. Despolarización (Promedio±EEM) provocada por el extracto de col

en antenas de hembras apareadas

37

Figura 8. Respuesta (%) de hembras apareadas a extracto de col y la mezcla de

sintéticos, en túnel de viento.

38

Figura 9. Respuesta (%) de hembras vírgenes y apareadas a extracto de col, en 48

vii

túnel de viento

Figura 10. Respuesta (%) de grupos de machos vírgenes a feromona sexual

49

Figura 11. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Q1 < Mediana < Q2)

por grupo de edad de machos vírgenes en respuesta al extracto glandular de

feromona sexual

50

Figura 12 Respuesta (%) de machos vírgenes y apareados a extracto glandular

de feromona sexual

51

Figura 13. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Q1 < Mediana < Q2) de

machos vírgenes y apareados en respuesta al extracto glandular de feromona

sexual

52

Figura 14. Respuesta (%) provocada por el extracto de col en machos y hembras.

53

Figura 15. Respuesta (%) provocada por el extracto glandular de feromona sexual

en machos y hembras en túnel de viento.

54

Figura 16. Respuesta (%) de hembras sin pre-exponer y pre-expuestas al extracto

de col en túnel de viento.

55

Figura 17. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Promedio ± EEM) de

hembras sin pre-exponer y pre-expuestas al extracto de col en el túnel de viento

56

Figura 18. Respuesta (%) de machos sin pre-exponer y pre-expuestos al extracto

glandular de feromona sexual en túnel de viento.

57

viii

Figura 19. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Promedio ± EEM) de

machos sin pre-exponer y pre-expuestos al extracto glandular de feromona sexual

en el túnel de viento.

58

Figura 20. Cámara para evaluar la preferencia de oviposición por hembras de C.

decolora.

68

Figura 21. Número de huevecillos (Promedio ± EEM) sobre plantas de col o

alrededor de ésta.

69

Figura 22. Olfatómetro en Y para evaluar la atracción de larvas neonatas. 78

Figura 23. Larvas neonatas (Promedio ± EEM) sobre plantas de col o alrededor de

ésta.

79

Figura 24. Respuesta de larvas neonatas a extractos volátiles de col con diferentes

disolventes y a la mezcla de sintéticos.

80

ix

Resumen

Copitarsia decolora es una plaga de plantas crucíferas, y la col es una de sus principales

plantas hospederas. El manejo de C. decolora puede incluir el uso de los volátiles de las

plantas hospederas como modificadores del comportamiento. Para C. decolora no se

han realizado estudios sobre los compuestos químicos involucrados en la atracción a la

planta hospedera, de algunos factores que afectan esta respuesta de atracción, además de

los factores que afectan a los machos en la búsqueda de pareja. Por lo anterior, se

propuso estudiar los compuestos volátiles de la col y de algunos factores bióticos que

afectan el comportamiento de atracción de C. decolora en la búsqueda y aceptación de

su planta hospedera y de pareja. Para lo cual, se obtuvieron extractos de volátiles de col

usando plantas sin daño y con daño, además de extractos glandulares de feromona

sexual. Las pruebas en olfatómetro mostraron que el extracto de col sin daño, del cual se

identificaron 9 compuestos volátiles, fue el que provocó más vuelos orientados hacia los

volátiles. Este extracto provocó la máxima respuesta de atracción en hembras apareadas

de 4-6 días de edad. Las hembras de 4 días de edad, se pre-expusieron a volátiles de la

col y se evaluó la atracción 2, 24 y 48h después, observándose una disminución de la

atracción en comparación con las hembras no pre-expuestas. Los machos de 4-7 días de

edad responden en mayor proporción a la feromona sexual, y al ser pre-expuestos a

dicho estímulo, se observó un efecto de inhibición a las 2 h y sensibilización a las 24 h.

Las hembras apareadas pusieron más huevecillos alrededor de la planta de col que sobre

ella. Las larvas neonatas al eclosionar a diferentes distancias de la planta de col, se

desplazan hacia la planta hospedera para su alimentación. El extracto de col sin daño

provocó la máxima atracción en las larvas neonatas, y aproximadamente la mitad de las

larvas evaluadas con la mezcla de compuestos identificados se dirigieron a dicho

estímulo. Esta investigación aporta conocimiento sobre la identidad de los compuestos

que participan en la atracción de hembras adultas de C. decolora, y posiblemente de

larvas, en la búsqueda de la planta hospedera. El estudio de algunos factores que afectan

esa búsqueda de hospedera por las hembras y de pareja por el macho. La oviposición

por las hembras ocurre alrededor de la planta y las larvas están involucradas en parte del

proceso de aceptación de la planta hospedera, ya que se desplazan hacia ella para

alimentarse.

x

Abstract

Copitarsia decolora is a pest of cruciferous plants and mainly cabbage is one of its host

plants. An alternative C. decolora management may include the use of host plant

volatiles and sex pheromone. For C. decolora studies have been conducted on the

chemical compounds involved in attracting the host, and the factors affecting this

response attraction, addition the factors affecting males in partner search Therefore, it

was proposed to study the volatiles of cabbage and sex pheromone and some biotic

factors that affect the behavior of attraction in the search C. decolora and acceptance of

their host plant and partner search. For this purpose, obtaining volatile extracts of

cabbage plants with damage and without damage was done, and sex pheromone gland

extracts. The extract of cabbage without damage was provoked longer flights to the

volatile and 9 volatile compounds were identified. This extract provoked maximum

response in females mated 4-6 days of age. Mated females of 4 days of age was pre-

exposed to volatiles from cabbage and attraction 2, 24 and 48h after evaluated, and it

was observed a decrease in the attraction compared with non-pre-exposed females.

Males 4-7 days of age respond most to the sex pheromone, and being pre-exposed to

said stimulus, an inhibition at 2 h was observed. Females prefer to lay eggs around the

cabbage plant, with a pattern of distribution of number of eggs up to 30 cm and then a

gradual decrease of eggs to cabbage plant. The neonate larvae to hatch at different

distances from the cabbage plant, moving toward her, taking part in the acceptance of

the host for food. The extract of cabbage without damage caused maximum attraction in

neonate larvae, and approximately half of the larvae tested the mixture identified

compounds were directed to this stimulus. This research provides knowledge about the

identity of the compounds involved in attracting adult females of C. decolora and

possibly larvae in search of the host plant. The study of some factors affecting this host

search by females and the male partner. Oviposition by females occurs around the plant

and the larvae are involved in part of the process of acceptance of the host plant, and

moving toward her to feed.

1

I. Introducción general

Los insectos herbívoros tales como las palomillas, discriminan olores entre

distintas plantas (De Bruyne y Baker, 2008), detectando el olor “específico” que le

permite ubicar a su planta hospedera en los procesos de oviposición y/o alimentación

(Visser, 1986; Bruce y Pickett, 2011). Muchas palomillas, representan un problema

económico en la agricultura causando pérdidas importantes en el rendimiento de sus

plantas hospederas (Tovar et al., 2007; Venette y Gould, 2006). Para el manejo de estos

insectos plaga se han utilizado insecticidas; pero éstos contaminan el ambiente y no son

específicos (Barrera et al., 2006). Los modificadores del comportamiento tales como las

feromonas y los volátiles de plantas hospederas pueden ser integrados en sistemas de

manejo de estos insectos (Schoonhoven et al., 2005). Para el empleo de compuestos

atrayentes en trampas y capturar hembras, primero se requiere hacer estudios de análisis

e identificación de los compuestos atractivos y los bioensayos de comportamiento para

conocer la respuesta del insecto a esos compuestos (Barrera et al., 2006).

El proceso de selección de la planta hospedera no sólo depende del estímulo

olfatorio, la recepción de volátiles y la respuesta a los mismos (Proffit et al., 2011),

también depende, entre otros factores, del estado fisiológico y la experiencia de la

hembra (Anton et al., 2007). Se conoce que la selección de la planta hospedera lo

realizan los adultos, específicamente las hembras; sin embargo, varios estudios han

demostrado que las hembras no siempre seleccionan la planta más apropiada, y que las

larvas recién emergidas pueden rechazar la planta sobre la que ellas eclosionaron y

seleccionar una planta más adecuada para su alimentación (Renwick y Chew, 1994).

2

En Copitarsia decolora (Guenée), se desconoce en gran parte el proceso de

selección de la planta hospedera, ya que no se sabe si existe una correlación adecuada

entre la selección de la hospedera por la hembra, y el desarrollo y supervivencia de las

larvas. En este trabajo, se estudian los compuestos volátiles emitidos por la planta

hospedera y algunos factores bióticos que están involucrados en la búsqueda y

aceptación de la planta hospedera por parte de hembras adultas y larvas neonatas, y de

pareja por lo machos de C. decolora.

1. Selección de la planta hospedera por noctuidos adultos

En los insectos herbívoros la búsqueda y aceptación de la planta hospedera

difiere entre las especies de acuerdo a si se alimentan u ovipositan en varias familias de

plantas hospederas (herbívoros generalistas) o en una o pocas especies de plantas

(herbívoros especialistas) (Bernays y Chapman, 1994; Rojas et al., 2003).

Los herbívoros generalistas utilizan estímulos comunes que están presentes en

sus plantas hospederas, para esto deben procesar la información visual, olfativa y táctil

proveniente de la planta hospedera, en contraste, los herbívoros especialistas utilizan

estímulos específicos de sus plantas hospederas, enfocándose en estímulos relevantes ya

sean visuales, olfativos o táctiles (Bernays y Chapman, 1994; Schoonhoven et al.,

2005). Sin embargo, esta clasificación no es estricta, ya que hay un gradiente entre

especies que se alimentan de un solo tipo de planta y aquellas que consumen varias

plantas. Además, la elección de una planta hospedera puede deberse a la combinación

de varios factores, es decir a una señal multimodal (Bernays y Chapman, 1994) más que

a un factor único (Marchioro y Foerster, 2014).

3

En general, el proceso de selección de la planta hospedera en insectos noctuidos

muestra una secuencia comportamental de modalidades sensoriales olfativas y

gustatorias, y en algunos casos, visuales y mecánicas (Bernays y Chapman, 1994; Rojas

y Wyatt, 1999a). Pero, el estímulo considerado más importante en el proceso de

selección de la planta hospedera para los noctuidos es el olfativo. Existe evidencia que

en algunas especies la atracción a la planta hospedera puede ser posible sólo con el

estímulo olfativo, sin el estímulo visual (Bernays y Chapman, 1994; Schoonhoven et

al., 2005).

En insectos noctuidos, las hembras son quienes seleccionan la planta hospedera

para su alimentación u oviposición, ya que esto determina la supervivencia de su

descendencia (Renwick y Chew 1994; Marchioro y Foerster, 2014).

1.1. Búsqueda de la planta hospedera por adultos

En las palomillas nocturnas, los estímulos olfativo y táctil son preponderantes

durante el proceso de selección de la planta hospedera (Rojas et al., 2003; Schoonhoven

et al., 2005). Los eventos conductuales que lleva a cabo una palomilla a la selección de

la planta hospedera son orientación, búsqueda, aterrizaje y evaluación al contacto, y

posteriormente la aceptación o el rechazo; lo anterior se puede resumir en búsqueda-

localización y aceptación de la planta hospedera (Thompson y Pellmyr, 1991; Renwick

y Chew 1994; Honda, 1995; Knolhoff y Heckel, 2014) (Figura 1).

4

Figura 1. Eventos de búsqueda y aceptación de la planta hospedera por las hembras (Esquema

modificado de Knolhoff y Heckel, 2014).

En la fase de búsqueda y localización de la planta hospedera, los compuestos

volátiles liberados por la planta son recibidos por quimiorreceptores (Leal, 2013)

localizados en las antenas del insecto (Keil, 1999), en donde las neuronas receptoras

olfatorias transmiten la información al lóbulo antenal, el cual procesa la información

olfatoria y genera una respuesta motora (Hildebrand, 1995). Estos compuestos pueden

ser percibidos a distancia de la planta hospedera y entre los más comunes están los

terpenos, alcoholes, aldehídos y ésteres (Dicke y van Loon, 2000). Todos éstos son de

bajo peso molecular y se volatilizan al ser expuestos al aire o a temperatura ambiente

porque tienen presiones de vapor altas (Kessler y Morrell, 2010).

Los insectos pueden detectar los volátiles de la planta hospedera entre los demás

volátiles del ambiente, el volátil o los volátiles “específicos” tienen un papel clave en la

ubicación de la planta hospedera, aún a la distancia. En la búsqueda de la planta

hospedera el insecto tiene que realizar movimientos orientados hacia la planta y tener

contacto con ella, aunque no siempre el insecto aterriza sobre la planta, pero al menos

éste debe permanecer en la proximidad de la planta, donde percibe otros estímulos con

5

la finalidad de seguir examinando sus características y aceptarla como sitio de

oviposición (Visser, 1986; Bernays y Chapman, 1994; Knolhoff y Heckel, 2014).

1.2. Aceptación de la planta hospedera por adultos

En la fase de aceptación de la planta hospedera, los insectos fitófagos utilizan

principalmente el estímulo químico (olfativo y táctil) para evaluar la calidad de la planta

hospedera como sitio de oviposición (Del Campo et al., 2001; Simmonds, 2001; Scheirs

y De Bruyn, 2002; Calas y Marion-Poll, 2007; Gripenberg et al., 2007a; Gripenberg et

al., 2007b). Para ello, la palomilla tiene receptores sensoriales en los tarsos, antenas,

probóscide y ovipositor (Leal, 2013) que le permitirán elegir una planta hospedera en

condiciones “óptimas” o con “calidad” para oviposición, es decir una planta con los

requerimientos nutricionales para la supervivencia y crecimiento para las larvas

(Awmack y Leather, 2002), y que además las larvas tengan la capacidad para

contrarrestar sus defensas químicas (Knolhoff y Heckel, 2014).

La presencia o ausencia de algunos metabolitos secundarios (estimulantes o

disuasivos de la oviposición) y nutrientes presentes en la planta hospedera, determinará

la aceptación de ésta por la palomilla (Bernays y Chapman, 1994; Honda, 1995;

Schoonhoven et al., 2005). Los compuestos estimulantes regularmente no son volátiles

(Simmonds, 2001; Calas y Marion-Poll, 2007), aunque existen ejemplos donde la

oviposición es estimulada por compuestos volátiles (Städler, 1974; Fatzinger y Merkel,

1985) o por una mezcla de ambos (Renwick et al., 2006).

La aceptación de la planta hospedera por el adulto está correlacionada con la

disponibilidad de la planta hospedera para el desarrollo y la supervivencia de su

6

progenie (Thompson y Pellmyr, 1991; Knolhoff y Heckel, 2014), aunque no siempre se

da esta correlación (Potter et al., 2012).

Cuando la preferencia de la hembra por la planta hospedera y el desarrollo larval

no coinciden, puede deberse a:

- El herbívoro generalista quede condicionado a la planta de la cual se

alimentó en su fase larvaria (principio de selección de Hopkins) (Barron,

2001).

- La experiencia tanto de adultos o las larvas sobre la planta hospedera

(Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al., 1998b; Rojas y Wayt 1999b;

Papaj y Prokopy, 1989; Barron, 2001; Akhtar y Isman, 2003; Olsson et al.,

2006).

- La presencia de compuestos repelentes (Renwick y Chew, 1994).

- La presencia de parasitoides y depredadores por el daño al comienzo de la

oviposición (Meiners y Hilker, 2000; Hilker y Meiners, 2002; Hilker et al.,

2002).

- Cuando las hembras no son capaces de evaluar la “calidad” de la planta

correctamente (Jaenike, 1978).

- La presión de ovipositar por la carga de huevecillos (Jones, 1977; Doak et

al., 2006).

- La diversidad y distribución de vegetación alrededor de la planta hospedera

(Rausher y Papaj, 1983; Petzold, 2009).

- Cuando el desarrollo larval requiera moverse a otras plantas hospederas

(Bar-Yam y Morse, 2011).

7

- Las larvas por sí mismas eligen la planta hospedera para su alimentación

independientemente del sitio de oviposición elegido por la hembra

(Cunningham et al., 2011; Rivera y Burrack, 2012).

- Cuando las hembras prefieren ovipositar en plantas libres de enemigos

naturales que en plantas en condiciones “óptimas” para el crecimiento de las

larvas (Jeffries y Lawton, 1984).

2. Selección de la planta hospedera por larvas

Regularmente las palomillas herbívoras ovipositan sus huevecillos sobre la

planta hospedera, al emerger las larvas pueden quedarse o emigrar a otra planta

hospedera, en la mayoría de los herbívoros especialistas sus estados inmaduros se

alimentarán de la planta hospedera en la cual emergieron de huevo. En contraste con los

herbívoros generalistas que pueden poner sus huevecillos sobre la planta hospedera,

alrededor de ella o en otra planta que no sea su hospedera; es en estos casos cuando las

larvas, tienen opción de elegir la planta hospedera adecuada para su supervivencia y

crecimiento (Petzold, 2009; Knolhoff y Heckel, 2014) (Figura 2).

En la mayoría de los estudios donde se reporta el comportamiento de las larvas a

los volátiles de la planta hospedera, no identifican los compuestos químicos causantes la

atracción (Singh y Mullick, 2002; Zalucki et al., 2002; Castrejon et al., 2006). En

algunos casos las hembras y las larvas son atraídas por los mismos compuestos que

libera la planta hospedera (Rembold et al., 1991; Hartlieb y Rembold, 1996).

8

Figura 2. Eventos de búsqueda y aceptación de la planta hospedera por las larvas de lepidóptero

noctuido para su alimentación (Esquema modificado de Knolhoff y Heckel, 2014).

En las larvas de lepidópteros sigue siendo sumamente importante el estímulo

químico (olfativo y táctil), éstas se caracterizan por tener aproximadamente el 80% de

los quimiorreceptores en las antenas y los palpos maxilares (De Boer, 2006). Aunque en

algunos casos como en las larvas neonatas de Epyphias postvittana (Walker) usan la

señal visual (Harris y Foster, 1995) y química (Harris et al., 1999) para orientarse, y

encontrar la planta hospedera.

Además de los volátiles de la planta hospedera que afectan el comportamiento

locomotor de las larvas, también se han reportado que las plantas contienen inhibidores

de la alimentación (Landolt et al., 1998), pero ante esto último, las larvas pueden

modificar los compuestos e inhibir a los compuestos tóxicos o disuasivos de la

alimentación de la planta (Thompson y Pellmyr, 1991).

9

3. Emisión de volátiles por las plantas

Los compuestos químicos producidos por las plantas se clasifican según

modifiquen el comportamiento de los insectos (Bernays y Chapman, 1994) y pueden ser

repelentes o atrayentes de insectos en la búsqueda de la planta hospedera.

Por una parte, un atrayente es un compuesto o mezcla química que atrae al

insecto con movimientos orientados a la fuente de olor (Miller et al., 2009). Estos

compuestos atrayentes que liberan las plantas sin daño, sirven para que el insecto se

guíe hasta la planta hospedera, pero también se sabe que algunos volátiles atrayentes

son inducidos por el daño de larvas en la planta hospedera (Dicke y van Loon, 2000).

Por otra parte, un compuesto químico repelente provoca que el insecto realice

movimientos orientados para alejarse de la fuente de olor (De Moraes et al., 2001;

Miller et al., 2009). Estos compuestos son un mecanismo de defensa contra los

herbívoros alejándolos de la planta hospedera (Bernays y Chapman, 1994).

Los volátiles producidos por las plantas como respuesta al ataque de un

herbívoro son similares estructuralmente a los que liberan las plantas sin daño, sin

embargo, los herbívoros tienen la capacidad de distinguir los volátiles entre una planta

sin daño o con daño (Turlings y Tumlinson, 1992; Turlings et al., 1995). El daño

mecánico en las plantas ocasiona una respuesta volátil rápida y de corta duración, pero

cuando el herbívoro se alimenta de la planta, la respuesta es mayor en intensidad y

tiempo, además, las secreciones orales de los herbívoros inducen respuestas volátiles

específicas en las plantas (Turlings et al., 1998).

Son tres las principales rutas biosintéticas relacionadas con la producción de los

compuestos volátiles en plantas: la ruta de los ácidos grasos/lipoxigenasa que da origen

a los volátiles de hoja verde, la ruta del mevalonato/no mevalonato que da origen a los

10

terpenos, y la ruta del ácido shikímico/triptófano que da origen a los compuestos

aromáticos (Paré y Tumlinson, 1996; Paré y Tumlinson, 1999; Arimura et al., 2009;

Scala et al., 2013).

