TESIS DOCTORAL · TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Faustino...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Faustino Mollinedo García

DIRECTOR:

Vicente Emilio Larraga Rodríguez de Vera

Madrid, 2015

© Faustino Mollinedo García, 1982

Organización y función de las subunidades de ATPasa

Translocadora de protones (F1 - ATPasa) de micrococcus

lysodeikticus : estudio inmunológico y bioquímico

F n v i . s t , i n o M o l l i n e r l o G n r r f n

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

organizacion y funcion df, las subuntdadfs

DE LA A T P a e a TRANSLOCADORA DE PROTONES ( F , - A T P a s a )

DE MICROCOCCUS L Y S Q D E IK T IC U S

ESTUDTO INMUNOLOGICO Y BTOQUIM ICO

Dr p a r t a m e n t o d e R l o q v i l m lc a

F a r u l t a d d e Ci e n c i a s Q u f m l c a s

U n i v e r s i d a d C o m p l u t e n s e d e M a d r id

!Q%4 «IBI3I-IO TEC A

C o l e c c i ô n T e s i a D o c t o r a l e s , NS 2 2 0 / 8 4

Faust itm Mollinorlo Oarrin E d i t a e i m p r i m e l a E d i t o r i a l d e l a U n i v e r s i d a d C o m p l u t e n s e d e M a d r i d , S e r v i c i o d e R e p r o g r a f i a N o - r i c i a d o , 3 M a d r i d - 3 M a d r i d , 1 9 ^ 4 X e r o x 9 2 0 0 X3 4 3 0 D e p o s i t o L e g a l : M- 3 1 • 4 2 ,3 - 1 0 8 4

uNIv e r s Idad c o m p lu te n s e de Madrid

fAcuLt Ad de quimica

ORGANIZACION Y RÜNCION DË LAS SUBUNI DAbES DE La AtEasa TRANSLOCADORA DE EROtONES (Pj-AtEasa) DE MICROCOCCUS LVSODEIKtlCUS. ESTUDtO INMUNOLOGICO V BIOQUIMICO.

m e m o r ia

que para optan al grado de

Doctor en Clencias Qufmicas

présenta

FAUST1NO MOLLINEDO GARCIA

MADRID, 1981

_l_

El presente trabajo tia sido realizado en la Unidad de Bio

membranas del Institufo de Inmunologfa y Biologie Mîcrobiana (C .S .I.

C. ) bajo la supervision del D r. Emilio Mufioz y del Dr. Vicente t_a

rraga, a quienes expreso mi agradecimlento per su valiosa ayuda y

por las facilidades recibidas durante la realizacion de este trabajo.

LJn especial agradecimiento dirijo al D r. Emilio Munoz

tanto por su provechosa discuslon de los resultados como por el ejem

plo que con su entusiasmo y dedicacion constante a la investigacion

nos ofrece a todos.

Asimismo expreso mi agradecimiento al Dr. Esteban San

tiago y a la Dra. Natalia L_opez-Moralalla, del deparlamento de Big

quimica de la Universidad de Navarra, por su colaboracion en los a-

nalisis de metales asi como por permitirme realizar algunos expéri

mentes en su laboratorio,

También agradezco al S r. Rafael Bragado, del deparla

mento de Inmunologfa de la Fundacion Jimenez Diaz, la colaboracion

prestada en la realizacion de los analisis de aminoécidos.

Igualmente agradezco al Frof. Dr. Angel Martin Municio

tanto el Haber aceptado la ponencia de esta tes is como su importan

te pape I en mi fopmacion bioquimica.

Asimismo agradezco a la Srta. Josefa Toribio por Haber

me ayudado en la tpanscripcion de este trabajo a maquina.

Este lr#bajo se Ha realizado mediante una beca predoctg

pal del Consejo Superior de Investigaciones Cientfficas.

- I I -

a b r e v ia t u r a s

ADP

AMP-PNR

ATP

é -A T P

bisacrilamida

butll-PBD

CTP

D

DCCD

DTT

ECR,

EEDQ

EDTA

Fo

adenosfn difosfato.

adenini|i-^ imidodlfosfato.

adenosfn trifosfato,

1 -N^-elenoadenosfn-5 ' -tr i fosfato.

factor de acoplamiento 1 de fosforilacion o

F|-ATPasa de bacterias.

N ,N ' -metilen-bîsacrilamida,

2-(4* butllfenil)-5-(4" blfenil)-1 , 3 , 4-oxadia

zol.


F| -ATPasa de cloroplastos.

citidfn trifosfato.

dalton.

N , N ' -diciclohexilcarbodilmlda.

ditiotreitol.


F -ATPasa de Escherichia coli.

1 -etoxicarbonil-2-eloxl- 1 ,2 d.nidroquinoleina.

acido etilen diamino tetraacélico.

parte hidrofobica insertada en la membrana

del complejo de ATPasa, siendo el respon

sable de la inhibîcion por oligomicina del

complejo de ATPasa mi tocondrial.


F^-ATPasa en sentido genérico.


F^-ATPasa mitocondrial.

- I l l

-ATPasa

(F .F ) ATPasa o 1

GTP4-

H -ATPasa

ITP

NBD-CI

NDP

NTP

p/v

PAGE

PAS

pCMB

p.m.

PMSF

SDS

TEMED

T ris

U TP

v/V

parte hidrosolubie del complejo de ATPasa

o factor de acoplamiento 1 de fosforilacion.

complejo de ATPasa.

guanos in trifosfato.

complejo de ATPasa.

inosin trifosfato.

7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3 diazol.

nucleosido difosfato.

nucleosido trifosfato.

relacion peso volumen.

electroforesis en gel de pollacrilamida.

acido peryodico - reactivo de Schiff.

p-cloro-mercuribenzoato.

fosfato inorganico.

peso molecular.

inhibidor de proteasas de serina (fenil-me

til-sulfonil fluoruro).

dodecil sulfato sodico.

N ,N ,N ’ ,N* tetramelilllendiamina.

factor de acoplamiento I de fosforilacion o

F^-ATPasa de bacteria termofila PS^,

trishidroximetil-am inometano .

uridin trifosfato.

relacion volumen volumen.

INDICE

- V -

1 . INTRODUCCION

Péqina

1.1. Caracteristicas v organizacion de las protefnas de

membrana. ................ 2

1.2. L-as membranas biologicas como transductoras de

enerqfa ............................... 10

1.3. Aspectos evolutivos en el acoplamiento bîoenergé-

tico.......................................................................................................................... 15

1.4. Diferentes denominaciones para un mismo sislema

enzimatico............................................................. 19

1.5. El complejo de ATPasa como un complejo multi-

tuncional ............................................. 23

1.6. Posibles modetos para la multifuncionalidad de los

compleios de ATPasa....................................................................... 26

1.7. Factores Fj de acoplamiento......................................................... 28

1.7.1. Aislamiento y purificacion................................................................. 28

1.7.2. Peso molecular, forma y microheterogeneidad de

la enzima purificada............................................................................. 33

1.7.3. Subestructura molecular. Subunidades , estequio-

metria y papel de las mismas.................................................. 37

1.7.4. Composicion quimica............................................................................... 42

1.7.5. Latencia....................................... 44

1.7.6. Ppopiedades cataliticas del factor F j..................................... 45

1.7.6. 1. Sustrato, requerimientos ionicos y paramétrés ci-

néticos.............................................................................................................. 45

1.7. 6. 2. Actividad en ausencia de iones metalicos....................... 47

1.7. 6. 3. Especi ficidad para nucleosidos trifosfa to.................. 48

1.7. 6. 4. Grupos funcionales del sitio a c tivo ................................. 46

1.7.7. Inhibidores y activadores de la actividad hidrolitica

- V i

de los factores . . .................................. 50

1.7.7.1. Nucleolidos de adenîna y analogos............................ 50

1.7.7.2. Inhibidores de la fosforilacion oxtdaiiva................................ 51

1.7.7.3. Aniones........................ 51

1.7.8. Fijacion de ligandos.................................................................................. 52

1.7. 8. I. Nucleolidos de adenina..................... 52

1 .7 .8 .2. Fosfato.............................................................................................................. 53

1 .7 .8 .3. Aurovertina........................................................ 54

1 .7 .8 .4. Aniones...................................... 54

1.7.9. Sitios cafallticos.................................................................................... 55

1.7.10. Cambios conformacionales................................................................. 56

1.7.11. Diferencias entre los factores F soluble y unido a

membrana................................. 57

1.7.12. Organizacion de la enzima en la membrana...................... 58

1.8. Aspectos de los factores de acoplamiento. F ro-

telnas responsables de la accion de DCCD..................... 62

1.9. Estudios qenéticos........................................................................ 65

1.10. F^-ATPasa de Micrococcus Ivsodeikticus............................ 66

1.11. Esta tesis........................................................................................................... 71

2. MATERIALES Y METODOS.......................... 72

2. 1 . Réactives........................................................................................................... 73

2.2. Microorqanismo v condiciones de creclmlento................ 74

2.3. Preparacion de membranas .................. 75

2.4. Solubilizacion de la enzima................................................................. 75

2.5. Purificacion de la enzima.................................................................... 77

2.6. Aislamiento de subunidades................... 78

2.7. Electroforesis en qel de pollacrilamida................................. 79

2.7.1. PAGE preparativa. . . . ...................................................................... 79

2.7.2. p a g e analitica.......................................................................................... 79

- V I I -

2.7.3, Tlnciones............................................. 81

2.8. Ensayos de actividad enzimatica................................................ 82

2.9. Inhibicion de la actividad enzimética por antisuero. 83

2.10. Tratamiento con agentes quelantes........................................... 84

2.11. Otras determinaciones anallticas. ............................ 84

2.12. Reinsercion de -ATPasa v sus subunidades a

membranas desprovistas de enzima...................................... 85

2.13. Tratamiento con tripsina........................... 86

2.14. Preparacion de antisueros............................................................. 87

2.15. Titulacion de antisueros.................................................................... 88

2.16. InmunodIfusion doble bidlmensional........................................... 89

2.17. Inmunoelectrofo rests ................ 891 25

2.18. Marcaie de prtelnas con £.................................................... 89

2.19. 1—ocalizacion de radiactividad en qeles............................... 91

2.20. Radiolnmunoensavo de la enzima - ATPasa v

de sus subunidades.................................................................... 91

2.21. Piiacion de fosfato a Pj -ATPasa............................................ 92

2.22. Analisis de metales............................................................................. 92

.................... 93

2.24. Medldas de radiactividad................................................................. 93

2.25. Medidas de absorcion........................................................................ 93

2.26. Medidas de fluorescencia...................... 94

2.23. Reconstitucion de Zn - ( P -ATPasa )

3. r e s u l t a d o s ........................................................................... 95

3.1. Subes tructura del factor BP .................................................. 96

3.1.1. Aislamiento y analisis de la enzima soluble............ . 97

3.1.2. Identificacion de un nuevo componente en la subes

tructura de P - ATPasa de M. lysodeiklicus ............ 101

3.1 .3. Relacion estequiometrica de subunidades............... 105

3.2. Antigenicidad de la enzima P^-ATPasa y sus sub

- V I I I -

unidades................ 107

3.2.1. Caracterizacion de antisueros........................................................ 108

3.2.2. Titulo de los sueros................................................................................. I l l

3.3. Radioenmunoensavo de -ATPasa y sus subunida

des. Influencia de las subunidades v X sobre

las propiedades inmunoqufmicas de la enzima............... 114

3.3.1. Marcaie y estado molecular de la molécula de P^-

ATPasa y de sus subunidades oC , |3 y ^ .................... 115

3.3.2. Radioinmunoensayo de P^-ATPasa.......................................... 124

3.3.3. Radioinmunoensayo de las subunidades O/ , y . 126

3.3.4. Reconstitucion de las propiedades antigénicas de la

molécula de P^-A.TPasa a partir de sus componen

tes polipeptidicos........................................................................................ 126

3.4. Papel de las subunidades de -ATPasa en la ac

tividad enzimatica................ 134

3.4.1. Dos aproximadones expérimentales para afrontar

un mismo problema............................................. 135

3.4.2. Electo de distintos antisueros sobre la actividad

ATPasica de la enzima purificada........................................... 135

3.4.3. Sensibilidad a tripsina de la enzima purîficrda. Su

efecto sobre la actividad enzimatica........................................ 138

3.4.4. Aislamiento de distintas formas de P^-ATPasa ob-

tenidas por digestion con tripsina.............................................. 142

3.5. Inmunoqutmica del factor SP unido a membrana. . . 151

3.5.1. Efecto de los sueros anti-( Pj-ATPasa ) sobre la

actividad enzimética del factor BP, unido a membra1 —

na y purificado........................................................................................... 152

3.5.2. Efecto de los sueros anti-subunidades sobre la ac

tividad enzimética del factor 8Pj unido a membrana

y purificado................................................................................................... 154

- I X -

( 2+3.6. Rapel de la subunidad O v los iones Mq en la

fi lac ion de ta molécula -ATPasa a membranas.. 160

3.6.1. Efecto de la presencia de iones bivalentes sobre

la reinsercion de enzima a membranas............................. 161

3.6.2. Reversion de la fijacion de Fj-ATPasa a mem

branas................................................................................................................ 161

3.6.3. Estudîo comparative de la solubilizacién de enzima

y de la reversion del complejo BF -membrana for2+

mado en presencia de f lg ............................ 173

3.6.4. Digestion proteolîtica controlada de la enzima pu

rificada. Su efecto sobre la reinsercion a mem

branas ..................................................................................... 173

3.6.5. Reinsercion a membrana de una enzima con sub

unidad oC modlficada.......................................................... 1 78

3.6.6. Reinsercion a membrana de molécules de F -

ATPasa con contenido variable en subunidad é . . 181

3.6.7. Reinsercion a membrana de una enzima defectiva

en subunidad obtenida por tratamiento con trip_

sina......................... 181

3.6.8. Reinsercion de las subunidades aisladas del factor

BF^ a membranas................................................................................... 183

3.6.9. Efecto de distintos antisueros sobre la reinsercion

de la enzima a la membrana......................................................... 191

3.7. Papel de los iones metâlîcos en la Fj -ATPasa. . . . 193

3.7.1. Contenido de zinc de la enzima purificada. . . . . . . . . 194

3.7.2. Efecto de varlos agentes quelantes sobre la activi

dad enzimatica.............................................................................................. 194

3.7.3. Reconstitucion de (Zn^ ) F -ATPasa y de su ac

tividad.................................................................................................................. 200

3.7.4. Accion de cationes bivalentes en la prevenciôn y

- X -

reversion del efecto de los agentes quelantes 200

3.7.5. Distlnta funcionalldad de los iones metélicos diva-

lentes ........................................................................................ 205

3.7.6. E fee to de cationes divalentes sobre la actividad

enziiTiatica.................... 207

3.7.7. Influencia de diverses cationes sobre las propieda

des opticas de la molécula de -ATPasa estudia

das por espectroscopia de fluorescencia........................... 209

3.8. Efecto del agente quelante EDTA sobre la subes-

tructura del factor BF^ ................... 213

3.8.1. Disociacion de componentes polipeptidicos por tra

tamiento de F^-ATPasa con E D T A ..................................... 214

3.8.2. Efecto del EDTA sobre la tincion PAS de la enzi

ma................................................ 220

3.8.3. Reinsercion a membrana de una enzima defectiva

en las subunidades minoritarias................................................. 220

3.9. Fijacion de fosfato a F -ATPasa .............................. 225

3.9.1. Medida de fijacion de P i................................... 226

3.9.2. Fijacion en funcion de la concenlracion de fosfato. . 226

3.9.3. Efecto de la fuerza ionica, pH y temperatura 230

3.9.4. Influencia de nucleotidos de adenina, cationes diva

I en tes y t_ CD I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 4

4. DISCUSION.................................................................................................... 23 7

4.1. Propiedades estructurales del factor BF de M . Iv

sodeikticus.......................................................................................................... 238

4.1.1. Componentes intrinsecos............................. 239

4.1.2. Latencia................................................. 241

4.1.3. Microheterogeneidad y labilidad........................................................ 242

4.1.4. Estequiometria en subunidades. .................................................. 244

- X I -

4.1.5. Consideraciones sobre la presencia de hidratos

de carbone.................................... 244

4.2. Propiedades inmunoqufmicas de ta enzima..... 248

4.2.1. Antisueros y actividad enzimética............................ 249

4.2.2. Radioinmunoensayo y estructura molecular...................... 251

4.3. Subunidades v actividad ATPasica ........................ 254

4.3.1. Papel de las subunidades mayoritarias, y . . . 255

4.3.2. Interacciones entre subunidades y comportamiento

cataiftico. ........................................................................................... 259

4.4, Union de Fj -ATPasa a membranas...................................... 262

4.4.1. Requerimientos ionicos .................................................. 263

4.4.2. Datos cuantitativos.................................................................................... 265

4.4.3. Papel de la subunidad ................................................................ 266

4.4.4. Reinsercion de las subunidades aisladas............................ 271

4.5. Papel de los iones metélicos en las Fj -ATPasas. 273

4.5.1. Las Fj -ATPasas como metaloprotefnas......................... 274

4.5.2. Funciones estructurales y cataifticas de los iones

metélicos divalentes................................................................................ 276

4.6. Fijacion de P l. .................................................... 280

4.6.1. Caracteristicas de la fijacion........................................................ 281

4.6.2. Efecto de nucleotidos, cationes divalentes y agentes

quelantes.......................................................................................... 232

4.7. Resumen del estudio de la enzima F -ATPasa de

M . Ivsodeikticus.................................................................................... - 284

4.8. Comparacion entre distintas ATPasas................................. 294

4.9. Perspectives.................................................................................................. 303

5. CONCLU SIGNES.................................................................................... 306

6. BIBLIOGRAFIA.................................................. 310

FE DE EDitATAS

- r n - . 1 7 6 . T a b la X X IT I.24- 24- 24-

DojkI o no Ic e "M j 0 ,6 6 nTÎ y T 'j 1 ,2 0 m2" lo b e ] n o r no " : 'y 1 , 10 y24-

Eg ' 1,00".

-Fac. 200 . T-’ b l - XXXV.

Dondc nc Ico concmt^'ao; onon rl c: r’n' (o, 1; 1 ,0 ;3 ,2; 10,0 ),

1 ,0 ;2 ,4 ;1 0 ,0 ) , Co^‘ ( 0 , l ; l ,0 ;2 ,2 ;1 0 ,0 ) , Fo^‘ (0 ,l ; 1,0; 10,0),

(0,1; 1,0) y Cu-'*‘(0,1;1,5), Aobn locrec: Fir'^(0,15;l,5;1,5;13,0),

2G^'*‘ ( 0 , 2 1 ; 2 , 1 |5 , 0 ; 2 1 , 0 ) , n o "'^ (C , lO ; 1 ,2 ; 1 ,0 ;T O ,0 ) , F o ''‘* '(0 , ] 0 ; 1 ,0 ;

1 8 , 0 ) , 0a " '* '(0 , 1 2 ; l , 2 ) y C u " '^ (c , 1 0 ; 1 ,0 ) .

- F a j . 2 3 6 . T a b la XXXIX.

t5ondo r-c lo o c o n c o o tro c 5 one;; C-' ( ] , 2 i -y- 10 1 ,2 1 10 )

y E g ' ( 1 ,1 2 r 10 6 ,7 7 10 '^ ) , 6 '-'t-'o I c o r r jo ! Co' (2 ,4 0 10 ' ;

1 , 6c % 10~ ^ ) y F j " '^ ( 2 , 10 % l o " ^ ; 1 ,1 4 r l o ” ^ ) .

I. INTRODUCCION

—2—

1.1, Caracteristicas v organizacion de las proteinas de membrana.

Las membranas biologicas tienen una importancia basica en -

casi todos los fenomenos celulares, habiendose avanzado notablemente du

rante los ultimos quince anos en el conocimiento de la organizacion es -

tructura I de estos sistemas, sin los cuales no se podria concebir una -

celula como un organismo diferenciado, A pesar de que los sistemas -

membranosos difieren ampliamente en su morfologfa, funcionalldad y corn_

posici6n; algunas generalizaciones pueden aplicarse a todos los tipos de

membranas celulares .Ac tualmente, el modelo con mayor apoyo experimen

tal lo constituye el denominado modelo de "mosaico fluido", propuesto por

Singer y Nicolson en 1972 ( I ) . Dicho modelo considéra a la membrana

como una solucion "orientada" de proteinas globulares en la matriz viscg

sa y discontinua de una bicapa lipidica (véase Fig. l ) .

Todas las membranas estén constituidas principalmente por li

pides y proteinas, y en mener medida por hidratos de carbone. La pro-

porcion en que cada uno de estos componentes se halla présente en la -

membrana varia segûn el tipo de la misma (véase Tabla I ) . En gene -

ral las membranas mas ricas en proteinas corr es ponder ian a membranas

mu y activas, es decir, que participarian en un gran numéro de funciones

( 2 ) .

El componente lipidico constituye la matriz estructural de la -

membrana y se organiza en forma de una bicapa con los grupos polares

en las superficies intra y extra-celular, mientras que las cadenas hidrofg

bicas de hidrocarburo se disponen par a le lamente hacia la parte interna -

formando un éngulo recto con el piano de la membrana (6) . Esta estruc

tura ûnica, conleniendo una parte externa hidrofilica y otra interna hidro

fobica, proporciona una barrera astable y relativamente impermeable en

tre los fluidos intra- y extra-celulares. For otra parte, la fluidez de una

bicapa lipidica, dependiente de su composicion a una temperatura deterrru

nada, y las transiciones de fase desde un estado fluido ( liquido ) a un

—3 —

'Y.%m

aO '

H

#FIGURA 1 . - Modelo del "mosaico fluido" propuesto por Singer y Nî

colson ( l) . Represenfacion esquemàtica en seccion y 1res dimensiones

modlficada de la figura original (1). En este modelo se représenta cg

mo las moléculas de proteina pueden a t raves a r total o parcialmente la

bicapa lipidica, asi como las posibilidades de movimiento translacional

y rotacional airededor de un eje perpendicular al piano de la membra

na de las proteinas.

—4 —

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- 5 -

estado crislalino n'gido (gel) , representan propiedades de primer orden

er» el comportamiento de las biomembranas al repercutir profundamente —

sobre la distribucion y funcionabilidad de las proteinas en la membrana (?)

Como se ilustra en la Tabla I, las proteinas conslituyen el com

ponente mayorifario en peso de la mayoria de las membranas biologicas.