Los volátiles de hoja verde son compuestos de 6 carbonos, como aldehídos,

alcoholes y ésteres (Dudareva et al., 2004). Se liberan cuando la planta presenta daño

por herbívoros o sufren de estrés biótico/abiótico. El primer compuesto de la ruta

biosintética de los volátiles de hoja verde es el (Z)-3-hexenal, el cual se forma en el sitio

del daño inmediatamente después del ataque de herbívoros o daño mecánico (Arimura

et al., 2009). El (Z)-3-hexenal es reducido por una enzima alcohol deshidrogenasa a (Z)

-3-hexenol y este compuesto es convertido a (Z)-3-hexenil acetato por una enzima

alcohol aciltransferasa.

Algunos compuestos volátiles de hoja verde son sintetizados de novo y liberados

al momento, en horas, o días después del daño (Paré y Tumlinson, 1997a, b). En una

planta sin daño éstos son emitidos en cantidades traza y se emiten inmediatamente

después de la ruptura celular (Turlings et al., 1995; D’Auria et al., 2007).

Se han identificado compuestos volátiles característicos de grupos de plantas

hospederas, como los glucosinolatos de la familia Brassicaceae. Estas sustancias pueden

variar cualitativa y cuantitativamente entre genotipos de plantas, tejidos y estados

ontogénicos, por lo que la influencia en los insectos herbívoros puede ser variada. Los

glucosinolatos son defensas constitutivas, sus niveles están influenciados por factores

abióticos y bióticos que incluyen el daño provocado por el insecto (Pivnick et al., 1994;

Hopkins et al., 2009; Städler y Reifenrath, 2009).

En especies de plantas Brassica y Sinapsis, Tollsten y Bergström (1988)

identificaron compuestos como alcoholes, aldehídos y productos de degradación de

11

glucosinolatos. Los isotiocianatos estuvieron presentes en hojas maceradas, mientras

que los terpenos se identificaron en plantas completas cortadas desde el tallo (Tollsten y

Bergstrom, 1988).

En diversos estudios, se han identificado los compuestos volátiles de las plantas

y su efecto biológico. Para la identificación se ha usado la cromatografía de gases

acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), una técnica suficientemente sensible

para identificar compuestos volátiles desconocidos en bajas concentraciones, además,

los registros en electroantenografía (EAG) han permitido confirmar la actividad

biológica a los compuestos más atractivos (Hartlieb y Rembold, 1996).

Por ejemplo, Fraser et al. (2003) en Manduca sexta (Linnaeus), analizaron

extractos de volátiles de plantas hospederas, encontrando 23 compuestos (alifáticos,

aromáticos y terpenoides) con actividad biológica e identificaron 15 de ellos en CG-

EM. Una mezcla de 8 compuestos comunes en sus plantas hospederas como el (Z)-3-

hexenil acetato, nonanal, decanal, fenil acetaldehído, metil salicilato, benzil alcohol,

geranil acetona, (E)-nerolidol) fue evaluada y encontraron que para las hembras, la

mezcla causó más atracción que los compuestos evaluados individualmente.

En otro estudio, Tasin et al. (2006) observaron que las hembras de Lobesia

botrana (Denis y Schiffermüller) son atraídas a una mezcla de 10 compuestos de planta

hospedera, aunque también se demostró que una combinación de tres compuestos, entre

ellos el compuesto más abundante el (E)-β-cariofileno, provocó el mismo efecto

atrayente.

La mezcla de compuestos atrayentes debe estar en una proporción tal y como la

liberan las plantas; aunque Najar-Rodríguez et al. (2010) reportan que la proporción de

compuestos de la mezcla puede variar un poco sin disminuir la atracción del insecto. De

12

manera general, se ha reportado que los insectos herbívoros responden a una mezcla de

compuestos más que a un solo compuesto (Finch y Collier, 2000; Bruce et al., 2005).

Compuestos de la familia Brassicaceae han sido reportados por Reddy y

Guerrero (2000), en extracciones de plantas de col dañadas mecánicamente se

identificaron 7 compuestos: 1-hexanol, hexanal, hexil acetato, (E)-2-hexenal, (Z)-3-

hexen-1-ol, (Z)-3-hexenil acetato y 1-hexen-3-ol, sin detectar isotiocianatos. En pruebas

de laboratorio, el (Z)-3-hexenil acetato fue el más atractivo para la palomilla Plutella

xylostella (Linnaeus), y en mezcla con feromona sexual aumentó las capturas de

hembras encampo.

Para Rojas (1999) el alil isotiocianato identificado en extractos de col estimuló

las hembras apareadas de M. brassica para que aterrizaran sobre la planta. También

identificó volátiles como el (E)-2-hexenal y el (Z)-3-hexenil acetato, los cuales

provocaron vuelos hacia la fuente de emisión.

4. Factores que influencian la selección en adultos

El proceso de búsqueda de la planta hospedera y de búsqueda de pareja no sólo

depende del estímulo olfatorio, la recepción del estímulo y la respuesta a los mismos

(Proffit et al., 2011), puede depender en gran medida de factores fisiológicos tales como

la edad de la hembra en la que se aparea (Pivnick et al., 1990; Browne, 1993), edad y

estado de apareamiento del macho (Roelofs, 1995) y de la experiencia a los volátiles de

hospedera (Pivnick et al., 1990; Petzold, 2009) y a la feromona sexual (Anton et al.,

2007).

El efecto de la edad al apareamiento se ha estudiado en algunas especies de

palomillas (Browne, 1993), por ejemplo Mechauber et al. (2002) mencionan que las

13

hembras de 4 días de edad apareadas tuvieron la máxima respuesta a los volátiles de su

planta hospedera, además, mostraron el ovipositor como señal de oviposición.

Para Rojas (1999a) e Ikeura et al. (2010) las hembras apareadas de M. brassicae

y Pieris rapae (Linnaeus) respectivamente, presentaron la máxima respuesta hacia los

volátiles de planta hospedera. En algunas palomillas las hembras vírgenes son

fuertemente atraídas a los volátiles de la planta hospedera (Saveer et al., 2012).

En el caso de los machos, en algunas especies de palomillas (Anton y Gadenne,

1999; Gadenne y Anton, 2000; Gadenne et al., 2001; Zhang et al., 2009; Soques et al.,

2010; Barrozo et al., 2010a, 2010b; 2011) la edad y el estado de apareamiento

modifican el proceso de recepción y procesamiento olfatorio de la feromona sexual.

La condición fisiológica en un insecto es fundamental para elegir la planta

hospedera y la pareja para apareamiento, sin embargo, su capacidad de aprendizaje les

permitirá adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes (Landolt y Molina, 1996;

Olsson et al., 2006; Dukas, 2008; Dukas et al., 2012).

Para Matthews y Matthews (2010) el aprendizaje es un cambio adaptativo en el

comportamiento y ocurre como resultado de la experiencia o la práctica. En palomillas,

se ha documentado que el aprendizaje cambia la respuesta a las señales olfativas

relacionadas con la oviposición (Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al., 1998b;

Rojas y Wayt, 1999b), la alimentación (Cunningham et al., 1998a), y la atracción sexual

(Anderson, 2003; Anderson et al., 2007).

Sin embargo, no es claro cuánto puede influir el aprendizaje en la respuesta a los

estímulos olfativos (Prokopy y Lewis, 1993). En este contexto, hay varios tipos de

aprendizaje en insectos herbívoros el aprendizaje asociativo y el no asociativo, éste

último involucra a la habituación y a la sensibilización (Papaj y Prokopy, 1989).

14

La habituación es probablemente la forma más común de aprendizaje en

insectos, es una disminución gradual de la capacidad de respuesta a un estímulo, por

exposición repetida al mismo (Daly y Figueredo, 2000; Dukas, 2008; Matthews y

Matthews, 2010). Este tipo de aprendizaje ha sido reportado en varias palomillas, en

estudios de pre-exposición a volátiles de planta hospedera (Rojas y Wayt, 1999b) como

para feromona sexual (Bartell y Lawrence, 1973, 1976, 1977; Bartell y Roelofs, 1973;

Figueredo y Baker, 1992; Daly y Figueredo, 2000).

En la sensibilización por pre-exposición al estímulo, hay un aumento en las

respuestas después de estimulaciones consecutivas, provocadas por cambios en la

respuesta de las neuronas postsinápticas (Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al.,

1998b; Dukas, 2008; Matthews y Matthews, 2010). Por ejemplo, hembras de

Helicoverpa armígera (Boddie) pre-expuestas a volátiles de plantas hospederas y

machos de Spodoptera litoralis (Boisduval) pre-expuestos a feromona sexual,

mostraron una sensibilización en la posterior respuesta de atracción hacia los mismos

estímulos, respectivamente (Cunningham et al., 1998b; Anderson, 2003; Anderson et

al., 2007).

5. Manejo de insectos plaga con semioquímicos

El control o manejo de insectos plaga incluye diferentes métodos entre los que se

encuentra el desarrollo de técnicas basadas en la manipulación del comportamiento, lo

cual implica comprender la biología y ecología del insecto plaga, es decir, el estudio de

condicionantes fisiológicas y la relación con su comportamiento, que permitan

interpretar de manera adecuada los datos que un sistema de trampeo pueda

proporcionar.

15

En métodos alternativos de manejo para insectos plaga de cultivos agrícolas, se

pueden usar compuestos que median las interacciones dentro y entre especies como los

semioquímicos. Por un lado, está el uso de feromonas (compuestos que median las

interacciones entre organismos de una misma especie, la interacción resulta beneficiosa

tanto para el emisor como para el receptor) (Foster y Harris, 1997), las cuales se

emplean en el monitoreo y trampeo masivo, por ejemplo, en la interrupción del

apareamiento, donde la saturación del ambiente con moléculas de feromona sexual

inhibe los receptores olfatorios de los machos lo cual impide el encuentro con la hembra

para el apareamiento.

Por otro lado, están los compuestos llamados aleloquímicos que median

interacciones entre diferentes especies, como por ejemplo las kairomonas, que son

sustancias químicas que intervienen en las relaciones interespecíficas de los insectos, en

donde el organismo receptor se beneficia y el emisor se perjudica (Metclaf y Metclaf,

1992).

A pesar de que las feromonas de insectos han sido la base de la manipulación del

comportamiento de los insectos, los estudios de identificación química y la actividad de

la aplicación acerca de los volátiles de plantas hospederas y su potencial uso en la

protección de cultivos contra insectos plaga se ha incrementado (Rodriguez-Saona y

Stelinski, 2009).

Para la aplicación de semioquímicos es necesario comprender los factores que

afectan a la relación entre insectos y plantas. Por ejemplo, para el empleo de

aleloquímicos en un sistema de manejo, es importante investigar cómo los insectos

encuentran y eligen sus plantas hospederas (Rodriguez-Saona y Stelinski, 2009).

16

Además, la identificación de los estímulos químicos de atracción o repulsión que

participan en la selección de la planta hospedera para el proceso de oviposición y la

preferencia de las larvas en los insectos herbívoros polífagos, proporcionaría una

herramienta para diseñar trampas que atraigan hembras y/o larvas recién emergidas, con

la finalidad de disminuir el daño a los cultivos agrícolas.

Una estrategia de manejo de manipulación del comportamiento con

aleloquímicos es el método Push-Pull, en donde el cultivo es protegido mediante

compuestos que enmascaran su presencia o bien repelen al insecto y simultáneamente

compuestos atrayentes desvían al insecto plaga hacia zonas de captura o plantas trampa,

donde son eliminados (Cook et al., 2007).

El empleo de semioquímicos como los volátiles sintéticos de planta hospedera

de C. decolora, en conjunto con lo que se conoce para el manejo con feromona sexual

en esta especie (Rojas et al., 2006; Muñiz et al., 2007; Gómez et al., 2012), ofrece una

oportunidad para diseñar una estrategia de manejo para este insecto plaga que involucre

ambos estímulos olfativos. Tal estrategia permitiría monitorear C. decolora antes de que

afecte al cultivo, dando una gestión sostenible en la práctica de los sistemas agrícolas

que actualmente dependen en gran medida de las aplicaciones de insecticidas.

6. Copitarsia decolora como modelo de estudio

C. decolora conocida comúnmente como “gusano del corazón de la col” es una

plaga importante de plantas crucíferas en México, Centro y Sudamérica; es una especie

cuarentenada en los Estados Unidos de América (Venette y Goul, 2006). En México se

localiza principalmente en la col (Brassica oleracea var. capitata Linnaeus) (Suárez-

Vargas et al., 2006) presentándose todo el año, alimentándose del brote principal

ocasionándole deformación e inclusive la muerte de la planta (Tovar et al., 2007).

17

Para el manejo de C. decolora, se han utilizado insecticidas convencionales, el

manejo cultural, mediante prácticas agrícolas realizadas por los productores como

preparación del suelo, uso de invernaderos y eliminación de plantas afectadas (Cibrián,

1999).

Una alternativa para el manejo de este insecto, es el empleo de modificadores del

comportamiento, tales como los volátiles de planta hospedera, los atrayentes y los

repelentes. Al respecto, son escasos los estudios acerca del comportamiento de

búsqueda y la aceptación de la planta hospedera.

Se conoce que las larvas y las hembras de C. decolora, eligen plantas de col

entre diferentes plantas hospederas (Pérez, 2010; Acatitla, 2010). En estudios de

preferencia alimentaria de larvas neonatas hacia cinco especies de plantas hospederas,

las larvas se alimentaron significativamente más de plantas de col que de cualquier otra

planta evaluada (Perez, 2010). Pero no hay trabajos que precisen la identidad química

de los compuestos involucrados en la atracción de las hembras o larvas a la planta

hospedera.

Se sabe que la edad en la que las hembras de C. decolora alcanzan el máximo

potencial reproductivo posiblemente está relacionada con la máxima atracción a los

volátiles de planta hospedera (Rojas y Cibrian-Tovar, 1994; Callado-Galindo et al.,

2013), pero no se ha establecido la preferencia de oviposición sobre su planta hospedera

y el involucramiento de las larvas en la búsqueda y aceptación de la planta hospedera.

Por otra parte, en campo se ha evaluado la eficiencia de dispositivos en trampas con

feromona sexual sintética como posible alternativa de manejo al uso de insecticidas

sintéticos (Rojas et al., 2006; Muñíz et al., 2007; Gomez et al., 2012), pero se

desconoce el efecto de los diferentes factores ambientales (Dumont y McNeil, 1992)

18

sobre la respuesta de los machos a la feromona sexual. El conocimiento de la respuesta

hacia la feromona o a las plantas hospederas de las palomillas cuando se ven afectadas

por factores bióticos, ayudará a entender el proceso de atracción de los machos a las

trampas cebadas con feromona sexual saber si es posible la inclusión de volátiles de las

plantas en esa misma trampa diseñada para capturar machos y capturar hembras, lo que

generaría una herramienta de monitoreo o control más potente.

7. Objetivos

El objetivo de esta tesis fue generar y aportar conocimiento sobre el estudio de

los compuestos volátiles de col y de algunos factores bióticos que afectan el

comportamiento de atracción de Copitarsia decolora en la búsqueda y aceptación de su

planta hospedera, así como en la búsqueda de pareja por parte de los machos.

El estudio incluyó los siguiente capítulos; en el Capítulo II se estudió la

atracción de hembras de C. decolora a extractos de compuestos volátiles de hospedera,

se da a conocer el extracto de col con el disolvente que provocó la máxima atracción en

las hembras de C. decolora.

Posteriormente en el Capítulo III, se identificaron los compuestos volátiles del

extracto de col que fue más atractivo para las hembras, el tipo de compuestos atrayentes,

y la respuesta antenal y comportamental de las hembras al extracto y a la mezcla de

compuestos sintéticos identificados.

Para conocer si el estado fisiológico y la experiencia afectan la respuesta de

hembras a los volátiles de col en la búsqueda de planta hospedera y de machos a la

feromona sexual en la búsqueda de pareja, en el Capítulo IV, se estudió la edad de

apareamiento de las hembras, el efecto de la edad y el estado de apareamiento de los

19

machos, sobre las respuestas de atracción provocadas por extractos de col y extractos

glandulares de feromona sexual, respectivamente. Además, se estudió el efecto de la

pre-exposición de hembras apareadas a los volátiles de col y de machos vírgenes al

extracto glandular de feromona sexual sobre la respuesta de atracción a esos estímulos

químicos.

En el Capítulo V, se conoció la preferencia de oviposición por las hembras,

comparando como sitio de oviposición la planta de col o alrededor de ésta.

Finalmente en el Capítulo VI, se estudió la atracción de larvas neonatas a

compuestos volátiles de col, se investigó si las larvas se desplazan a la planta hospedera

y si son atraídas al mismo extracto de hospedera y a la misma mezcla de compuestos

sintéticos que atrae a las hembras.

20

II. Atracción de hembras de C. decolora apareadas a compuestos volátiles de la col

1. Introducción

Los olores que emiten las plantas, además de ser atrayentes para insectos

herbívoros, pueden ser también disuasivos de los procesos de oviposición y/o

alimentación (Bernays y Chapman, 1994; Renwick y Chew, 1994; Schoonhoven et al.,

2005).

Las plantas sin daño mantienen ciertos niveles de emisión de compuestos

volátiles orgánicos (Dudareva et al., 2004; Baldwin, 2010). Esta composición de los

volátiles que libera la planta hospedera puede variar cualitativa y cuantitativamente

(Bruce et al., 2005; Holopainen y Gershenzon, 2010; Bruce et al., 2010; Niinemets et

al., 2013) en condiciones de estrés abiótico, por ejemplo el daño mecánico (Gouinguene

y Turlings, 2002; Holopainen y Gershenzon, 2010) y biótico, por ejemplo por

herbívoros (Holopainen y Gershenzon, 2010).

En algunos estudios se ha observado que el daño mecánico no induce un

incremento en la emisión de volátiles (Bricchi et al., 2010), en cambio la emisión de

éstos aumenta drásticamente cuando los insectos herbívoros se alimentan de su planta

hospedera. Esta mezcla de compuestos volátiles emitidos por la planta en respuesta al

daño de herbívoros incluye a los llamados volátiles de hoja verde (Dudareva et al.,

2004; Hare, 2011). Por lo tanto, estos compuestos inducidos por herbivoría han sido

considerados como una forma de defensa indirecta en las plantas para combatir a los

herbívoros mediante la atracción de sus enemigos naturales (Turlings et al., 1995, De

Moraes et al., 1998; De Moraes et al., 2001; Heil et al., 2008; Howe y Jander, 2008;

Wu y Baldwin, 2010; Mumm y Dicke, 2010; Heil et al., 2012; Holopainen y Bland,

2013; Scala et al., 2013).

21

Los volátiles que liberan las plantas constituyen información química que puede

ser usada por algunas especies de palomillas que ovipositan en ellas, aun con el riesgo

de que sus huevecillos o larvas sean atacadas por depredadores o parasitoides (Loughrin

et al., 1995). El estudio de estas interacciones planta-insecto, han permitido entender

cómo las palomillas utilizan los diferentes tipos de volátiles y cómo modulan su

comportamiento en la búsqueda de la planta hospedera (Bernays y Chapman, 1994;

Shoonhoven et al., 2005).

En los adultos de C. decolora, son escasos los estudios acerca de los estímulos

olfativos involucrados en la búsqueda de la planta hospedera y su modificación por

efecto del daño en la planta. Por lo anterior, se propuso estudiar la atracción de hembras

apareadas a los extractos de volátiles de la col sin daño y con daño.

2. Materiales y Métodos

2.1. Insectos

Los insectos utilizados en los bioensayos se obtuvieron de la colonia de C.

decolora ubicada en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos-IPN en Yautepec,

Morelos, México; mantenida a 22°C (±3), 60 % (± 3) de HR y 12 horas luz: 12 horas

oscuridad, con la fotofase y escotofase invertidas respecto al ciclo de luz natural, para

realizar los bioensayos durante el día. Los estados inmaduros fueron alimentados con

una dieta para lepidópteros (Rojas et al., 2003). Se tuvo un intervalo de peso de las

pupas de 0.35 g a 0.45 de acuerdo a Callado-Galindo et al. (2013) para descartar la

influencia del mismo en la respuesta a los volátiles de col.

Los adultos se mantuvieron en jaulas de plexiglás (20x20x20cm) y se

alimentaron diariamente con solución azucarada al 50% colocada en un algodón, la cual

se cambió cada tercer día. En las jaulas de plexiglás se aparearon por jaula 30 machos y

22

30 hembras. En los bioensayos se utilizaron hembras apareadas de 4-5 días de edad

(n=10 por tratamiento).

2.2. Plantas

Las plantas de col se cultivaron en condiciones de invernadero a 20°C (±2), 60

% HR (± 2) y fotoperiodo 13 horas luz: 11 horas oscuridad. Estas se colocaron en

macetas de plástico (20 cm de alto por 25 cm de diámetro) conteniendo suelo estéril y se

requirieron de 30-40 días de crecimiento, antes de la floración y con un peso fresco

aproximado de las plantas de 120 g.

Para la colecta de volátiles se utilizaron plantas de col sin daño, con daño por

larvas (10 larvas de tercer estadio puestas en una planta durante media hora antes de la

extracción y retiradas al momento de la extracción) y con daño mecánico (10 cortes en

las hojas realizados 5 minutos antes de la extracción, cada corte de 1 cm).

2.3. Extracción de volátiles de la col sin daño y con daño

El sistema de colecta (Figura 3) consistió en colocar dentro de una cámara de

vidrio (30 cm de largo y 20 cm de diámetro) (modificado de Geervliet et al., 1997) una

planta de col sin daño o en diferentes condiciones de daño. Al sistema de colecta de

volátiles en cada planta se le adaptó en la entrada una placa de acrílico sujetando la

planta por el tallo y aislando el suelo, y en la salida de la cámara una micropipeta de

vidrio (13 cm largo × 0.6 cm diámetro externo) conteniendo 250 mg de material

adsorbente Super Q (Alltech Assoc, Inc., Deerfield, Illinois). A la cual se le conectó una

bomba de vacío (Welch® USA) con un flujo 1 L/min medido por un flujómetro (Cole

Palmer, Ev-03217-06, USA) para extraer los volátiles liberados por las plantas.

La colecta de volátiles se llevó a cabo durante tres días consecutivos usando una

planta/día durante las 3 primeras horas de la escotofase a 20°C y 60 % HR.

23

Posteriormente, para los extractos de plantas sin daño los compuestos capturados se

disolvieron en 3 mL de hexano (HPLC, JT Baker, EUA), diclorometano (HPLC, JT

Baker, EUA) o metanol (HPLC, JT Baker, EUA) Después, cada muestra se reconcentró

a 300 µL con corriente de nitrógeno y se almacenó a 4 ̊ C hasta su utilización en los

bioensayos. Para los extractos de plantas de col con daño se utilizó sólo hexano.

Figura 3. Sistema de extracción de volátiles de plantas de col en diferentes condiciones.

2.4. Respuesta de atracción en túnel de viento a extractos de col

El comportamiento de las palomillas hacia el estímulo olfativo (extracto de

volátiles de col sin daño con diferentes disolventes, daño por larva o daño mecánico) se

midió en un túnel de viento (Figura 4) de plexiglás (180x80x80 cm) equipado con un

extractor (Frecuency Inverter CFW-08 Software 4.1x, Mineapolis, USA) que generó

24

una corriente de aire a una velocidad de 40 cm/s y limpiado por un filtro de carbón

activado. La velocidad del viento se midió con un anemómetro (Sper Scientific 840003,

Taiwan) a 30 cm del piso y en el centro del túnel.

Los experimentos fueron realizados en las dos primeras horas de inicio de la

escotofase a 20°C (±3), 60 % (± 5) de humedad relativa (HR) y luz roja (3 focos rojos

de 20 watts). Las hembras fueron transferidas antes del inicio de la escotofase de su

cámara de cría al túnel de viento. En el extremo donde se ubica el extractor se colocó

una hembra y en el extremo opuesto se pusieron 10 µL (en estudios pre-eliminares, a 10

µL las palomillas presentaron una respuesta de atracción) del extracto de col sobre un

papel filtro Waltman No.1 (Whatman ® 2V, England) de 2 X 2 cm. Después de 20 s,

tiempo suficiente para que el disolvente se evaporara, la hembra fue liberada en el túnel

por 300 s y se registró su comportamiento. Después de cada bioensayo se limpió el

túnel de viento durante 300 s (flujo de viento sin estímulo) para eliminar cualquier

posible contaminación antes de continuar con los experimentos.

En el túnel de viento se registró cuando la hembra desplegó el ovipositor,

presentaba un vuelo orientado (vuelo mayor a los 150 cm en el túnel de viento) hacia el

estímulo (Modificado de Picimbon et al., 1997). No se incluyó el patrón de

comportamiento de aterrizaje, ya que en estudios pre-eliminares las hembras no

mostraron aterrizajes sobre el estímulo.

Por una parte, se compararon los datos de los patrones de comportamiento

mostrados por la hembra (desplegó el ovipositor y si presentó un vuelo orientado) hacia

el extracto de col sin daño con diferentes disolventes (Planta de col= PC, extracto de col

con hexano= EH, extracto de col con diclorometano= ED y extracto de col con

metanol= EM), la planta de col y con el control (Aire, hexano= H, diclorometano= D y

25

metanol= M). Por otra parte, se compararon los datos de los patrones de

comportamiento mostrados por la hembra (desplegó el ovipositor y vuelo orientado)

hacia el extracto de col sin daño con los mostrados por los extractos de col con daño por

larva y daño mecánico.

Figura 4. Túnel de viento para evaluar la respuesta de los insectos en diferentes condiciones a

los volátiles de col.

2.5. Análisis estadístico

Se realizó una prueba de χ² para probar si las respuestas de las hembras son

significativamente dependientes de los estímulos olfativos (p<0,05). Las pruebas se

realizaron con el programa estadístico Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., Chicago,

Illinois).

26

3. Resultados

3.1. Respuesta de atracción en túnel de viento a volátiles de la col

No se encontraron diferencias en el patrón de vuelo orientado con extracto

hexánico en la atracción, comparando con una planta de col, pero si con respecto al

extracto con diclorometano (χ²= 7.521; gl= 1; p= 0.006) y el extracto con metanol (χ²=

72.521; gl= 1; p= 0.001) (Figura 5). Los grupos de insectos evaluados al control (aire,

hexano, diclorometano y metanol) no tuvieron ninguna respuesta.

El mayor porcentaje de hembras que desplegó el ovipositor se observó para la

planta de col y el extracto hexánico, aunque en esos grupos no hubo diferencia

significativa, pero si con el control (χ²= 82.881; gl= 1; p= 0.001), con el extracto con

diclorometano (χ²= 16.990; gl= 1; p= 0.001) y con el extracto de metanol (χ²= 82.881;

gl= 1; p= 0.001) (Figura 5).

El extracto hexánico de volátiles de col fue el que provocó la máxima respuesta

de atracción en las palomillas, debido a esto, el hexano fue el disolvente que se ocupó

para realizar las extracciones de volátiles de col sin daño o con daño.

El extracto de volátiles de col sin daño provocó una máxima respuesta de las

hembras apareadas de C. decolora, en comparación con los extractos de col con

diferentes tipos de daño. La diferencia significativa se observó en el patrón de

comportamiento de vuelo orientado (para daño por larva χ²= 16.990; gl= 1; p= 0.001 y

para daño mecánico χ²= 7.521; gl= 1; p= 0.006). Entre los tipos de daño en este patrón

de comportamiento no hubo diferencia significativa (Figura 6).

27

Tratamiento

PC EH ED EM

Re

sp

ue

sta

de

he

mb

ras a

vo

látile

s d

e c

ol (%

)

0

20

40

60

80

100

Vuelo orientado

Despliega ovipositor

b

c

c

a

bb

a

a

b

Figura 5. Respuesta (%) de hembras apareadas a una planta completa y a extractos volátiles de

col con diferentes disolventes, en túnel de viento. Planta de col= PC, extracto de col con

hexano= EH, extracto de col con diclorometano= ED y extracto de col con metanol= EM. Letras

diferentes sobre barras del mismo color indican valores significativamente diferentes al p<0.05

(χ²), n=10.

Para el patrón de comportamiento de desplegar el ovipositor hubo diferencia

significativa entre el extracto de col sin daño y daño por larva (χ²= 31.687; gl= 1; p=

0.001), sin daño y daño mecánico (χ²= 7.220; gl= 1; p= 0.007) y daño por larva y daño

mecánico (χ²= 8.595; gl= 1; p= 0.003) (Figura 6).

28

Condición del extracto de volátiles de col

Respuesta

de h

em

bra

s a

extr

acto

s d

e c

ol

(%)

0

20

40

60

80 Vuelo orientado

Despliega ovipositorb

a

a

a

c

b

Sin daño Daño por larva Daño mecánico

Figura 6. Respuesta de (%) de hembras apareadas a extractos volátiles de col sin daño y con

daño, en túnel de viento. Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores

significativamente diferentes al p<0.05 (χ²), n=10.

4. Discusión

Los resultados de este trabajo, muestran que entre los diferentes disolventes

utilizados para la extracción de volátiles de col, el extracto de col con hexano provocó la

máxima atracción en las hembras apareadas de C. decolora. Aunque las hembras de C.

decolora no presentaron el comportamiento de aterrizaje en la fuente de emisión,

podemos valorar el vuelo orientado hacia la fuente de olor como un indicador de

atracción (Visser, 1986). También, la hembra puede dar señales al momento de percibir

los volátiles de la planta hospedera, como es el desplegar el ovipositor como señal de

oviposición (Mechauber et al., 2002) como se observó en las hembras de C.decolora.

29

En otras especies de palomillas, se ha encontrado que solamente con

determinados disolventes se extraen los compuestos que estimulan a las hembras para la

búsqueda de planta hospedera, como es el caso de E. postvittana, los extractos de planta

hospedera con metanol y diclorometano no atrajeron a las hembras, pero si con pentano

(Foster y Howard, 1998).

En cuanto al efecto del daño en las plantas, se observó que el extracto de plantas

de col sin daño provocó mayor atracción en las hembras de C. decolora que aquellos

contenidos en extractos de plantas con los dos tipos de daño, a diferencia de lo que

ocurre en otras especies de palomillas como Helicoverpa armígera (Hübner) (Hartlieb y

Rembold, 1996), M. brassicae (Rojas, 1999) y P. xylostella (Reddy y Guerrero, 2000)

las cuales presentan mayor respuesta a extractos de su planta hospedera con daño.

Las hembras de C. decolora, tuvieron menor porcentaje de respuesta a los

extractos de col con daño por larvas que al daño mecánico. El daño en las plantas, ya

sea ocasionado por la alimentación de herbívoros, daño mecánico, o por la oviposición

(Wu y Baldwin, 2010), desencadena reacciones enzimáticas que cambian la

composición de la emisión de los volátiles (Agelopoulos y Pickett, 1998; Van Loon y

Dicke, 2001; Shiojiri et al., 2006) respecto a la condición sin daño, lo que afecta el

comportamiento de los insectos (Dicke et al., 1990; Schoonhoven et al., 2005;

Agelopoulos y Pickett, 1998).

Cuando las plantas presentan daño por herbívoros, hay incremento en la emisión

de compuestos volátiles y algunos de éstos se emiten hasta varias horas después del

daño (Paré y Tumlinson, 1998). Otros volátiles son liberados de manera inmediata al

daño tales como los volátiles de hoja verde, que pueden ser compuestos atractivos

(Turlings et al., 1995) o repulsivos a los insectos herbívoros (Allmann et al., 2013).

30

Los volátiles de hoja verde proveen información de la localización exacta del

ataque del herbívoro (Scala et al., 2013). Entre estos compuestos se han reportado

alcoholes, aldehídos y ésteres los cuales son sintetizados y emitidos, en cuestión de

segundos, a partir de ácidos grasos insaturados (Turlings et al., 1995; Paré y Tumlinson,

1997a; Gang et al., 2001; D’Auria et al., 2007; Arimura et al., 2009).

El tipo de volátiles que emite la planta hospedera guía a la palomilla en el

proceso de búsqueda (Späthe et al., 2013), en este sentido, C. decolora presentó mayor

vuelo orientado hacia extractos de col sin daño y menor hacia los extractos de col con

daño, aunque no se observaron aterrizajes en ningún tipo de estímulo. Normalmente las

hembras de noctuidos prefieren una planta hospedera en condiciones “óptimas” para el

crecimiento y desarrollo de su descendencia (Schoonhoven et al., 2005) como sucede en

otras palomillas (Landolt, 1993; De Moraes et al., 2001; Kessler y Baldwin, 2001;

Huang et al., 2009).

Cuando una hembra aterriza en una planta independientemente de su condición

“óptima” para el desarrollo larval, puede ser debido a que selecciona la planta hospedera

de la cual se alimentó en su etapa de larva (Barron, A. 2001).

Otra explicación a la correlación negativa entre la preferencia de la hembra por

la planta hospedera y el desarrollo larval es que en ocasiones las hembras prefieren

ovipositar en plantas libres de enemigos naturales que en plantas en condiciones

“óptimas” para el crecimiento de las larvas (Jeffries y Lawton, 1984). También, pueden

existir compuestos repelentes que alejen a la hembra de la planta hospedera (Renwick y

Chew, 1994).

31

III. Identificación de los compuestos volátiles de la planta de col

1. Introducción

La respuesta comportamental de orientación hacia la fuente de olor de los

insectos herbívoros en la búsqueda de la planta hospedera, depende de una mezcla de

compuestos más que a un compuesto por sí solo (Dicke y van Loon, 2000).

La identificación de los compuestos atractivos para los herbívoros es parte

integral del uso y la manipulación de los semioquímicos como componentes

importantes de una estrategia de manejo de plagas (Shoonhoven et al., 2005). Para esto,

la actividad antenal a compuestos identificados y el estudio comportamental en túnel de

viento debe tener una correlación positiva en función de la atracción de los insectos

herbívoros.

Es importante que la mezcla de compuestos atrayentes esté en una proporción tal

como la liberan las plantas; aunque Najar-Rodríguez et al. (2010) reportan que la

proporción de compuestos de la mezcla puede variar un poco sin disminuir la atracción

de la misma. Algunas palomillas como H. armígera son atraídas a las mezclas de

compuestos en la misma proporción que extractos de su planta hospedera (Rembold et

al., 1991; Hartlieb y Rembold, 1996).

La mezcla de compuestos como (Z)-3-hexenil acetato, nonanal, decanal, fenil

acetaldehído, metil salicilato, benzil alcohol, geranil acetona y (E)-nerolidol provocó en

las hembras de M. sexta mayor atracción que los compuestos evaluados individualmente

(Fraser et al., 2003). En otras palomillas, una combinación de tres compuestos volátiles

de hospedera, tienen el mismo efecto atrayente que la mezcla de 10 compuestos (Tasin

et al., 2006).

32

Algunos compuestos de la familia Brassicaceae han sido reportados por Reddy y

Guerrero (2000), como el (Z)-3-hexenil acetato. Este compuesto fue el más atractivo

para la palomilla P. xyllostella, y en mezcla con feromona sexual aumentó las capturas

de hembras en campo. El (Z)-3-hexenil acetato, junto con el (E)-2-hexenal identificado

en extractos de col estimuló las hembras apareadas de M. brassicae provocando vuelos

hacia la fuente de emisión (Rojas, 1999).

En C. decolora, no se han identificado los estímulos que la atraen a la planta de

col, por lo que en el presente estudio, se identificaron los compuestos de la planta de col

que provocan la atracción de las hembras apareadas, para ello, se evaluó la respuesta

antenal de las hembras apareadas a los compuestos identificados y la atracción de las

hembras a la mezcla de compuestos sintéticos en túnel de viento.

2. Materiales y Métodos

2.1. Insectos

Los insectos utilizados en los bioensayos se obtuvieron, mantuvieron y se

aparearon como lo descrito en el Capítulo II, en la Sección 2.1.

Para los bioensayos de electroantenografía (n=12) y de túnel de viento (n=10)

por tratamiento) se ocuparon las antenas de hembras apareadas de 4-5 días de edad.

2.2. Plantas

Para la extracción de volátiles se utilizaron plantas de col sin daño, las que se

obtuvieron y mantuvieron como lo descrito en el Capítulo II, en la Sección 2.2.

2.3. Extracción de compuestos volátiles de la col

Los extractos de plantas de col sin daño se realizaron como se describe en el

Capítulo II, en la Sección 2.3, con la variante de colocar dentro de la cámara de vidrio

33

sólo plantas de col sin daño. Además, los compuestos capturados se extrajeron con

hexano.

2.4. Análisis químico e identificación de los compuestos

Para el análisis e identificación del perfil químico del extracto de volátiles de

col, el cual fue más atractivo para las hembras apareadas en los bioensayos en túnel de

viento, se utilizó un cromatógrafo de gases (CG) (HP 6890) acoplado a un

espectrómetro de masas (EM) (HP 5972) (Agilent, EUA). Se utilizó una columna no

polar HP 5 MS (30 m, 250 µm de diámetro interno y 0.25 µm de espesor de película)

(Agilent, Palo Alto, CA). La temperatura inicial del horno fue de 60°C la que se

incrementó 4°C/min hasta 220°C (Tollsten y Bergstrom, 1988). El gas acarreador fue

helio a un flujo constante de 1 mL/min. La temperatura del inyector fue de 225°C y del

auxiliar de 250°, se utilizó el inyector en modo Splitless durante 18 s. El EM se trabajó

en ionización electrónica (70 EV), en modo SCAN y en un intervalo de masas de 35 a

550 UMA.

La identificación de los compuestos se llevó a cabo considerando sus tiempos de

retención e índices de retención (Kovats) (Kovats, 1958) y comparando los espectros de

masas con los de la biblioteca espectral (NIST/EPA/NIH. 2002) y por comparación con

estándares sintéticos (Sigma Aldrich®, Toluca, México). Se inyectaron alícuotas del

extracto de col de 2 µL.

Los compuestos químicos 6-metil-5-hepten-2-ona (pureza≥ 99 %), (Z)-3-hexenil

acetato (pureza≥ 98 %), limoneno (pureza≥ 98 %) nonanal (pureza≥ 98 %) decanal

(pureza≥ 98 %) tetradecano (pureza≥ 99.5 %) pentadecano (pureza≥ 98 %) hexadecano

(pureza≥ 99 %) y heptadecano (pureza≥ 99 %) fueron obtenidos de (Sigma Aldrich®,

Toluca, México).

34

2.5. Respuesta electroantenográfica al extracto y a la mezcla de sintéticos

El análisis y medición de las respuestas en electroantenografía (EAG) se efectuó

en un equipo Syntech (Kirchzarteng, Alemania). Una vez que la antena del insecto fue

desprendida, se montó entre dos electrodos metálicos, el electrodo registrador se colocó

en la parte distal del funículo, y el electrodo de referencia en el segmento de la base de

la antena. A ambos electrodos se les agregó gel conductor Syntech para facilitar el

registro de la respuesta. La señal generada por la antena fue trasmitida a un amplificador

IDAC-2 y observada en un monitor con el software EAG. La estimulación de la antena

fue por 1s con flujo de aire de 0.5 L/min transportado a la antena por una bomba

(Stimulus controler SC-55) con un flujo constante de aire puro humidificado (0.7

L/min).

Para la aplicación del estímulo, cada uno de los compuestos químicos

identificados del extracto de col y de la mezcla de compuestos identificados del extracto

de col, fueron colocados sobre piezas de papel Whatman No. 1 (1 x 0.5 cm). En cada

experimento se dejó evaporar el disolvente por 20 s, entre cada estímulo fue de 120 s y

entre cada antena fue de 300 s. En estos bioensayos, se consideraron los valores de

despolarización de las antenas, descontando las despolarizaciones provocadas por el

disolvente. Los compuestos fueron el 2 µL (6-metil-5-hepten-2-ona (14.58 pg/µL), (Z)-

3-hexenil acetato (12.35 pg/µL), limoneno (156.66 pg/µL) nonanal (148.89 pg/µL)

decanal (39.45 pg/µL) tetradecano (17.45 pg/µL) pentadecano (16.78 pg/µL)

hexadecaneo (18.11 pg/µL) y heptadecano (64.46 pg/µL).

2.6. Respuesta de atracción en túnel de viento al extracto y a la mezcla de sintéticos

Se utilizó el túnel de viento con las mismas condiciones descritas en la Sección

2.4 del Capítulo II, con la variante de que el estímulo utilizado para medir la atracción

35

de las hembras fue el extracto de col sin daño y la mezcla de compuestos sintéticos

incluyendo el 6-metil-5-hepten-2-ona (72.90 pg/µL), (Z)-3-hexenil acetato (61.77

pg/µL), limoneno (783.30 pg/µL) nonanal (744.45 pg/µL) decanal (197.23 pg/µL)

tetradecano (87.27 pg/µL) pentadecano (83.92 pg/µL) hexadecano (90.57 pg/µL) y

heptadecano (322.32 pg/µL) contra el extracto donde se identificaron los compuestos

químicos. La mezcla de compuestos sintéticos se preparó con la proporción de cada

compuesto similar al que se encontró en el extracto de col.

2.7. Análisis estadístico

Los datos obtenidos de la despolarización provocada en la antena de las hembras

por el extracto de col, mezcla y compuestos individuales sintéticos, fueron analizados

por medio de un análisis de varianza unifactorial para medidas repetidas (ANOVA MR),

después de la transformación de datos (lnx) y para las comparaciones entre grupos se

hizo una prueba de Tukey.

Los datos de los patrones de comportamiento mostrados por las hembras en túnel

de viento, se analizaron con una prueba de χ². Las pruebas se realizaron con el programa

estadístico Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., Chicago, Illinois).