I—as moléculas de proteina se localizan en la matriz lipidica de un modo -

totalmente asimétrico, ocupando una posicion exterior con respecte a la -

bicapa y manteniéndose asociadas a la superficie externa y citoplasmica -

de la membrana por interacciones predominantemente electrostaticas (pro

te inas periféricas o extrinsecas) o penetrando en una mayor o menor ex

tension en el interior de la bicapa, interaccionando hidrofobicamente con -

las moléculas lipfdicas (proteinas intégrales o intrinsecas) . Dentro de es

te ultimo grupo se encontrarian las proteinas transmembranales que atra-

viesan la membrana. La division de las proteinas de membrana en extrin

secas e intrinsecas surge de una clasificacion basicamente operacional, —

realizada por Singer y Nicolson al proponer su modelo del "mosaico flui

do" ( l ) . Segun ellos, las proteinas extrinsecas (p.ej. citocromo c, -

F^-ATFasa) se caracterizan por los siguientes criterios : ( a) requieren -

tratamientos suaves, como un cambio en la fuerza ionica del medio o la a

dicion de agentes quelantes para separarse en una forma molecularmente

Intacta de la membrana j (b) en su estado soluble se encuentran libres de

lipidos ; y (c) una vez aisladas de la membrana son relativamente solubles

en tampones acuosos neutros. For el contrario , las proteinas intrinsecas

(p. e j. citocromo b^, Na +K -ATFasa, glucoforina) que representan més

del 70% de las proteinas de membrana, poseen caracteristicas diferentes;

(a) requieren tratamientos mucho més drasticos que rompan interacciones

lipido-proteina o lipido-lipido ( fundamentalmente de naturaleza hidrofobica) -

como detergentes, solventes organicos, agentes caotropicos, para disociag '

se de la membrana; (b) en muchos casos, permanecen asociadas con |i-

pidos al solubilizarse; (c) si se encuentran libres de lîpidos son general

mente insolubles o forman agregados en tampones acuosos neutros. Esta

- 6 -

dislincîôn entre ambos tipos de proteinas no presupone una descripcion

molecular en la ordenacion de las mismas en las membranas, descono-

cida en la mayoria de los casos y debe considerarse como una situacion

extrema, presentandose matices intermedios principalmente en lo que -

concîerne a las proteinas intrinsecas segun estén mas o menos embebi-

das en la bicapa lipidica. l_a figura 2 hace alusion a los distintos tipos -

posibles de organizacion de las proteinas en la membrana y a los posi -

bles efectos de su extraccion en medios acuosos, ya cpje la disposîcion

y estructura de una proteina de membrana puede modifîcarse ostensible-

mente durante el proceso de solubilizacion de la misma.

La composicion porcentual de aminoécidos con carécter hidro-

fébico (9) de una proteina de membrana puede reflejar su grado de interac

cion con la bicapa lipidica^ o) , sin embargo la secuencia debe contener re

glones responsables de dicha interaccion, es decir, cabe esperar una -

distribucion asimétrica de grupos polares y no polares ( I I ) . Ademés, no

todas las region es hidrofobicas se encontraran en el interior de la bica

pa, sino que mucfias de ellas parecen estar relacionadas con la confor -

macîon de la proteina (véase Discusion).

Se ha supuesto que las proteinas intrinsecas que se encuentran

embebidas en la membrana juegan un papel critico en la integridad estruç.

tural de las membranas ( 1 ) . Estas proteinas intrinsecas presentan una

forma predominantemente globular con un porcentaje elevado de conforma

cion o(-hélicoïdal (12-15).

Quizés uno de los descubrimientos recientes mas importantes

en el estudio de las membranas, radie a en que mue has de sus proteinas

son méviles, pudiendo difundir lateralmente en el piano de la membrana y

rotar airededor de un eje perpendicular al piano de la membrana, como

ocurre con las moléculas de rodopsina en las membranas ---------------------------

- 7 -

{ B*9l4n h ld ro flll.

RlOn hid ro f Ablo*

{ teSltehWrof6bl<

R^iôn Ü2ShUrafHl»

2 .- Po«Jbl« dispostclén relmHva d* protefnas art una bicapa llpfdica y

lo# poaiblaa ofactoa da su axtracc(6n a rradlos acuosos.

I , Protefnaa y Hpfdoa Intaraeclonan axclualvamanta a iravas da «us ra -

glpnas hIdrolfHcas. L.a protafna quad# sa r transfarida a un madio acuoso con

la minima parftirbacl6n (aatado A ),

2. Prorefnas y npldos fntaracclonan a travâ» da sus regions hldrollllcas

a hidrol6blcas. En esta caso al alslar las protalnas, asias axpondrfan al agua

algunas raglonas hldrol6blces por lo qua sa producirîa un raagrupamienio « bien

quadando ancarradas dlcbas raglonaa an al Inferior da la mofacula (estado A | o

bien constlHjyando un compla|o mulHmolacular (esiado S) ,

3. Aquf la proteins atravlesa totalmante la bleeps llpldlca, pero las conse

cuencfas da su exirmccl6n a un medio acuoso son an4logas a las <~ltadas an al

caso anterior.

a. (_a Iniaraccl6n antre la proiafna y loa llpldoa as pur amenta hidrotdbl-

ea ya q«.io la parts bfdrortlfca da la proteins se ancuanrra an el Interior da la

molecule funa pos'ble pero Improbable rflsposlclon) . En un medio acuoso, la

protafna podrfa rava rtir a loa astados A o 8 o a una mezcia da alios, o pg

drfa former un agragado Insoluble como «I rapreseniado por la letra C .

S. t-a protafna sa com pone axcfuslvamenta da amlnoacldos htdnol6blcos y

lormarfa un agragado Insoluble an medfoa scuosos (estado C ) . Una proiafna

da este tfpo serfs soluble an medfos no acuosos.

En eats asquama sa ha supuesio qua las protefnas astan unldaa a las

membranaa por Inlaraccl6n directs con npldos. Algunas protefnas pueden no

Irtiaracclonar con tlpldos dlrectamente sfno qua sa ancuentran asocladas a la

membrane por Intaraccilones con otres protefnas, las cualas si Intaracclonan

diractamenta con loa llpldos da la membrane. Esta poslhllldad adlcfonal exileg

da pero no altera los conceptos llustrados an el diagrams. (Esquema tornado

do ( 0 l ) .

- 8 -

de los bas tone! (os refinianos (16). La primera demos(racî6n de que las

proteinas de las membranas plasméticas posefan una movilidad conside

rable, fué realizada por Prye y Edidin en 1970 para los antigenos de-

membrana de heterocariontes de célules de raton y humanas (17). Pos

lerîormente, se observé que la unién de anticuerpos a antigenos de su_

perficie Induce la aparicién de varies tipos de redistribucién selectiva -

de los complejos anticuerpo—antîgeno en la membrana como son(18): (a)

formacion de agregados ("patches” ), consistente en una agrupacién pa—

siva de macromoléculas en un proceso anélogo a una precipitacîon o a-

glulinacîén, teniendo lugar en las dos dimensiones de la membrana (19);

(b) segregacién polar de ciertas moléculas ("capping” ) por un proceso

activo, dependîente, probablemente de los micro fi lamenios citoplâsmîcos

(2 0 ) ; (c) pinocitosis de los complejos, lo que en algunos casos pue—

de conduclr a una pérdida de protemas de membrana ( 20 ) ; mecanis-

mo para el que se ha postulado un posible papel de modulacién antigé-

nica ( 21 ) -

Por otra parte, exister muchos casos en que las funciones

exigen que las protefnas tengan una escasa y/o controlada movilidad y

que se disiDongan en una disiribucion no uniforme y polarizada como o

curre , por ejemplo, en las uniones discontinuas ("gap junctions"), don

de las células se acoplan ionica y metabélicamente. Aunque no se co—

noce como se efectua este control sobre la distribucion y el movimieri

to de las protefnas de membrana sepodrfa pensar en varios mécanis

mes. Estos incluirfan la formacion de grandes agregados de protefna-

que difundirfan mu y Ientamante y/o la accién de las estructuras fibrila

res intracelulares : microtübulos, microfilamentos y filamentos interme_

dios (18).

Otra caracterfstica notable de las protefnas de membrana -

es su ya mencîonada localizaclon asimétrica, Hasta el présente no se

ha identifîcado ninguna protefna que se encuentre simétricamente dis—

tribuida o no expuesta a algun lado de la membrana, por lo que la —

- 9 -

asimetrfa en la orientacion de las protefnas en la membrana parece ser

absoluta. Cada cadena poHpeptfdica tiene la misma orientacion en l a ------

membrana, manteniéndose esta asimetrfa por la ausencia de difusion —

transmembrana I . La mayor parte de las protefnas parece que atravie-

san asimetricamenfe la membrana o se hayan expuestas unicamente ha-

cia la superficie cîtoplâsmica. Asf, en la membrana de eritrocito huma

ne (18), que es la mejor estudiada entre las membranas de mamfferos,

de las quince protefnas mayoritarias (p.m. 15.000-250.000) détectables

por elecfroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, la ma

yorfa de ellas se encuentran ubicadas en el lado citoi'lâsmico de la mem

brana, siendo la més abondante una protefna fibrosa, la espectrina ( 22) ,

que comprends aproximadamente el 25% de la protefna de membrana. Dos

protefnas cfje se proyectan hacia la superficie externa son glucoprotefnas

que cruzan la membrana (18), una de ellas es una protefna globular de

unos 100.000 dalton de peso molecular (23) y la otra , la glicoforina -

(24) .

Por su parte , los hîdratos de carbono son componentes mino-

ritarios de las membranas biolégicas (véase Xabla I) presenléndose------

principalmente como cadenas latérales de oligosacarido unidas covalente—

mente a protefnas y, en una menor extension, a esfingolfpidos. Aunque-

més de un centenar de monosacéridos diferentes pueden hallarse en la

naturaleza, tan solo una decena de ellos se localizan en las glucoprotef_

nas y glucol fpidos de membrana, siendo los principales : galaclosa,ma-

nosa, fucosa, galactosamina, glucosamina, glucosa y acido slalico (18),

A pesar de haberse realizado un progreso sustancial en la elucidacion

de las secuencias de muchos oligosacéridos unidos a Ifpido o protefna,

la funcionalidad biologica del hldrato de carbono permanece por diluci —

dar, habiéndose sugerido posibles implicaciones en la biogenesis de la

membrana, comunicacion celular y reconocimiento celular (18,25).

- 1 0 -

1.2. Las membranas biologicas como transducloras de energfa.

Cualquier organisme requiere un aporte de energfa para su -

existencia. Esia energfa, una vez fransformada por las células en una -

forma aprovechable biologicamente se emplea para un ampllo numéro de

funciones celulares: biosfntesis, transportes activos, trabajos mecénicos,

cambios conformacionales, expresion de antfgenos, recambio, etc. Esta

gran variedad de procesos celulares que necesita un aporte eficaz de -

energfa, utilizan en su mayor fa un unico compuesto como fuente de ener

gfa, el trifosfato de adenosina (ATP). Este nucleotide, considerado como

la "moneda universal de energfa", contiene una elevada concentracion de

cargas negativas en lor no al grupo trifosfato, lo que constituye un factor

importante en la naturaleza del ATP como compuesto de alto contenldo e

nergético (25). Consecuentemente hay diversas enzimas que catallzan la

hidrolisis del grupo fosfato terminal de la molécuta de ATP, dando lugar

a di fosfato de adenosina (ADP) y fosfato inorganico (Pi) y liberando una

apreciable cantidad de energfa (de 7.000 a 8.000 cal/mol) , la cual, con

veni en tern ente acoplada, puede utilizarse en procesos trasceden tales para

el mantenimiento del organisme vivo.

Tres son los procesos fundamentales por los que las células

contribuyen a la recuperacién del "pool" de ATP a partir de ADP y Pi:

la glucolisis, la fosforilacion oxidativa y la fotofosforilacion. Es los 1res -

procesos requieren sistemas enzimaticos eficazmente coordinados, pero la

fosforilacion oxidativa y la fotofosforilacion precisan, ademas, que die ho s

sistemas se encuentren asociados con membranas biologicas. Asf, en cé

lulas procarioticas estos sistemas se hallan asociados a su membrana plas

mética, mientras que en las células eucariôticas se encuentran ubicados

en organulos especializados : la membrana interna de las mitocondrias -

(fosforilacion oxidativa) y la membran tilacoidal de los cloroplastos (foto

fosforilacion) . Estos tres tipos de membrana son comunmente denomina -

das " membranas transductoras de energfa ", ya que en ellas s e ------------

- 1 1 -

acopla la energfa derivada del transporte de electrones a la sihtesis de

A TP , Los sistemas enzimAticos implicados en el transporte eleclronico

y la fosforilacién acoplada son notablemente complejos y diffciles de a —

bordar de forma experimental ya que se encuentran embebidos o asocia

dos con los sistemas membranosos. Este hecho ha constituido un obsté_

culo para la elucidacion del mecanismo molecular por el cual se con —

serva la energfa del flu jo electrénico en forma de energfa del enlace -

fosfato del A TP , si bien parece fuera de toda du da que la membrana -

constituye un e lem en to fundamental en este proceso de acoplamiento de

energfa.

En la actualidad se sabe que los sistemas transportadores -

de electrones asociados con las membranas mitocondriales, de cloro—

plastos y bacterianas se encuentran funcionalmente acoplados a un sis-

tema que sintetiza ATP (complejo de ATPasa) por un mecanismo que

es fundamentalmente similar en todas las células vivas; sin embargo, -

el modo en que acontece dicho acoplamiento sigue eslando sujeto a con

troversia (26). Algunas de las principales hipotesis se ilustran en la -

figura 3. ,

Segun la hipotesis qufmica (Pig. 3 A ) inicialmente propues-

ta por Slater en 1953 (27) , la cadena transportadora de electrones -

generarfa un intermediario qufmico de "alta energfa" durante el flujo -

eleclronico que acoplado qufmicamente al complejo de ATPasa energi_

zarfa el P», el ADP o ambas moléculas. Esta hiooiesis postulaba por

lo tan to una analogfa entre los procesos de fosforilacion oxidativa y fg

to fosforilacion con la fosforilacion a nivel de sustrafo.Sin embargo, —

existe un gran numéro de hechos expérimentales que son muy diffciles

de acomodar con esta hipotesis qufmica (28), que no obstante,no ha-

sido totalmente desechada (29).

Posleriormente en 1961, Mitchell propu so su hipotesis qui_

miosmotica (28) en la que lanto los sistemas responsables del trans_

- 1 2 -

B2e“2eT

#ADP+Pi

ADP+PiATP

ATPATP

E 2e~2e"

ADP+Pi

ATP (y otros tones)ATP

RIGURA 3 .- Rrincipales hipotesis de la iransducciôn de energia. (A)

La hipotesis quimica de Slater postula la existencia de compuestos inter

mediarios "ricos en energia” . ( E5 ) La hipotesis qui miosmotica de Mitchell

asume que el flujo de prolones generado durante el transporte de electro

nes participa de una forma directa en la sinlesis de A T P .{C ) La h!p6

tests de Williams diliere de la anterior en que considéra que no todos -

los protones son dirlgidos hacia el espacio externo. Algunos, pueden -

liberarse en el Interior de la membrana. (ù ) La hipotesis confoixnacto

nal propucsla por Goyer suponfa originariamenlo quo la energfa dériva

da de la respiracion y la lotosfntesis se acumulaba en cambios conlor -

macionales, que se Iransmitifan por interacciones proteina-protefna den_

tro del espacio membranai. ( E ) La hipotesis electroconformacional de

Boyer se puede considerar como una variante de la anterior. Supone

que 'os cambios conlormacîonales responsables de la liberaclôn de ATP

preformado (véase lexto) se originan a partir de un gradiente electro -

qtiimico de protones (o de protones+ oiros iones) .

- 1 3 -

porte de electrones como de la sfnlesis de ATP eran espaces de gene

rap un gradiente de protones a traves de la membrana, constltuyendo -

este gradiente la via de transferencia de energfa entre los dos sistemas

(30-32) (Fig. 3B) . Esta hipotesis quimiosm6tica da una explicacion del

requerimiento de la membrana en este proceso de Iransducciôn de ener

gfa, en contraposiciôn, con la hipotesis qufmica en la que la presencia

de la estructura de membrana podrfa no ser un requisite necesario (28).

El papel de la membrana segun esta hipotesis quimîosmotica serfa el de

constituir una barrera impermeable a iones, en la que la distribucion -

asimétrica de los componentes de la cadena de éxido- reduccion dîera -

origen a potenciales eléctricos transmembranales y/o gradientes de pH

a través de los cuales se transmitirfa y se ulilizarfa la energfa para la

sfntesis de A TP .

I_a hipotesis propuesta por Williams (33,34)^ representada -

en la figura 3C diliere unicamente del modelo de Mitchell en el sentido

de que la transferencia de energfa entre los sistemas de transporte de

electrones y los complejos de ATPasa puede tener lugar a través -

de flujos de protones en el interior de la membrana. No obstante,am —

bas hipotesis a pu n tan hacia una intervencién di recta del gradiente de —

protones originado durante el transporte electrénico en la deshidraiacion

de ADP y Pi para la subsiguiente sfntesis de ATP (35-37).

Una cuarta hipétesis, propuesta originariamente por Boyer -

en 1965,consîderaba que la iransducciôn de energfa tenfa lugar a tra —

vés de cambios conform acionales de los sistemas implicados, que se -

transmitfan por interacciones prolefna-protefna dentro del espacio mem

branai ( Pig. 3D). En una modificacion de esta hipotesis (38-40), es —

quematizada en la figura 3E , se sugiere que un gradiente electro qufmi

co de protones ( o protones més oiros iones) conduce a un cambio con

formacional en el complejo de ATPasa que favorecerfa la union de Pi y

AQP a la enzima y la liberaclôn de ATP de la misma. Este modelo su

pone que la sfntesis de ATP a partir de la deshidraiacion de ADP y Pi

— 1 4 “

se producirfa sin aporte energético, favorecida seguramente por un en

tor no fuertemente hidrofobico en el sitio activo.

En la actualidad, se ha establecido que los sistemas implica

dos en el transporte de electrones y en la sfntesis de ATP pueden gene

ra r reversiblemente un gradiente de protones y/o un potencial de mem

brana a través de la membrana en la que se hayan localizados y, aùn

més, que la transferencia de energfa entre dîstîntos sistemas transduq_

tores de energfa ubicados en la misma membrana puede efectuarse me

diante un gradiente de protones y/o un potencial de membrana, en con

cordancîa con la hipotesis quimiosmélica. Sin embargo, los meçanis-----

mos moleculares por los que se genera un gradiente de protones y/o

un potencial de membrana o por los que se sintetiza una molécula de-

ATP a partir de ADP y Pi no son conocîdos. De este modo, pudiera

suceder que las hipétesis esquemalizadas en la figura 3 no represen-

ten alternativas mutuamente exclusives, si no que reflejen aspectos dife_

rentes de un mismo mecanismo bésico enfocado des de un punto de - -

vis ta transmembranal, intramembranal y molecular (41).

- 1 5 -

1.3. Aspectos evolutivos en el acoplamiento bioeneroético.

I—a fermentacion constituye el proceso melabolico més antiguo

que hizo posible las formas més tempranas de vida. Posteriormente un

mejor aprovechamiento y almacenaje de la energfa, marcarfan las direc

trices de los procesos evolutivos hasta alcanzar el de la fosforilacion q_

xidativa.

l_a figura 4 reproduce el arbol filogenetico relative al acopla

miento energético, propues to por Dickerson y col. (42,43) , y comenta-

do recientemente por Vignais (44). Como puede apreciarse, af final de

la cadena se encuentran las bacterias que bajo una atmosfera reduc tor a

existante en la tierra primitiva, obtenfan su energfa (ATP) a través

del proceso glucofftico. En estos fermentadores anaerobios, la presencia

de una enzima ATPasa unida a la membrana plasmética podrfa "energi-

zar" la membrana haciendo posible transportes activos de sustancias:

azucar glucolisis______________ ATP___________.ootencial de mem

brane .

Un fuerte apoyo a esta hipotesis radica en la identilicacion y

aislamiento de una enzima ATPasa unida a membrana y capaz de crear

un gradiente de pH y un potencial de membrana en una bacteria anaero-

bia estricta. Clostridium pasteurianum . situada en un estadio filogenetico

muy primitivo (45,46).

Poster iormente con la aparicion de las bacterias lotos in te tic as

conteniendo ya un sislema de transporte de electrones asociado a las

membranas, se habrfa adquirido un mecanismo por el que se aprovecha

rfa la energfa solar para originar un potencial de membrana y poder al-

macenar energfa en forma de ATP de una manera més eficaz, presurrd

blemente, por medio de la misma ATPasa opérande en forma inversa:

— 16 —

ORGANISE KDS AEROBIOS AUGAS

vsncEAzuuAOAjBACTERIAS PURPUREAS

NO SULFURE ASPERDIOA DE UA

FOTOSINTESISCLOSTRIDIUM

DESULFCTCMACULL^RESRIRACION

HgO A

FOTOSINTESI'SULFOBACTERIASVERDES OESULFOVIBRIO

CICLO OE KREBS

RESRIRACION

HjS A SO‘ "

FOTOSINTESIS

BACTERIAS ANCE STRALES FERMENTADORAS

F IG U R A 4 .- Arbol filogenetico relaiivo a la evolucion de la fotosfn-

tesis bacteriana y de la respiracion. En este modelo, la respiracion

con sulfato surgîo tempranamente en la tierra primifiva como respues

ta a la fotosfntesis productora de sulfato, de la misma manera que la

respiracion con oxfgeno apareciô mas tarde una vez que la fotosinte-

sis productora de oxfgeno hubo creado un ambiante aerobico. {Es

quema tomado de (42)).

- 1 7 -

t_uz ___________ cadena transportadora de electrones _________potencial de

ATPasa a -t-i-. membrana _________________ ATP

Estas bacterias fotosintéticas primitivas ulilizarfan como

fuente de équivalentes reductores (42) , lo que condujo a una oxidacion

de a azufre y en ultimo termino a sulfato. Esta produccion de con

centraciones locales de sulfato, incluso en condiciones de atmosfera re_

ductora, pu do inducir a que ciertos microorganismos evolucionaran para

extraer un mayor contenido energético a partir de sus metabolites, oxi-

déndolos con sulfato en vez de degradarlos por simple fermentacion (47) .

En este estadio ya algunas sulfobacterias v ?rdes y purpureas

presentarfan un cfcio de Krebs parcial o completo, pero aparentemente

lo emplearfan como un medio de sfntesis de glutamato u otras moléculas,

o como un medio de fijacion de CO^ (48) . Sin embargo en los antepa-

sados de las bacterias purpureas no sulfureas ya se presentarfa un ci-

clo de Krebs completo con el que se proverfan de una fuente alternativa

de NADH, eliminando la i necesidad de una fuente externa de reductores.