3. Resultados

3.1. Identificación de los compuestos volátiles

En el análisis del extracto de col en CG-EM se identificaron 9 compuestos, una

cetona, un éster, un terpeno, 2 aldehídos y 4 hidrocarburos (Cuadro 1).

3.2. Respuesta electroantenográfica al extracto y a la mezcla de sintéticos

El extracto de col y la mezcla de compuestos químicos sintéticos provocaron una

despolarización significativamente mayor en las antenas de las hembras apareadas en

comparación con los compuestos químicos evaluados individualmente (F10/131=17.322,

36

p=0.001), aunque la mezcla de compuestos sintéticos provocó mayor despolarización

que el (Z)-3-hexenil acetato, no hubo diferencia significativa entre ellos (Figura 7).

Cuadro 1. Compuestos químicos identificados en CG-EM del extracto de col

Compuesto químico Clase Peso

molecular

Tiempo de

retención

Índice de

Kovats

6-metil-5-hepten-2-ona Cetona 126.104 7.66 693

(Z)-3-Hexenil acetato Éster 142.09 8.145 1004

Limoneno Terpeno 136.125 8.81 1017

Nonanal Aldehído 142.135 11.38 1057

Decanal Aldehído 156.151 14.79 1203

Tetradecano Alcano 198.234 21.20 1400

Pentadecano Alcano 212.25 24.1 1500

Hexadecano Alcano 226.266 27.23 1600

Heptadecano Alcano 240.281 30.03 1700

37

Figura 7. Despolarización (Promedio ± EEM) provocada por el extracto de col en antenas de

hembras apareadas. Letras diferentes indican valores que son significativamente diferentes al p

< 0.05 (Tukey), n = 12.

3.3. Respuesta de atracción en túnel de viento al extracto y a la mezcla de sintéticos

Por un lado, en el patrón de vuelo orientado el extracto de volátiles de col sin

daño provocó mayor porcentaje de atracción en las hembras apareadas que la mezcla de

compuestos químicos sintéticos equivalente, pero esta diferencia no fue significativa.

Por otro lado, hubo diferencia significativa en mostrar el ovipositor entre los dos tipos

de estímulos (χ²= 16.990; gl= 1; p= 0.001) (Figura 8).

38

Condición del estímulo

Respuesta

de h

em

bra

s a

volá

tile

s d

e c

ol (

%)

0

20

40

60

80 Vuelo orientado

Despliega ovipositora

a

a

b

Extracto de col Compuestos sintéticos

Figura 8. Respuesta (%) de hembras apareadas a extracto de col y la mezcla de compuestos

sintéticos, en túnel de viento. Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores que

son significativamente diferentes al p<0.05 (χ²), n=10.

4. Discusión

Debido al mayor porcentaje de vuelo orientado y de mostrar el ovipositor de las

hembras de C. decolora al extracto de col sin daño, se identificaron los compuestos de

dicho extracto, en donde se encontraron compuestos como el (Z)-3-hexenil acetato, este

compuesto es un derivado de un volátil de hoja verde como es el (Z)-3-hexenal.

El (Z)-3-hexenil acetato ya había sido reportado por Rojas (1999) y Reddy y

Guerrero (2000), y en estudios en túnel de viento este compuesto provocó en hembras

apareadas de P. xylostella y M. brassicae mayor porcentaje de vuelo y aterrizaje sobre la

fuente de volátiles; sin embargo, para identificar los compuestos volátiles, se ocuparon

39

extractos de hojas de col cortadas, a diferencia del extracto de la planta col sin daño,

ocupada en este estudio.

En este trabajo, el (Z)-3-hexenil acetato estuvo presente en los extractos en

plantas sin daño; algunos compuestos volátiles inducidos por daño presentan similitud

estructural con los volátiles liberados cuando no hay daño, lo que indica que sus vías

biosintéticas son semejantes (Geervliet et al., 1997).

En otras brasicáceas como Arabidopsis, el (Z) -3-hexenal se forma segundos

después de ser dañada la hoja, seguido por la formación del (Z)-3-hexenol y el (Z)-3-

hexenil acetato (D’Auria et al., 2007). El producto principal en hojas dañadas de

Arabidopsis es el (Z)-3-hexenal, mientras que el (Z) -3-hexenol y el (Z)-3-hexenil

acetato se producen en hojas parcialmente dañadas (Matsui et al., 2012). Las plantas sin

daño aledañas a las plantas que están siendo atacadas por herbívoros, pueden

incrementar la emisión de volátiles de defensa en respuesta a señales que emiten las

plantas dañadas (Dicke et al., 2003). Por ejemplo, en plantas sin daño de Arabidopsis,

se incrementó la síntesis de (Z)-3-hexenil acetato y (Z)-3-hexenol, cuando estas plantas

fueron expuestas a los volátiles de plantas de Arabidopsis con daño (Ozawa et al.,

2013).

La respuesta antenal y en túnel de viento para el extracto de col fue alta y similar

a la mezcla de compuestos sintéticos elaborada con las proporciones de compuestos

encontradas en el extracto. El (Z)-3-hexenil acetato por sí solo provocó una

despolarización alta pero no mayor al de la mezcla de compuestos. En túnel de viento,

las hembras desplegaron menos el ovipositor al exponerlas a la mezcla de compuestos

que al extracto de col, posiblemente porque en la mezcla no existen compuestos que

estímulen el proceso de oviposición (Dicke y van Loon, 2000).

40

La atracción de palomillas a la mezcla de compuestos en la misma proporción

que se encuentran en los extractos de su planta hospedera, ha sido reportado por

(Rembold et al., 1991; Hartlieb y Rembold, 1996). Se conoce que el reconocimiento de

la planta hospedera por medio del olfato puede deberse a un solo compuesto o bien a

una mezcla específica (Finch y Collier, 2000; Bruce et al., 2005; Tasin et al., 2006;

Riffell et al., 2009), lo que sugiere que los insectos tienen receptores olfativos

específicos para detectar diversos compuestos volátiles de plantas.

Cuando los insectos herbívoros detectan compuestos de plantas hospederas y no

hospederas, la proporción de volátiles emitidos por la planta hospedera (llamada mezcla

especifica) es vital en la señal olfatoria (Bruce et al., 2005). En este caso, la

especificidad dependería de una proporción particular de los compuestos más que de un

solo compuesto (Fraser et al., 2003; Bruce et al., 2005).

Se ha visto en algunas palomillas, que formular atrayentes con algunos

compuestos tiene el mismo efecto de atracción que la mezcla completa (Tasin et al.,

2006b; Cha et al., 2008; Lu et al., 2012). Para C. decolora, en otros experimentos de

túnel de viento, se podrán evaluar mezclas con menor número compuestos volátiles

identificados pero sin disminuir el efecto atractivo para las hembras.

41

IV. Factores que afectan a las hembras en la búsqueda de la planta de col y a los

machos en la búsqueda de pareja

1. Introducción

La búsqueda de la planta hospedera para oviposición o alimentación por parte de

las hembras y la búsqueda de pareja por parte de los machos en las palomillas, está

mediada principal por el olfato. El proceso de búsqueda implica una secuencia

comportamental guiada por estímulos químicos como volátiles de planta hospedera o

feromona sexual (Visser 1986; Roelofs 1995; Proffit et al., 2011). Sin embargo, su

condición fisiológica (edad y estado de apareamiento) será fundamental para realizar los

procesos de búsqueda de planta hospedera y de pareja, pero además, su capacidad de

aprendizaje les permitirá adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes (Browne,

1993; Landolt y Molina, 1996; Olsson et al., 2006; Anton et al., 2007; Dukas, 2008;

Dukas et al., 2012).

Las palomillas hembras apareadas son más atraídas a los volátiles de sus plantas

hospederas que cuando son vírgenes. Por ejemplo, hembras apareadas de M. sexta de 3

días de edad son más atraídas a su planta hospedera que hembras vírgenes o apareadas

de otras edades (Mechauber et al., 2002). En otras palomillas, las hembras vírgenes son

atraídas a sus plantas hospederas pero en menor grado que las hembras apareadas

(Pivnick et al., 1990; Rojas, 1999; Ikeura et al., 2010).

En el caso de la atracción del macho por parte de la hembra, en algunas especies

como P. xilostella (Zhang et al., 2009), Agrotis ipsilon (Hufnagel) (Anton y Gadenne,

1999; Gadenne y Anton, 2000; Gadenne et al., 2001; Barrozo et al., 2010a, 2010b;

2011), Heliothis virescens (Fabricius) y Heliothis subflexa (Guenée) (Soques et al.,

42

2010) la edad y el estado de apareamiento pueden modificar el proceso de recepción y

procesamiento olfatorio del macho a la feromona sexual.

En cuanto al aprendizaje en palomillas, se ha documentado que éste cambia la

respuesta a las señales olfativas relacionadas con la atracción sexual (Anderson, 2003;

Anderson et al., 2007), oviposición (Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al.,

1998b; Rojas y Wayt, 1999b) y alimentación (Cunningham et al., 1998a).

Algunos de estos estudios mencionados muestran que la pre-exposición a

feromona (Bartell y Lawrence, 1973, 1976, 1977; Bartell y Roelofs, 1973; Figueredo y

Baker, 1992; Daly y Figueredo, 2000) y a volátiles de planta hospedera (Rojas y Wayt,

1999b) provoca una reducción de la respuesta de atracción; pero puede en otros casos,

provocar un aumento en la respuesta a feromona sexual (Anderson, 2003; Anderson et

al., 2007) o a volátiles de planta hospedera para oviposición (Landolt y Molina, 1996;

Cunningham et al., 1998b).

En C. decolora, estudios acerca de factores bióticos que afecten la búsqueda de

la planta hospedera por las hembras o búsqueda de pareja por el macho, son escasos.

Por una parte, se sabe que en pruebas de elección entre varias plantas hospederas, las

hembras eligen plantas de col (Pérez, 2010; Acatitla, 2010). Además, se han realizado

estudios acerca del comportamiento reproductivo, donde las hembras de un intervalo de

edad alcanzan su mayor potencial reproductivo, entendido como fecundidad, fertilidad y

dinámica de oviposición (Rojas y Cibrian-Tovar, 1994; Callado-Galindo et al., 2013).

Por otra parte, aunque ya se han empleado dispositivos en trampas con feromona

sexual sintética como alternativa de manejo al uso de insecticidas sintéticos (Rojas et

al., 2006; Muñíz et al., 2007; Gomez et al., 2012), no se ha estudiado el efecto de los

43

factores ambientales (Dumont y McNeil, 1992) y fisiológicos sobre la respuesta de los

machos a la feromona sexual.

Conocer como la respuesta hacia la feromona o a las plantas hospederas de las

palomillas se ve afectada por el estado fisiológico y la experiencia de hembras y

machos, ayudará a entender el proceso de atracción de los machos a las trampas cebadas

con feromona sexual y decidir sobre la inclusión de volátiles de las plantas en esa

misma trampa diseñada para capturar machos y capturar hembras, lo que generaría una

herramienta de monitoreo o control más potente.

En este capítulo de estudió la edad al apareamiento de las hembras, el efecto de la edad

y la condición de apareamiento de los machos, sobre las respuestas de atracción

provocadas por extractos de col y extractos glandulares de feromona sexual. También,

se estudió el efecto de la pre-exposición de hembras apareadas a los volátiles de plantas

de col y de machos vírgenes al extracto glandular de feromona sexual sobre la respuesta

de atracción a esos estímulos químicos.

2. Materiales y Métodos

2.1. Insectos

Los insectos utilizados en los bioensayos se obtuvieron y mantuvieron como lo

descrito en el Capítulo II, en la Sección 2.1.

2.1.1. Edad al apareamiento en hembras

Para estudiar el efecto de la edad al apareamiento en las hembras, las pupas se

separaron por sexo en jaulas de 20x20x20 cm hasta su emergencia como adultos para su

apareamiento. Se utilizaron 10 adultos por edad: hembras de 2, 4, 6 y 8 días de edad

apareadas y se compararon con hembras vírgenes de sus respectivas edades. Los grupos

44

de hembras apareadas fueron de 2-8 días de edad vírgenes (dv) y apareadas (da)

(Callado-Galindo et al., 2013).

Después del apareamiento, cada hembra se separó individualmente en frascos de

20 cm de altura x 10 cm de diámetro y se registró la hora final de apareamiento para

sincronizar el tiempo y medir su respuesta al extracto de volátiles de col. Para

comprobar si hubo apareamiento, se disectó la bursa copulatrix y se observó la

presencia de espermatóforos.

2.1.2. Edad y estado de apareamiento en los machos

Para estudiar el efecto de la edad en los machos se utilizaron grupos de 2-3, 4-5,

6-7, 8-9 y 10-11 días de edad (n=10, para cada intervalo de edad) y para el efecto del

apareamiento, la respuesta de los machos a los extractos fue medida 24 y 48 horas

después del apareamiento (24 h-dap y 48 h-dap).

2.1.3. Acondicionamiento de los insectos para evaluar el efecto de pre-exposición a

los volátiles de col y a la feromona sexual.

Para este estudio, se utilizaron hembras y machos de 4-6 días de edad, ya que se

observó previamente que su respuesta al extracto de volátiles de col y al extracto

glandular de feromona sexual no cambio con la edad, respectivamente. Una vez

controlada la edad y para que el estado de apareamiento y el sexo no interfiriera en el

efecto del aprendizaje sobre la posterior respuesta a los estímulos olfativos, se evaluaron

machos vírgenes, machos apareados, hembras vírgenes y hembras apareadas al extracto

de volátiles de col y al extracto glandular de feromona sexual (n=10, para cada grupo de

insectos).

Aquellos grupos de insectos que presentaron una atracción significativamente

mayor en vuelo orientado hacia el estímulo (en el caso de las hembras a volátiles de col)

45

o aterrizaje en la fuente de emisión (en el caso de los machos a feromona sexual), fueron

utilizados para los experimentos del efecto de pre-exposición.

2.1.4. Efecto de pre-exposición a los volátiles de planta hospedera y al extracto

glandular de feromona sexual.

Para el efecto de pre-exposición al extracto de volátiles de planta hospedera al

extracto glandular de feromona sexual, se utilizaron los machos y las hembras que

presentaron una respuesta máxima al estímulo de los experimentos de la sección

anterior. Así, las hembras apareadas fueron pre-expuestas a 10 µl del extracto de col y

los machos vírgenes fueron pre-expuestos a 3 (EH) del extracto glandular de feromona

sexual, ambos durante 10s.

Posteriormente, los insectos se evaluaron a corto plazo (2 horas después de la

pre-exposición=2h-DP) y a largo plazo (24 horas después de la pre-exposición= 24h-DP

y 48 horas después de la pre-exposición= 48h-DP). Se hicieron 10 repeticiones para cada

tiempo evaluado. En el análisis de datos del efecto a corto y largo plazo, los insectos pre-

expuestos se compararon con insectos sin pre-exponer (SP) de edades iguales (4-6 días

de edad).

2.2. Plantas

Las plantas de col sin daño se utilizaron para la extracción de volátiles, se

obtuvieron y mantuvieron como lo descrito en el Capítulo II, en la sección 2.2.

2.3. Extracción de compuestos volátiles de la col

Los volátiles de plantas de col sin daño se obtuvieron como lo descrito en el

Capítulo II, en la Sección 2.3.

El análisis para confirmar el perfil químico de los extractos de volátiles de col y

poder utilizarlos en los bioensayos, se realizó de acuerdo a lo descrito en el Capítulo III,

46

en la sección 2.4. En todos los extractos de volátiles de col utilizados en los experimentos, se

verificó que los compuestos químicos aparecieran constantemente.

2.4. Extracción de feromona sexual

La glándula productora de feromona sexual de hembras vírgenes de 4-5 días de

edad, fue disectada de acuerdo a Rojas et al. (2006). Estas glándulas fueron colocadas en

viales de vidrio de 2 ml con un 1 ml de diclorometano como disolvente, durante 10 min.

El sobrenadante se refrigeró a -4ºC hasta su análisis químico o su utilización en los

bioensayos. Cada extracto tenía una concentración de 3 equivalentes hembra (EH) por

cada 5 μl.

2.5. Respuesta de atracción en túnel de viento al extracto

Se utilizó el túnel de viento con las mismas condiciones descritas en el Capítulo

II, en la Sección. Se utilizó como estímulo el extracto de col o el extracto glandular de

feromona sexual. En el acondicionamiento de los machos o las hembras que se pre-

expondrían a los volátiles de col, para las hembras se registró sólo el patrón de

comportamiento de vuelo orientado hacia el estímulo y para los machos cuando

aterrizaban.

En los experimentos de edad al apareamiento y pre-exposición, se registró

cuando la hembra desplegó el ovipositor o presentó un vuelo orientado (vuelo mayor a

los 150 cm en el túnel de viento) hacia el estímulo; además se registró la latencia de

activación (movimiento de antenas y de alas) y la latencia de aterrizaje o vuelo

orientado hasta la fuente de olor.

En el caso de los experimentos de edad, el estado de apareamiento y pre-

exposición se registró cuando el macho desplegó los “claspers”, el aterrizaje sobre el

estímulo, la latencia de activación y aterrizaje.

47

2.6. Análisis estadístico

Los datos de los patrones de comportamiento mostrados por las hembras y los

machos en el túnel de viento fueron analizados con una prueba de χ².

Para las hembras, los datos de latencia de activación y latencia a la fuente de olor

se analizaron por medio de un análisis de varianza unifactorial para medidas repetidas

(ANOVA MR), después de la transformación de datos (lnx) y para las comparaciones

entre grupos se hizo una prueba de Tukey.

Para los machos, los datos de latencia de activación y aterrizaje para edad y

estado de apareamiento, fueron analizados por una prueba de Kruskal-Wallis y la

comparación entre grupos con una prueba de Tukey.

Las pruebas se realizaron con el programa estadístico Sigma Plot 11 (Systat

Software Inc., Chicago, Illinois).

3. Resultados

3.1. Efecto de la edad al apareamiento en hembras

Las hembras apareadas de C. decolora de 4da y 6da fueron más atraídas por el

extracto de volátiles de col en comparación con las otras edades de hembras vírgenes o

apareadas, no se encontró diferencia significativa entre los grupos de edades de 4da y

6da, pero si con 6dv (χ²= 52.769; gl= 1; p= 0.001), con 4dv y 8da (χ²= 31.687; gl= 1; p=

0.001) y con 2da (χ²= 16.990; gl= 1; p= 0.001) (Figura 9).

Para el patrón de comportamiento de desplegar el ovipositor no hubo diferencia

significativa entre los grupos de 4da y 6da, todos los demás grupos de hembras no

desplegaron el ovipositor (Figura 9).

No se encontró diferencia significativa entre los grupos de hembras apareadas

para la latencia de activación y latencia de vuelo orientado.

48

Edad y condición de las hembras

2da 4dv 4da 6dv 6da 8da

Re

sp

ue

sta

a e

xtr

acto

s d

e c

ol (

%)

0

10

20

30

40

50

60

70

Vuelo orientado

Despliega ovipositor

a

ab

b

c c

a

a

ab

a

Figura 9. Respuesta (%) de hembras vírgenes y apareadas a extracto de col, en túnel de viento.

Hembras de días de edad vírgen (dv) y hembra de días de edad apareada (da). Letras diferentes

sobre barras del mismo color indican valores que son significativamente diferentes al p<0.05,

(χ²), n=10.

3.2. Edad y estado de apareamiento en los machos

En el túnel de viento, se observó que la atracción de los machos al extracto fue

mayor a los 4-5 días y después disminuyó conforme incrementó la edad (Figura 10). Los

machos de 4-5 y de 6-7 días de edad no presentaron diferencias significativas, pero si

con los otros grupos en los patrones de comportamiento de aterrizaje para 2-3 y 8-9 días

de edad (χ²= 52.769; gl= 1; p= 0.001) y para 10-11 días de edad (χ²= 72.521; gl= 1; p=

49

0.001) y mostrar “claspers” para 2-3 días de edad (χ²= 20.056; gl= 1; p= 0.001) y para 8-

9 y 10-11 días de edad (χ²= 8.526; gl= 1; p= 0.004) (Figura 10.

Edad de los machos (días)

2-3 4-5 6-7 8-9 10-11

Re

sp

ue

sta

a e

xtr

acto

de

fe

rom

on

a s

exu

al (

%)

0

20

40

60

80

100

Aterrizaje

Despliega claspers

a

a

a

b

b

b

b

a a

a

Figura 10. Respuesta (%) de grupos de machos vírgenes a extracto glandular de feromona

sexual, en túnel de viento. Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores que

son significativamente diferentes al p<0.05 (χ²), n=10.

Por otra parte, los machos de 4-5 días de edad presentaron una latencia de

activación y aterrizaje significativamente menores que aquellos mostrados por los

machos de 2-3, 8-9 y 10-11 días de edad (H= 24.167, H= 28.577, p= 0.001), pero no

con aquellos de 6-7 días (Figura 11).

50

Edad de los machos (días)

Late

ncia

de a

ctivació

n (

s)

0

10

20

30

40

50

Late

ncia

de a

terr

izaje

(s

)

0

100

200

300

8-92-3 4-5 6-7 10-11

bc

a

ab

c

c

a

ab

b bb

Figura 11. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Q1 < Mediana < Q2) por grupo de

edad de machos vírgenes en respuesta al extracto glandular de feromona sexual, en el túnel de

viento. Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores que son

significativamente diferentes al p < 0.05 (Tukey), n = 10

Los machos vírgenes presentaron las mayores respuestas de atracción al extracto

que los machos evaluados 24 y 48 h después de apareados. Se encontraron diferencias en

el comportamiento de aterrizaje para los machos 24 h-dap (χ²= 18.484; gl= 1; p= 0.001)

y para los machos 48 h-dap (χ²= 48.505; gl= 1; p= 0.001) (Figura 12).

Se observó que el apareamiento tiene un efecto tanto en la latencia de activación

y aterrizaje en la fuente de olor; los grupos de 24 h-dap y 48 h-dap presentaron

diferencias significativas respecto al control (H= 14.885, H= 17.867, p= 0.001), pero no

entre ellos. Los machos de los grupos 24 h-dap y 48 h-dap emplearon más tiempo para

51

activarse y aterrizar en la fuente de olor que los del grupo de machos vírgenes (Figura

13).

Condición de los machos

Vírgen 24 h-dap 48 h-dap

Respuesta

a e

xtr

acto

de f

ero

mona s

exual

(%)

0

20

40

60

80

100

Aterrizaje

Despliega claspers

c

b

a a

a

a

Figura 12. Respuesta (%) de machos vírgenes y apareados a extracto glandular de feromona

sexual, en túnel de viento. Los machos apareados fueron evaluados 24 y 48 horas después del

apareamiento (24 h dap y 48 h-dap, respectivamente). Letras diferentes sobre barras del mismo

color indican valores que son significativamente diferentes al p<0.05 (χ²), n=10.

3.3. Efecto de la pre-exposición

3.3.1. Acondicionamiento de los insectos para evaluar el efecto de pre-exposición

En el experimento de condicionamiento para saber cuáles de los grupos de

insectos considerados responden más a los volátiles de col y evaluar el efecto de pre-

exposición, la respuesta máxima de atracción se observó en el patrón de comportamiento

52

vuelo orientado en hembras apareadas, en comparación con las hembras vírgenes (χ²=

16.990; gl= 1; p= 0.001), los machos apareados (χ²= 52.769; gl= 1; p= 0.001) y los

machos vírgenes (χ²= 31.687; gl = 1; p= 0.001) (Figura 14).

Condición de los machos

Late

ncia

de a

ctivació

n (

s)

0

10

20

30

40

50

Late

ncia

de a

terr

izaje

(s)

0

50

100

150

200

250

300

Vírgen 24 h-dap 48 h-dap

a

b

b

a

b b

Figura 13. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Q1 < Mediana < Q2) de machos

vírgenes y apareados en respuesta al extracto glandular de feromona sexual, en el túnel de

viento. Los machos apareados fueron evaluados 42 h y 48 h después del apareamiento (24 h dap

y 48 h-dap, respectivamente). Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores

que son significativamente diferentes al p < 0.05 (Tukey), n = 10.

Para los machos, en el patrón de comportamiento aterrizaje se observó una

respuesta significativamente mayor en los machos vírgenes en comparación con los

53

machos apareados (χ²= 36.214: gl= 1; p= 0.001), con las hembras vírgenes (χ²= 96.182;

gl= 1; p= 0.001) y con las hembras apareadas (χ²= 124.820; gl= 1; p= 0.001) (Figura 15).

Respuesta

a e

xtr

acto

de c

ol

(%)

0

10

20

30

40

50

60

70

a

ab

b

c

Condición de machos y hembras

Macho virgen

Macho apareado

Hembra apareada

Hembra virgen

Figura 14. Respuesta (%) provocada por el extracto de col en machos y hembras en túnel de

viento. Letras diferentes indican valores que son significativamente diferentes al p<0.05 (χ²), n

= 10.

3.3.2. Pre-exposición de hembras apareadas a volátiles de col

Las hembras SP presentaron diferencias significativas en el patrón de

comportamiento vuelo orientado en comparación con las hembras 2h-DP (χ²= 52.769;

gl= 1; p= 0.001) y las hembras 24 h-DP y 48h-DP (χ²= 7.220; gl= 1; p= 0.001). Además,

para el patrón de comportamiento despliega ovipositor, entre las hembras SP y 48h-DP

no mostraron diferencias, pero con las hembras 2h-DP (χ²= 11.281; gl= 1; p=0.001) y

24h-DP (χ²= 7.521; gl= 1; p= 0.006) si hubo diferencia (Figura 16).

54

Macho virgen

Macho apareado

Hembra apareada

Hembra virgen

Respuesta

a e

xtr

acto

de f

ero

mona

sexual (

%)

0

20

40

60

80

100

a

a

b

c

Condición de machos y hembras

Figura 15. Respuesta (%) provocada por el extracto glandular de feromona sexual en machos

y hembras en túnel de viento. Letras diferentes indican valores que son significativamente

diferentes al p<0.05 (χ)², n = 10.

Respecto a la latencia de tiempo de activación, todas las hembras apareadas se

activaron, pero ninguna aterrizó en la fuente de olor. Para el tiempo de activación, se

observaron diferencias significativas en las hembras 2h-DP en comparación con las

hembras SP, las hembras 24h-DP y las hembras 48h-DP (F3/39= 20.573; n= 10; p=

0.001). En el tiempo de arribo a vuelo largo se observaron diferencias significativas en

las hembras SP con las hembras 2h-DP y las hembras 48h-DP (F3/39= 33.687; n= 10; p=

55

0.001). Entre las hembras pre-expuestas hay diferencia significativa en las hembras 2h-

DP con las hembras 24h-DP y 48h-DP (F3/39= 33.687; n= 10; p= 0.001) (Figura 17).

Condición de las hembras

Re

sp

ue

sta

a e

xtr

acto

de

co

l (

%)

0

10

20

30

40

50

60

70 Vuelo orientado

Despliega ovipositor

c

a

b b

b

a

c

b

SP 2h-DP 24h-DP 48h-DP

Figura 16. Respuesta (%) de hembras sin pre-exponer y pre-expuestas al extracto de col

en túnel de viento. A corto plazo (2 horas después de la pre-exposición=2h-DP) y a largo plazo

(24 horas después de la pre-exposición= 24h-DP y 48 horas después de la pre-exposición= 48h-

DP). Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores que son significativamente

diferentes al p<0.05 (χ)², n = 10.

3.3.3. Pre-exposición de machos vírgenes a feromona sexual

Los machos 2h-DP mostraron diferencias significativas respecto a los machos SP (χ²=

72.521; gl= 1; p= 0.001), los machos 24h-DP (χ²= 30.420; gl= 1; p= 0.001) y con los

56

machos 48h-DP (χ²= 16.990; gl= 1; p= 0.001) en el patrón de comportamiento de

aterrizaje. En éste patrón de comportamiento, no se observó diferencias entre los machos

24h-DP y los machos 48h-DP. La mayoría de los machos en diferentes condiciones

evaluados en el túnel de viento mostraron los “claspers” (Figura 18).

Condición de las hembras

La

ten

cia

de

activa

ció

n (

s)

0

10

20

30

40

50

La

ten

cia

a v

ue

lo o

rie

nta

do

(s

)0

50

100

150

200

250

300

350

SP 2h-DP 24h-DP 48h-DP

c

ba

a

a

aba

b

Figura 17. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Promedio ± EEM) de hembras sin

pre-exponer y pre-expuestas al extracto de col en el túnel de viento. A corto plazo (2 horas

después de la pre-exposición=2h-DP) y a largo plazo (24 horas después de la pre-exposición=

24h-DP y 48 horas después de la pre-exposición= 48h-DP). Letras diferentes sobre barras del

mismo color indican valores que son significativamente diferentes al p < 0.05 (Tukey), n = 10.

Para el tiempo de activación, los machos SP mostraron diferencias significativas

con los machos 2h-DP y con los machos 24h-DP (F3/39= 65.722; n= 10; p= 0.001). En

57

los machos pre-expuestos se observó diferencias en 2h-DP con 24h-DP y 48h-DP (F3/39=

65.722; n= 10; p= 0.001), además, los machos 24h-DP presentaron diferencias con los

machos 48 h-DP (F3/39= 65.722; n= 10; p= 0.001). Respecto a la latencia de aterrizaje, se

encontraron diferencias entre los machos 24h-DP con los machos SP, los machos 24h-

DP y los machos 48h-DP (F3/39= 12.349; n= 10; p= 0.001) (Figura 19).

Condición de los machos

SP 2h-DP 24h-DP 48h-DPRespu

esta

a e

xtr

acto

de

fero

mon

a s

exua

l

(%)

0

20

40

60

80

100

120

Aterrizaje

Despliega claspers

c

a

a

a

b

a

b

a

Figura 18. Respuesta (%) de machos sin pre-exponer y pre-expuestos al extracto glandular de

feromona sexual en túnel de viento. A corto plazo (2 horas después de la pre-exposición=2h-DP)

y a largo plazo (24 horas después de la pre-exposición= 24h-DP y 48 horas después de la pre-

exposición= 48h-DP). Letras diferentes sobre barras del mismo color indican valores que son

significativamente diferentes al p<0.05 (χ²), n = 10.

58

b

c

a

b

aa

a

b

Condición de los machos

Late

ncia

de a

ctivació

n (

s)

0

10

20

30

40

Late

ncia

de a

terr

izaje

(s)

0

50

100

150

200

250

300

350

SP 2h-DP 24h-DP 48h-DP

aa

a

b

b

c

a

b

Figura 19. Latencia de activación y latencia de aterrizaje (Promedio ± EEM) de machos sin pre-

exponer y pre-expuestos al extracto glandular de feromona sexual en el túnel de viento. A corto

plazo (2 horas después de la pre-exposición=2h-DP) y a largo plazo (24 horas después de la pre-

exposición= 24h-DP y 48 horas después de la pre-exposición= 48h-DP). Letras diferentes sobre

barras del mismo color indican valores que son significativamente diferentes al p < 0.05

(Tukey), n = 10.

4. Discusión

Los estudios en túnel de viento con las hembras de C. decolora mostraron que la

edad de apareamiento es un factor que afecta la respuesta comportamental a los volátiles

de col, y que los individuos apareados de diferentes edades presentan diferencias en el

comportamiento de atracción. Las hembras vírgenes de C. decolora tuvieron una mínima

respuesta a los volátiles de col como sucede en otras palomillas (Browne, 1993).

59

En C. decolora posiblemente una hembra virgen a la edad de 4 días está enfocada

en la búsqueda de pareja para el apareamiento y no en la búsqueda de la planta

hospedera. Una hembra después del apareamiento, tiene como prioridad la búsqueda de

la planta hospedera para oviposición. Es decir, la hembra realiza movimientos orientados

hacia la planta hospedera para tener contacto con ella aunque no siempre se da en esta

última acción de aterrizaje (Visser, 1986).

En C. decolora las hembras apareadas de 4-6 días de edad, fueron las que

tuvieron una atracción máxima a los volátiles de col, como ocurre en otras palomillas

apareadas con respuesta máxima en otras edades (Ikeura et al., 2010). Por ejemplo en M.

sexta al cuarto día de su emergencia, es la edad en la que se aparean en mayor

proporción y en la que son más atraídas a los volátiles de su planta hospedera

(Mechauber et al., 2002) y para P. xylostella la respuesta se incrementa del día 2 hasta

los 7 días de edad (Pivnick et al., 1990).

La edad en la cual las hembras apareadas de C. decolora alcanzaron la máxima

respuesta de atracción a los volátiles de col, está relacionada con el máximo potencial

reproductivo de la hembra alcanzado a los 4 días de edad, ya que se ha observado que a

otra edad su fecundidad y fertilidad disminuye (Callado-Galindo et al., 2013).

El apareamiento en los insectos debe ocurrir en un intervalo de edad determinado

ya que la fisiología tanto de la hembra como del macho cambia con el tiempo (Jiménez-

Pérez y Wang, 2003), como consecuencia de un retraso en el apareamiento las hembras

reducen su potencial reproductivo, ya que influye sobre la fecundidad y fertilidad de los

huevecillos, como sucede en otras palomillas (Rogers y Marti, 1996; Jiménez-Pérez y

Wang, 2003).

60

La edad de apareamiento, en la que alcanzan la madurez sexual las hembras,

aumenta su adecuación biológica y les permite aumentar su fecundidad y fertilidad, lo

anterior relacionado con la “calidad” de apareamiento que le ofrece el macho (tiempo de

apareamiento, tamaño del espermatóforo y cantidad de espermatóforos transferidos del

macho, tamaño del insecto) (Gillott, 2003).

El apareamiento para la hembra es un cambio fisiológico que influencia

fuertemente la respuesta a los estímulos, como en este caso los volátiles de planta

hospedera. Este cambio sensorial permite a las hembras modular su comportamiento a

una serie de estímulos (Mowrey y Portman, 2012) y responder oportunamente a las

condiciones ambientales presentes.

En C. decolora, los primeros días después de su emergencia, la respuesta de

atracción de los machos es baja e incrementa en relación a la edad hasta alcanzar su

máximo los días 4-5 y 6-7 días, para luego disminuir conforme aumenta la edad. En

algunas otras especies de palomillas, como por ejemplo en los machos de A. ipsilon, la

respuesta a la feromona sexual también incrementó a partir de los 3 días de edad

(Gadenne et al., 1993).

En otras palomillas como Spodoptera frugiperda (Smith) la edad óptima es

alcanzada a los 2 días de edad (Rogers y Marti, 1994), mientras que para Spodoptera

exigua (Hübner) se alcanza entre 1-2 días de edad (Rogers y Marti, 1996). Al parecer,

los machos jóvenes (2-3 días de edad) de C. decolora, no han alcanzado la madurez

sexual para responder a la feromona sexual como sucede en machos recién emergidos de

A. ipsilon (Gadenne et al., 1993; Duportets et al., 1998). En este sentido, la respuesta

olfatoria aumenta conforme los machos alcanzan la madurez sexual y después disminuye

conforme éstos son más longevos (Evenden y Gries, 2008).

61

El apareamiento en los machos de C. decolora está asociado con una

disminución de la respuesta comportamental, como sucede en machos apareados de A.

ípsilon (Gadenne et al., 2001). En C. decolora, esta disminución en la respuesta a la

feromona puede estar relacionada con el hecho de que los machos se aparean una sola

vez por noche (Rojas y Cibrián, 1994) y en total pueden aparearse de 2 a 3 veces de por

vida (Castrejón-Gómez et al., 2000).

Posiblemente los machos de C. decolora necesitan recuperarse del gasto de

energía realizado en el apareamiento y volver a almacenar esperma (Gillott, 2003). En

ese periodo de inhibición los machos pueden enfocarse en la búsqueda de alimento para

restablecer las reservas en sus glándulas accesorias para la producción de

espermatóforos y volver a aparearse, como se ha observado que ocurre en A. ipsilon

(Barrozo et al., 2011).

El efecto de la experiencia previa de las hembras apareadas sometidas 10s al

extracto de col, fue suficiente para que se produjera en éstas un cambio en su

sensibilidad de respuesta. Las hembras apareadas después de una breve exposición a

volátiles de col, tuvieron a las 2h un efecto inhibitorio de respuesta a los mismos,

posiblemente por una saturación de sus receptores, sin llegar a una facilitación o

potenciación de la respuesta olfatoria a las 24h. Se ha documentado que el ciclo

circadiano del insecto puede tener efecto sobre el aprendizaje olfativo (Decker et al.,

2007) y los niveles de hormonas (Bloch et al., 2013), entonces, el que se dé un efecto de

inhibición a las 2h, posiblemente es porque el ciclo circadiano de las hembras apareadas

de C. decolora no coincida con la puesta de huevecillos inmediatamente después de

haberse apareado.

62

Si la atracción a la planta hospedera está relacionada con la carga de huevecillos

(Minkenberg et al., 1992), entonces esto coincide con la restauración de la respuesta de

las hembras apareadas de C. decolora a las 24 y 48h después de haberse pre-expuesto a

volátiles de col, ya que se ha observado que las hembras ovipositan la mayor cantidad de

huevecillos los primeros días después de haberse apareado (Callado-Galindo et al.,

2013). Además, para la latencia de activación y latencia a vuelo orientado se observó

que en las hembras pre-expuestas y evaluadas a las 24 y 48h, se restaura la respuesta

olfatoria al nivel del que muestra las hembras sin pre-exponer.

Por una parte, en estudios con otras palomillas, se ha documentado un efecto

inhibitorio de atracción y aterrizaje en las hembras por pre-exposición a los volátiles de

planta hospedera (Rojas y Wyatt, 1999a). Por otra parte, la pre-exposición a esos

estímulos puede provocar un aumento en la respuesta a volátiles de planta hospedera

para oviposición (Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al., 1998b). Para estas

palomillas Rojas y Wyatt (1999a), Landolt y Molina (1996) y Cunningham et al. (1998b)

mencionan que el efecto está relacionado con la habituación o sensibilización de la

respuesta olfatoria.

Dado que la habituación se da por estímulos repetidos, entonces la reducción de

la respuesta a las 2h en las hembras de C. decolora no parece debida a un efecto de

habituación a nivel de sistema nervioso central, sino a una inhibición o posiblemente a

una adaptación sensorial, es decir, a una reducción en la sensibilidad a nivel periférico

(Dukas, 2008). Los mecanismos neurobiológicos de la sensibilidad en la respuesta

olfatoria a volátiles de hospedera han sido explicados muy poco o no han sido

explicados a nivel periférico y central del sistema nervioso (Cunningham et al., 1998b;

Dukas, 2008).

63

Posiblemente, la sensibilidad a volátiles de planta hospedera en el insecto tenga

un mecanismo parecido al que ocurre con los machos a feromona sexual, con un cambio

en las concentraciones de hormonas o neurotransmisores o aminas biogénicas, por

ejemplo, serotonina (Kloppenburg et al., 1999), octopamina (Pophof, 2000) y hormona

juvenil (Anton y Gadenne, 1999).

En cuanto a los machos pre-expuestos al extracto glandular de feromona sexual,

se produjo en éstos un cambio en su sensibilidad de respuesta, aunque la mayoría de los

machos pre-expuestos y sin pre-exponer a feromona sexual mostraron los “claspers”, se

observó en el patrón de aterrizaje una disminución a corto plazo (2h-AP) y un

incrementó a largo plazo (24h-AP y 48h-AP).

Por una parte, una reducción en la respuesta comportamental por efecto de la

experiencia previa a feromona ha sido observado en otras palomillas (Bartell y

Lawrence, 1973, 1976; Bartell y Roelofs, 1973; Kuenen y Baker 1981; Figueredo y

Baker, 1992; Daly y Figueredo, 2000; Judd et al., 2005; Stelinski et al., 2004, 2006a, b;

Trimble et al., 2012) en donde la pre-exposición a la feromona sexual causo un efecto

inhibidor en su respuesta comportamental, tal efecto, está relacionado con la habituación

de la respuesta olfatoria. Sin embargo, una comparación directa con los trabajos

mencionados y éste no puede hacerse, debido a que usaron diferentes tiempos de pre-

exposición y de medición, así como distintas dosis de feromona sexual y repetición de

ésta.

La respuesta a las 2h en los machos de C. decolora posiblemente no fue debida a

un efecto de habituación, ya que ésta se da por estímulos repetidos y en este trabajo no

se hicieron, tal vez exista una reducción en la sensibilidad a nivel periférico, como

64

sucedió en otras palomillas (Rumbo y Vicrers 1997; Stelinski et al., 2005; Trimble y

Marshall, 2010; D´Errico et al., 2013).

Por otra parte, se ha documentado en otras palomillas, un incremento en la

sensibilidad a la feromona sexual (Anderson et al., 2003; Stelinski et al., 2004; 2006b;

Anderson et al., 2007), ya que los machos después de una inhibición a las 2h

incrementaron su respuesta a las 24 h como se observó en el patrón de aterrizaje,

además, para el tiempo de activación se observó que la respuesta se potencia aún más

que en un macho sin pre-exponer.