Otra alternativa diferente evolucionarfa de las primitivas algas

verdeazuladas o cianoffceas, utilizando un abundante pero pobre reduc--

tor, el . Con el desarrollo de los sistemas folosintéticos de las plan

las verdes, liberando a partir de moléculas de H^O, comenzarfa —

una lenta alteracion en la atmosfera, que en el transcurso del tiempo —

conducirfa a la presents atmosfera oxidante. Consecuentemente, ciertos

microoganismos utîlizarfan este como un aceptor de electrones hacien

do posible el funeionamlento de la cadena transportadora de electrones —

en la oscuridad (respiracion), Lina vez que los procesos folosintéticos-

de las algas verdeazuladas Inubieren incrementado el contenido de oxfge-

no en la atmosfera por encima de un cierto umbral, la respiracion serfa

lo suficientemente eficiente para que la pérdida de la fotosfntesis se pro-

dujese sin perjuicio alguno. Asf las nue vas bacterias aerobias obtendrfan

su energfa segûn el si gui en te proceso:

— 1 8 —

Sustralo ----------► cadena transportadora de electrones -----------------potencial

de membrana ---------------------------ATP.

En este contexto se ha propuesto que los procesos respltalo-

rios de las células procarioticas y eucariôticas se habrian originado a -

partir de la pérdida de la capacidad fotosintética de las bacterias no sul_

fùreas, que presentaben un comportamîenlo dual : fotosintético y resplrato-

rio (4 2 ) . Avanzando més en la escala evotutiva y de acuerdo con la teo

rfa endosimbiôtîca, los orgénulos responsables de la transduccion de ener

gfa en las células eucariôticas se habrfan originado a partir de organis

mes procariôlicos: los cloroplastos de las algas sîmbioticas y las mito -

condrias de las bacterias aerobias. En este sentido se ha sugerido que

una bacteria del tipo Paracoccus podrfa ser el probable antecesor de -

las mitocondrias (49) . Sin embargo una gran interrogante permanece to

davfa por afrorttar ,<i cuales son los posibles mécanismes reguladores que

introducidos en el curso de la evolucion transformarfan un organisme

vo e independiente en un orgénulo especialîzado en la transduccion de e

nergfa ?.

Un hecho comun a lo largo de lodo este hipolético proceso e

volutivo radicarfa en la existencia de un mismo sistema de ATPasa con

una funcion similar en todos los organismes, a saber, la translocacion -

de protones. Como se veré més adelante estos sistemas enziméticos asg

ciados a las membranas bacterianas, mitocondriales y de cloroplastos -

participan de notables similitudes estructurales y funcionales.

- 1 9 -

1.4. Diferentes denominaciones para un mismo sistema enzimatico.

Todas las membranas transductoras de energfa poseen un -

complejo de protefnas, denominado complejo de ATPasa y disenado para

utilizar la energfa procédante de la luz o de la oxidacién de compuestos

orgénicos en la sfntesis energéticamente desfavorable de ATP , como ya

se menciono en el apartado 1.2.. Segûn la hipotesis quimiosmélica, ini

cialmente propuesta por Peter Mitchell en 1961 (28), y actualmente acep,

tada en sus postulados bésicos, el A TP se sintetizarfa en dicho complejo

de ATPasa al utilizar uh gradiente electrocpjfmico de protones transmem

branal (gradiente de pH y de potencial eléctrico) , formado por el movi_

mienlo unidireccional de protones a través de la membrana de cioroplas

tos, mitocondrias y células bacterianas, durante el flujo de electrones a

través de las moléculas transferidoras de las cadenas respitatoria y fo-

losiniéfica. Asf, la fosforilacion de ADP para dar lugar a ATP se Ile

varia a cabo en dicho complejo de ATPasa por un flujo de protones en

sentido inverso, a favor de gradiente. Por otra parte, este complejo pue

de trabajar reversiblemente formando un gradiente electroqufmico de pro

tones a través de la membrana, acoplado con la hidrolisis de ATP. Un

fuerte apoyo experimental a esta hipotesis estriba en el hecho de que el

complejo de ATPasa reconstituido en liposomas interviene en la acu mu-

lacion de H a expenses de la hidrolisis de ATP (50) .

El hecho de que este complejo se comporte realmente como-

una bomba de protones (51 ,52) y de que esta propiedad sea comûn a -

mitocondrias (53-55), cloroplastos (56), bacterias (54,57) e incluso a -

bacterias anaerobias estrictas como Clostridium pasteurianum (45), hace

que sea més apropîado denomînar a este complejo de ATPasa como------4- +

ATPasa translocadora de protones o H —ATPasa, como ocurre con Na ,

K -ATPasa y Ca -ATPasa (52) . Sin embargo, se han asfgnado dife

rentes denominaciones a esta H - ATPasa desde que tuera primeramen-

te aislada de la membrana milocondrial (58) e identificada enfonces como

- 2 0 -

•*ATPasa sensible a oligomicina” . Esta denominacion que no puede ser+

universalmente aceptada ya que solamenie la H - ATPasa mitocondrial

se muestra sensible a oligomicina (52) ha sido empleada por otros labo

ratorios (59). Otras denominaciones para el mismo sistema H - ATPasa

son: (pQ • P^ ) ATPasa (57,60), ATPasa sensible a DOCD (61 ) , —

complejo de ATPasa (62-64), complejo V (65), ATPasa transckjctora

de energfa y ATPasa • ATP sintetasa (66) .

Estas ATPasas translocadoras de protones (H - ATPasas)

o complejos de ATPasa que constituyen Ips denominaciones més exten-

didas presentan dos caracterfsticas notables: a) la similllud en compo^

cion y propiedades générales de todas las H - ATPasa estudiadas (52,

55, 62-64, 67-69) \ b) su ubicacion universal, encontréndose en todas

las células eucariôticas y procariéticas examinadas , a excepciân de -

los eritrocîtos (52) , incluso en organismes lan simples como Streptoco

ccus faecalîs (70) o C. pasteurianum (45) que no poseen una cadena

respiratoria o fotosintética. Esta amplia distribucion se justifica por el -

hecho de que la translocacion de protones a través de la membrana es

esencial, no solo para la fosforilacion oxidativa o fotosintética (26,55,71),

sino para multitud de funciones celulares como son la translocacion de -

iones y sustratos (72) , el movimiento de flagelos (54) , transferencia de

informacion (54), etc.

Al mismo tiempo, esta presencia universal del complejo de —

ATPasa en todos los organismes vivos, permfte estudîar su estructura

y funciôn en diferentes formas, utilizando preparaciones de organismes-

con dis tin tas caracterfsticas. Asf, por ejemplo, en el caso de E. coli se

puede aprovechar el gran conocimiento genético adquirido en esta bacteria,

pudiéndose extrapolar los resultados obtenidos sobre éste u otro microor%

ganismo a cloroplastos y mitocondrias. No obstante debe de acogerse —

con cautela cualquier tipo de generalizacion (73).

Estas H - ATPasas, ubicadas segûn se muestra en la figura

- 2 1 -

5 en la membrana interna de las mitocondrias, en la membrana tilacoi

dal de los cloroplastos y en la membrana plasmética de las bacterias, -

constan de dos grupos de poiipéptidos b estante diferenciados. Uno de —

ellos, conocido como factor de acoplamiento 1” 6 (74) que se pro-

yecta fiacia la matriz (mitocondria) , estroma (cloroplasto) o citoplasma

(bacterias) , puede ser aisiado por tratamientos suaves y constituye el

sitio responsable de la sihtesis e hidrolisis de A TP . La extraccion de

estos componentes P de la membrana provoca un desacoplamiento del

proceso de la fosforilacion exidativa y un aumento en la permeabilidad a

protones, que puede ser revertido por adiccion de DCCD u oligomicina

( en mitocondrias ) (75) . Esta disociacion es frecuentemente reversible,

restaurandose de nuevo las caracterfsticas funcionales de las membranas

de partida (76). De ahf que se haya utilizado el termine de "factor de

acoplamiento" para describir este tipo de protefnas. El segundo grupo -

de poiipéptidos constituyen tes del complejo de ATPasa, denominado fac

tor de acoplamiento o" 6 Pq (77), constituye una parte integral de la -

membrana difîcil de définir con precision y que parece formar una espe

cie de canal en la translocacion de protones. Ambas partes Pi y P© -

seran tratadas mas adelante.

—2 2 —

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1.5. El complejo de ATRasa como un compteio muMi'f jncionat.

Los complejos de ATPasa pueden participan no solamente en

la si'nlesis de ATP sino también en lunciones dependientes de ATP (Ta

bla II). De este modo, en mitocondrias, por ejemplo, el complejo de —

ATPasa interviene en al menos cuatro funciones conocidas : sfntesis de-

A T P j reduccién dependiente de A TP , de N AD P por NADH (transhidro2+

genasa); transporte de Ca dependiente de ATP y reversion del flujo

de electrones dependîente de ATP (66). Recientemente el grupo de Pe

dersen ha demostrado que el componenfe del complejo de ATPasa rni

tocondrial de higado de rata constituye el sitio donde tienen lugar la sfn

tesis de ATP y las reacciones dependientes de ATP (78,79). La extrac

cion del factor P , de vesfculas de membrana interna, por tratamlento -

con urea sin alterar la cadena transportadora de electrones de las vesfcu

las es concomitante con la pérdida de aclividad ATPésica, de sfntesis de

A TP y de actividades dependientes de ATP. Sin embargo, la adicion de

una preparacton de P purîficado, de mitocondrias de hfgado de rata, --

restaura dîchas funciones. Esta restauracion se ve favorecida por la pre

sencia de ATP o AMP-PNP. Segun Pedersen (66) , este hecho junto -

con la potente accion inhibitoria de AMP-PNP de la actividad ATPésica

(véase apartado 1.7.7. 1 .) y la posible identificacion de ATP como un -

elector negativo de esta actividad, sugerirfa que la forma de P més ac

tiva para la sfntesis de ATP serfa aquella forma de "baja actividad ATP

ésica"; lo que podrfa eslar relacionado con la presencia del peptido inhi_

bidon en esta enzima (véase figura 5 y apartado 1 .7 .5 .).

Por otra parle, y como se muestra en la Tabla III, estas fun

ciones catalizadadas por el factor P de los complejos de ATPasa mue%_

Iran ciertas caracterfsticas con relacion a la especificidad del nueleosido

trifosfato y Km (ATP) .

- 2 4 -

T A B L A II

FUNCIONES DEL COMPLEJO DE ATPasa

MITOCONDRIAL

1. Sfntesis de ATP (ADP + Pi -A ATP + H^O)

2. Funciones dependientes de ATP (ATP + H^O j ADP+Pi)

Transporte de calcio4" 4“

NADH + NADP ~ . . N AD +NADPH

Reversion del flujo de electrones.

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- 2 6 -

1.6. Posibles modelos para la mu Mi funcionalidad de los compleios de -

ATPasa.

Basicamente son très los modelos que pueden explicar esta

bidireccionalidad en la funcionalidad de los complejos de ATPasa (62,

66) .

ATPADP

ADP+Pi

NDP+Pi

NDPPi ATP+HgO

NTP+HgO

ATP+HgO

ADP NTP+ +

Pi HgO

Lino de ellos i lus tra como la H -ATPasa puede tener un

ûnico sitio catalîtico que al actuar de una forma reversible puede parti-

cipar en ambas actividades: sfntesis de ATP y funciones dependientes

de ATP. No obstante, es importante observer que dicho modelo nece-

sitarfa de la existencia de ciertos tipos de regulacion (quizés efectos -

alostéricos) que dieran cuenta de las diferencias en especificidad, Km

(ATP) y efecto de inhibidores y aciivadores sobre la sfntesis de ATP

y las funciones dependientes de ATP (véase Tabla III y apartado 1.7.7.)

Asf se sugiere un cambio reversible en el estado con formacional de la

enzima que alterarfa la especificidad del sitio catalîtico. Un segundo mo

delo muestra la presencia de dos sitios separados responsables de la

sfntesis de ATP y de las funciones dependientes de ATP respectiva -

- 2 7 -

menle. Tales silios podrfan ser independientes, si bien, una cierfa in-

teraccion entre ellos seria mas plausible. Un tercer modelo ilustraria -

la presencia de "sitios compartidos" donde los dos silios mencionados -

anteriormen te no serian ni complet am ente idénticos ni estarian compléta

mente separados, de forma anéloga al modelo propuesto por Kozlov y

Skulachev (55).

—2 9 —

1.7. Factores de acoplamiento.

1.7.1. Aislamiento v purificacion.

El compuesto F^ del complejo H — ATPasa, también denomj

nado factor de acoplamiento 1 6 F - ATPasa, ha sido purificado a ho

mogeneidad a partir de distintas biomembranas translocadoras de proto

nes procédantes de diferentes orgénulos (mitocondrias de corazén de —

buey y de hfgado de rata, cloroplastos de varias especies vegetales, —

cromatéforos de microorganismos fotosintéticos ) y de membrana plasmé

tîca de diferentes procariotas (Tablas IV y V ). A las F^ - ATPasas -

procédantes de mitocondrias se las désigna genéricacmente como factores

F^ , mientras que para los cloroplastos y bacterias se utilizan las abre-

viaturas CF^ y BF^ , respectivamente.

Se han empleado distintos métodos de solubilizacion de la pro

tefna dependiendo principalmente del tipo de membrana original. Asf, en

mitocondrias, los tratamientos de disrupcion mecénica (agitacion, sonica

cion) han permilido obtener buenos rendimientos (68), mientras que en

cloroplastos se ha mostrado més eficaz el tratamiento de las membranas

con tampones de baja fuerza ionica en presencia de agentes quelantes -

(63). En bacterias, por el contrario, existe un amplio abanico de pro-

cedimientos, no pudiéndose aplicar un proceso general para todos los —

microorganismos (69). No obstante, desde que Ishikawa y t—ehninger, -

en 1962, lograran solubilîzar la actividad ATPésica de las membranas -

de Micrococcus Ivsodeikticus mediante un "chocjue osmotico" con agua —

frfa (132), un proceso similar tratando las membranas bacterianas con

tampones de baja fuerza ionica en presencia o no de agentes quelantes,

ha sido anpliamente utilizado para aislar la enzima F^-ATPasa de la -

membrana de numerosas especies bacterianas (véase Tabla V). Sin em

bargo este tipo de tratamiento no logra solubilizar la actividad ATPésica

en ciertos microorganismos , como Rhodospirilium rubrum (105) o ------

Mycoplasma laidlawii (133). También han sido descri tos otros métodos -

- 2 9 .

TAO LA IV

ESQUEMA DE LO S PROCESOS DE SOLUBILIZACION DE -ATPncos

DE C E LU LA S EUCARIOTICAS

Blomçmbr ana

Mitocondria

Mitocondria

Mitocondria

Mitocondria

Mitocondria

Mitocondria

Mi tocoiidria

Mitocondria

Mitocondria

GranuloscromalfnicoE

Cloroplastos

Cloroplastos

Cloroplastos

Mitocondria

Mitocondria

Mitocondria

Mitocondria

Fulinie Método do solubilizacion

Sonicacion

Sonicaciôn

Sonicacion

Sonicaciôn (pH 5,2)

Corazôn de buey

Corazôn do buey

Corazôn de buey

Corazôn de buey

Corazôn de buey Incubaciôn en presencia de losloh'pidos

Corazôn de buey Tratamiento con clorofor

Corazôn de cerdo Tratamiento con cloro-

Higado de rata

Higado de rata

Medula adrenal bovin a

Lechuga

Sonicaciôn

Sonicaciôn

Tratamiento con dicloro meiano en presencia de

EDTA

Tratamiento. con cloro lormo

czspinacas

Espinacas

- Levadura ( Saccharomyces cerevisiae)

Levadura {Saccharon.yces cerevisiae)

Levadura(Saccharomycescerevisiae)

Levadura ( Schizosaccharomyces pombe)

Tratamiento con EDTA

Tratamiento hi per lônico con sacarosa 0,3 M

Sonicaciôn

Tratamiento con cloro

Tralamiento con cloro

NQ de cadenas polipeplidicas Relerencia

Sonicaciôn

( 7 7 , 9 1 )

( 8 1 - 8 3 )

(0A-B6)

( 8 7 )

( 0 8 )

(89)

( 4 5 0 )

( 9 0 )

( 9 1 )

( 9 2 , 9 3 )

(94)

( 9 5 - 9 7 )

( 9 0 )

( 9 9 - 1 0 1 , 1 7 9 )

( 1 0 2 )

( 1 79)

( 1 0 3 )

- 3 0 -

1

- 3 1 -

de extraccion empleando soiventes organicos, como n-butanol (134) o

cloroformo (89,94), y agentes caotropicos (135), si bien en estos -

casos la compose ion en subunidades de los factores se suele presen

tar menos compleja y la capacidad de reasociacion a la membrana disrrW

nuida, Pero a pesar de los distintos procesos de solubilizacion existan

tes, que pudieran sugerir una interaccion P^-membrana de naturaleza -

fundamentalmente hi fro fobica y/o mediada por cationes divalentes (136),

las principales diferencias en los diverses esquemas de extraccion suelen

residir en los tratamientos previos de las membranas.

Recientemente, Cox y col. (137) han descrilo que la presen

cia del inhibidor de proteasas, p-aminobenzamidina (138) , impide la so

lubilizacion de la P^-ATPasa de membranas de Escherichia coli al tra

tarlas con tampones de baja fuerza ionica en presencia de EDTA. D e-

este modo, Cox y col. ( 137) sugieren que este tipo de tratamiento, em

pleado principalmente en cloroplastos y bacterias, expo ne el factor P -

a la accion de una proteasa o activa una proteasa responsable en cual

quier caso de la solubilizacion de la enzima P^-ATPasa. En este sen

tido se ha descrito la existencia de proteasas unidas a membrana e n ------

Bacillus subtilis (139) y Escherichia coli (140,192). A la luz de estos

resultados, cabe pensar que la presencia de actividad proteasica en mem

branas puede afectar significativamente la solubilizacion de enzimas unidas

a membrana, y presumîblemente alterar su estructra en subunidades (137)

De esta manera debe tenerse gran cuidado en la inter pre tacion de tos -

resultados obtenidos en los estudios de relacion estructura-funcion, espe

cialmente cuando no se utilicen inhibidores de proteasas. Por otra parte,

la presencia de p-aminobenzamidina no impide la extraccion del compo—

nente P por cloroformo (102, 137), obteniéndose en este caso una com

posicion en subunidades mas reducida (102, 137).

Los esquemas de purificacion subsiguientes de la mayoria de

las preparaciones de P -ATPasa inc lu yen precipitacion con sulfato amo-

iiico ( 1 4 1 ) o polietilenglicol (142) , crometografia de intercambio iônico —

- 3 2 -

(115), fîltraciôn en gel (112), electroforesis en gel de pollacrilamida

(143) o cromatograffa de afînidad (126).

Estas P^-ATPasas aisladas de organismes tan diverses -

sen solubles en tampones acuesos, poseen un compleje patron de sub

unidades (véase apartado 1.7.3.) y se observan al microscepie eleç

tronice corne partîculas esferulares de apreximadamenle 90-100 X de

diémetre (123,128), que representan las mismas es férules (144-146)

eriginalmente ebservadas sobre la superficie de la membrana interna

mitocendrial (147) y subsiguienlemente sobre la membrana de cloro-

piasto (148) y la membrana bacteriana (57,71).

La mayoria de estes componentes se muestran làbiies

al frîo (mitocondrîas, cloroplastos, levaduras, ciertas baclerias) , —

disoclandose en subunidades a 0-4QC (1 13,149,150), si bien etros

factores Fj no participan de esta propiedad (R. rubrum. fvl. phlei.

RSg, M. Ivsodeikticus. B. stearolhermophilus) ( 1 26. 130.131 . 1 51 . 152)

Como se podra observer en les apartados siguientes, les factores

poseen propiedades moleculares y funcionales mu y similares y se —

presentan como un sistema mucho mas asequible de abordar que el

compleje H -ATPasa (véase apartado 1.7.13.), en virtud de su re

lativamente facil solubilizacion per tratamientos suaves, sin necesidad

de la acclon de detergentes y sin producir desnaturalizacién de la -

protein a . No obstante, las posibilidades para estudiar el mécanisme

de la fosforilacion oxidatîva sobre este factor P se hayan llmitadas

per el hecho de que en su estado soluble pierde su capacîcbd de -

sintetizar AT"P y tan solo manifiesta su actividad ATPàsica hidroli-

zando el ATP en ADP y Pi. Sin embargo, esta enzima P^-ATPa

sa ademés de catalizar la fiidrolisis de ATP, también cataliza su —

sfntesis cuando se acopla correctamente a la cadena transportadora

de electrônes.

- 3 3 -

I .7.2. Peso molecular, forma y microheterogeneidad de la enzima pur i fie ada.

Todas las R^-ATPasas osludiadas exhiben pesos moleculares

que oscilan en el rango de 320.000-400.000 dalton. En la Tabla VI se -

muestran los pesos moleculares de algunos factores purificodos y las

técnicas empleadas en su determinaciôn. Como puede apreciarse se ban

descrito diferentes pesos moleculares para un mismo componente Pj ,

asf en el caso de CP^ se ban descrito valores desde 325.000 dalton

(95) hasta 300.000 dalton (153), por lo cyje las diferencias entre pe -

SOS moleculares de enzimas procedentes de diferentes organismes se

deben tomar con réservas. Varias pueden ser las causas de estas dis-

crepancias, ademas de la obvia de reflejar propiedades intrinsecas de

cada factor P : a) uso de diferentes técnicas para la determinaciôn de -

la talla molecular; b) disociacion de algunos factores P , producida in -

cluso a 25ÛC (149,153, 167), lo que daria lugar a una infraestimacion

del peso molecular; c) diferentes procesos de purilicacion utilizados que

podrian causar la disociacion de alguno de los componentes polipeptidicos

débilmente uni dos a la enzima.

Otra posible explicacion de las diferencias encontradas en la

determinaciôn de pesos moleculares de estas enzimas, podria residir en

los estudios llevados a cabo por Muller y col. (154), quienes indicaron

la presencia de aproximadamente un 8% de material no proleico en P -

mitocondrial de corazon de buey. Sin embargo, la naturaleza de este

material no proteico no ba sido fodavia esiablecida, desconociéndose si -

dicbo material es una parte intrinseca de la enzima o un contaminante -

(154) . En este contexte, estudios realizados por el grupo de Penefsky -

(74,83) pusieron de manifiesto que en la preparacion P mitocondrial de

corazon de buey no se detectaba la presencia de glucosamina, galaciosa

mina o acidos grasos. Posteriores analisis de azùcares sobre este mis

mo factor P y sus sutiunidades aisladas no revelaron la presencia de -

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es los (68). No obstante, ha sido descrita la presencia de hidratos-

de carbono por el grupo de Munoz en -ATPasa de M. Ivsodeikticus

(155-157) y cloroplastos (155,156), si bien estos resultados no ban po-

dido ser confirmados por otros au tores (68, 158, 159). En este contex

to, recientemente Nalin y col. no pudieron idenliHear hidratos de carbot-

no unidos covalentemente en los factores P de mitocondrias de corazon

de buey, de cloroplastos y de E. coli (160).

Los coeficientes de sedimentacion de los factores P^ se situan

en 13+. Is y los de difusion en 3,4 + 0,5 x 10 cm^xseg ' (62). El vo-

lumen especifico parcîal ba sido generalmonte estimado a partir de la —

composicidn de aminoécidos en 0,735+ 0,05 rrvlxg" (95,161), guardando

una esirecha relacion con los valores de 0,73 y 0,74 m edi do s experi —

mentalmenle (161,162). Los valores del coefîciente friccional relativo, -

f/fo , de 1,3^.0,2 (62) estimados a partir del peso molecular y del coe

ficiente de sedimentacion, indican que la molécula de P - ATPasa pre—

senta un cierto grado de asimetrîa.

Si bien, las preparaciones de P^-ATPasa descri tas ban sido

consideradas bomogéneas en veiocidad y equilibrio de sedimentacion, fil-

traciôn en gel, electroforesis en gel de pollacrilamida, etc ; se ha obser

vado, mediante electroforesis en gel de pollacrilamida, en condiciones a-

decuadas, la presencia de al menos très especies moleculares de migra

cion muy prôxima, no distinguibles por otros procedimientos, en P^-ATP

asa de mitocondrias, cloroplastos, Alcalioenes faecalis v M. ivsodeikticus .

cuya proporcion relative depende del procedimiento de purificacion, edad

de la preparacion, actividad especifica y accion de sustrato o inhibidores

(163,164). Esta microheterogeneidad electroforética puede ser concomitan

te con una microheterogeneidad funcional o bien puede pensarse en la e-

xistencia de estados funcionales diferentes para cada una de estas especies

electroforéticas. En cualquier caso, es importante définir en las prépara

clones de enzima la naturaleza de la microheterogeneidad para una serie

dada de experimentos ya que la falta de dicba definicion puede ser una -

- 3 7 -

causa de las discrepancias en los resultados obtenidos en diferentes la

boratories (163).

1 .7.3. Subestructura molecular. Subunidades. estequiometria v papel

de las mismas.

El tratamiento de los factores con agentes desnaturalizan

tes, como SDS, urea y clorhidrato de guanidina, pone de manifiesto la

gran similitud entre los patrones de subunidades de estas enzimas (véa

se Tabla VI) .En este aspecto, se advierte una presencia constante de

dos subunidades mayoritarias denominadas oZ y fi , cuyos pesos molecu

lares son asimismo relativamente homogéneos deniro de los diferentes -

factores P , oscîlando entre 56,9 + 4,9 kilodallon para oi y 53, 5 i 3,7

kilodalton para fi . Estos dos componentes representan un 8 0 - 9 0 % de la

masa de la enzima. Por lo que se refîere a las subunidades minorilarias,

referidas como g" , & y S , la siluacion se encuentra menos definida ya

que aunque todas las P^-ATPasas aisladas de mitocondrias y cloroplas

to s constan de estos 1res componentes, si bien en proporcion variable,

los factores BP^ presentan toda una gama de posibilidades. Se han ais

la do P^-ATPasas constituidas unicamente por ût y (î en B. megaterium

( l is ) , B. subtilis (119) y formas I—de Proteus (114), mientras que en

R . rubrum ( 1 05, 106 ) , E . coli ( 1 1 2, 1 13 ) y bacteria termofila P S 3 ------

(131,153) los factores P poseen ademas las très subunidades minori

larias mencionadas. En otros BP^ se aprecian estados intermedios en

cuanto al numéro de subunidades (véase Tabla VI). Estas discrepancias

pueden responder a propiedades intrinsecas de cada factor P , a la téc

nica de analisis utilizada y/o al proceso de extraccion y purificacion del

mismo (véase Resultados y Discusion). A pesar de la presencia varia

ble de estas subunidades minorilarias en las diferentes F^-ATPasas, de

las que representan un 10-20% de su masa, se !as asignan pesos mole

culares semejantes que suelen oscilar entre 3 0 . 0 0 0 - 3 5 . 0 0 0 dalton para

- 3 8 -

^ , 15.000-21.000 dalton para y 5.000-1 2.000 dalton para é .Es

ta ultima subunidad ha sido identificada en diverses laboratorios como el

inhibidor natural de la actividad ATPasica (158,166,171), inicialmente-

descrito por Pullman y Monroy (159), asignando a dicha subunidad una

funcion reguladora en el complejo de ATPasa, cuando este se encuentra

en su medio fisîologico, con el fin de prévenir un gasto inütil de ATP—

(174), ya que inhibe la actividad hidrolitica sobre el ATP sin afectar al

proceso de la fosforilacion (175). Sin embargo, otros investigadores —

han hecho recaer dicha funcion en una sexta subunidad (67, 176) de —

peso molecular 1 0 .0 0 0 - 1 2 . 0 0 0 daltons.

Las diferencias en las tailas moleculares descri tas para las

subunidades de los distintos factores (Tabla V I), pueden representor

diferencias reales entre los factores P y/o ser un reflejo de la aplica

cion de diferentes técnicas para su determinaciôn. En este aspecto ca

be resaltar que la mayoria de las determinaciones de pesos moleculares

se han llevado a cabo por electroforesis en gel de pollacrilamida en pre

sencîa de SDS, lo que conlleva sérias limitaciones (177) . Por ejem-

plo, la presencia de hidrato de carbono en la proteina reducirta la pro

porcion de delergente unido a la cadena polipeptfdica (177,178).

Una gran controversia existe en la actualidad en io que se -

refiere a la estequiometria en subunidades de este tipo de enzimas. LirrW

téndose fundamentalmente a las subunidades ot , ^ y ^ de la enzima, ya que

es dificil determiner el numéro exacto de copias de 6 y 6 présentes, de—

bido a su fée il disociacion del conjunto de la enzima (véase Discusion) ,

se puede decir que la controversia esta centrada en dos tipos de este-

quiometrfa : oc p“, K i ' o ^ o i ' o • Quiza el principal motivo

de esta falta de acuerdo radica en la carencia de pesos moleculares fia

bles para la enzima P^-ATPasa y sus subunidades, ya que el valor —

méximo esperado para una estequiometria del tipo X P* 2 aprg

ximadamente de 34000 0 dalton , mientras que para la opcion 3 3

séria de unos 390.000 dalton o indu so algo superior si se tuviesen va

rillS copias de las subunidades minoritarias en la molécula. En la Tabla

—3 9 —

VII, se encuenlran recopilados varios trabajos que apoyan una u otra -

estequiometria segùn el método de estudio elegido. El fracaso al intentar

establecer un tipo de estequiometria no ya en los factores de diferen

tes fuenles, sino en la misma P^-ATPasa de un mismo origen, refleja

en parte las considerables dificultades técnicas originadas por la lenden-

cia de estas moléculas a disociarse y degradarse.

Solamente, en el caso del factor CP^ parece existir una gran

concordancia de crlterios, asignandosele una composiclon en subunidades

de (X p 2 ^ & 6 2 ( I 86 ) , aunque observacîones recienfes (189, 190) in

dican que la subunidad y posiblemente la subunidad £ pueden disociarse

facilmente de la' enzima durante el aislamiento de CP^ de la membrana,

lo que parece ser una caracteristica de todos los factores P . Si los pe

SOS moleculares de las subunidades y del factor CP^ calculados son co-

r rectos, esta estequiometria del tipo f?> se cor r es ponder ia con bas

tante aproximacion con el peso molecular de 325.000 dalton , determina-

do por ultracentrifugacion (95) y confirmado posteriormente por la apli-

cacion de rayos X por dispersion a bajo angulo (191) . Sin embargo, es

posible que las preparaciones utilizadas en estos experimentos no corres-

pondieran a una enzima integra, ya que recientemente el grupo de Kagawa

(153,193) ha encontrado un valor de ta lia molecular de 380.000 dalton

para una preparacion de CP^ en tampon conteniendo metanol (161) con

el fin de provenir su disociacion. Este mismo grupo de investigadores

(153) baséndose en la posible disociaciôn de los factores P mitocondrial,

de cloroplastos y de bacterias mesofiias, ha reinvestigado las lallas mole

culares de los mismos utilizando tampones estabilizantes que previenen la

disociacion de estas enzimas mesofilicas (161), encontrando en todos —

elles un peso molecular proximo a 380.000-390.000 dalton (153), lo cjLie

apoyaria una estequiometria universal del tipo X A X X é • Pro3 ' 3 ‘■'X X X ~

balolemente los resultados mas fiables sean los obtenidos con el factor P

de la bacteria termofila PS3 (denominado TP^ ) . Este factor TP^ pre—

senta notables peculiarîdades, no solamente es astable al calor ( 131 ) , -

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sino que también lo es, en gran medida, trente a todos los agentes di-

sociantes ensayados (57). Esta energta extra de estabilizacion es pro-

porcionada por la existencia de numerosos puentes salînos inira e inter

catenaries (194,195) sin perturbaciôn de la estructura terciaria o cua-

lernarîa esencial para la actividad enzimatica. t_a estequiometria de este

factor "TP| ha sido analizada extensivamente por Kagawa y su grupo -

(57, 181), quienes concluyen que la composicion en subunidades de es

te factor iTFj es del tipo ^ 3 3 » baséndose en très hechos experi —

mentales; a) anélisis de la razon de subunidades en TF^ marcado ra-

diactivamente (57,131), b) contenido de cisteina (3SH/TF^ y solamente

1 SH/subunidad oL ) (181), c) determinaciôn de pesos moleculares de

las distintas subunidades por cuatro procedimientos diferentes (equilibrio

de sedimentacion a baja y alta veiocidad, anélisis de aminoécidos y filtra

cion en gel en presencia de cloruro de guanidina) y del factor TF^ por

equilibrio de sedimentacion (153).

Un punto de suma importacia a la hora de resolver la discre

panda existente entre los distintos tipos de estequiometria para los facto

res , consiste en reexaminar las propiedades de estos factores por -

un procedimiento en el cual la disociacion de sus subunidades no tenga -

lugar. Mientras tanto y hasta que no se logre un acuerdo en cuanto a la

estequiometria, no puede excluirse la posibilidad de que diferentes P -

ATPasas posean diferentes estequiometrias en subunidades.

La funcionalidad de las subunidades de estas enzimas P - -

ATPasas ha sido estudiada por experimentos con anticuerpos obtenidos

trente a cada una de las subunidades (196,197), por digestion proteoliti-

ca controlada de la enzima (97,172,198), por reconstitue ion de enzimas

parcialmente dîsociadas (131, 142) y por reconslituciôn de la molécula

de Pj-ATPasa a partir de sus subunidades aisladas (176,199). Estos-

estudios, si bien no han permîtido todavia obtener un esquema generali

ze do de la funcionalidad de las dîversas subunidades, han pueslo de ma

nilles lo que la subunidad fi parece ser esencial para que la hidrofTsis de

- 4 2 -

ATP se lleve a efecto (176,200), Ilegandose a oblener enzimas funcio-

n aim ente activas que contienen tan solo las dos subunidades de ma/or -

peso molecular : oE y (134,172, 198, 200, 201 ) . No obstante, en otros -

casos, dicho complejo no résulta poseer actividad ATPasica (176). Tam

bien existe bastante informacion que hace refersTcia a la necesidad de la

presencia de la subunidad <S para la union de -ATPasa a la membra

na ( 141 , 189, 202-205) . I—a subunidad 6 ha sido identificada por diversos

investigadores como el inhibidor natural de la P^-ATPasa (158, 166,

171), aunque como se menciono anteriormente existe cierta controversia

en este punto (67,176,206), También se ha asignado a la subunidad £

una participacion esencial en la unién de la enzima a membrana en E . -

coli (2 0 7 ) . Con respecto a la subunidad oE se la ha reconocido un po

sible papel en la luncion catalftica (115, 134, 170, 172, 200, 201 ) ,asi

como una participacion en la union de la P -ATPasa a la membrana en

el caso de Streptococcus faecalis (205). En cuanto a la subunidad ^ ,

su papel puede ser el mas discutido, habiendosele asignado distintas par

ticipaciones en las propiedades estructurales o funcionales de la enzima

(158,199,201,208). Recientemente, Putai y Kanazawa han realizado una

revision en la que se tratan con minuciosidad todos los aspectos relati—

VOS a la funcionalidad de las distintas subunidades de las ATPasas trans

locadoras de pro tones (73).

1.7.4. Composicion oufmica

I—as composiciones de aminoécidos de los distintos factores

P es muy semejente . Muestran una hidrofobicidad moderada, au sen —

cia aparenfe de Iriptofc no y un contenido relativamente elevado de amino

écidos dicarboxflicos (Tabla VUI).

Tanto la P - ATPasa mitocondrial como de cloroplasto con—

tienen un total de 12 restos de cisieina por molécula- 8 grupos S H , de

los que unicamente dos pueden titularse en la enzima native, y 4 grupos

més de ciste ina formando dos puentes disulfuro (209,210). Las P - ATP

—A3—

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asas baclerianas parecen poseer un contenido en grupos SH mucho me

nor (181,211). Otra caracteristica de estos factores , radica en ei-

hecho de que sus grupos N terminales se encuentran aparentemente bio

queados (95).

“También se han determinado las composiciones de aminoéci

dos para las diferentes subunidades aisladas de mitocondrias, cloroplas

tos y bacterias (52), observéndose una cierta analogia: , (& y , pa

recen fundamentalmente acidas, mientras que 6 y 5 parecen ser bésicas.

Sin embargo, existen ciertas discrepancias sobre la composicion quimi-

ca de algunas subunidades. Particularmente notable es el contraste de -

resultados descritos para la subunidad ^ de F mitocondrial de corazon

de buey; mientras que Knowles y Penefsky (166) deteclan 18 residues

de prolina/mol, Brooks y Senior (212) no encuentran cantidades apre-

ciables.

1.7.5. I—atencia.

El factor F^ soluble o unido a membrana muestra una actiyi

dad ATPésica latente que puede ser estimulada por exposicion al calor

( 2 1 3 ), a tripsina (213), ditiotreitol (214) o urea. Parece muy probable

que esta activacion sea una consecuencia de ia disociacion de un peptido

de bajo peso molecular que especificamente inhibe la actividad hidrolitica

de F^ sobre el ATP sin afectar al proceso de la fosforilacion oxidativa

cuando el factor F^ se encuentra unido a la membrana. Varios labors—

torios han aislado estos peptidos inhibidores en mitocondrias de corazôn

de buey (77,159,206), higado de rata (169,215) y levadura (216-218)-

asi como en cloroplastos (171): y E . coli (219.220) . Estos inhibidores -

naturales de F^- ATPasa presentan propiedades comunes, como estabiji

dad al calor y gran sensibilidad a tripsina (169,171,220), pero también

se observan numerosas diferencias (distinta composicion de aminoécidos,

talla molecular e interaccîon con la enzima) . Por otra parte, dichos inh[

—A5 —

bîdores mani fies tan una clara especîficidad hacia sus respeclîvos factores

F (171,220), mientras que el componente TN-1 de la Iroponina, inhi-

bidor de la actividad ATPâsica de la actomiosina de musculo, inhibe las

F -ATPasas de mitocondria y cloroplasto (221).

La inhibicion de la actividad hidrolitica por estes peptidos inN

bidores es del tipo "no competitivo " respecto al ATP. De hecho, la a^

ciôn de ATP facilita la înieraccion del inhibidor con F^ , mientras que la

energizaciôn de la membrana, inducida por la respiracion disminuye la a-

flnîdad del inhibidor por F^ (77, 175,222,223). Por otra parte y como

ya ha sido mencîonado con anterioridad, se han descrito resultados con_

tradictorîos sobre si este inhibidor se corresponde con una de las cinco

subunidades de F^ o représenta una sexta subunidad unida debilmente a

la enzima (83,165,156). Hasta el momento, tan s6lo se ha identificado -

este inhibidor con la subunidad £ en los factores F de cloroplastos (171)

y de E. coli ( 220) .

Las diferencias observadas en la latencia de la actividad ATP

ésica de los factores F^ procedentes de distintos ortgenes son probable-

mente una consecuencia de las diferencias existantes en la facilidad con la

que el inhibidor puede ser disociado del factor de acoplamiento.

1.7.6. Propiedades cataifticas del factor F^ .

1 .7.6.1. Sustrato. requerimienlos ionicos y parâmetros cinéticos

Como se ha mencionado anteriormente, las preparaciones de

F -ATPasa purificadas pierden la capacidad de sintetizar A T P , manifes

tando solamente una actividad ATPésica de hidrolisis de ATP. Esta act[

vidad hidrolitica de la enzima unida a membrana o soluble présenta un re

querimiento absolute de cationes para su actividad, especiaimente calcio y

magnesio, observéndose cierto antagonismo entre cîertos iones metélicos -

divalentes en determinados factores F . Asi por ejemplo, se ha descrito2 + 2 +

que la presencia de iones Mg , pero no de Ca , estimula la actividad

—A 6—

hidrolitica en la F -ATPasa de S. faecalis (127) , mientras que la ac_

cion inversa tiene lugar en la F^-ATPasa de B. subtilis (119). Una -

primera cuestion sobre la que existe cierta discrepancia radica en cong

cer cuâl es el verdadero sustrato de la enzima. Selwyn ( 224) concluyo

que Mg'ATP era el sustrato de la F^-ATPasa mitocondrial, al estudiar

la dependencia de la veiocidad de reaccion enzimética con las concentra

clones de Mg^ y ATP libres. Sin embargo, Hilborn y Hammes (225)

opinan que ATP y Mg'ATP se unen en el sitio activo de la enzima con

aproximadamente la misma afinidad. A esta falta de acuerdo sobre cuél

es el sustrato de la enzima, hay que ahadîr otros factores adicîonafes -

que con fier en una gran complejidad a los estudios realizados hasta el mg

men to sobre la cinética de hidrolisis y que pueden describirse brevemen

te del siguiente modo: a) como se verâ més adelante, la enzima posee

sitios de union de ATP y cation divalente que no parecen estar implica_

dos directamente en la hidrolisis de A TP , desconociéndose cuél es su -

influencia sobre la veiocidad de hidrolisis; b) el producto de hidrolisis,-

ADP, es un inhibidor potente de la reaccion; c) la enzima probablemen

le posee més de un sitio activo de hidrolisis, pudiendo ser distintas las

especi fie idades de estos sitios.

Todas estas limitaciones han tenido como consecuencia que -

los estudios cinéticos se hayan realizado solo parcialmente, empleéndose

en general concentraciones variables de ATP y cation, conservando cons

tante la relacion molar entre éstos. Asi pues, los valores de Km para -

ATP descritos en la bibliografia presentan discrepancias apreciables, in

cluse para F^-ATPasas de la misma procedencia, que oscilan entre 0,25

mM y 2,5 mM dependiendo del origen y del método empleado para su de

terminacién (111,120, 200, 222, 226, 227 ) .

Aunque la mayoria de los investigadores han obtenido cinélicas

tipicamente michaelianas para la hidrolisis de ATP calalizada tanto por la

enzima purificada como la unida a membrana, tampoco en este punto exis

— A 7 —

fe un acuerdo complete. Ebel (220) encontre para de htgado de rata,

que las repr esentaciones dob le reciprocas de los dates de veiocidad ini

cial, a concentraciones variables de ATP (manteniendo constante la re

lacion ATP: Mg^ ), ,eran curvadas en ausencia de aniones activadores

(véase apartado I.7 .7 .3 .) , con coeficientes de Hill de 0,5, lo que po

dria sugerir la existencia de coopérât!vidad negativa. En presencia de -

aniones activadores no se observé ninguna curvalura en las gréficas do

ble reciprocas. Por su parte Rossi y col (289) encontraron para la —

R^ - ATPasa unida a membrana de mitocondria de corazon de buey gré

ficas trifasicas al representar la veiocidad inicial Irente a la concentra —

cion de ATP , que se correspondfan con valores de Km (ATP) de 12,5;

75 y 400yitxM. Estos resultados dan de nuevo idea de la complejidad ex

perimental del sistema.

Por otra parte, las actividades especificas descritas para di

verses preparaciones de R^-ATPasa varian en gran medida, dependien

do del método de purificacion y organisme utilizados, asi como de la la

tencia y proceso de activacion de la enzima. De este modo, es dificil —

comparar datos cinéticos obtenidos con preparaciones de que presen

tan actividades especificas muy dispares con la complicacion adicional de

la existencia de diferentes formas de la enzima en una misma prepara--

cion (véase apartado 1 ,7 .2 .).

1 .7.6,2. Actividad en ausencia de iones metélicos .

Preparaciones de F^- ATPasa mitocondrial ( 232-234) y baç

teriana (S. faecalis. M. lysodaikticus y A. faecalis) (152,235,236) ca_

lalizan bajas velocidades de hidrolisis de ATP sin ahadir cationes diva—

lentes. I_as bajas actividades hidroliticas han sido detectadas, en algunos

casos, cuando se intentaba medir la fijacion de ATP a la enzima (23 2,

233,235). Estos datos han pasado inadvertidos para numerosos investi —

gadores, sin embargo son de gran interés para establecer si la hidroli

sis tiene lugar en un sitio separado del centre activado normalmente por

- 4 0 -

la adicîon de cationes.

1 .7.6.3. Especificidad para nucleosidos trifosfato.

Los factores hidrolîzan distintos nucleosidos trifosfato en -

el orden ATP ^ ITP GTP ^ UTP c CTP (55,62) , aunque se han -

descrito algunas diferencias respecto al orden de magnitud de la actividad

segun el origen de cada factor y de su estado, soluble o asociado a

membranas (52,229). De los datos actualmente disponibles se pueden cg

nocer algunos aspectos de la estructura del nucleotide que pueden afectar

a las propiedades cataifticas de la enzima. En principio, el grupo ami no

de la posiciôn 6 en el anillo de purina no parece ser un requisite impres

cindible, ya que las velocidades de hidrolisis de ITP y GTP son compa

rables a aquella de ATP (230). La insercion de un grupo eteno en esta

parte de la molécula como en 6-ATP ( 1-N^-etenoadenosfn-5*-trifosfato)

no interfiere serîamente la actividad hidrolitica de la enzima (60) . Sin em

bargo, la insercion de un étomo de oxfgeno sobre el N-1 del anillo de pu

rina disminuye la veiocidad de hidrolisis (68). Ciertas alteraciones en el

anillo de rîbosa son toleradas por la enzima, hidrolizando deoxi-ATP (68)

y arilazido- jî-alanil ATP (231). No obstante, anélogos de ATP con ca

denas hidrocarbonadas sustituyendo al anillo de ribosa, no pueden ser hi-

drolizados por la enzima, inhibiéndose en gran medida la hidrolisis d e ----

ATP cuando la longitud de la cadena es de 3 6 4 grupos metileno (55).