Asimismo, se observó que en un macho pre-expuesto y medido a las 48 h se

restauró la respuesta olfatoria a nivel de un macho sin pre-exponer. En otras palomillas,

algunos de los mecanismo neurobiológicos de la sensibilidad en la respuesta olfatoria a

feromona han sido explicados a nivel del sistema nervioso periférico y central (Guerrieri

et al., 2012). Es decir, la sensibilidad a feromona cambia por las concentraciones de

hormonas o neurotransmisores o aminas biogénicas, por ejemplo, serotonina

(Kloppenburg et al., 1999), octopamina (Pophof, 2000) y hormona juvenil (Anton y

Gadenne, 1999).

La respuesta de atracción a los volátiles de planta hospedera y a los compuestos

feromonales de C. decolora, no sólo depende de su naturaleza química, hay una

plasticidad neural inducida por el estado fisiológico y la experiencia, que les permite a

las hembras y a los machos modular su respuesta a los volátiles de planta hospedera y a

la feromona sexual.

65

V. Preferencia de oviposición por C. decolora

1. Introducción

El proceso de selección de planta hospedera por el adulto está correlacionado

con la disponibilidad de la planta hospedera para el desarrollo y supervivencia de su

progenie (Thompson y Pellmyr, 1991; Knolhoff y Heckel, 2014). Sin embargo, no

siempre se observa una correlación positiva entre la elección de la planta hospedera para

oviposición por la hembra y el desarrollo larval (Potter et al., 2012), lo que puede variar

en función de variables ecológicas y presiones de selección (Janz, 2008).

La preferencia por una planta hospedera puede estar influenciada por factores

como la experiencia tanto de adultos o las larvas sobre la planta hospedera (Landolt y

Molina, 1996; Cunningham et al., 1998b; Rojas y Wayt 1999b; Papaj y Prokopy, 1989;

Barron, 2001; Akhtar y Isman, 2003; Olsson et al., 2006), la presencia de parasitoides y

depredadores por el daño al comienzo de la oviposición (Meiners y Hilker, 2000; Hilker

y Meiners, 2002; Hilker et al., 2002) y cuando las hembras no son capaces de evaluar la

“calidad” de la planta correctamente (Jaenike, 1978).

Otros factores son la presión de ovipositar por la carga de huevecillos (Jones,

1977; Doak et al., 2006), la diversidad y distribución de vegetación alrededor de la

planta hospedera (Rausher y Papaj, 1983; Petzold, 2009), cuando el desarrollo larval

requiera moverse a otras plantas hospederas (Bar-Yam y Morse, 2011), las larvas por sí

mismas eligen la planta hospedera para su alimentación independientemente del sitio de

oviposición elegido por la hembra (Cunningham et al., 2011; Rivera y Burrack, 2012),

cuando las hembras prefieren ovipositar en plantas libres de enemigos naturales que en

plantas en condiciones “óptimas” para el crecimiento de las larvas (Jeffries y Lawton,

1984).

66

La aceptación o rechazo de la planta hospedera puede estar regulado por la

presencia de estimulantes o disuasivos de la oviposición (Honda, 1995). Los

compuestos estimulantes regularmente no son volátiles (Simmonds, 2001; Calas et al.,

2007), aunque existen ejemplos donde la oviposición es estimulada por compuestos

volátiles (Städler, 1974; Fatzinger y Merkel, 1985) o por una mezcla de ambos

(Renwick et al., 2006).

Por una parte, se menciona que la elección de la planta hospedera la hace la

hembra (Gripenberg et al., 2010; Refsnider y Janzen, 2010; García-Robledo y Horvitz,

2012), es decir, cuando hay una planta hospedera que es apropiada para el desarrollo de

la larvas (Shikano et al., 2010) y también cuando el sitio de oviposición es mal elegido

y hay una alta mortalidad de larvas (Groenteman et al., 2006). En el proceso de

oviposición, la hembra puede modificar su comportamiento reduciendo el número de

huevecillos puestos sobre la planta hospedera, si esta no se encuentra en condiciones

“óptimas” para el desarrollo de su descendencia (Thompson y Pellmyr, 1991; Knolhoff

y Heckel, 2014).

En C. decolora, los estudios acerca de la aceptación de la planta hospedera son

escasos. Se sabe que las hembras ovipositan durante toda su vida, sin embargo a los 4

días de edad alcanzan su mayor potencial reproductivo, reflejado en su fecundidad y

fertilidad (Callado-Galindo et al., 2013). En estudios pre-eliminares de oviposición

sobre plantas de col por hembras de C. decolora se observó que éstas no ovipositan o lo

hacen muy poco sobre la planta. Por tal motivo, en este estudio se investigó en hembras

apareadas de C. decolora, la preferencia de oviposición sobre la planta de col o

alrededor de ésta.

67

2. Materiales y métodos

2.1. Insectos

Los insectos utilizados en los bioensayos se obtuvieron y mantuvieron como lo

descrito en el Capítulo II, en la Sección 2.1.

2.1.1. Preferencia de oviposición

Para aparear a los insectos, 30 machos y 30 hembras de 4 días de edad se

colocaron en una cámara de plexiglás (20x20x20 cm) para que estos se aparearan,

después de lo cual, cada hembra se separó individualmente en frascos de 20 cm de altura

x 10 cm de diámetro hasta su utilización en el bioensayo. Posteriormente, la hembra

apareada fue introducida en la cámara bioclimática con la planta de col sin daño y a las

24 horas después de haber introducido la hembra apareada, se registró el número de

huevecillos puestos en la planta de col o alrededor de ésta. Al final del registro del

número de huevecillos, se verificó que las hembras hubieran sido apareadas, de lo

contrario estas fueron excluidas de los análisis. Se ocuparon 12 hembras, una por cada

repetición.

2.2. Plantas

Las plantas de col sin daño fueron las que se utilizaron para la extracción de

volátiles, se obtuvieron y mantuvieron como lo descrito en el Capítulo II, en la Sección

2.2.

2.3. Determinación de preferencia de oviposición

Para evaluar la preferencia de oviposición sobre la planta de col o alrededor de la

planta, se utilizó una jaula de plexiglás (100x80x60 cm), a 20°C (±2), 60 % HR (± 2). A

cada maceta con la planta de col utilizada en el bioensayo, se le adaptó una placa de

acrílico sujetando el tallo y aislando el suelo. Asimismo, para el registro del número de

68

huevecillos, se marcaron círculos a partir de la base de la maceta cada 5 cm hasta los 30

cm (Figura 20).

Figura 20. Dispositivo para evaluar la preferencia de oviposición por hembras de C. decolora.

Distancias de la planta de col: a) 5 cm, b) 10 cm, c) 15 cm, d) 20 cm, e) 25 cm y f) 30 cm.

2.4. Análisis de datos

Los datos de preferencia de oviposición sobre col y en cada una de las distancias alrededor de

col, fueron analizados por medio de un análisis de varianza unifactorial para medidas repetidas

(ANOVA MR), y para las comparaciones entre grupos se hizo una prueba de Tukey.

69

3. Resultados

3.1. Preferencia de oviposición

Las hembras de C. decolora ovipositan un mayor número de huevecillos

alrededor de la planta de col que sobre ésta. El incremento en el número de huevecillos

puestos fue desde la planta de col hasta los 30 cm. Se observó que sobre la planta de col

hasta los 15 cm a su alrededor no hay diferencia significativa en la cantidad de

huevecillos, pero de los 20 a los 30 cm de distancia de la planta de col la diferencia en el

número de huevecillos es significativa entre ellos y respecto a los encontrados sobre la

col y hasta los 15 cm (F= 185.190; gl= 6,83; n= 12; p= 0.001) (Figura 21).

Distancia de la planta de col (cm)

Planta de col 5 10 15 20 25 30

me

ro d

e h

ue

ve

cill

os

(Pro

me

dio

± E

EM

)

0

10

20

30

40

50

60

70

a

b

a

aa

d

c

[------------------------------------------------------------]

Figura 21. Número de huevecillos (Promedio ± EEM) sobre plantas de col o alrededor de

ésta. Letras diferentes indican valores significativamente diferentes al p< 0.05 (Tukey), n = 12.

70

4. Discusión

Las hembras de C. decolora ovipositaron mayor cantidad de huevecillos

alrededor de la planta de col, y en menor cantidad sobre la planta.

Algunas palomillas como Cydia pomonella (Linnaeus) ponen sus huevecillos a

20 cm de su planta hospedera y al emerger las larvas son atraídas por el olor de la planta

hospedera, aunque para C. pomonella se ha observado una mayor atracción a su planta

hospedera cuando esta presenta daño por conespecíficos (Landolt et al., 2000).

Debido a que se encontraron huevecillos sobre la planta de col, esto hace pensar

que la hembras de C. decolora en un momento dado aterrizaron sobre la col, en este

sentido,

según la teoría de oviposición “óptima” las hembras al momento de colocar sus

huevecillos, seleccionan aquellas plantas hospederas donde las larvas puedan alcanzar

un máximo desarrollo (Jaenike, 1978). Posiblemente, las hembras de C. decolora no

sean capaces de evaluar la calidad de la planta para poner la totalidad de huevecillos

sobre la planta de col.

Los pocos huevecillos que pusieron las hembras de C. decolora sobre la planta

de col, se encontraron en el centro de la col llamado “cogollo”, posiblemente sea la zona

menos expuesta al ataque de enemigos naturales y la que más consumen las larvas,

evitando lo que pasa con Helicoverpa zea (Boddie), que pone sus huevecillos en una

zona de su planta hospedera con una elevada depredación de los mismos, aunque

necesaria para la nutrición de las larvas (Takeuchi et al., 2009).

La hipótesis de que la hembra siempre elige la planta hospedera en condiciones

“óptimas” para que las larvas alcancen su máximo desarrollo larval, es aplicable en su

mayoría a herbívoros especialistas, mientras que en los herbívoros generalistas como C.

71

decolora, muchas veces no se cumple, ya que estos insectos pueden “equivocarse” al

elegir la planta hospedera. Es cuando las larvas tienen que elegir otra planta hospedera

“óptima” en términos de desarrollo larval. (Jaenike, 1978; Barron, 2009).

La preferencia de elegir una planta hospedera no está determinada sólo por

máximo desarrollo larval, otras variables ecológicas y presiones de selección pueden

estar influenciando la elección de la planta hospedera, por ejemplo el evitar

depredadores y parasitoides.

La distribución de huevecillos alrededor de la planta de col por hembras de C.

decolora hace pensar en la posibilidad elige varias plantas de modo que exista una

distribución de larvas dentro y entre las plantas. De este modo maximiza la dispersión

larval, teniendo un espacio libre de enemigos naturales (Jeffries y Lawton, 1984).

Entre menos larvas haya en una planta, serán insuficientes para estimular la

respuesta defensiva de la planta. Al menos por un tiempo el sitio de oviposición estará

libre de enemigos naturales, con la llegada de más larvas a la planta la emisión de

volátiles se incrementa, y con ello la llegada de parasitoides y depredadores que son

capaces de identificar los volátiles que libera la planta por el daño (Jeffries y Lawton,

1984; Singer et al., 2004).

En el proceso de oviposición los insectos herbívoros, utilizan el estímulo táctil

sobre la planta hospedera para reconocer los estímulantes de la oviposición e influenciar

la elección de hospedera, como ocurre en algunas palomillas (Schoonhoven y van Loon,

2002; Rojas et al., 2003; Lee et al., 2006), aunque existen casos en donde los

estimulantes de la oviposición son volátiles como los isotiocianatos (Jallow et al., 1999;

Renwick et al., 2006). En este sentido, posiblemente C. decolora reconozca algunos

volátiles estímulantes de la oviposición, pero que al inicio de éste proceso la planta de

72

col emite compuestos volátiles que atraen a los depredadores y parasitoides de sus

huevecillos; sin embargo, en el presente estudio no se observó si la hembra empezó a

ovipositar sobre la planta inmediatamente después de colocarla en la jaula.

Un factor fisiológico que afecta la preferencia del adulto al elegir la planta

hospedera es la carga de huevecillos (Javois y Tammaru, 2006). Aquellas hembras que

están muy cargadas de huevecillos regularmente no discriminan entre plantas

hospederas en comparación con las que producen pocos huevecillos que discriminan los

sitios de oviposición (Jones, 1977; Jaenike, 1990; Doak et al., 2006). Por ejemplo, en un

estudio con Pieris rapae (Linnaeus) se encontró que las hembras con un mayor carga de

huevecillos tienden a reducir la longitud de sus vuelos e incrementar sus giros, lo que

lleva a aceptar plantas que deberían ser rechazadas cuando las hembras no tienen tal

carga de huevecillos (Jones, 1977).

Otro factor importante en el proceso de selección de la hospedera y que puede

ser determinante, es el aprendizaje o experiencia previa de los adultos al reconocer los

volátiles de la planta hospedera (Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al., 1998b;

Rojas y Wayt, 1999b) o en el caso de las larvas, donde la experiencia de sus larvas al

haberse alimentado de una hospedera puede influir en la preferencia de oviposición de

las hembras de la siguiente generación (Papaj y Prokopy, 1989; Barron, 2001; Akhtar y

Isman, 2003; Olsson et al., 2006). Los insectos que se utilizaron en este estudio se

alimentaron con una dieta para lepidópteros, sería necesario conocer si la dieta contiene

compuestos químicos de la planta de col, para descartar la atracción de las hembras a la

planta de col por el efecto de la experiencia previa de las larvas con el alimento.

En conclusión, las hembras prefieren ovipositar alrededor de la planta de la col,

con un patrón de distribución de número de huevecillos máximo a los 30 cm, ésta

73

distancia concuerda con lo observado en cultivos de plantas de col en campo, ya que las

plantas en un mismo surco están separadas entre ellas a los 25-30 cm. En este trabajo se

observó una disminución gradual de puesta de huevecillos desde los 30 cm hasta la

planta de col.

El entender la dinámica de oviposición por las hembras podría ser de utilidad en

alternativas de manejo, con compuestos químicos empleados para la interrupción del

comportamiento de oviposición.

74

VI. Atracción de larvas de C. decolora a volátiles de la col

1. Introducción

La elección de un sitio adecuado para oviposición es fundamental por parte del

insecto adulto (Bar-Yam y Morse, 2011), pero para las hembras generalistas de

lepidoptera parecen no siempre elegir el sitio de oviposición “óptimo” (Potter et al.,

2012).

Cuando a las hembras no les es fácil elegir una planta hospedera de calidad

nutricional para su descendencia, el distribuir los huevecillos fuera de la planta

hospedera o en una planta no hospedera puede ser una estrategia para maximizar su

adecuación biológica (Hopper, 1999; Zalucki et al., 2002; Diamond y Kingsolver, 2010;

Refsnider y Janzen, 2010). En este caso las larvas necesitan moverse a otras plantas

hospederas para alcanzar su máximo desarrollo (Bar-Yam y Morse, 2011) o cuando las

larvas eligen la planta hospedera para su alimentación independientemente del sitio de

oviposición elegido por la hembra (Cunningham et al., 2011; Rivera y Burrack, 2012)

Se ha documentado que desde el momento en que las larvas participan

activamente en la búsqueda y aceptación de la planta hospedera (Gripenberg et al.,

2010), le quitan presión selectiva de hospedera al adulto (Pöykkö, 2006; Cunningham et

al., 2011; Rivera y Burrack, 2012; Bora et al., 2013). En algunos casos, los estados

larvales responden a los mismos compuestos que los adultos en la búsqueda y

aceptación de su planta hospedera (Rembold et al., 1991; Huang y Renwick, 1994;

Hartlieb y Rembold, 1996; Miles et al., 2005).

En pruebas de doble elección para evaluar la preferencia alimentaria C.

decolora, hacia cinco especies de plantas hospederas, las larvas se desplazaron

75

significativamente más a plantas de col que a las otras plantas evaluadas (Pérez, 2010).

Puede ser que las larvas son las que se desplacen hasta la planta hospedera para su

alimentación, posiblemente guiadas por los mismos compuestos volátiles que atraen a la

hembra adulta. En este sentido, se evaluó la atracción de las larvas neonatas de C.

decolora a la planta de col completa y a extractos de compuestos volátiles de col.

2. Materiales y métodos

2.1. Insectos

Los huevecillos y las larvas neonatas utilizados en los bioensayos se obtuvieron

y mantuvieron como lo descrito en el Capítulo II, en la Sección 2.1.

2.1.1. Respuesta de larvas a plantas de col

Hembras apareadas de C. decolora se colocaron en jaulas de plexiglás

(20x20x20 cm)) cubriendo la entrada con una malla de tela, después de que las hembras

ovipositaron sobre la malla, esta se cortó en secciones donde hubiera 10 huevecillos. En

cada bioensayo, se utilizaron 50 huevecillos de 5 días después de la oviposición en la

última fase de su desarrollo embrionario (color negro característico de la última fase),

estos se distribuyeron en grupos de 10 huevecillos a 30 cm de la base de la maceta con

la planta de col (n=12 repeticiones, cada repetición con 50 huevecillos).

El registro de número de larvas neonatas presentes en la planta de col o

alrededor de ésta se realizó a las 2, 6, 12, 18 y 24 horas después de haber colocado los

huevecillos en la cámara bioclimática, entre cada registro se retiraron las larvas

contadas. Después de cada prueba se contó el número de larvas, se cambió la planta de

col para que no interfiriera el efecto del daño por larva en la planta. Todos los registros

fueron con plantas de col intactas.

76

2.2. Plantas

Las plantas de col sin daño se obtuvieron y mantuvieron como lo descrito en el

Capítulo II, en la Sección 2.2.

Para los bioensayos de presencia de larvas se sincronizó el fotoperíodo invertido

para las larvas y las plantas de col, con la finalidad de realizar los experimentos durante

el día.

2.3. Determinación de la respuesta de larvas en plantas de col

Para el registro del número de larvas sobre y alrededor de la planta de col, se

utilizó la cámara descrita en el Capítulo V, en la Sección 2.3.

2.4. Extracción e identificación de volátiles de col

Se utilizaron plantas de col sin daño, se utilizó el sistema de extracción de

volátiles descrito en el Capítulo II, en la Sección 2.3. Los compuestos capturados en

Super Q, se extrajeron con hexano, diclorometano o metanol.

El análisis para confirmar el perfil químico de los extractos de volátiles de col y

poder utilizarlos en los bioensayos en olfatómetro en Y, se realizó de acuerdo a lo

descrito en el Capítulo III, en la Sección 2.4. En todos los extractos de volátiles de col

utilizados en los experimentos, se verificó que los compuestos químicos atractivos

aparecieran constantemente.

2.5. Respuesta de larvas a extractos de col

La respuesta de las larvas neonatas de C. decolora a los diferentes extractos de

col se evaluó en pruebas de una elección en un olfatómetro de vidrio tipo Y (Figura 22),

similar al utilizado por Vander Meer et al. (1988), donde se comparó la atracción de las

larvas por el extracto (extracto de col con hexano, diclorometano o metanol) contra un

control (aire), además, se comparó el extracto más atractivo para las larvas contra la

77

mezcla de compuestos sintéticos atractiva para las hembras (compuestos sintéticos

identificados en el Capítulo III, en la Sección 2.6).

En cada cámara del olfatómetro Y, se pasó una corriente de aire con un flujo de

200 mL/min, medido por unos flujómetros (Cole Palmer, Ev-03217-06, USA). Para cada

bioensayo, en el tubo principal del olfatómetro, se introdujo una larva neonata (al menos

dos horas de edad después de la emergencia), y se observó su comportamiento durante

300 s. Durante este tiempo, se consideró una elección de la larva, cuando esta alcanzó

alguna de las cámaras, con la fuente de olor o el control.

Para cada bioensayo, en un papel filtro Waltman No.1 (Whatman ® 2V,

England) de 1 cm de largo por 0.5 cm de ancho, se colocaron 10 µL de cada uno de los

extractos de col o la mezcla de compuestos. Todos los bioensayos se realizaron en el

primer tercio de la escotofase a 20°C (±3), 60 % (± 5) de HR y luz roja (40 watts).

Después de cada prueba se invirtió el olfatómetro para eliminar cualquier sesgo.

2.6. Análisis de datos

Los datos de presencia de larvas, sobre col y en cada una de las distancias

alrededor de col, fueron analizados por medio de un análisis de varianza unifactorial

para medidas repetidas (ANOVA MR), y para las comparaciones entre grupos se hizo

una prueba de Tukey.

Los datos de las respuestas de una elección de las larvas neonatas, se analizaron

con una prueba de χ². Las pruebas se realizaron con el programa estadístico Sigma Plot

11 (Systat Software Inc., Chicago, Illinois).

78

Figura 22. Representación esquemática de los componentes del sistema con olfatómetro en Y

para evaluar la atracción de larvas neonatas a diferentes extractos de col y a la mezcla de

compuestos sintéticos.

3. Resultados

3.1. Respuesta de larvas a plantas de col

Los registros del número de larvas presentes sobre la planta de col o alrededor de

ésta, se realizaron a partir de las 12 h, ya que hasta ese tiempo se detectó la presencia de

larvas. A diferencia de la puesta de huevecillos, existe una tendencia del incremento de

número de larvas presentes desde los 30 cm hasta la planta de col. Se observó en los

79

promedios de los registros 12, 18 y 24 h, diferencia significativa en el número de larvas

neonatas presentes sobre la planta de col, que en cada una de las distancias consideradas

a su alrededor (F= 25.879; gl= 6,83; n =12; p= 0.001) (Figura 23).

Distancia a la planta de col (cm)

Planta de col 5 10 15 20 25 30

me

ro d

e la

rva

s p

or

regis

tro

(P

rom

ed

io ±

EE

M)

0

2

4

6

8

[------------------------------------------------------------]

ab

aa

a

aab

b

b

a

aab

a

ab

aa

a

b

c

Figura 23. Larvas neonatas (Promedio ± EEM) sobre plantas de col o alrededor de ésta. Para los

registros a las 12 h (barra negra), 18 h (barra gris) y 24 h (barra blanca).Letras diferentes entre

barras del mismo color indican valores significativamente diferentes al p < 0.05 (Tukey), n=12.

3.2. Respuesta de larvas a extractos de col

Por un lado, las larvas neonatas de C. decolora responden más al extracto

hexánico de col (χ²= 7.220; gl= 1; p= 0.007) en comparación con el control (aire), así

como para el extracto de col con metanol (χ²= 19.220; gl= 1; p= 0.001) contra el

control. Por otro lado, para el extracto de col con diclorometano y la mezcla de

80

compuestos sintéticos atractiva para las hembras no tuvieron deferencia significativa en

comparación con el control (Figura 24).

Figura 24. Respuesta de larvas neonatas a extractos volátiles de col con diferentes disolventes y

a la mezcla de sintéticos, en olfatómetro Y. Estadísticamente significativo * * (p < 0.007) * (p <

0.001), no estadísticamente significativo (ns), no responde (NR), χ², n=15.

4. Discusión

En este estudio, la mayoría de las larvas que emergieron en la periferia migraron

hacia la planta de col. Posiblemente si se hubiera hecho un registro de la presencia de

larvas a las 36 h, todas las larvas contadas estarían sobre la col, ya que en el registro del

número de larvas a las 24 h no se observaron larvas en las distancias de 20 a 30 cm. En

ocasiones las larvas emergidas en la periferia de la planta hospedera, no se desplazan

-100 -60 -20 20 60 100

% de elección

Extracto metanólico

Extracto diclorometanólico

Extracto hexánico

ns

ns

**

100 60 20

Estímulo Control (Aire) % de NR

Mezcla de compuestos

*

13.33 33.33 6.66 13.33

81

hacia la planta hospedera, como sucede en las larvas de Phthorimaea operculella (Zell),

donde sólo el 50 % localizan un sitio adecuado de alimentación (Varela, 1988).

Cuando las larvas participan activamente en la búsqueda y aceptación de la

hospedera, le quitan presión selectiva de hospedera al adulto (Gripenberg et al., 2010),

presentando una alta movilidad dentro o entre las plantas para elegir el sitio adecuado

para su alimentación (Pöykkö, 2006; Cunningham et al., 2011; Rivera y Burrack, 2012).

Parece ser que las larvas de C. decolora participan activamente en la búsqueda y

aceptación de la planta hospedera, la hipótesis de que el adulto hembra “sabe” más al

momento de elegir una planta hospedera en condiciones “óptimas”, puede no cumplirse

en C. decolora. Sin embargo, puede ser que la elección de la planta hospedera por el

adulto, no está determinada sólo por el futuro desarrollo de la larva, sino que existan

otras variables ecológicas y presiones de selección, como la presencia de depredadores

y parasitoides (Paré y Tumlinson, 1999; Potter et al., 2012).

Se sabe que los volátiles inducidos por el ataque de herbívoros pueden ser

atractivos para las larvas de conespecíficos u otra especie, entonces, las larvas además

de vencer las defensas de las plantas tendrán la competencia por el alimento (Landolt et

al., 2000; Carroll et al., 2006, 2008).

Dada la alta movilidad hacia la planta de col por las larvas neonatas de C.

decolora, posiblemente detecten los mismos compuestos que son atractivos para la

hembra. Así lo demuestran estudios con los estados inmaduros de H. armígera, C.

pomonella y P. rapae, las cuales son atraídas a los mismos compuestos a los que

responden las hembras (Rembold et al., 1991; Huang y Renwick, 1994; Hartlieb y

Rembold, 1996; Miles et al., 2005), puede ser que las larvas tengan neuronas olfativas

82

que responden a diferentes olores, sin estar especializadas a moléculas específicas

(Rharrabe et al., 2014).

En las pruebas de una elección, el extracto hexánico de col provocó más

atracción en larvas neonatas de C. decolora. Un estudio similar pero con plantas

dañadas, se realizó con larvas de H. armígera, donde los extractos hexánicos de varias

plantas hospederas provocaron en las larvas mayor atracción en comparación con los

extractos metánolicos (Singh y Mullick, 2002).

Posiblemente, el realizar experimentos donde se evalué la respuesta de las larvas

neonatas a extractos con daño en las plantas u otro tipo de extracción como lavado de

hojas o macerado, se pueda identificar los compuestos que detectan las larvas cuando

tocan la hoja.

En algunos trabajos, han identificado los compuestos involucrados en la

atracción de las larvas neonatas a los volátiles de su planta hospedera, como en C.

pomonella, el compuesto (E,E)-α-farneseno de frutos dañados es atrayente de larvas

(Landolt et al., 2000).

Cuando las larvas disponen de opciones de planta hospedera y se desplazan a la

más adecuada para su alimentación, existen factores que afectan la mortalidad de las

larvas como el microclima, y los riesgos de depredación y parasitismo. Además, en

condiciones naturales la respuesta única a un determinado estímulo en particular,

difícilmente conducirá al insecto en la búsqueda de alimento o sitio de oviposición, sino

que es muy probable que deban estar en combinación con otra serie de estímulos

involucrados en estos procesos, tales como los estímulos visuales y táctiles (Harris y

Foster, 1995; Harris et al., 1995).

83

Este tipo de estudios, permite conocer la dinámica del comportamiento y

supervivencia de las larvas para aumentar su adecuación biológica. En este sentido, una

interrupción de la orientación larval, es decir, atracción de las larvas a trampas, sería

posible como estrategia de manejo para este insecto plaga (Cook et al., 2007).

84

VII. Discusión general

1.- Atracción de hembras de C. decolora a volátiles de col sin daño y con daño

En este estudio, el extracto de col sin daño fue el que provocó la máxima

atracción en las palomillas en comparación con los extractos de plantas con daño.

Después de conocer el extracto que provocó mayor atracción en las hembras apareadas

de C. decolora, se identificaron los compuestos de dicho extracto. Entre los compuestos

identificados, se encontró el (Z)-3-hexenil acetato, compuesto que individualmente

provocó la máxima despolarización antenal, y que en otras palomillas provocó un alto

porcentaje de vuelo y aterrizaje sobre la fuente de volátiles (Rojas, 1999; Reddy y

Guerrero, 2000).

El (Z)-3-hexenil acetato ha sido identificado de extractos de plantas en donde el

método de extracción implica el corte de hojas (Rojas, 1999; Reddy y Guerrero, 2000),

lo cual puede interpretarse como daño en la planta. Algunos compuestos volátiles

inducidos por daño presentan similitud estructural con los volátiles liberados cuando no

hay daño, lo que indica que sus vías biosintéticas son semejantes (Geervliet et al.,

1997).

Los compuestos identificados del extracto de col sin daño y evaluados en

mezcla, provocaron en las hembras un porcentaje de vuelo orientado al estímulo similar

al que tuvieron con el extracto ya mencionado. Tal reconocimiento puede deberse a un

solo compuesto presente en la mezcla o la mezcla completa (Finch y Collier, 2000).

Probablemente el evaluar individualmente cada compuesto identificado en túnel de

viento, complementaría este estudio, ya que posiblemente el (Z)-3-hexenil acetato por sí

solo, provoque las máximas respuestas en los vuelos orientados, como ocurre en P.

xylostella y M. brassicae.

85

También, se pueden identificar los compuestos del extracto de col con daño para

conocer los compuestos responsables de la disminución de la atracción y evaluar

posibles respuestas de repelencia. La repelencia de herbívoros y la atracción de

enemigos naturales a plantas dañadas tienen aplicación directa en el campo del control

de insectos plagas de cultivos agrícolas.

2. Efecto del estado fisiológico y la experiencia sobre la respuesta a los volátiles de

planta hospedera y feromona sexual de C. decolora

En insectos noctuidos el estudio del estímulo químico es importante en la

búsqueda y aceptación de la planta hospedera por parte de la hembra y en la búsqueda de

pareja por el macho; sin embargo, estudios sobre la biología del insecto plaga permitirá

diseñar estrategias de manejo adecuadas con las características de cada especie.

Las hembras de C. decolora de 4-6 días de edad apareadas tuvieron una respuesta

máxima los volátiles de col. Este intervalo de edad está relacionado con el máximo

potencial reproductivo de la hembra, según lo observado por Callado-Galindo et al.

(2013), ya que a otra edad su fecundidad y fertilidad disminuye. La edad adecuada de

apareamiento en las hembras aumenta su adecuación biológica y les permite un mayor

éxito en su fecundidad y fertilidad, como sucede en otras palomillas (Rogers y Marti,

1996; Jiménez-Pérez y Wang, 2003)

Respecto a los machos de C. decolora, a los de 4-7 días de edad alcanzaron la

máxima atracción al extracto glandular de feromona sexual, la respuesta olfatoria

aumenta conforme los machos alcanzan la madurez sexual y después disminuye

conforme éstos son más longevos (Evenden y Gries, 2008). Asimismo, la respuesta de

atracción disminuyó después de que los machos se aparearon. Posiblemente necesitan

recuperarse del gasto de energía realizado en el apareamiento y volver a almacenar

86

esperma (Gillott, 2003). En ese periodo de inhibición los machos pueden enfocarse en la

búsqueda de alimento para restablecer las reservas en sus glándulas accesorias para la

producción de espermatóforos y volver a aparearse, como se ha observado que ocurre en

A. ipsilon (Barrozo et al., 2011).

Otro factor importante que se estudió en este trabajo, fue la experiencia previa de

hembras apareadas a volátiles de planta hospedera como de machos a la feromona

sexual.

Una breve exposición de las hembras apareadas a volátiles de col y de los

machos vírgenes a feromona sexual, provocó a las 2h un efecto inhibitorio de la

respuesta olfatoria posiblemente por una saturación de sus receptores o adaptación

sensorial, es decir una reducción de la sensibilidad a nivel periférico, como sucede en

otras palomillas (Rumbo y Vicrers 1997; Cunningham et al., 1998b; Stelinski et al.,

2005; Dukas, 2008; Trimble y Marshall, 2010; D´Errico et al., 2013).

Las hembras después de que se aparean buscan un sitio para oviposición,

entonces, el que se dé un efecto de inhibición a las 2h, posiblemente es porque el ciclo

circadiano de las hembras apareadas de C. decolora no coincide con la puesta de

huevecillos inmediatamente después de haberse apareado (Decker et al., 2007).

Posiblemente, la restauración de la respuesta olfatoria en las hembras, está relacionada a

la presión de carga de huevecillos, ya que se ha reportado que las hembras ovipositan la

mayor cantidad de huevecillos los primeros días después de haberse apareado (Callado-

Galindo et al., 2013), esto coincide la restauración de la respuesta olfatoria a las 24 y 48

horas.

Para C. decolora, probablemente en otros estudios de pre-exposición a volátiles

de planta hospedera en las hembras y de feromona sexual en los machos, en donde se

87

incluyan diferentes tiempos de pre-exposición, dosis de estímulo y tiempos de medición

de la respuesta olfatoria después de haber pre-expuestos a los insectos, se pueda conocer

si la inhibición se mantiene y hay un proceso de habituación, como sucede en otras

palomillas (Rojas y Wyatt, 1999b; Landolt y Molina, 1996; Cunningham et al., 1998b).

C. decolora como muchos otros insectos, tiene una plasticidad neural, inducida

por la experiencia que les permite a las hembras y a los machos modular su respuesta a

los volátiles de la planta hospedera y a la feromona sexual (Anton et al., 2007).

3.- Preferencia de oviposición por C. decolora

El que las hembras ovipositaran muy pocos huevecillos sobre la planta de col,

posiblemente sea porque ellas no son capaces de evaluar la calidad de la planta para

poner la totalidad de huevecillos sobre la planta de col (Jaenike, 1978). Es entonces

cuando las larvas tienen que elegir otra planta hospedera “óptima” en términos de

desarrollo larval. (Jaenike, 1978; Barron, 2009). Sin embargo, la preferencia de elegir

una planta hospedera no siempre está determinada por el futuro desarrollo larval, otras

variables ecológicas y presiones de selección pueden estar influenciando la elección de

la planta hospedera, por ejemplo el evitar depredadores y parasitoides.

Posiblemente en el campo C. decolora distribuya sus huevecillos en varias

plantas para maximizar la dispersión larval, teniendo un espacio libre de enemigos

naturales (Jeffries y Lawton, 1984) al menos por un tiempo, mientras la planta

hospedera libera los compuestos volátiles que atraen a los enemigos naturales del

herbívoro.

En otras palomillas, la puesta de huevecillos sobre las plantas, provocó la

liberación de volátiles atrayentes de parasitoides (Meiners y Hilker, 2000; Hilker y

Meiners, 2002; Hilker et al., 2002) En este sentido, posiblemente C. decolora reconozca

88

algunos volátiles estimulantes de la oviposición, pero al inicio de éste proceso la planta

de col emite compuestos volátiles que atraerán a los depredadores y parasitoides de sus

huevecillos; sin embargo, en el presente estudio no se observó si la hembra empezó a

ovipositar sobre la planta inmediatamente después de colocarla en la jaula.

Como ya se mencionó anteriormente, C. decolora produce una gran cantidad de

huevecillos durante toda su vida (Callado-Galindo et al., 2013), debido a esto,

posiblemente las hembras de C. decolora no discriminen entre plantas hospederas para

oviposición, como sucede con las hembras que producen pocos huevecillos y que

discriminan los sitios de oviposición (Jones, 1977; Jaenike, 1990; Doak et al., 2006).

4. Atracción de larvas de C. decolora a volátiles de la col

En las larvas neonatas de C. decolora se observó una alta movilidad hacia la

planta de col, parece ser que ellas detectan los mismos compuestos que son atractivos

para el adulto. En estudios con los estados larvales de otras palomillas, se ha observado

que son atraídas a los mismos compuestos a los que responden las hembras (Rembold et

al., 1991; Huang y Renwick, 1994; Hartlieb y Rembold, 1996; Miles et al., 2005).

Posiblemente, el realizar experimentos donde se evalué la respuesta de las larvas

neonatas a extractos con daño en las plantas u otro tipo de extracción como lavado de

hojas o macerado, se pueda identificar ese tipo de compuestos que detectan las larvas

cuando tocan la hoja.

En C. decolora, dada la alta movilidad de las larvas, probablemente sean ellas

quienes elijan la planta hospedera, quitándole presión selectiva de hospedera al adulto

(Gripenberg et al., 2010). Será necesario estudiar el comportamiento de larvas de

diferentes estadios para ver qué tipos de estímulos usan para elegir la planta hospedera.

Ya que es probable que deban estar en combinación con otra serie de estímulos

89

involucrados en estos procesos, tales como los estímulos visuales y táctiles (Harris y

Foster, 1995; Harris et al., 1995). Además, habría que estudiar la posibilidad de que las

larvas no permanecen alimentándose en la misma planta sino que se desplacen en busca

de otras plantas hospederas (Bernays et al., 2004).

De acuerdo a la hipótesis de que la hembra “reconoce”, al momento de elegir

una planta hospedera, que tiene las condiciones “óptimas” para el desarrollo larval. Para

C. decolora tal vez ni la hembra ni la larva “reconocen” esas condiciones al momento

de elegir la planta hospedera; se podría pensar que el adulto y la larva participan en el

proceso de elección adecuándose a la distribución y abundancia relativa de las

potenciales hospederas para maximizar su adecuación biológica, y que la selección final

de la planta hospedera está en función de otras variables ecológicas y presiones de

selección.

La información básica de este trabajo contribuye al conocimiento del estímulo

químico olfativo que causa la atracción de las hembras de C. decolora, la influencia que

tienen algunos factores en la atracción a la planta hospedera por las hembras, y de

búsqueda de pareja por los machos. Además, el estudio de la aceptación de la planta

hospedera por adultos y larvas neonatas.

Los estudios acerca del uso de volátiles de planta hospedera, de feromona sexual

y de la biología de la especie en relación a la respuesta a esos volátiles, deben incluir a

los estados inmaduros, formulaciones con los compuestos sintéticos y los dispositivos

de liberación a emplearse, a fin de proporcionar alternativas que puede integrarse en el

manejo de insectos plaga (Cook et al., 2007). Tales alternativas de manejo pueden

incluir a la feromona sexual y volátiles de planta hospedera, para capturar ambos sexos

90

en trampas en el monitoreo de poblaciones o para trampeo masivo, en combinación con

insecticidas o como atrayentes de depredadores y parasitoides.

91

Conclusiones

El extracto de col sin daño provocó la respuesta máxima de atracción en las

hembras apareadas.

Se identificaron 9 compuestos del extracto de col: una cetona, un éster, un

terpeno, 2 aldehídos y 4 hidrocarburos, de los cuales el (Z)-3-hexenil acetato fue el que

provocó la máxima despolarización antenal. La mezcla de compuestos en proporción

similar a lo encontrado en el extracto, provocó igual porcentaje de atracción en las

hembras.

Las hembras apareadas de 4-6 días de edad, presentaron la máxima respuesta de

atracción al extracto de compuestos volátiles de col y una breve pre-exposición de las

hembras a volátiles de col, causó un efecto de inhibición en la respuesta olfatoria.

Los machos vírgenes de 4-7 días de edad, presentaron la máxima respuesta de

atracción al extracto glandular de feromona sexual y una breve pre-exposición de los

machos a feromona sexual, causó un efecto de inhibición a corto plazo (2h) y una

sensibilización a largo plazo (24h y 48 h).

Las hembras prefieren ovipositar alrededor de la planta de la col, con un patrón

de distribución de número de huevecillos máximo a los 30 cm y de ahí una disminución

gradual de huevecillos hasta la planta de col.

Las larvas neonatas al eclosionar a diferentes distancias de la planta de col, se

desplazan hacia ella, participando en la aceptación de la hospedera para su alimentación.

El extracto hexánico de col sin daño provocó la máxima atracción en las larvas

neonatas, y un aproximado del 50% de las larvas evaluadas a la mezcla de compuestos

identificados se dirigieron a dicho estímulo.

92

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ANEXOS

Carta de aceptación del artículo científico.

De: Waldemar Klassen [[email protected]]

Enviado: sábado, 01 de noviembre de 2014 14:32

Para: Angel Rene Arzuffi Barrera

CC: Epsky, Nancy

Asunto: Your manuscript- RES 8 14-039 Effect of Male Age and Mating on Response to the Sex

Pheromone of Copitarsia decolora 11 01 14 EDITED

Dr. René Arzuffi;

Dr. Nancy Epsky, Associate Editor, has recommended that your manuscript be accepted for

publication in the Florida Entomologist.

I concur and I will include it in the March 2015 issue.

Please proof the attached version and make needed changes with "track changes".

Also please email me tiff or jpeg images of the 4 figures.

Best regards,

Waldemar Klassen, Editor

Running Head: Reyes et al.: Copitarsia decolora Sex Pheromone

Please address correspondence to:

René Arzuffi

Km. 8.5 Carretera Yautepec-Jojutla Yautepec, Morelos. C.P. 62731, México

Phone: 55(735)3942020, ext 82511

Fax: ext 82509

Email: [email protected]

Effect of male age and mating status on response to female sex

pheromone of Copitarsia decolora (Lepidoptera: Noctuidae)

Humberto Reyes, René Arzuffi* and Norma Robledo

CEPROBI, Instituto Politécnico Nacional, Km. 8.5 Carretera Yautepec-Jojutla Yautepec,

Morelos C.P. 62731, México

*Corresponding author: [email protected]

Abstract

The effects of male age and mating status on the behavioral response of Copitarsia

decolora (Guenée) males to the glandular extract of the female sex pheromone were studied

by conducting wind tunnel bioassays and electroantennography (EAG). To study the effect

of age, 2-3, 4-5, 6-7, 8-9, 10-11 day old males were used to measure attraction in the wind

tunnel. To study the effect of age on virgin male antenna depolarization, individual males

3-, 6- and 9-days old were used. The effect of male mating status was studied with 4-6 day

old males and subsequent pheromone response was measured after a period of 24 and 48 h.