Este hecho podrfa explicarse si se supone que el nucleotido objeto de hi

drolisis interacciona con el factor P en una conformacion tensa. Asi el

cambio de un anillo de ribosa, mas bien rigide, por una cadena hidrocar

bonada de 3 6 4 grupos metileno permite un elevado grado de flexibilîdad

a la molécula impidiendo su hidrolisis (55) .

1 .7.6.4. Grupos funcionales del sitio activo.

Poco se conoce de los restos de aminoécidos esenciales para

la luncion catalitica de las F^-ATPasas, habiéndose llevado a cabo la -

- 4 9 -

mayoria de estos estudios mediante modificacion quimica de ciertos gru

pos. El termine de aninoâcido "esencial" présenta, en este tipo de estu

dios, una definicion meramente operacional, en el sentido de que su mg

di ficacion es concomitante con una pérdida de actividad. Asi, es dificil -

distinguir si el residue modificado forma parte del sitio activo de la en:^

ma, aun cuando se observe una cierta proteccion por parte de los sus-

tratos, o si al modificarse quimicamente impide un cambio conformacional

necesario para la realizacion del proceso catalitico o provoca una distirg

ta disposicion de alguno de los grupos hjncionalmente actives.

Senior ha demostrado la ausencia de grupos suIfhidrilos en el

sitio de union del sustrato para la -ATPasa mitocondrial (209), mien

tras que Eerguson y col. (237) han descrito que la modi ficacion de un

unico resto de tirosina con 7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3 diazol (NBD

-Cl) produc ia una inactivacion total de la molécula, lo que sugeria la pre

sencia de un unico sitio active o la existencia de interacciones cooperati_

vas entre subunidades como una parte integral del mécanisme catalitico,

Experimentos con los réactivés especificos 2,3-bulanodiona y

fenilglîoxal indicaron la posible presencia de restos de arginina en el sitio

activo de la enzima mitocondrial (238-241). L_a actividad hidrolitica tam

bién era inhibida irreversiblemente por la accion del piridoxal fosfato —

(290-293). Estes resultados parecen generalizar la presencia de resi

duos de arginina y/o Usina en los sitios de fijacion de ligando a la enzi

ma cuando se Irata de un ligando anionico,

Por otra parte, la inhibicion de la E -ATPasa por 1-etoxicar

bonil-2-etoxi-1 , 2 dihidroquinoleina (EEDQ) (242) y carbodiimidas (243)

parece deberse a una modi licacion quimica de grupos car boxidos en la -

molécula.

Estudios recientes del efecto de ATP,ADP, y Pi sobre el —

marcaje e inactivacion por distintos reactivos especificos de restos de -

aminoécidos (244,245) han indicado que restos de Tyr, A rg , Lys y —

- 5 0 -

Glu o Asp se encuentran localizados en el sitio catlftico de la enzima, -

habiéndose propuesto tentativamente un mecanismo para la hidrolisis y -

sîntesis cataifticas de ATP en el que se describe como partîciparîan di—

chos residues (245).

1.7.7. Inhibidores v activadores de la actividad hidrolitica de los factores

Fj .

1 . 7.7.1 . Nucleotidos de adenina v analogos .

El nucleosido di fosfato ADP ejerce una potente inhibicion por

producto en la actividad ATPésica de los factores , habiéndose des

crito una gran variedad de valores de Ki (62,68) para las mismas u —

homologas preparaciones de F^-ATPasa, lo que podria reflejar diferen

tes estados de la enzima o diferencias en las condiciones expérimentales

de ensayo. Por otra parte, el incremento de los valores de Ki (ADP),

por ciertos aniones (246), podria explicar alguna de las aparentes dis—

crepancias.

El analogo de ATP, AMP-PNP, inhibe competitivamente la -

hidrolisis de ATP en la enzima soluble (233,247) y unida a membrana

(233). De manera similar al inhibidor natural de ATPasa (véase apar

tado 1 .7 .5 .), el AfvtP-PNP, cuyas propiedades se recopilan junto con

las de otros anélogos de ATP en una revision de Vount (248), inhibe -

la actividad ATPésica pero no afecta a la fosforilacion, es decir, a la -

sintesis de ATP (233,249). Este compotamiento podria ser el reflejo de

la existencia de dos sitios cataliticos separados en F^-ATPasa, para la

sintesis e hidrolisis de ATP. El hecho de que el AMP-PNP no pueda -

desplazar todo el J ADP unido a F^-ATPasa, induso a altes con —

c en trac iones del anélogo (233,249), pudiera sugerir que éste es incapaz

de interaccionar con el sitio de unién del ADP, particularmente durante

la fosforilacion oxidativa.

- 5 1 -

Otro inhibidor, quercelina ( 3 , 3 ' , 4 ' , 5 , 7-pGntahidroxi flavona ) ,

exhibe una accion similar al AMP-PNP, inhibiendo la actividad hidroliti

ca de la P^-ATPasa soluble y unida a membrana, sin afectar a la fos

forilacion oxidativa en particulas submitocondriales (250).

1.7.7.2. Inhibidores de la fosforilacion oxidativa .

La fosforilacion oxidativa es inhibida por DCCD, aurovertina

B, cloruro de tri-n-butil estaho, venturicidina y azida (62). Estas sus-

tancias también inhiben a la P^-ATPasa asociada a membrana (62). En

mitocondrias ademés lo son por oligomicina y putamicina (52). De estos

inhibidores tan solo el antibiotico aurovertina B y azida (60,251 ) inhiben

de forma no competitiva la actividad ATPasica del factor P soluble, si

bien esta inhibicion no es total (62). Estudios de fijacion han pueslo de

manifiesto que aurovertina se une a la subunidad ^ del factor P de cora

z6n de buey (182), de levadura (183,252) y de E.coli (253). Espega-

cina, un alcaloïde dihidroindolico, parece actuar de forma similar a au rg

vertina ( 254 ) .

1 .7.7.3. Aniones.

Una apreciable activacion de la actividad ATPésica tanto en la

P - ATPasa mitocondrial soluble como unida a membranas se observa en

presencia de ciertos oxianiones (bicarbonato, bisulfite, selenito, sulfite, -

borato, maleato, tereftalato, dicromato, cromato, pirofosfato) (75,90,246,

255,256). La estimulacion de la enzima adquiere gran interés a causa de

su posible significado fisiologico, pudiendo constituir un control metabolico -

en la célula. Se ha especulado con la posibilidad de que esta activacion -

fuese debida a una participacion de los aniones (bases de Lewis) como -

catalizadores de tipo bésico (62) o a una induccion de cambios conforma

cionales (68) . Moyle y Mitchell (256) han sugerido un cambio conforma-

cional més especifico inducido por aniones que impiicarian transiciones en

tre formas activas e inactivas de P - ATPasa. Por otra pare, se ha —

- 5 2 -

observado que los aniones activadores no muestran ningûn efecto sobre

la Km (ATP) de la P^ -ATPasa asociada a la membrana, pero dismi-

nuyen la Km aparente en la forma soluble de la enzima (62).

El agente desocoplante 2,4-dinitrofenol activa también la P -

ATPasa mitocondrial soluble (84,99,255,257), habiéndose pueslo de ma

nifîesto la in ter accion directa del agente desacoplante J 2,4-dinilro-

fenol, con el factor P mitocondrial (256).

1 ,7.8. Pîï.acîon de llgandos.

1.7.8.1. Nucleotidos de adenina .

Ya que los factores P se requieren en la formacion catalfti-

ca de A TP , deben de contener uno o més sitios de union para el ADP.

Por otra parte, al hidrolizar el ATP poseeran al menos un sitio de union

para el ATP. Se han detectado multiples sitios de unién para los nue leg

lidos de adenina, pero la relacion de estos sitios con la sfntesis e hidro

lisis de ATP esté por establecer. Aunque se ha aceptado generalmente-

que un mismo sitio en la enzima fuese el responsable de la sfntesis e hi

drolisis de A TP , se ha mostrado en los ullimos ahos cierta evidencia que

sugiere la existencia de dos centres distintos para realîzar ambas funcio-

nes (55,64,258).

Ademés de los sitios fosforilante e hidroiftico donde se requerî

rfan recambios répidos de nucleotidos, los factores P aislados poseen -

sitios donde los nucleotidos interaccionan con alta afinidad,de forma que -

en todos los factores P en los que se ha estudiado, se han encontrado

nucleotidos fuertemente fijados. Estos se definen operacîonalmente como -

aquellos nucleotidos que permanecen unidos a la enzima cuando se han e-

liminado de la solucion todos los nucleotidos libres detectados (259). Asf,

Harris y col. ( 260) encontraron que el factor P aislado de corazon de —

buey contenfa cinco moles de nucleotido de adenina fuertemente unidos por

mol de enzima (3 moles de ATP y 2 moles de ADP) , los cuales se di-

sociaban durante inactivacion en frfo de la enzima (260,261). Posteriores

- 5 3 -

e sHUflios llevaron a Harris y col. (262) a revisar el numéro de nucleo-

lidos de adenina unidos- 2, 2 moles A T P / mol P y 1,3 moles ADP/mol

P . Sin embargo Garret y Penefsky ( 263) pusieron de manifiesto la e-

xistencia de al menos cinco sitios de alfa afinidad al lograr unir casi 5 -

moles del analogo de ATP,AM P-PNP, por mol de enzima, a la que —

previamente se habia desprovisto de sus nucleotidos fijados por cromatg

grafia de la protetna en columnas de %phadex equilibradas con glicerol

al 50%. Ya que la enzima utilizada en estos experimentos contenia 2 mg

les ADP y 1 mol ATP/mol P , antes de someterla al tratamiento con -

glicerol, Garret y Penerlsky coneluyeron que debian cxislir en la molé

cula de proteina cinco sitios de fijacion para los nucleotidos, tres de alla

afinidad y dos réversibles (263) .

También se ha pu es to de manifiesto la existencia de dos sitios

de fijacion de nucleotidos en preparaciones de P de htgado de rata (249)

asi como de nucleotidos fijados aunque a niveles menores que su homo-

loga de corazon de buey { < 2 mol/mol P ) (62).

De igual forma que en los factores P mitocondriales, los fac

tores CP^ y BP^ también contienen nucleotidos fuertemente unidos, os-

ci lando los niveles de ATP entre 0-2,0 iTiol/mol enzima y los de ADP

entre 0,7 y 2,3 mol/mol enzima (64,69,264) . I_as diferencias en el nu

méro de nucleotidos fijados a la enzima pueden estar relacionadas con -

diferencias basicas entre las diferentes P^-ATPasas y/o con diferencias

en los métodos de separacion y purificacion de las proteinas.

1 .7.8.2. Posta to .

Se ha prestado poca alenciôn a la fijacion de fosfato a l a ------

P - ATPasa, a pesar de que al participar esta enzima activamente en -

la sintesis de ATP durante la fosforilacion oxidativa, pareceria razona —

ble esperar que la enzima exhibiera sitios de union para el Pi. Sin erg

bargo este tipo de estudios se ha limitado al factor P mitocondrial de cg

- 5 4 -

raz6n de buey (265,266), encontréndose un sitio de alta afinidad para -

el Pi (K^ = 80 /A-f ) , aunque en presencia de Mn^ , SO^ y auroverti

na se observaba la presencia de un secundo sitio de fijacion sobre la mg

lécula. El hecho de que la union de Pi a la enzima sea modulado por -

activadores e inhibidores especificos de la actividad ATPésica y la fosfg

rilacion oxidativa apoya la idea de que el sitio de alta afinidad descrito se

corresponde con el sitio de union del Pi en el proceso de la fosforilacion

oxidativa (266).

1 .7.8.3. Aurovertina.

Aurovertina es un potente inhibidor de la fosforilacion oxidativa

(267) que interacciona directamente con el factor P formando un compte

Jo fluorescente (251). El factor P mitocondrial de corazon de buey ex

hibe dos sitios de union para el antibiotico aurovertina (154,268), que pa

recen estar localizados sobre la subunidad ( 182) .

1 .7.8.4. Aniones.

Como se menciono en el apartado 1.7.7.3. una gran variedad

de aniones puede interaccionar con las P^-ATPasas. Sin embargo, es-

probable que la afinidad de la proteina por los aniones sea baja como pa

rece ocurrir para el su I fa to (68).

La union de ciertos agentes desacoplantes al factor P puede

considerarse como un caso especial de union de aniones. Se ha descrito

la inter accion de 1-2 moléculas de 2,4-dini trofenol por mol de P ^-A TP

asa mitocondrial de corazôn de buey (257). Un anélogo de 2,4-dinitrofe-

nol, 2-azido-4-nitrofenol, se une a la subunidad aC del factor P (269).

- 5 5 -

1 .7 .9 . Sitios cataliticos

El conocimienlo del numéro de sitios cataliticos présentés en -

la -ATPasa es de capital importancia para cualquier consideracion de

un posible mecanismo de accion de la enzima. Como se menciono en el

apartado 1 .7 .6 .4 ., la observacion de que el compuesto NBD-CI reaccig

nara con un unico grupo de tirosina de la subunidad ji produciendo una -

inhibicion total de la actividad ATPésica (237,270), sugeria la posible —

presencia de un unico sitio catalitico en la enzima soluble (237). Sin em

bargo, la presencia de més de una subunidad fi en la molécula de enzi

ma y la aparente ausencia de heterogeneidad en las preparaciones de di

cha subunidad (83,168,212), parece sugerir una asimetria en las subu—

n idades fi provocada probablemen te por cambios conformacionales produ

cidos por la interaccion con nucleotidos de adenina (270) . Asi, la pérdL

da total de actividad podia explicarse en términos de interacciones esen—

ciales entre subunidades, de modo que la modificacion de un aminoacido

esencial en una subunidad impide la manifestacion de actividad enzimética

en cualquier otra subunidad (270) . En este contexio, es conveniente des

tacar el hecho de que la fijacion de aurovertina a P^-ATPasa miiocon--

drial no es estequiométrica con el numéro de subunidades, observéndose2 +

dos sitios en presencia de ATP y uno en presencia de ADP o Mg ------

( 268) , lo que puede indicar la importancia de las interacciones entre las

subunidades y la existencia de asimetria en la enzima inducida por la in

teraccion con ligandos .

Como ya se ha descrito en el apartado 1.7,8. 1., existen cin

co sitios de fijacion de nucleotidos de adenina sobre P mitocondrial de -

corazon de buey (263) , tres de los cuales son de alta afinidad que se in

tercambian con nucleotidos exogenos muy lentamente, incluso durante la h[

drolisis de ATP, por lo que no parecen participar directamente en el pa

so catalitico (264).

Medidas de inhibicion de C P por NBD-CI y de fijacion de nu

- 5 6 -

deotidos de adenina condujeron a Cantley y Hammes (271) a concluir-

que, de los tres sitios de lijacion encontrados para los nucleotidos sola

mente uno de ellos se correspondia con el sitio catalitico.

Estudios de fijacion de nucleotidos en el factor de Alcallqe-

nes faecalis . llevaron a Adofsen y Moudrianakis a sugerir la presencia

de dos tipos de sitios de fijacion tales que la interaccion de ATP en uno

de ellos provocaria un cambio conformacional en la enzima que facilitaria

la expulsion de los productos de fildrolisis ADP y Pi en un segundo sitio

(272). Estos autores postulan sugestivamente un mecanismo "flip-flop" en

el que la enzima oscilaria entre dos estados conformacionales alternatlvos

pero cataliticamente équivalentes (272).

En este contexte, Kozlov y Skulacfiev (55) postulan la presen

cia de dos sitios de fijacion para nucleotidos de adenina participes en e l-

proceso catalitico, pero solamente uno de ellos séria propiamente catali—

tico.

En los ûltimos seis ahos se ha mostrado cierta evidencia ex—

perimental apoyando la existencia de interacciones cooperativas en esta -

enzima (00,255,273—275). Sin embargo, como en tantas otras face tas de

este sistema, el numéro de sitios cataliticos permanece como punto de —

controversia entre distintos laboratorios.

1.7.10. Cambios conformacionales.

Se han detectado cambios conformacionales en la enzima unida

a membrana en respuesta a la iniciacion de reaccîones de trans fer encia -

electronica o a gradientes de pH, y en la enzima soluble como resultado

de la adiciôn de una gran variedad de ligandos (ATP, ADP, Pi, Mg^ , —

oxianiones, aurovertina, quercetina) y por cambios de pH ( 234, 268 , 276-

281). El conocimiento de la naturaleza de estos cambios conformaciona—

les es de gran importancia para entender el mecanismo de accion de es

tos factores de acoplamiento en la fosforilacion oxidativa. Asi y con rela-

• 5 7 -

cion a la ••hipotesis conformacional” formulada por Boyer (véase a par la

do 1.2.) , seria de capital interes el determinar la existencia de cambios

conformacionales dependientes de un aporte energélico en las P^-ATBasas

asociadas a membrana, que se relacionasen con cambios en la afinidad

de las enzimas por los nucleotidos de adenina y Pi. Una recopilacion ac

lualizada y crflica de trabajos relatives a este tema puede encontrarse —

en una revision reciente de Penefsky (68).

1.7.11. Diferencias entre los factores P soluble v unido a membrana.

Una caracterfstica de los factores P radica en la manifesta-

cion del fenomeno de alotopfa, mostrandose notables diferencias entre la

enzima soluble y asociada a membrana.

Asi, la baja actividad ATPasica de las membranas contrasta

con la correspond!ente a la enzima soluble, lo que condujo a Pullman y

Monroy a la identificacion de un peptido de pequeno peso molecular----------

( 15.000 dalton ) que af interaccionar con la forma soluble o unida a

membrana de la enzima inhibfa su actividad ATPAsica (159). Estudios —

posteriores mostraron que para obtener un mismo grado de inhibicion, se

requerfa una mucho menor cantidad de protema inhibidora para la enzima

asociada a membrana que para la enzima soluble (77) , lo que sugiere

ferencias de afinidad en la interaccion del inhibidor con las dos formas de

^1*

Otra discrepancia entre la P^-ATPasa soluble y unida a mem

brana, observada tempranamente, consislfa en la inhibicion por oligomici-

na y por DCCfZ) de la actividad enzimatica del factor P cuando se encuen

tra asociado a la membrana, lo que llevo al reconocimiento de una protei

na presente en la membrana en asociacion con la P^-ATPasa , con la -

que ambos compuestos interaccionaban (187,282,283).

Las propiedades cataliticas de las dos formas de enzima tam —

bien muestran diferencias, como se deduce de los valores de Km, para

- 5 8 -

A TP , mâs bajos en la F^-ATPasa unida a membranas ( \OOjuiM para

de hîgado de rata) ( 246) que en el caso de la forma soluble ( 1

mM para P de higado de rata ) (62). Estas observacîones parecen —

sugerir que la interaccion de P con la membrana aumenta su afinidad -

por ATP, lo que pudierà estar relacionado con diferenles estados con

formacionales de las dos formas de proteina (62).En este contexte, e l-

anâlogo de ATP, AMP-PNP, inhibidor competitive de las dos formas —

de enzima, muesira una Kî de 0,33 /xM para P soluble y de 0,16 ytM

para P unida a membrana (233) , lo que concuerda con lo anteriormen

te dîcho.

En un estudio comparativo de las dos formas de enzima,Ham

mes y Hilborn (226) sugirieron que la presencia de un grupo ionizable-

en la enzima soluble,con pK de aproximadamente 7, era esencial para la

actividad, sin embargo el electo de este grupo se encontraba aparente—

mente enmascarado en la enzima asociada a membrana, posiblemente de

bido a una alteraclon estructural o un cambio conformacional.

1.7.12. Orqanizacîon de la enzima en la membrana.

L_a abundancia de hipotesîs sobre la distribuciôn tcpografica de

las subunidades de los factores P , se manifiesta como un reflejo logico

de la controversia existante en cuanto a la estequiometna en subunidades

de los mismos. Estas hipotesis pueden clasificarse basicamente en dos -

grandes grupos : las que propician un modelo hexagonal (Pigs. 6a, 6b, 6c y

6d) y aquellas que apoyan un modelo tetragonal (Pig. 6e) . En la figura

6 se ilustran distintas estructuras propues tas, depend! endo del numéro-

de copias y disposîciôn de las subunidades. Una caracterfstica comûn a

todas ellas reside en considerar que alguna o todas las subunidades mino

ritarias de la enzima ( , « y é ) constituyen un tronco que conecta el

factor P a P^ , reflejando el papel asignado a estas subunidades en la

union de P a la membrana (véase apartado 1 .7.3. y Discusion) .

- 5 9 -

A

o ©

D

PIGAJRA G. - Modf>los para el lactor . En In parte superior izqut^r

do se ilunlran dos modolos pianos, propuestos por Kozlov y Mikelserr

porn el factor m ilocondrlal, con alternancia de las SLih©nidader; v*a-

yoritarins y un nijcieo central conslifjido por la subunidad ^ (al o oor

tjnn copin de + ^ + £ que lormarîan el conjunto de une subunided(bl

En la parle superior se muestra un modelo no pUino, propuosto por ~

estos mismos auiores, en vision lateral y desde arriba (c l . En ta par

le superior dérocha se muesira el modelo dcscrito por Bragn y Mou -

para el laclor F de H . coli . en vision lateral y desrie abnjo (dl . En

este modelo, las subunidades «y y ^ ocupan los lados opueslos de un ho

xâgono. Las subunidades 5 y £ înleraccionan con las subunîda«’*es ^ y

respecllvamenle, siluandose en un piano in lorior al ocupado por las sub

unidadec; m ayorilarins. P o r ultimo, Gait'tl y hlammes oroponen un mo

delo tetragonal sin nllernancin en 1ns subunidades oC y p para el lector

E, de cloroplasios (e) .

D

—6 0 —

Para el factor mitocondrial han sido propuestos très mo-

delos hexagonales (Rigs. 6a,6b y6c) , basados principalmente en la apa

riencia hexamérica de la molécula de R al microscopio electronico. Dos

de estes modelos (Rigs. 6a y 6b) plantean una alternancia de las subu

nidades od y p y un nûcleo central constituido por una copia de subunidad

(62) o por una copia de una subunidad compuesta por i + é (87).

Los au tores de este ultimo modelo, Kozlov y Mikelsaar, suponen que las

très subunidades minoritarias observadas en la mayoria de las prepara-

ciones de R^-ATPasa pueden formar parte de una unica subunidad "in

vivo" (55,87) de tamaho molecular similar al de las subunidades mayq_

ritarias (50.000-60.000), la cual se transformaria en las denominadas-

^ i y t por la accion de enzimas proteolitîcas durante el proceso de

aislamîenfo de la enzima (55,87). Un tercer modelo ( Rig. 6c ) , propues

to por estos mismos au tores, sugiere una disposîcion alternante de las

subunidades mayoritarias, pero ahora sîtuadas en un piano distinto y con

una especie de tallo constituido por la supuesta séptima subunidad ( ^ +

+ 5 ) (87).

La posible existencia de proteasas que se activaran durante -

el proceso de aislamiento del factor R y acluaran sobre esta protefna -

oligomérica no ha sido rigurosamente excluida. Por el contrario, recien

temente Ryrie y Gallagher (284) han demostrado que el factor Rj mito

condrial de levadura y el complejo de ATPasa pueden sufrir modificacig

nés proteolîticas durante el proceso de purificacion de los mismos, sîno

se incluyen inhibidores de proteasas. En este contexte, es relevante el

hecho de que un cierto porcentaje de la actividad proteâsica celular (has

ta un 50% en E . coli ) (140) se encuentra unida a membrana (285) y no

se solubiliza completamente aün después de someter las membranas a la

vados exhaustivos. De este modo, ciertas proteinas pueden encontrarse

estéricamente protegidas en la membrana, pero pueden sufrir una proteg

lisis limitada cuando la proteina, y presumibic.nente la (s) proteasa (s) ,

son extraidas de la membrana durante el proceso de purificacion (284,

- 6 1 -

286) . Esta prolcolisis limitada podria explicar las dîscrepancias encontra

das en las composiciones de aminoacidos, pesos molecularos y subestruc

tura de los factores de un mismo o distinto orîgen. Ademés, si tuvie

se lugar esta actividad proleolitica, esta probablemenle actuaria en distin

to grado sobre cada tîpo de preparacion enzimatica.

El uso de reaclivos entrecruzantes se fia mostrado como una

técnica poderosa en el estudio de la estequiometria y disposicion espacial

de las subunidades en las proteinas oligoméricos (287). Los factores R

no han sido una excepcion y estudios de este tipo han sido realizados -

sobre R^-ATPasa mitocondrial (185), de cloroplasto (186) y de E .coli

(115,288), indicando la existencia de diferencias en la organizacion mole

cular de estas proteinas. Basandose en estos estudios, se ha propuesto

un modelo hexagonal no alternante entre où y fi para la R^-ATPasa de

E . coli ( 288) y otro tetragonal para la R -ATPasa de cloroplasto (186)

( Fmgs. 6d y 6e ) .

- 6 2 -

1,8, Aspectos de los (adores F~r> de ac op I ami en to. Proteinas res

ponsables de la accion de DCCD.

De lo anteriormente descri to, se deduce que las posibi lidades

para estudiar el mecanismo de la fosforilacion oxldativa con el factor

se liayan limitadas por el hecho de que esta enzima en su eslado soluble

pierde propiedades importantes. Asi, la constante de la reaccion A T P -

sintetasa catalizada por el factor solubilizado es tan pequena que no-

puede medirse, incluso en condiciones favorables (p. ej. en presencia-

del sisfema: hexoquinasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) (55) . El faç

tor F^ tampoco catallza la reaccion de intercambio ^^P-ATP (55) ,

De este modo, en la ac lu alidad se esté comenzando a prestar

gran atencion al aislamiento y caraclerizacion de los complejos de A T P

asa, lo que plantea grandes difîcultades al tener que solubilizar el factor

F^ juntamente con un sector F^ intimamente integrado en la membrana.

Sin embargo, varios complejos de ATPasa han sido preparados reciente

mente a partir de mitocondrias de corazon de buey (65,295,296), mito-

condrias de higado de rata (297), mitocondrias de levadura (101), cloro

plastos (298), Escherichia colt (299), Rhodospirillum rubrum (300,301),

Mycobacterium phlei (302) y bacteria lermofila PS3 (61), habîéndose uti

lizado deoxicolato, colato o Triton X-100 como agentes de extraccion. -

Los complejos de ATPasa fxirificados de la bacteria term 6 fi la PS3, E .

coli y R. rubrum contlenen aparentemente très polipeptidos, ademés de -

los cinco cor respond!en tes al factor F^ (61,299,300), mientras que el -

complejo H -ATPasa de cloroplastos posee cuatro cadenas polipepifdicas

adicionales (298). Las preparaciones mitocondriales son considerablemen

te més complejas (65,284,295,297),

El grupo de Pedersen ha logrado obtener recien temente una -

preparacion de H -ATPasa, aislada de mitocondrias de higado de rata,

que observada al microscopio electronico révéla ser altemente disperse y

poseer una disposicion estructural similar a la ilustrada en la figura 5, -

- 6 3 -

consstente en: una esférula { ) , una pieza basal y un tronco que co

necta arnbas unidades (297). El espesor de la pieza basal ( -^60 A) es

sufîciente para airavesar completamente la fase hidrofobica de la membra

na in erna mitocondrial.

Las H -ATPasas aisladas de organismes procarioticos y eu_

carioicos, generaimente contlenen una subunidad altamente hidrofobica que

const tuye el principal componente del factor membranal F^ (61,193,298,

303,304). Esta subunidad de bajo peso molecular (6.000-9.000 dalton )

const tuye el sitio de accion del inhibidor diciclohexilcarbodiimida (DCCD)

que tloquea la actividad translocadora de protones de F^ ( 305-307) . Es

le inf ibidor, DCCD, constituye una prueba relativamente especifica para

el sector F^. La actividad ATPasîca se inhibe por DCCD, unicamente,

cuanco el factor F se encuentra asociado a F . La separacion de F 1 o 1

de F^ 6 la modificacion de la interaccion de estos dos factores provoca

un aumento en la permeabilidad a protones de la membrana, que puede -

bloquearse medianle la adicion de DCCD (75). La primera correlacion

entre la accion de este inhibidor y la protefna fuertemente hidrofobica se

estab ecio en estudios llevados a cabo por Fillingame en E . coli . al lograr

marcar covalentemente dicho polipéptido con ^C j DCCD en membranas

de E. coli. cepa salvaje, pero no en membranas de un mutante resis ten

te al electo de DCCD (308) .

En los ùltimos ahos se ha determinado la secuencia de aminoa

cidos de esta protefna fijadora de DCCD, aislada de mitocondrias (cora

zon ce buey, f^eurospora crassa. Saccharomyces cerevisiae) , cloroptas

(os (espinaca) y bacterias ( E . coli. PS3) (309-311). Una comparacion -

de estas secuencias homologas, pero distantes desde un punto de visia —

evolucionista, permile obtener ciertas caraclerfsticas comunes consis ten tes

en : (a) dos secuencias hidrofobicas de unos 25 resicJuos*, (b) un resf—

duo acido en el centre de la segunda secuencia hidrofcSbica; (c) una par

te central polar que incluye dos residues basicos y très residues hidroff-

licos neutres; (d) el caracter polar de la secuencia N-terminal. La poîÿ

—6 A"*

cion del residue de aminoécido écido en la mitad del segundo segmenlo

hidrofobico parece ser de especial in.portancia, Es e! unico resto acido

que es conservado en todos los organismes, Ademés,este aminoécido es

modifîcado especifica y covalen temente por el inhibidor diciclohexilcarbo

diimida (3Î2). Recienfemente se ha descri to un mutante de E . coli cuya

H -ATRasa era incapaz de translocar protones, encontréndose que el

residue écido de la subunidad fijadora de DCCD estaba sustituido por un

residue de glicocola (313).

Esta proteina hidrofobica se ha convertido en la actualidad en

una de tas subunidades mejor caracterizadas del complejo de ATRasa,-

encontréndose en dicho complejo en forma oligomérica (309). Junto con,

al menos, otros dos polipeptidos hidrofobîcos més constituye el factor f^

(61,314), formando un canal para el paso de protones (315). Reciente

mente se ha demostrado que este polipéptido aislado exhibe una actividad

protonofora sensible a DCCD cuando se reconstituye en liposomas (306,

307) .

- 65 —

1 . 9 . E s t u d io s q en é t ic o s .

El empleo de mutantes constituye una aproximacion al estudio

de las relaciones es truc lu ra-lunciôn y de ensamblaje de estos sistemas -

de fosforilacién. A (al fin, la H -ATPasa de E . coli ha sido ampliamente

estudiada. Todas las mutaciones que afectan al complejo de ATPasa han

sido mapeadas en un unico locus denominado une , y estos genes pare

cen estar organizados en un operon (69). Desde que Butlin y col. en -

1971 obtuvieron el primer mutante de E . coli en el que la fosforilacion -

oxidativa se encontraba desacoplada del transporte electronico (316), nu

merosos laboralorios comenzaron a aislar distintos mutantes en los que-

se ténia alterada alguna propiedad de los sistemas de fosforilacion. A s i,-

este tipo de estudios ha permitido demostrar que las subunidades cL , p>

de E -ATPasa de E.coli juegan algun papel en la actividad catalitica, ya

que una alteraclon genética de cualquiera de ellas suprime la actividad -

ATPésica. Recientemenle, Eutai y Kanazawa (73) y Downie y col. (69)

han abordado en profundidad estos lemas en sus respectives revisiones.

- 6 6 -

1 . 10. -ATPasa de Micrococcus Ivsodeikticus.

En esta bacteria gram-positiva aerobia estricta, Ishikawa y -

Lehninger identîficaron inicialmente una proteina asociada a membrana —

con actividad ATPésica como factor de acopiamiento de fosforilacion oxi_

dativa (132,317).

MuMoz y cols, estudiaron su solubilizacion selectiva de la mem

brana plasmética por tratamiento con tampon a baja fuerza ionica ( 124) ,

identîficéndola con las estructuras hexaméricasasociadas a la membrana,

que se observan al microscopio electrénico por tincion negaliva (123).—

También se fia descri to someramente la especificidad de sustrato y actî-

vacion por cationes para la enzima unida a membrana y soluble (152),-

asf como la purificacion, peso molecular, composicion de aminoacidos,—

composicion en subunidades (143,152,319,320) y la caraclerizacion y - -

propiedades de diferentes formas de la enzima purificada (321-324).

En su estado asociada a membrana, la -ATPasa de M. —

Ivsodeikticus muestra una considerable especificidad por ATP , pero re

quière la accion de tripsina para manifester su actividad fiidrolftica ( 1 24) .

Una vez solubilizada la enzima muestra unos niveles mâs bajos de laten-

cia que Megan a ser inexistentesen la forma purificada. Esta pérdîda de -

latencia durante el proceso de purificacion de P^-ATPasa de M. Ivso--

deikticus. podria ser el resultado de una actividad proteoiftica ya que pue

de ob ten erse una preparacion de enzima fiomogénea que exfiibe eslimula-

bilidad por tripsina mediante adicion del inhibidor de proteasas de serina

fenil-metil-sulfonil fluoruro ( PMSP) , durante el proceso de solubi lizacion

de la enzima (325).

Esta enzima requiers la presencia de cationes divalentes para 2+

ser activa » preferentemente Ca , Ademés, la enzima asociada a mem —

brana présenta formas interconvertibles por cationes, con diferentes ca-

- 6 7 -

nacten'sicas de activacion de Ca y dislinta latencia, de probable sig-

nificacioi regulaforia (326-3 28). El optimo de activacion de -ATPasa

soluble ;e encuentra para relactones de ATP : Ca^ (1:1) y ATP: Mg^

(2:1) a pH 7,5, aunque en este ultimo caso la actividad es cuatro ve-21-

ces meror (123). Es significativo el hecho de que el cation Mg sea2+

un inhibdor de la actividad Ca -ATPasa. Esta inhibicion alcanza un -

valor dfl 50% para una relacion Mg^ / Ca^ de 1/10, no incremen tan do

se al aunentar la concentracion de Mg^ (123,152). Oligomicina, 2 ,4-di-

nitrofentl y los iones monovalentes Na , K ( a concentraciones inferig

res a 1)0 mM ) no ejercen ninguna influencia sobre la enzima soluble o

unida a membrana. La enzima soluble présenta una alta especificidad - - — 2+por AT^ y Ca , no hidrolizando otros nucleotidos como ADP,UDP,

2+ 2+AMP, ti p-nitrofenil fosfato en presencia de Ca 6 Mg . De los inhi

bidores tipicos de actividad ATPésica (p-cloromercuribenzoato, N-efil-

maleimi<a, ouabaina, cianuro y azida sodica) solamente azida produce -

una inhibicion del 60% a concentraciones de 0, 1 mM, siendo resistentes

a los d«mas hasta las concentraciones ensayadas (5 mM ) tanto la enzi

ma soluble como la unida a membrana (123,152). Ademas , ADP se21-

muestra como un inhibidor de la actividad ATPésica dependiente de Ca

(70% de inhibicion a 4 mM ADP en la enzima soluble ) ( 1 23 ) .

La purificacion de esta E - ATPasa se ha llevado a calio por

filtraciot en gel (152) y por electroforesis preparaliva en gel de polia —

crilamich (143) . La enzima purificada se muestra astable al frio y mu y

sensible al calor ( 1 min a 659c causa la pérdida total de actividad) ( 152) .

La presencia de nucleotidos fuertemente unidos a la ertzima ( 2 moles ATP

y 2 mobs AD P/mot BE^) , coeficiente de sedimentacion (13,6 S ), coe

ficiente riccional relative (1,34), volumen espectfico parcial (0,72 m l/g),

peso mdecular ( 350.000 dalton ) , anélisis de aminoacidos y propie

dades oiticas han sido descri tas (318,319,3 29) .

Se han purificado varias formas diferentes de la enzima (véa

se Tabtî IX) que presentan diferencias en actividad hidroiftica, peso mo-

- 6 8 -

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- 6 9 -

locular, mov!lidad eleclroforética en gel do poliacrilamida, estimulabilidad

y sensibilidad a tripsina, estructura en subunidades y comporfamiento -

inmunologico (319,321,323,330-332). Las distintas formas moleculares -

de la enzima se obtienen simplemente cambiando las condiciones de cre-

cimiento del microorganismo. La utilizacion repetida de caldo comun pa

ra la resiembra y conservacion de la bacteria, aunque luego se procese

en la forma habitual (véase Maleriales y Méfodos) da origen a una sub-

cepa que produce -ATPasa, forma B. Esta en eslado purificado se-

puede presentar en la forma B (enzima inactive) , cuya actividad especf

fica es mu y baja y no es estimu table por tripsina o en la forma B ^ (en

zima activa) de superior actividad especifica que en algunos casos mues

era estimulabi lidad por tripsina (forma B _ _) , llegandose a alcanzar has

ta un 100% de estimulabi lidad de su actividad basal. En este ultimo caso,

el patron de subunidades muestra la presencia de un componente, & , de

peso molecular 25.000 dalton que ha sido identificado como el inhibidor

natural de este BR^ (330). Una caracterfstica comun a la subuestructu

ra de todas las formas B consiste en la presencia de un componente, X ,

de alto peso molecular (97.500 dalton ) y en la microbe te rogeneidad de

la subunidad ci que se muestra muy poco definida y proxima en tamaho -

a |5 . Por su parte la conservacion y resiembra de la bacteria en un -

medio compuesto por peptona y extracto de levadura, creciéndose a con

tinuacion en la forma descrita en Materiales y Métodos, da origen a la -

forma A de la enzima para la que se ha dëscrîto la presencia de très -

fipos de subunidades oL , ^ y g" bien definidas, ademas de uno o mas corn

ponentes que mi gran con el colorante marcador en electrofo resis en gel

de poliacrilamida al 7% en presencia de SDS denominado " g ",y que es

comun a todas las formas de R^-ATPasa de M . Ivsodeikticus

Este factor BR constituye el unico factor de acopiamiento pa

ra el que se ha descri to la presencia de hidratos de carbono (155-157),

Las distintas formas A y B también difieren en este aspecto, presentan-

dose diferencias en la composicion de azücares y un contenido mas bajo

—7 0 —

de hexosas en la forma B (155).

Un estudio comparativo de la solubilizacién de R^-AXPasa -

de M. Ivsodeikticus por n-bulano| y "choque osmotico", realizado por -

Salton y Schor (134) muestra que solo la proteina solubilizada por es

te ultimo método, que contiene subunidades minoritarias, puede reasociar^

se a la membrana. La proteina obtenida en la fase acuosa de la extrac_

cion con n-butanol posee exclusivamente las subunidades mayoritarias, oL

y fi . Estos au tores postulan para las subunidades minoritarias un papel

regulador y de asociacion a membrana, ademés de una cierta participa-

cion en la estimulacîon por tripsina (134).

La protefna parece estar localizada exclusivamente en la ca-

ra interna de la membrana plasmética, segûn experiencias de marcaje -

con I (333 ) y con anticuerpos conjugados con ferritina(334,335) .

Se han preparado anticuerpos frente a 8R^ de M. Ivsodeikti

cus . inhibiendo completamente y de forma "no compelitiva" su actividad -

hidroiftica, asf como aquella en las enzimas homologas de Sarcina flava.

Sarcina lutea y parcialmente en Micrococcus varians . no mostrando nin

gun electo sobre Sporosarcina ureae v Bacillus subtilis (336), Estas —

experiencias junto con otras de reactividad inmunologica cruzada y de mo

vi lidades electroforéticas sugieren una estrecha relacion entre las es truc

tu ras de los factores BR^ , de M. Ivsodeikticus. S . flava v S . lutea .

Asf pues, el factor de acopiamiento BR^ de M. Ivsodeikticus

muestra ciertas similitudes con los correspondientes factores de mitocon-i

drias, cloroplastos y otros micoorganismos. No obstante, a medida que -

se realiza un estudio més minucioso de estos sistemas, van emergiendo

diferencias tanto a nivel molecular como a nivel cataiftico. Estas diferen

cias pueden tener gran înterés para explicar las particularidades fisloloqi

cas de cada enzima.

• 71 -

1 . 1 1 . E s t a l e s i s .

En el présente Irabajo se Irafan varios aspeclos del factor -

BE de M. Ivsodeikticus. Por una parte se define cual es la subestruc

tura de esta enzima, asignando a cada subunidad una luncion détermina

da. Estos estudios de relacion estructura-funcion se fian Ifevado a cabo

mediante la aplicacîon de técnicas bioqufmicas e inmunoquimicas y han -

permitido identificar una nueva subunidad, no descrita hasta el présente

en esta -ATPasa, responsable de la interaccion de la enzima con la

membrana, asi como dilucidar cual es el nucleo cataiftico de la protefna.

Por cira parte también se pone de manifiesto la antigenicidad de los dis

tintos componentes polipeptfdîcos del factor BE , estudiandose por radiq_

inmunoensayo la influencia de estos sobre las propiedades inmunoqufmi-

cas de la enzima. También se dan nue vos dates sobre la estequiometrfa

en subunidades de la enzima. Posteriormente se describe la presencia -

de iones metalicos fuertemente unidos a la enzima que parecen jugar un

papel cataiftico y estructural. En esta lesis, uno de los puntos en los que

se ha pu es to una gran atencion radica en el papel jugado por los iones

mefélicos en los aspectos cataiftfcos, reguladores y estructurales de esta

enzima, tema practicamente desatendido en el estudio de los factores E

de cualquier origen. Asfmismo se ha estudiado la interaccion del factor-

BE de M. Ivsodeikticus soluble con fosfato.

Estos estudios han sido realizados primordialmente con la for

ma A de la enzima, por lo que, salvo cuando se especificase, todos los

resultados descritos en esta tesis hacen referenda a esta forma Ej -A T l^

asa de M. Ivsodeikticus .

V .

2. MATERIALES Y

METODOS

- 7 3 -

2 . 1 . R e a c l i v o s .

ATP {irifosfato de adenosina, sa) disodica) y ADP (difos-

fato de adenosina, sal disodica) fueron obtenidos de Pabst Laborato -

ries Biochemicals (Milwaukee, Wisconsin, E E .U U .), AMP-PNP ( 5-

adenilil-imidodifosfato, sal tetrasodica) fué un producto de ICN Phar -

maceuticals Inc. (Cleveland, Ohio, E E .U U .). EDTA (elilendiaminote

traacetato, sal disodica) de Eisher Scientific Co. (Pair Lawn, New

Jersey, E E .U U .); cloruro de L-cisteina de British Drug House Bio

chemicals (Poole, Inglaterma) ; Zincon ( 2-carboxi-2-hidroxi-5-sulfofor-

mazilbenceno ) de Sigma Chem. Co. (St. Louis, Mo., EE.LJIJ.) y

batofenantrolina ( 4, 7-di lenil-1 , 1 0-fenantrolina) de Serva Eein biochenn[

cals (Heidelberg, Rep. Eederal Ajemana) . Lisozima fué un producto

de Boehringer (Mannheim, Rep. Eederal Ajemana) y de Calbiochem

(San Diego, California, E E .U U .); RN Asa A , pepsir a, albumina de -

huevo y seroalbumina bovin a fueron de Sigma; tripsina y DN Asa de -

Calbiochem; inhibidor de tripsisina de soja de Boehringer. D TT (ditio

Ireitol ) y Triton X-100 fueron produc los de Calbiochem. SDS (dode

cil su I fa to sodico) , especialm ente puro, se obtuvo de BDH y urea de

Merck ( Darmstadt, Rep. Eederal Alemana) . Acrilamida; N , N% meli-

len-bisacrilamida y TEMED fueron productos de Eastman Kodak Co.

(Rochester, N .V ., E E .U U .). Coomassie R250 y Coomassie G250 -

de Serva, y fucsina de Merck. Sephadex G-200, G -100, G—50 y G-

25 lueron obtenidos de Pharmacia Eine Chemicals (Uppsala, Suecia) .

Agarosa fué un producto de Sigma. Azul de bromofenol fué de BDH

y azul dexlrano de Pliarmacia. ^ 1 (16 mCi/^g) ; Z n ( 1 , 6 9 mCi/mg

como cloruro de zinc en HCl 0,1 N ) y Pi (10 mCi/ml, como orlofos-

fato en solucion acuosa) fueron olilenidos de The Radiochemical Centre

(Amersham, Inglaterra) . Cloramina T y Tris (trishidroximetil-aminome

tano) fueron de Merck.

Todos los demas reaclivos empleados fueron de grado ana-

lilico y obtenidos de Mercf<.

—7 4 “

2.2. Microorganismo v condiciones de crecîmiento.

Se emplearon dos cepas A y B de la eubacteria gram-po^

llva Micrococcus Ivsodeikticus (NCTC 2665) conservadas en un medio

solido de agar-PWYE (baclopeptona, 5%; extracto de levadura, 0,1%;

NaCI , 0,5%, ajustado a pH 7,5 con hidroxido sodico y suplemenfado -

con agar al 2%) (337) y en medio solido agar-PNB (bactopeptona, -

0,5%,extracto de carne, 0,3%; suplementado con agar al 2%) respecti-

vamente. Aunque ambas cepas tuvieron el mismo origen, se encontra-

ron diferencias en el crecîmiento cuando se cullivaron en medio liquide

PWYE. L_a apariencia al microscopio, composicion de peptidoglicano y

los requerimientos nutrîcionales mostraron que ambas cepas presenta-

ban las caracterfsticas propias de M. Ivsodeikticus (NCTC 2665) (321 ) .