Both male age and mating status significantly affected male response to the female sex

pheromone. In the wind tunnel, male attraction to the extract reached its maximum in males

4-7 days old and then decreased as moth age increased. The glandular extract provoked a

significantly greater depolarization of the antennae of 6 day old males than in 3 and 9 day

old males. In the wind tunnel, virgin males were more attracted to female extracts than

mated males. Significantly greater depolarization was observed in the antennae of virgin

than mated males.

Key Words: Copitarsia decolora, sex pheromone, age, mating, wind tunnel,

elecroantennography

Resumen

Se estudió el efecto de la edad del macho y el estado de apareamiento sobre la respuesta de

comportamiento de machos de Copitarsia decolora (Guenée) al extracto glandular de la

feromona sexual de la hembra, mediante bioensayos en túnel de viento y

electroantenografía (EAG). Para medir la atracción en túnel de viento se utilizaron machos

de 2-3, 4-5, 6-7, 8-9, 10-11 días de edad y para estudiar el efecto de la edad sobre la

despolarización de sus antenas, se utilizaron individuos de 3, 6 y 9 días de edad. Para

estudiar el efecto del apareamiento se utilizaron machos de 4-6 días de edad y su respuesta

a la feromona se midió 24 y 48 horas después. Ambos, la edad del macho y el estado de

apareamiento, afectan de manera significativa la respuesta de los machos a la feromona

sexual de las hembras. En el túnel de viento, se observó que la atracción de los machos al

extracto fue mayor a los 4-7 días y después disminuyó conforme incrementó la edad. El

extracto glandular provocó una despolarización significativamente mayor en las antenas de

los machos de 6 días de edad que en los machos de 3 y 9 días de edad. En túnel de viento

los machos no apareados fueron más atraídos al extracto glandular de las hembras que los

machos apareados. Se observó una despolarización significativamente mayor en las antenas

de los machos no apareados que en los machos apareados.

Palabras Clave: Copitarsia decolora, feromona sexual, edad, apareamiento, túnel de viento,

electroantennografía

Males moths use sex pheromones emitted by females to locate a mate. However,

male response can be affected by numerous factors, including the physiological state of the

insect (Anton et al. 2007; Evenden & Gries 2008) and experience (Anton et al. 2007).

Pheromones are detected by olfactory receptor neurons (ORN) housed within cuticular

sensilla mainly on the antennae (Keil 1999). The axons of ORNs project via the antennal

nerve into the antennal lobe (AL). There they make synaptic contact with intrinsic AL

neurons, the local interneurons, and with AL projection neurons, which transfer information

to higher brain centers (de Belle & Kanzaki 1999). The AL consists of a species-specific

number of glomeruli (Hansson &Anton 2000). Male moths have large numbers of olfactory

receptor neurons tuned to single compounds of the sex pheromone produced by females,

and large glomeruli, called the macroglomerular complex, are entirely dedicated to the

processing signals pertaining to these sex pheromones (Hansson & Anton 2000).

For some moth species such as Plutella xylostella (L.) (Zhang et al. 2009), Agrotis

ipsilon (Hufnagel) (Anton & Gadenne 1999; Gadenne & Anton 2000; Gadenne et al. 2001;

Barrozo et al. 2010a, 2010b, 2011), Heliothis virescens (F.) and Heliothis subflexa

(Guenée) (Soques et al. 2010) it has been demonstrated that age and mating status can

modify olfactory reception and sexual pheromone processing in males. In these species, the

male response to the female sex pheromone is regulated by hemolymph titers of juvenile

hormone (JH) (Gadenne et al. 1993; Duportets et al. 1998; Anton & Gadenne 1999;

Gadenne & Anton 2000), and by neuromodulators that act on ORNs and AL neurons

(Anton et al. 2007).

Copitarsia decolora (Guenée) (Lepidoptera: Noctuidae) is an important pest of

cruciferous crops in Mexico (Suarez-Vargas et al. 2006) and subject to quarantine in the

United States (Venette & Gould 2006). Rojas et al. (2006) identified the sex pheromone of

C. decolora and, although synthetic sex pheromones have been used as an alternative to

synthetic insecticides (Rojas et al 2006; Muñiz-Reyes et al. 2007; Barrientos-Hernández et

al. 2011; Diaz-Gomez et al. 2012), the effect of environmental (Dumont & McNeil 1992)

and physiological factors on male response to the sex pheromone have not been studied.

However several factors, including of age and physiological status of males, should be

evaluated before the pheromone compounds can be used effectively for C. decolora

management. The efficiency of traps baited with pheromone could be affected importantly

by these 2 factors.

This study examined the effect of age and male mating status on male attraction and

antennal responses to sex pheromone extracts of C. decolora females. Understanding the

effect of the factors on olfactory guided behavior of C. decolora males will contributes to

improving current pheromone-based methods for the management of this pest species.

Materials and Methods _____

INSECTS

Insects used in the bioassays were obtained from a C. decolora colony at the Centro

de Desarrollo de Productos Bióticos, National Polytechnic Institute (IPN) in Yautepec,

Morelos, Mexico. The insects were maintained at 25 ± 3 °C, 60 ± 5% RH and 12:12 h L:D,

with the photophase and scotophase reversed with respect to the natural light cycle in order

to allow pheromone extraction and bioassays during the day. Larvae were fed with a special

artificial diet for lepidopterans (Cibrián-Tovar & Sugimoto 1992). Adults were fed with a

50% sucrose solution placed on cotton wool, which was replaced every 3rd day.

PREPARATION OF SEX PHEROMONE EXTRACT

The gland that produces the sex pheromone, situated between the seventh and ninth

abdominal segment (Rojas et al. 1995), was dissected from virgin 3-5 day old females that

presented sexual calling behavior during the final third of the scotophase (Rojas et al.

2006). Sixty glands were placed in 2 mL glass vials containing 1 mL of dichloromethane as

a solvent for 10 min. The supernatant was concentrated to 100 µL under a nitrogen flow.

Each extract had a concentration of 3 female equivalents (FE) for each 5 μL. The gland

extracts was stored at -4 ºC until chemical analysis or use in the bioassays.

ANALYSIS AND IDENTIFICATION OF VOLATILE COMPOUNDS

Two µL of extract were injected into a gas chromatograph (GC) (HP 6890) coupled

with a mass spectrometer (MS) (HP 5972) (Agilent, USA). The samples were analysed

using a non-polar HP 5MS column (30 m long, 250 µm internal diameter and 0.25 µm film

thickness; Agilent Technologies, Santa Clara, California). The initial oven temperature was

60 °C, increasing 15 °C/min until it reached 280 °C. The carrier gas was helium at a

constant flow of 1 mL/min. The injector temperature was 225 °C and the auxiliary was 280

°C; the injector functioned in splitless mode for 0.30 min. The MS functioned by electronic

ionization (70 EV), in SCAN mode and at a mass interval of 35 to 550 AMU. Compound

identification was carried out by considering retention time (RT) and by comparing mass

spectra to spectral libraries (NIST/EPA/NIH 2002) and synthetic standards. The standards

(Z)-9-tetradecenylacetate (Z9-14:Ac) and (Z)-9-tetradecenol (Z9-14:OH), with 98% purity

were obtained from Sigma Aldrich (Toluca, Mexico). In all of the extracts used in the

bioassays, the presence of Z9-14:Ac and Z9-14:OH in similar proportions to those reported

by Rojas et al. (2006) were verified.

WIND TUNNEL BIOASSAYS

In the wind tunnel bioassays, volatile chemicals from the glandular extract were

carried to the insects by a current of air (0.4 m/s) produced by a fan (Siemens 1RA3055-

4YK31, México). The experiments were conducted at 25 ± 3 °C, 60 ± 5% RH. In

preliminary studies the following concentrations were tested: 3, 1.2, 0.12, 0.012 and 0.0012

FE. The 3FE concentration caused the greatest attraction response and landing, so this was

used in both experiments (wind tunnel and EAG). 5 µL (3 FE) of glandular extract was

individually placed on filter paper (2.0 × 2.0 cm, Whatman no. 1), then left for 20 s at the

same height as the air flow entrance to allow the solvent to evaporate. A single male was

released at this height but at the opposite end of the tunnel. Each moth was tested for

response within 300 s and with one test per moth.

The following types of behavior were measured in the wind tunnel: no response,

short flight (flight less than 100 cm), long flight (flight more than 100cm but less than 150

cm), and landing on the source. The number of males that displayed their claspers was also

recorded. Furthermore, latency to activation (antenna and wing movement and displaying

claspers) and latency to landing on the scent source were recorded.

ELECTROANTENNOGRAPHY

The measurement and analysis of the EAG responses were conducted using Syntech

EAG equipment (Kirchzarteng, Germany). Once the antenna of the insect was dissected, it

was mounted between 2 silver (Ag) electrodes and conductor gel was added. The signal

generated by the antenna was transmitted to an IDAC-2 amplifier and was observed on a

monitor with software for EAG recording and analysis. Antenna stimulation continued

for1s with an air flow of 0.5 L/min transported to the antenna by a pump (stimulus

controller SC-55) with a constant flow of humidified purified air (0.7 L/min). For stimulus

application, 5 µL (3 FE) of glandular extract of the sex pheromone were placed on filter

paper (1 × 0.5 cm, Whatman No. 1). In each experiment the solvent was allowed to

evaporate for 20 s and the interval between each stimulus was 120 s. In these bioassays, the

antenna polarization response to solvent was subtracted from response to glandular extract

before analysis. Each antenna was used only once.

TREATMENTS

To study the effect of age, the pupae were separated by sex. After emergence, adults

were placed in plastic containers (20 x 20 x 20 cm) to obtain single sex groups of known

age. In the wind tunnel bioassays, virgin males that were 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 and 10-11 days

old were used, with 10 moths tested per group. For EAG response, virgin males that were

3, 6 and 9 days old were tested, with 6 moths tested for each age. Selection of the age

groups for EAG tests was based on results of wind tunnel tests.

For tests of the effect of mating, virgin males and females, 4-5 days after

emergence, were individually paired and held in plastic containers (200 mL). The pairs

were observed for mating and time when mating ended was recorded. Male responses in

wind tunnel bioassays and EAG to the extracts were measured 24 and 48 h after mating. All

of the evaluated mated males in both wind tunnel (n = 10) and EAG (n = 6) were 5-7 days

old. The depolarization values obtained from the groups of mated males were compared

against a group of virgin 4-6 day old males. The females from each mated pair were

dissected and the presence of the spermatophore used to confirm that matings were

successful.

STATISTICAL ANALYSIS

The behaviors of the males in the wind tunnel were analysed by the Chi-square

test with Yates correction. Regarding the latency of the responses observed in the wind

tunnel, the median and interquartile range (Q1 to Q3) were determined for each group. The

interquartile range is little affected by extreme scores, so it is a good measure of spread for

skewed distributions. The latency data were analysed by a Kruskal-Wallis test and Tukey’s

test (P = 0.05) was used for comparison of means.

The data obtained from the depolarization in the male antennae were analysed by

ANOVA. Comparisons of means were carried out using a Tukey's test. Sigma Plot 11

(Systat Software Inc., Chicago, Illinois) was used for all statistical analyses.

Results _____

EFFECT OF AGE

Male attraction to the extract was greatest for 4-5 and 6-7 day old males and then

decreased with age in wind tunnel tests (Table 1). These groups were the most responsive,

although there was no difference between these 2 groups. There were also significant

differences between 4-5, 6-7 and 2-3 (Chi square = 52.769; df = 1; P < 0.001), 8-9 (Chi

square = 52.769; df = 1; P < 0.001) and 10-11 day old males (Chi square = 72.521; df = 1;

P < 0.001) regarding flight behavior patterns when landing on the scent source. In

addition, there were significant differences between 4-7 and 2-3 day old (Chi square =

20.056; df = 1; P < 0.001), 8-9 and 10-11 day old males (Chi square = 8.526; df = 1; P =

0.004) for displaying claspers (Table 1).

The 4-5 and 6-7 day old males presented activation and landing latencies

significantly less than those displayed by 2-3, 8-9 and 10-11 day old males (H = 28.557, df

= 4, P < 0.001 and H = 24.167, df = 4, P < 0.001; respectively) (Fig.1).

The EAG responses by age group are shown in Fig. 2. The extract elicited a

significantly greater depolarization in antennae of 6 day old males than in 3 and 9 day old

males (F = 9.965; df = 2,17; P = 0.002).

EFFECT OF MATING

In the wind tunnel bioassays, the virgin males were more attracted (both long flight

and landing) than males evaluated 24 and 48 h after mating (AM). Differences were found

in source landing behavior for 24 AM males (Chi square =18.484; df = 1; P < 0.001) and

48 AM males (Chi square = 48.505; df = 1; P < 0.001); as well as in long flight behavior

for 24 AM males (Chi square = 11.281; df = 1; P < 0.001) and 48 AM males (Chi square

=36.214; df = 1; P < 0.001) (Table 2).

Mating had an effect on both activation and landing latencies (activation latency H

= 17.867, df = 2, P < 0.001; landing latency H = 14.885, df = 2, P < 0.001). The males from

the 24 AM and 48 AM groups spent more time in activation and landing on the scent

source than the virgin males group (Fig. 3). Similarly, a significantly greater depolarization

was observed EAG responses of virgin males than mated males (24 AM and 48 AM

groups) (F = 9.814; df = 2, 17; P = 0.002) (Fig. 4).

Discussion ___

In this study, we found that antennal sensitivity to the sex pheromone by male C.

decolora moths varies in relation to age, reaching a maximum at 6 days. Similar changes in

antennal sensitivity due to age have been observed in other species of moths such as A.

ipsilon (Gadenne et al. 1993), Spodoptera litoralis (Boisduval) (Martel et al. 2009) and

Mamestra brassica (L.) (Pophof 2000). In these species, this has been attributed to the

maturation of the ORNs (Martel et al. 2009), changes in hemolymph titers of the juvenile

hormone (Gadenne et al. 1993; Gadenne & Anton 2000) and neuromodulation of biogenic

amines that act on ORNs sensitivity (Pophof 2000; Grosmaitre et al. 2001). These 3

mechanisms could explain the results observed in C. decolora as well; however studies are

needed on these variables for this species.

In C. decolora, the observed changes in antennal sensitivity to the sex pheromone

correspond to observed behavioral changes. During the initial days after emergence, male

attraction response is low and it then begins to increase with age until reaching its

maximum level at days 4-5 and 6-7, subsequently decreasing with age. In some species of

moths, such as A. ipsilon, male response to the sex pheromone starts to increase in 3 day

old individuals (Gadenne et al. 1993). In other moths such as Spodoptera frugiperda

(Smith), the optimal age is 2 days (Rogers & Marti 1994), while for Spodoptera exigua

(Hübner) it is reached at 1-2 days (Rogers & Marti 1996). It seems that young C. decolora

males (2-3 days old) do not have sufficient sexual maturity to respond to the sex

pheromone, and this also seems to be the case regarding recently emerged A. ipsilon males

(Gadenne et. al 1993; Duportets et al. 1998). Across species, the olfactory response

increases until the males reach sexual maturity, and then decreases (Evenden & Gries

2008).

Mating in C. decolora males was associated with a decrease in behavioral

responses, similar to those observed in A. ipsilon mated males (Gadenne et al. 2001). In A.

ipsilon, mating triggers the release of neuromodulators that have the ability to modulate

antennal lobe neurons in response to female sex pheromones and affect the development of

the sex accessory glands, but antennal sensitivity is not affected (Duportets et al. 1998;

Gadenne et al. 2001). In contrast, in C. decolora the antennal sensitivity is affected by

mating. The decrease in pheromone response could be related to the fact that C. decolora

males do not mate more than once during the night (Rojas & Cibrián-Tovar 1994) and can

mate a total of 2 to 3 times during their lifetime (Castrejón-Gómez et al. 2000). This

inhibition in the antennal and behavioral responses, combined with the effect of age, could

represent a mechanism for temporally separated matings.

Copitarsia decolora males possibly need to recover from increased energy

expenditure during mating and store sperm again (Gillott 2003). During this period of

inhibition, the males can focus on searching for food to re-establish reserves in their

accessory glands to allow sperm production and therefore mate again, as observed in A.

ipsilon (Barrozo et al. 2011).

The attraction response of male C. decolora to pheromone not only depends on the

chemical composition (type of compounds and their relative proportions) (Rojas et al.

2006), but is also influenced by insect age and mating status, which affect the sensory input

or processing that generates the necessary locomotion pattern to land on the stimulation

source (Daly et al. 2007; Anton et al. 2007; Lemmen & Evenden 2009). In C. decolora

males, neural plasticity induced by the physiological state allows males to modulate their

response to the sex pheromone, which must be considered before that synthetic pheromone

is used to manage this insect.

Acknowledgments ___

R. Arzuffi and N. Robledo are COFAA and EDI, IPN fellows. H. Reyes would like

to thank CONACYT and IPN for a scholarship. We are also very grateful to SIP, IPN

(Projects 20121192 and 20130883).

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Table 1. Response (percentage) by age group of virgin Copitarsia decolora males to

female sex pheromone extract (3fe) in wind tunnel bioassays.

Behavior

Age (days)

2-3 4-5 6-7 8-9 10-11

No response 20 b 0 a 0 a 10 b 50 b

Short flight 30 b 0 a 10 a 30 b 10 a

Long flight 10 a 10 a 10 a 20 a 10 a

Landed 40 a 90 b 80 b 40 a 30 a

Claspers displayed 80 a 100 b 100 b 90 a 90 a

Percentages followed by the same letter within a behavior are not significantly different

(Chi-square, n = 10, P < 0.05).

Table 2. Response (percentage) of virgin and mated Copitarsia decolora males to female

sex pheromone extract (3FE) in wind tunnel bioassays. Mated males were tested 24 h and

48 h after mating (AM).

Behavior

Condition

Virgin Mated, 24 h AM Mated, 48 h AM

Short flight 10 a 20 a 20 a

Long flight 10 a 30 b 50 c

Landing 80 c 50 b 30 a

Claspers displayed 100 a 100 a 100 a

Percentages in each row followed by the same letter within a behavior are not significantly

different (Chi-square, n = 10, P < 0.05).

FIGURE CAPTIONS

Fig. 1. Activation latencies (black bars) and landing latencies (gray bars) (Q1 < Median

< Q2) by age group of virgin males in response to a glandular extract of female sex

pheromone (3FE) in wind tunnel bioassays. Bars within a behavior headed by the same

letter are not significantly different (Tukey's mean separation test, n = 10, P < 0.05).

Fig. 2. Depolarization (mean ± SEM) of virgin male antennae in response to a glandular

extract of female sex pheromone (3FE) by male age. Bars headed by the same letter are not

significantly different (Tukey's mean separation test, n = 6, P < 0.05).

Fig.3. Activation latencies (black bars) and landing latencies (gray bars) (Q1 < Median <

Q2) of virgin and mated Copitarsia decolora males to female sex pheromone extract (3FE)

in wind tunnel bioassays. Mated males were tested 24 h and 48 h after mating (24 AM and

48 AM, respectively). Bars within a behavior headed by the same letter are not significantly

different (Tukey's mean separation test, n = 10, P < 0.05).

Fig. 4. Depolarization (mean ± SEM) of antennae in response to a glandular extract of

female sex pheromone (3FE) of virgin and mated males. Mated males were tested 24 h and

48 h after mating (24 AM and 48 AM, respectively). Bars headed by the same letter are not

significantly different (Tukey's mean separation test, n = 6, P < 0.05).

Fig. 1. Activation latencies (black bars) and landing latencies (gray bars) (Q1 < Median <

Q2) by age group of virgin males in response to a glandular extract of female sex

pheromone (3FE) in wind tunnel bioassays. Bars within a behavior headed by the same

letter are not significantly different (Tukey's mean separation test, n = 10, P < 0.05).

Fig. 2. Depolarization (mean ± SEM) of virgin male antennae in response to a glandular

extract of female sex pheromone (3FE) by male age. Bars headed by the same letter are not

significantly different (Tukey's mean separation test, n = 6, P < 0.05).

Fig.3. Activation latencies (black bars) and landing latencies (gray bars) (Q1 < Median <

Q2) of virgin and mated Copitarsia decolora males to female sex pheromone extract (3FE)

in wind tunnel bioassays. Mated males were tested 24 h and 48 h after mating (24 AM and

48 AM, respectively). Bars within a behavior headed by the same letter are not significantly

different (Tukey's mean separation test, n = 10, P < 0.05).

Fig. 4. Depolarization (mean ± SEM) of antennae in response to a glandular extract of

female sex pheromone (3FE) of virgin and mated males. Mated males were tested 24 h and

48 h after mating (24 AM and 48 AM, respectively). Bars headed by the same letter are not

significantly different (Tukey's mean separation test, n = 6, P < 0.05).