El proceso de crecîmiento del microorganismo que a continuacién se -

describe, asf como los restantes aparlados hacen referenda a la cepa

A, excepto cuando se especi fique lo contrario. Similares procedimientos

se realizan con la cepa B.

Lés células se crecen a 302C con una agitacîon constante -

de 250 r.p .m . en un incubador New Brunswick durante 18 h en matra

ces de 2 litros de capacidad conteniendo 400 ml de medio Ifquido PWYE.

Como inoculo se utilizan 4 ml de un preinoculo constituido por 50 ml de

medio en un matraz de 250 ml y crecido en las condiciones antes cita_

das hasta alcanzar el final de la fase logarfttrilca de crecîmiento o fase

estacionaria temprana, lo que se logra al obtenerse una medida de den

s idad optica de 1,0 a 750 nm, a partir de una dilucion 1/6 del cullivo.

Las células, de color amarillo intenso, obtenidas mediante

este proceso, se sedimentan por centrifugacion a 16.300 x g durante-

10 min a 02C y se lavan dos veces con agua destilada o tampon Tris-

HCI 30 mM (pH 7,5) .

- 7 5 -

2.3. Preparacion de membranas.

Las membranas se preparan segûn el procedimiento descH

to por Munoz y col. (123,124) con la modificacion de anadir MgCI^ -

10 mM durante la lisis osmotica.

Las células se resuspenden en tampon Tris-HCI 30mM, -

MgCI^ 10mM (pH 7,5) suplementado con sacarosa 0,8 M en un volu

men final dado por la siguiente expresion : 0,0065 x volumen de cultivo

(ml) X 6 X (D.O. due da lugar a una concentracion de 20-

30 mg de peso seco bacteriano/ml de suspension. Las células asi re-

suspendidas se incuban con lisozima (EC 3.2. 1.17) (0,075 mg/ml) -

con agitacîon constante durante 30 min a temperalura ambiente. Los -

protoplastos se recogen mediante centrifugacion a OSC (30 min, 34.800

X g ) y posteriormente se someten a un medio hipotonico constituido por

tampon Tris-HCI 30 mM, MgCI^ 10 mM ( pH 7,5) en un volumen final

similar al anteriormente calculado (todos los procesos posteriores se

realizan en este mismo volumen). A continuacion se anade DN Asa

( EC 3. 1.4.5) (0,075 mg/m|) y se incuba a temperalura ambiente bas

la reducir no tablemen te la viscosidad de los lisados ( aproximadamente

30 min ). Posteriormente, las membranas son sedimentadas a O C

( 4 0 min, 34.800 x g ) y lavadas cuatro veces en tampon Tris-HCI -

30 mM (pH 7 , 5 ) en ausencia de cationes divalentes. Estas membranas

que confienèn aproximadamente el 13% de la proteina celular (véase -

Resultados) se consorvan a -20&C para su uso.

2.4. Solubilizacion de la enzima .

En la figura 7 se muestra un esquema del proceso de aisla

miento de la enzima. La -ATPasa se solubiliza, por "choque osmo-

lico", resuspendiendo las membranas en tampon de baja fuerza ionica,

Tris-HCI 3 mM {pH 7,5) (124,152), La proteina soluble (0 ,5-1,0

mg/ml) se concentra hasta unos 8-10 mg/ml por ultrafiltracion en -

- 7 6 -

Resuspcoslôn de células en Tris-HC I 30 mM, MgCI^ 10 mM, sacarosa 0,8 M (pH 7,5)

Tratamienio con lisozima (0,075 mg/ml), 22«C, 30 min.Centri fugacion (34.800 x g, 30 min, OQC )

I ---------------------Sedimonio (Protoplastos)

Resuspenslôn en medio hipotonico (THs-HC l 30 mM, MgCI^ 10 mM, pH 7,5)

Tratamiento con ONAsa (0,075 mg/ml), 22SC, 25 min. Cenirifugaclén (34. 800 x g, 40 min, 02C)

Sedimento (Membranas)

Resuspenslôn en TrIs-HCI 30 mM, pH 7,5

I Centritugaclôn (34.000 x g, 40 min , OQC)

Sobrenadanle (Material cltoplésmlco)

I-------------------------------------------------Sedimento

Resuspenslôn en TrIs-H C I 30 mM, pH 7,5

Sobrenndante

Centrilugaclôn (34.000 x g, 40 min, 09c)

Sedimento

Resuspenslôn en Tris-HC I 30 mM, pH 7,5

Sobrenadanle

Centrilugaciôn ( 3 4 .0 0 0 x g, 4 0 min, 0 9 c )

Sedimento (Membranas lavadas)

Resuspenslôn en Tris-HCI 30 mM, pH 7,5

Sobrenadanle

Centrilugaciôn (34. 000 X g, 40 min, 02c)

Sedimento

Rasuspensiôn en Tris-HC I 3mM,pH 7,5 (Choque osmôtico)

Sobrenadanle

Centrilugaciôn (34 . 800 X g, 40 min, 02C )

Sedimento Sobrenadanle

Resuspenslôn en Tris-HC I 3 mM, pH 7,5

Centrilugaciôn (34.800 x g, 40 min, OGC )

I--------------Sedimento

{ "Membranas P " )Sobrenadanle

L_ÇJ

1*1(B -g

PIGURA 7 .- Esquema del aislamiento de Rj -ATRasa de M. Ivsodeik

ticus .

- 7 7 -

Hollow fiber modelo DC 2 (Amicon, Oosterfioul, Etolanda) con cartucho

diafiber HID x 50 . A continuacion se centrifuga a OfiC durante 60 min

a lOO.OOOxg para separar algunos componentes pesados. El sobrenadan

te se concentra fiasta unos 4-8 mg protefna/ml por ultrafiltracion a Ira

vés de una membrana Diaflo XM-50 en un ultrafiltro Amicon, bajo una2

presion de 1,5 Kg/cm de y se conserva a -202C.

Las membranas de las que se ha extraido la E - ATEasa -

se conservan a -209C para su posterior utilizacion y las denominare -

mos "membranas D" (membranas desprovistas de actividad ATPasica) .

Estas membranas dan cuenta del 7% de la protefna celular y retienen -

menos del 4% de las unidades totales de actividad ATPasica (véase Re

suilados) .

2.5. Purificacion de la enzima.

La purificacion se I leva a cabo principalmente mediante elec

troforesis en gel de poliacrilamida a escala preparative segûn el método

descrito por Andreu y Munoz (143) con ligeras modificaciones (véase

apartado 2.7. I .) . Siguiendo este proceso podian ser purificados crudos

de hasta 110 mg de protefna.

Otro procedimiento de purificacion de la enzima es mediante

filtracion en gel (152) por flu jo invertido (338 ) en columns de 2,5x145

cm de Sephadex G-200 equitibrada con tampon Tris-HCI 30 mM (pH -

7,5) y eluida con el mismo tampon a 4flC. Los volûmenes de exclusion

(Vo) e inclusion (Vo+Vi) se determinan a partir de los volûmenes de

elucion del azul dextrano y de g lucosa respeclivamente (Vo= 151 ml y

V0+Vi- 350 ml) . El flu jo se mantiene a una velocidad aproximada de -

7 nil/h con ayuda de una bomba peristaltica Sage 375 A (Sage Instru

ments, Cambridge, Mass, EE.LJU.). Este método fué ulilizado para -

purificar preparaciones de hasta 20 mg de protefna cruda.

- 7 8 -

En cualquiera de los dos procedimientos se registra conti -

nu am en te la absorcion del eluido a 278 nm y 206 nm por medio de un

monitor de doble haz modelo 2089 Uvicord HI Bromma, Suecia),

ademés de determinarse la actividad enzimatica y el patron electroforé-

tico en condiciones nativas de las distintas fracciones recogfdas. I—as -

fracciones activas mostrando una unica banda de movilidad relative igual

a P^-ATEasa se recogen y concentran hasta 4-8 mg/ml por ullraliltra

ci6n a través de Diaflo XM-50 (aprox. 1 ,5 Kg/cm^ de N^) . En ambos

procesos se obtienen rendimientos del 10-15%. La pureza de estas pre

paraciones se analiza por elec troforesis analftica en gel de poliacrllarru

da en ausencia o presencia de SDS, siendo mayor del 97%.

Las soluciones de P^-ATEasa purificada se conservan en

tampon Tris-HCI 0,1 M (pH 7,5) o Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) a -202

C y en pequehas alicuotas de 100 ^1 a fin de evitar sucesivas desconge

laciones y congelaciones que ocasionan una paulalina pérdida de activi

dad enzimética ( 1 64) .

2.6. Aislamiento de subunidades.

Las subunidades , (% y y de la enzima se aislan como po]i

péptidos de cadena estadfstica por electroforesis en gel de poliacrilami

da de P j—ATEasa purificada en presencia de urea 8M, requerido para

disociar totalmente la enzima (143,320,329).

Las subunidades y y también se han obtenido mediante elec

troforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS a escala micro-

preparativa mediante elucion de las bandas de protefna correspondien les

a dichos componentes.

Estas preparaciones de subunidades, dializadas exhaustiva -

mente frente a tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5), muestran una pure_

za mayor del 98% al analizarlas por electroforesis analftica en gel de -

- 7 9 -

poliacrilamida en presencia de SDS. Todos las subunidades se aislan

a partir de la forma A de la enzima debido a que es la forma més es

table (332) .

2.7. Electroforesis en gel de poliacrilamida.

2.7.1 . PAGE preparativa.

Se lleva a cabo en un Poly-Prep 200 (Buchler Co.) termes

tatizado a 6+12C con geles, cuya composicion se muestra en fa Tabla X,

de 80 ml en las condiciones descritas por Andreu y col, (143,320).

2.7.2. PAGE analftica .

Se realiza en todos los casos a pH 8,5+ 0,2 en geles de -

0,6 cm de diam'etro y 4 o 10 cm de longitud, segûn el proceso general

descrito por Davis y Ornstein (340, 341) modificado llgeramente (véa

se Tabla X) . Se emplean geles al 7% de acrilamida : 0,18% de N , N '

mefilenbisacrilamida, al 10% de acrilamida: 0,26% de N , N ' metilenbisa-

cri lamida 6 al 12% de acrilamida: 0,3 1% de N , N ' mefilenbisacrilamida.

L_as electroforesis se realizan a temperalura ambiente, primero a -

2 m A/gol (20 min) y luego a 5 mA/gel hasta que el azul de bromofe

nol, utilizado como marcador, llega aproximadamente a I cm del extre

mo inferior del gel.

En presencia de EDTA, los geles y los tampones emplea -

dos contlenen EDTA 2 mM , mientras que las muestras son traïadas

con distintas concentraciones de agente quelante a temperature amtiiente

durante tiempos diferentes ( 1 2 h 6 24 h).

En presencia de SDS, se afiade 0,1% SDS a los geles y

al tampon de electroforesis, siendo las muestras previamente tratadas -

con una razôn detergente ; protefna de 10:1 a 852C durante 5 min.

— 8 0 —

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—81 —

En presencia de urea, los geles y el tampon superior confie

nen urea 8M, D1 T 1 mM , tratandose las muestras con urea 10M, -

DT r 5 mM antes de ser sometidas a electroforesis. Las soluciones de

urea fueron preparadas inmediatamente antes de cada uso para evitar

la carbamoilacion de proteinas (342) .

Las movi lidades relativas se calculan segûn (343 ) . Los -

pesos moleculares de las distintas cadenas polipeptfdicas se determinan

por eleclroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SfDS segûn

(344,345), utilizéndose patrones de peso molecular conocido.

2.7.3. Tinciones.

Los geles se tîhen con azul de Coomassie R 250 (346) o -

por el procedimiento répido con azul de Coomassie G 250 (347), ob te

niéndose les perfiles densitométricos de bandas de protefna medianle la

absorcion de los geles a 575 nm en un espectrofotômetr'o Gilford 2400

equipado con un transportador lineal modelo 241 0-S,

Ocasionalmente se emplea la tincion histoqufmica de ATRasa

segûn una simplificaciôn de la técnica descrita por Weinbaum y Markman

( 348 ) . Los geles se incuban a 372C durante 60 min en una mezcla de

reaccion de 4,5 ml de tampon Tris-HCI 30 mM ( pH 7,5) conteniendo

40 yumoles do A TR, 40 yjmoles de CaCI^ y sobre la que se anaden

lentamente 0,5 ml de acetaio de plomo al 2%. Los perfiles densitométri

cos se obtienen por absorcion a 620 nm.

La visualizacion de hidratos de carliono se obliene por el

método del acido peryodico-reactivo de Schiff (tincion RAS) (381). Los

perfiles densitométricos se obtienen, en este caso, por absorcion de los

geles a 570 nm,

—82""

2 . 8 . E n s a y o s d e a c t iv îd a d e n z i m â t î c a .

L_a activîdad enzimâtîca se mide mediante la iiberacion de Pi

a partir de ATP en una mezcla de reacciôn compuesla de (volumen -

final 0,5 ml); 4 ^moles de ATP, 4 yumoles de CaCI^, cantidades varia

bles de enzima purificada ( 3-20 yug) o de membranes ( 100-1 50 yug pro

teina de membrana ) y tampon Tris-HCI (pH 7,5) a una conceniracion

final de 30 mM (124). En ensayos de activîdad ATPésica en membranas

o de estimulabilîdad por tripsina de diferentes preparaciones de enzima

se anaden 6 yug de tripsina a la mezcla de reacciôn. Las incubaciones

se llevan a cabo a 37&C durante 5 min deteniéndose la reacciôn por -

adiciôn de 3,2 ml de agua fria. El Pi liberado se détermina por el mé

todo de Vam bu tas y Packer (213), midiendo la absorbancia del com pie

jo fosfomoiibdico reducido a 650 nm En estas condiciones expérimenta

les, 1 yumol de Pi corresponde a 0,7 unidades de absorbancia (319) .

Una unidad de activîdad ATPésica se define como la cantidad de enzi

ma capaz de liberar 1 ^mol de Pi por minuto a 372C bajo las condicig

nés expérimentales anteriormente citadas (143). Las actividades espe-

cificas se expresan como unidades/mg de protefna,

2+En otros casos, los iones Ca fueron sustituidos por iones

2+Zn como activadores de la reacciôn.

Ocasionalmente se détermina la activîdad ATPésica mediante

la Iiberacion de protones que tiene lugar durante la hidrôlisij de ATP -

usando la técnica del pH-stato (164). La reacciôn iué seguida cons tan

temente con un aparato combinado de Radiometer (pH-metro pHM 26,

titulador II, bureta ABU 12, registrador SBR 2c y electrodo semimî —

cro combinado GK 2320 C) . La mezcla de reacciôn se man tiene a

37+0, 12C mediante agua circulante a través de la recémara de> reel -

piente de reacciôn por medio de un bano a temperalura constante

(Lauda K2RD, Rep. Pederal Alemana) . El electrodo se estandariza

- 0 3 -

a 37ÛC con un tampon patron Beckman a pH 7,0. La equivalencia en

tre el fosfato inorganico liberado y la cantidad de NnOH anadida para -

neutralizar los protones liberados y mantener el pH constante se dedu

ce de las curvas obtenidas por Dyson y Noltman (349) .

2.9, Inhlbicion de la actividad enzimatica por antisuero.

La capacidad de los antisueros-anti-( - ATPasa forma A ),

anti-( F —ATPasa forma B) , anti-( subuni dad od ) y anti-( subunidad (i )

- para inhibir la actividad enzimatica de la F^-ATPasa unida a membra

nas , se I leva a cabo incubando 110 ^ f de preparacion de membrana

(500 de protefna de membrana) durante 2 h a lemperatura ambiente

con cantidades crecientes de antisuero en un vo lumen final de 600 yjl de

tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5). Posteriormenle se precede a me-

dir la actividad enzimética residual, incubando a 372C durante 27 min

alicuotas de 150 yjl de las mezclas anteriores con : 4 yumoles de ATP,

4 yjmoles de CaCI^ y 6 yjg de tripsina en un vo lumen final de 0,5 ml -

de tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) . La reacciôn se detiene por ad[

cion de 0,2 ml de âcido trieloroacético al 12,5%, analizandose el Pi li

berado en el sobrenadante résultante tras una centrifugacion a 34.B00x

g dubante 30 min a 02C.

De una forma analoga, la capacidad de los aniisueros - anfi-

(F^-ATPasa forma A ), anti-( F^-ATPasa forma B) , anti-( subunidad

«X ), anti-(subunidad ( ) y anti-(subunidad ) - para inhilDir la acti\d

dad enzimatica de la F^-ATPasa purificada se realiza incubando la en

zima (0.06 unidades) con cantidades crecientes de antisuero durante

2 h a temper a tu r a ambiente en un volumen final de 200 yul de tampon -

Tris-HCI 30mM (pH 7,5) . Transcurrido este tiempo se ensaya la acji

vidad ATPésica residual (véase apartado 2.8.) con la modificacion de

que la reacciôn se detiene anadiendo 0,2 ml de acido trie loroacético al

12,5%, midiéndose a continuacion el Pi liberado en el sobrenadante ob-

8 4 -

tenido al centrifuger a 34-800xg durante 30 min a 02C.

Los :sueros control se obtienen a partir de la sangre de -

los conejos antes de ser inmunizados.

2.10. Tratamiento con agentes qjelantes.

La capacidad de diverses agentes complejantes de iones pa_

ra inhibir la activîdad ATPâsica se ensaya incubando la enzima purifi

cada (0,02-0,04 unidades) con cantidades crecientes de distintos agen_

tes quelantes en 200 jji de tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5), Poste-

riormente se retiran alicuotas de 100 yjl en las que se détermina la aç

tividad enzimética. En este tipo de ensayos se realizan los contrôles -2+

necesarios para lener en cuenta el e fee to quelante sobre el ion Ca ,

requerido para la actividad enzimética. En particular, la actividad

ATPésica de muesiras conteniendo EDTA se compara con aquella de2+

contrôles en los que se ha anadido una concentracion de iones Ca , -

disminuida en una cantidad igual a la présente de EDTA en las muesiras

en las que se esté estudiando su e fee to. Esta correccion se realiza pa

ra considerar la capacidad de este agente quelante para formar comple

jos de estequiometrîa 1: 1 con todo s los cationes y , por lo tanto, con

^ 2+ los lones Ca

Las actividades se refieren en porcentajes respecte a contrg

les realizados con mues tras de enzima incubadas en las condiciones an

teriormente descritas, pero en ausencia de agente quelante.

Los expérimentes de "prevenciôn" y "reversion" de estas

inhibiciones se llevan a cabo segun se indica en las leyendas de las -

tablas respect:vas.

2.11. Otras determinaciones anaifticas.

La concentracion de protefna se détermina segun el método

—85 —

de l_owry y col. (350) y ocasionalmente en soluciones mu y diluidas -

mediante absorcion a 230 nm (351),usando en ambos casos seroalbü-

mina bovina como patron, o bien , en las soluciones de P -ATPasa,1%

mediante el valor del coeficiente de extinciôn molar ^ ; cm"

a 276 nm, calculado previamente para la forma A ( 164) y corrobora-

do para la forma de la enzima (321).

I—as medidas de pH se realizan con un pH-metro modelo -

26 de Radiometer (Copenhague, Dinamarca) , equipado con un electro

do semimicro combinado GK2320 c de Radiometer, adecuadamente es-

tandarizado antes de cada medidà (352) .

2.12. Reinsercion de P^-ATPasa y sus subunidades a membranas

desprovistas de enzima.

Se emplean dos tipos de experimentos para médit' la rein -

sercion de la enzima compléta a "membranas D" :

a) Se incuba F^-ATPasa purificada (0,12 unidades) con

"membranas D" (500 yug de protefna de membrana) en un -

volumen final de 200 yjl de tampon Tris-HCf 30 mM (pH 7,5)

y en presencia de cationes divalentes. La mezcla se agita -

vigorosamente durante 5 min y se incuba a 37&C durante I 5

min mas, sometiéndola finalmenle a centrifugacion a 0S2C -

(43. OOOxg durante 30 min) . Una vez recuperado el sobrena

dante y el sedimento, este es lavado dos veces con 200 yul

de tampon Tris-HCI 30 mM ( pH 7,5) y resu s p en di do en -

100 /_il del mismo tampon para la poslet'ior medida de aclivj_

dad ATPésica tanto en el sobrenadante como en el sedimen

lo. Muesiras en ausencia de iones divalentes sirvieron como

contrôles de reinsercion inespecflica de enzima.

b) En otros casos se realizan experimentos de reinsercion

- 8 6 -

con F^-ATPasa purificada marcada con triiio (cedido am able

menie por la Dra. C. Munoz) o con F -ATPasa purificada 1 25

marcada con I (véase apartado 2.18.). El proceso segtn

do es semejante al anteriormente expuesto, incubando |~

F^ - ATPasa (3.000 cpm) o F^ -ATPasa (20.000 cpml

con "membranas D" (500 yjg de protefna de membrana ) y de

terminando la enzima reinsertada como el porcentaje de radiac

tividad medido en el sedimento.

Los resultados obtenidos por ambos métodos presentaron u -

na correlacion excelente.

P a ra ei estudio de la reinsercion de F ^ -A T P a s a s defectivas

en aiguna subunidad asf como de las propias subunidades a "membranas

D ", se sigue el mismo proceso ya descrito, marcando previamente las1 25

distintas protefnas con I (véase apartado 2.18.).

2.13. Tratamiento con Tripsina.

Varias mues tras de F^-ATPasa se incuban con tripsina a

3 7 2 c durante diferentes tiempos en un volumen final de 200 pi de tam

pon Tris-HCI 3 0 mM (pH 7,5) con una relacion tripsina/F ^-ATPasa

de 1/20 6 1/ 1 5 , segun se estudie la correlacion del efecto de la pro-

teasa sobre las subunidades de la enzima con la actividad enzimatica o

con la capacidad de reinsercion a membranas de la molécula F -A T P

asa . La accion proteolftlca se interrumpe anadiendo un exceso de inhibl

dor de tripsina de soja (înhibidor de tripsina/tripsina = 2/1 ) . Después

de éstos tratamientos, se détermina la actividad enzimâtîca o la capaci

dad de reinsercion a membranas de las muestras, correlacionando es

tas propiedades con sus respectivos pa trônes electroforeticos en presen

cia de SDS o urea. La realizacion de distintos contrôles, indica que

la presencia del Inhibidor de tripsina no afecta a las propiedades de la

F^-ATPasa.

- 0 7 -

En los tratamientos de las subunidades mayoritarias, o', y p

con tripsina el proceso seguido es analogo al descrito siendo la relacion

subunidad/tripsina de 20/1.

El aislamiento de formas distintas de -ATPasa obtenidas

tras un tratamiento con tripsina se Neva a cabo mediante electroforesis

a escala micro-preparativa en gel de poliacrilamida. Las muestras, ca

da una conteniendo aproximadamente 40 yjg de protefna, se aplican so

bre un mfnimo de seis geles de poliacrilamida al 7%, efecluandose la -

electroforesis al mismo tiempo. Posteriormente, uno de dichos geles -

se tifie con azul de Coomassie G 250 (347) a fin de localizar rapida -

mente las bandas de protefna, mientras en otro se realiza la tincion his

toqufmica de actividad ATPésica (véase apartado 2 .7 .3 .). Una vez que

las movilidades relativas de las respectivas bandas son medidas, las -

protefnas se eluyen con tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) a partir de

pequehos cortes producidos en las zonas correspondientes de los geles

restantes. Tras este proceso, en el que se récupéra mas del 90% de

la protefna, se procode a medir la actividad ATPésica y a anaüzar los

patrones electroforeticos en los sistemas de urea y SDS de los diferen

tes eluidos. Muestras de P - ATPasa no tratadas con tripsina y anali-

zadas en las mismas condiciones sirven como contrôles.

2.14. Preparacion de antisueros.

Se inoculan subcutaneamente varios conejos blancos de la ra

za New Zealand de 1,5 Kg de peso con enzima pura (0,4 mg) incor-

porada en adyuvante complete de Ereund (353) en un volumen de I ml

de tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) . Posteriormente se procédé a -

repetir el proceso semanaImente mediante inyecciones subcutaneas de -

0,4 mg de enzima purificada en un volumen final de I ml de tampon

Tris-EICI 30 mM (pH 7,5) con adyuvante incomplete por un periodo de

3 semanas. Transcurridas dos semanas después de la ultima inyeccion

•“0 0 —

se vuelve a inoculer una vez mas en la forma ya descrita, y sf.ete -

dias mas larde se extra e la sangre ('^30 ml) mediante una pu ne ion en

la vena marginal de la oreja, tras ser irrilada esta con xileno. A con

tinuacion se deja coagular la sangre ( 2 h a lemperatura ambiente y 18

h a 42C) , recogiéndose el suero por centrifugacion (3 .OOOx g durante

5 min) , el cual una vez calentado a 552C durante 30 min para inactivar

el sistema del complemento (354) se almacena a -2020.

Para obtiener antisueros trente a las subunidades A , fi y ^

purificadas se procédé de forma anéloga a la descrita anteriormente -

con la modificacion de que la cantidad de protefna utilizada en cada in

yeccion résulta ser de 300 ^g.

Sueros control se obtienen a partir de los mismos conejos

antes de inocularlos con el antigeno correspondiente.

2.15. lllulacion de antisueros.

Se realizan distintas diluciones de cada antisuero (desde

1/100 hasta 1/51 200) con tampon TNE (Tris 10 mM, NaCI 0,25 M,

EDTA 1 mM, a pH 7,2) , toméndose 200 yj| de cada una en tubos de

borosilicato a los que se anade antfgeno marcado radiactivamente (20.000

cpm) con (véase apartado 2.18.) . La mezcla se incuba durante

2 h a 372C y lu ego 18 h a 42C. Transcurrido este liempo se anade a

cada tubo 50 yul de una suspension de organismes de Staphylococcus -

aureus , fijados al 10% ( p / v ) con formol, para precipitar los complejos

antfgeno-anticuerpo (355), incubéndose durante 3 h a temperature am

biente. Por ultimo, se adiciona a cada tubo 1 ml de tampon TNE conte

niendo Triton X-100 ai 0,05% y se centrifuge a 02C (3. OOOxg durante

15 min). Se sépara sedimento y sobrenadante, midiéndose la radiacti-

vidad en los mismos. La dilucion de antisuero capaz de unir el 50% de

antfgeno marcado, bajo estas condiciones expérimentales, se define como

el tftulo del suero (356) .

- 8 9 -

2.16. tnmunodifusion doble bidimonsional.

Esta técnica denominada también como doble inmunodifusion

de Ouchferlony, se realiza en geles de agarosa al 0,8% en ta»r\p6n Tris-

HCI 3 0 f n M (pH 7 , 5 ) segun una modificacion del método de Campbell

( 3 5 7 ) . Las muestras, aproximadamente 3 5 yjg de protefna, se introdu

cer en pocillos de 1 , 5 mm de diametro ecfjidistantes 4 mm de otro cen

tral rellenado con el antisuero correspondiente. Tras una incubacion de

16 h 6 3 0 h en una camara hûmeda se observan di reclam en te las ban

das de precipitacion.

2.17. Inmunoelectro fores is .

Se lleva a cabo en plaças de agarosa (10x8x0,8 cm) al -

0,8% en tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) (353). Las muestras, con

teniendo aproximadamente 25 yjg de protefna se introducen en pocillos -

de 1 ,5 mm de diametro equidistanles 6 mm del eje longitudinal de la

plaça y se someten a electroforesis ( 300 voltios durante 2 h a IOSC ) -

en un aparato LKS (Bromma, Suecia) emplean dose Tris-HCI 20 mM

(pH 7,5), como tampon y azul de bromofenol, como marcador. Très

pliegucs de papel Whatman, F mpregnados del tampén mencionado y colg

cados sobre los extremes de la plaça de agarosa, conectan la disolu -

cion tampon en los compartimientos anodico y catodico con la superficie

del gel de agarosa,

Después de efectuar el paso eleciroforético, se realiza un

canal de 2,5 mm de anchura en el eje longitudinal de la plaça y una

vez relleno con el antisuero correspondiente, se deja en una camara -

hûmeda, observandose el desarrollo de las bandas de precipitacion a

las 24 y 48 horas.

I 252.18. Marcaie de protefnas con_____

La enzima -ATPasa pu ri ficada , sus subunidades c/ ,

— 9 0 —

, y y ^ » asî como P^-ATPasas defectivas en aiguna de estas sub

unidades se marcan radiactivamente con ^ 1 mediante una modificacion

del método de la cloramina-T (358,359). Por este procedimiento el - 1 25

I es iniroducido preferentemente en los resfduos de tirosina, si bien

los restos de histidina también pueden ser objeto de halogenacion (360,

361 ) . L_a mezcla de reacciôn (volumen final de 300 yjl) contiene tampon

TNE, Triton X-100 al 0,05%, 10 yug de protefna, I mCî l ' 10 jjgde cloramina-T. Tras una agitacion suave a 222C durante I min, la -

reacciôn se detiene mediante la adicion de 120 yug de metabisulfito sodîco

y 16 yjg de K l. I_a separacion de la protefna marcada del exceso de - 1 25

I libre se e fee tua por filtracion en gel uti lizando columnas de Sepfiadex

G-50 (0,9 cmxl 5 cm) o Sepfiadex G-25 (0,9cmx 15 cm) segun el ta-

mano de la cadena polipeptfdica marcada. L_as columnas fueron equili -

bradas previamente con tampén TNE conteniendo Triton X-100 al 0,05%

y eluidas con el mismo tampon. I—a muestra fue suplementada con 100

^1 de una soiucion de seroalbûmina bovina (200 yjg/ml) con el fin de -

minimizar la adsorcion de la protefna marcada sobre las paredes de -

la columna cromatogréfica. El empleo del detergente no ionico. Triton

X-100, tanto en la mezcla de reacciôn como en el equilibrado de la cg

lumna y en el tampon de eluciôn résulta ser un requerimiento impres -

cindible para evitar la formaciôn de agregados durante el proceso de -

marcaje (véase Resultados) . Se analiza el contenido en ^ 1 de las

fracciones recogidas y aquellas conteniendo la protefna iodada se diali-

zan frente a 1 litro de tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) con cambios

frecuentes hasta obtener fondo en los Ifquidos de dialisis (generalmente

3 cambios al cabo de 10, 20 y 30 h ) . La protefna asf marcada se aj

macena a -202C para su uso posterior.

El estado molecular de las protefnas marcadas fue analizado

por electroforesis en gel de poliacrilamida en ausencia y en presencia

de agentes disocianles (véase Resultados) , no detecténdose ningûn cam

bio en el estado molecular de aquellas.

- 9 1 -

2.19, Localizacioo de radiactividad en geles.

Una vez realizadas las electroforesis en ge* de poliacrilami

da on condiciones nativas o disociantes de las distintas protefnas marca

das radiactivamente, los geles se cortan en pequehas rodajas de 1 mm

de espesor mediante un cortador de geles Mickle (The Mickle Lab. Eng.

Co., Gomshall , Surrey, Inglaterra) y se introducen en sus correspon

dientes viales para medir radiactividad (véase apartado 2.24.).

2.20. Radioinmunoensavo de la enzima E -ATPasa v de sus subunida-

des_o<

Los experimentos de radioinmunoensayo se llevan a catjo on

lubos de borosilicato (10 mm x 75 mm). La mezcla de reacciôn, en -

un volumen final de 200 yul, contiene tampon TNE suplementado con

Tplon X-100 al 0,05%. Sobre este volumen se anade a cada tubo 20 -

yjl del antisuero correspondiente obteniéndose una dilucion final algo su

perior al valor de su tftulo. A continuacion se adicionan diferentes can

tidades de protefna no marcada (de 3 a 15.000 ng) seguidas de la ac

cioi de una cantidad fija de protefna iodada (aproximadamente 20.000

cptn ) . Después de una leve agitacion, las mezctas de reacciôn son in

cubadas durante 3h a 372C y posteriormenle a 42C durante 18 h. Trans

currido este tiempo se ahaden 50 pl de una suspension al 10% (p/v) de

Staphylococcus aureus . tratado previamente con formol para inaclivar-

to, dejandose incubar 20 min a 222C con una agitacion constante. Tras

la adicion de I ml de tampon TNE conteniendo Triton X-100 al 0,05%,

se centrifugan todos los tubos a 5. OOOxg durante 20 min recogiéndose

cuidadosamente sobrenadante y sedimento para medir radiactividad en -

ambas fracciones en un Radioinmunoanalizador Beckman,

Los datos representados en las figuras correspondientes re

presentan el valor medio de un mfnimo de dos determinaciones. Todos

los resultados se corrigieron por union antfgeno-anticuerpo no especffi-

- 9 2 -

ca. I—as curvas se ajusfaron por un programa de compulacion de a jus

te de mînimos cuadrados (388).

2.21. Fîiaciôn de (ostaio a -ATPasa.

Se incuban 0,17-0,20 mg/ml de enzima purificada en 100 p\

de tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) durante 30 min a 23SC con dis

tintas concentraciones de Na^HPO^ no radiactivo y trazas de Pi -

(300.000 cpm) en las condiciones indicadas en las leyendas de las figu

ras. Transcurrido este tiempo, el Pi uni do a la protefna se sépara del3 2

exceso de Pi libre mediante filtracion en columnas de Sephadex G -100

o G-25 (0,9 cmx 15 cm; Vo= 4,0 y 5,0 ml, respectivamente) . Se re

cogen fracciones de 150 yj|, determinandose radiactividad en las mismas

(véase apartado 2.24.).

Para calculer las concentraciones molares de la enzima -

P -ATPasa o sus subunidades, se hace uso de los pesos moleculares

de 350.000 dalton para P -ATPasa, 55.000 dallon para subunidad

y 50.000 dalton para subunidad p. , determinados previamente (319) .

2.22. Anâlisis de metales.

La presencia de metales se analiza por espectrofotometrfa de

absorcion atom ica en un espectrometro Perkin—Elmer, modelo 305B. -

Las determinaciones de zinc, hierro y calcio se realizan a 213,9 nm,

248,3 nm y 422,7 nm respectivamente. Para obtener valores cuantitaU

vos se tratan 3 mg de enzima en un volumen final de 1 ml completado

con agua desionizada con 0,1 ml de H^SO^ conc. y 0,1 ml de HNO^

conc. durante 2 horas en agua hirviendo. La posible presencia de me_

taies existante en los tampones empleados durante la purificacion de la

enzima se corrige utilizando como contrôles los ultrafiltrados de cada -

preparacion enzimatica.

- 9 3 -

1—as soluciones patron de metales se preparan a partir de -

sales espectrograficamente puras (Merck , Darmstadt, Rep. Federal

Alemana) disueltas en agua desionizada.

El agua empleada en este tipo de experimentos se deslila y

desioniza a través de un sistema de purilicacion de résina de intercam

bio ionica (Dala,Modelo Mar-606) . El material de vidrio se frata con

soluciones de EDTA, lavandose repetidamenfe con agua desionizada in

mediatamente antes de su utilizacion. Se toman las precauciones necesa

ri as contra la contaminacion de posibles trazas de metales siguiendo -

las recomendaciones descritas por Thiers (362) y siempre que es pq_

sible se emplea material de polietileno.

2 +2.23. Reconstitucion de Zn - ( - A TPasa) .

Estos experimentos se llevan a cabo midiendo la incorpora-

cion de ^^Zn^ a la protefna desprovista de Zn^ obtenida por trata -

miento con EDTA de la enzima nativa como se describe en Resultados.

2.24. Medidas de radiactividad.

l—a radiactividad de ^ 1 y de ^^Zn se mide directamente en

un Radioinmunoanalizador Beckman.

3 2L_a medida de R se lleva a cabo en un contador de cen —

telleo IfqiJido Inter technique ( Francia ) . A las muestras acuosas se les

anade 10 volümenes de Ifquîdo de centelleo "lôlueno/Triton (363), cons

tituido por una mezcla de 2 volümenes de Tolueno, 1 volumen de T r i

ton y 0,5% de butil-PBD.

2.25. Medidas de absorcion.

t—as medidas de absorcion se hacen en un especIrofotorneiro

de haz sencillo Spectronic 70 (EBausch ü l_omb. , Rochester, New -

- 9 4 -

York, E E .U U .). Los espectros de absorcion se registran en espec-

trofofometros de doble haz Varian modelo 635 D o Varian Cary 16 S

( Varian Cary Instruments, Monrovia, California), uséndose cubetas

de 5 y 10 mm de c amino optico, velocidades de 20 nm/min y abertura

pequeha de rendija.

2.26. Medidas de ftuorescencia.

Las medidas de fiuorescencia se realizaron con un espectrg

fluorimeiro diferencial Fica 55 Mkll (Le Mesmil, St. Denis, Francia)

equipado con una lâmpara de xenon de 450 watios y célula de rodamina

B, mantenida a 3 2+ 0 ,52C median te un bano de temperalura constante

Haake NB 22 (Karlsruhe, Rep. Federal Alemana). Las condiciones

de medida de émision fueron; una rendija de 7,5 nm, una ganancia de

medida de 5 a 10, una constante de tiempo de 3 s y una velocidad de

barrido de 10nm/min. Las cubetas (0,5 cm x 0,5 cm) se mantuvieron

a la temperatura deseada circulando agua a través del compartimiento

celularylos portacubetas por medio de un bano Lauda K2RD. Ambas

cubetas (muestra y referenda) contenian el mismo tampon, ajusléndose

el cero previamente a la adicion de la protefna. La exposicion de las

protefnas a los ray os de excitacion fué minimizada para evitar fotoiisis.

El registre de las medidas de fiuorescencia se realizo en un registre

dor XY Ohnigrafic 200 (Houston Instruments, Bellâtre, Texas, EE . U U . ) ,

utilizândose la escala de 50 mV, una constante de tiempo de 3 s y una

velocidad de registre de 20 nm/min. Se emplearon unidades arbitrarias

de fiuorescencia, tomando como 100 la émision a 340 nm de una soiu

cion de F^-ATPasa a 252C a una concentracion de 00 yjg/ml en tam

pon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5), usando como referenda este mismo

tampon y exdtandose con radiacion de 276 nm .

3. RESULTADOS

3.1. SUBESTRUCTURA DEL

FACTOR BF .

- 9 7 -

3.1.1. Aislamiento v anâlisis de la enzima soluble.

El tratamiento de membranas de M. Ivsodeikticus , obtenidas

segun se ha descrito en Materiales y Métodos, con tampon de baja tuer

za iénica libera aproximadamente el 55% de la actividad ATPésica unida

a membranas (Tabla X I), valor algo inferior al descrito por Muhoz y -

col. ( I 24,152 ) . El anâlisis de esta enzima soluble por electroforesis en

gel de poliacrilamida en condiciones no disociantes y en presencia de dg

dec il sulfato sodîco se muestra en la figura 8. La presencia de très corn

ponentes de pesos moleculares aproximados de 55.000,50.000 y 35.000

dallon en el gel con SDS corresponder^an a las très subunidades oC, ^ y

^ identificadas en este factor (319), La banda de movîlidad relati —

va 0,85 (aproximadamente 19.000 dalton ) podrîa asîmilarse a la subuni_

dad présenté en las F^ -ATPasas mitocondrîales, de cloroplastos y de

algunas bacterias ( vease Introduccion ) , pero no descrita hasta el momento

en M. Ivsodeikticus;mientras que el componente de movîlidad relativa 0,67

(aproximadamente 26.000 dalton ) podria corresponderse con la subuni -

dad 6 de peso molecular 25.000 dalton présente en las prepar'aciones de

M. Ivsodeikticus forma B^_^ (véase Introduccion ) e identificada por Carrei_

ra y col. (330 ) como el supuesto inhibidor natural de la enzima y respon

sable de su latencia.

Por otra parte, la electroforesis en gel de poliacrilamida en

condiciones no disociantes de la enzima soluble muestra la presencia de -

très bandas de protefna de movilidades relativas 0,29,0,58 y 1.00, ade -

ma"s de un cierto porcentaje de protefna que apenas se introduce en el —

gel (figura 9). El aislamiento de estos componenles y su posterior anâli

sis por PAGE en presencia de SDS (Fig. 9) permile visualizar ta com-

pDsicion de cada una de las bandas tehidas. De este anâlisis se înfiere —

que gran parte del components de peso molecular 19.000 dalton apenas -

se introduce en el gel, mienlras que la mayor parte del componente de —

26.000 dalton migra con el frente cuando la electroforesis se lleva a cabo

- 9 8 -

Q. E

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0 -

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0.1

S<

OJ

01

01

55 50 2035

0 80 I 000.20 0 60

M ovilidod rclotivo

FIGURA 9.- Rcgisïr-o çtociroforéllco de E3P rio'JbIo (bprox. ^0 jq) -

dcspLiés de electroforesis en gel de polîocrîlQmido al 7% en condiciones

no disociantes; y perflles donsitoméiricos de Ims cueiro bandas de protn j

na A ,0 ,C y O aisladas y somefIcJas a eleciroloresis en gel do poliocrU

tamido al 12% en oroscncîa de SDS 0,1% {condiciones en Materloles y -

Métodos) ,

-1 0 1

en condiciones no disociantes, Por otra parte, la banda de movilîdad re

laliva 0,29, correspondiente a F^-ATPasa, cuya actividad no muestra -

ahora estimulabilîdad por tripsina, exhibe un patron electroforético constitui_

do por las subunidades 0 , p y ^ ya definidas junto con un componente de —

unos 19.000 dalton de peso molecular. Un analisîs comparative de la sub

estructura de la enzima soluble estimulable y no estimulable por tripsina

(compérese figuras 9 y 9 b) sugiere que el componente de peso molecu

lar de 26.000 dalton o alguno de los que migran con movilîdad relativa -

1.00 (peso molecular inferior a 10.000 dallon ) podrîa ser el response -

ble de la latencia de la actividad enzimética. Sin embargo la adicion del -

componente de 26.000 dalton , parcialrnente purîficado, no afecta signifie a

tivamente a la actividad ATPésica cuando se incuba con la enzima purifi

cada en distintas condiciones expérimentales (ausencia de cationes divalen

tes ; presencia de Mg^ o Ca^ ; distintas tempera luras, y 37®C).

3.1 . 2, Identi ficacion de un nuevo componente en la subes tructura de P ~

ATPasa de M. Ivsodeikticus.

Un esquema del proceso de solubilizacion y purificacion de

la enzima se muestra en la tabla XI.

Tras la puri ficacion a homogeneidad de esta enzima, se ob

tiene una unie a banda de proteiha de movilîdad relativa 0,27 + 0,02 en -

electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% en condiciones no disociantes.

No obstante, un examen mas delallado por PAGE analHica a més alta re-

solucîon, aplicando pequehas cantidades de enzima en geles de 10 cm de

longitud, permite visualizar el desdoblamiento de la banda correspondiente

a Pj-ATPasa en al menos très, solapadas parcialmente entre si, poniên

dose de manifiesto la caracteristica microbe ter ogeneidad existenle en las

preparaciones de esta enzima (164,321,323).

La actividad especDica de estas preparaciones de P -ATPa2+

sa de M. Ivsodeikticus dependiente de Ca résulta ser de 6,42 + 1 ,08

- 1 0 2 -

jumol Pî/mg protema.min (diez preparaciones) , no siendo estimulable por

tripsina.

El empleo de geles de poliacrilamida al 1 2% en presencia de

SDS permits identificar la presencia de cuatro bandas de protefna en la -

-ATPasa purificada, correspondiendo tres de ellas a las subunidades 0 6 ,

y descritas previamente como componentes propios de la enzima —

(319), y una cuarta banda a un nuevo componente no descrito hasta el mo

mento en la - ATPasa de M. Ivsodeikticus de movilidad relativa 0,01 +

0 , 0 1 (cinco determinaciones) (véase Pig. 1 0 ), correspondiente a un peso

molecular de 2 0 . 0 0 0 + 700 dalton (cinco determinaciones)( Pig. 11). L_a

utilizacion de reductores como D TT (364) no produce ningun cambio sus-

tancial en estos patrones electroforeticos.

La presencia constante de esta nueva cadena polipeplndica -

en todas las preparaciones de P^—ATPasa, con independencia de la ce-

pa A o B del microorganismo empleado para su aislamiento, parecen —

identificarla como una subunidad intrfhseca de la enzima. Este nuevo com

ponente puede equipararse con la subunidad 6 de otros factores P de —

acoplamiento, tanto desde el pun to de vista funcional como de su talla mo

lecular (véase Discusién) ,

De esta manera, la estructura cuaternaria de este factor —

de acoplamiento BP^ se encuentra constitufda por cuatro tipos de subuni

dades denomînadas: ^ y & con pesos moleculares aproximados de —

55.000,50.000,35.000 y 20,000 dalton respectivamente, calculado s en —

los sistemas de poliacrilamida en presencia de SDS (344) con las limita-

ciones inherentes a este método (177,178,345,382).

Por otra parle, ademas de los cuatro componentes menciona

dos, en el patrén electroforético del factor BP^ en presencia de SDS —

véase Pig. 10) se puede apreciar la presencia de otros dos polipéptidos

debiImente tehîdos, uno de ellos denominado f i’ (peso molecular aproximado

de 47,000 dalton ) y otro que migra junto con el colorante marcador ,------

- 1 0 3 -

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0.2

0.1

;3log P m X 10

20

PIGURA 11,- Represeniacion del logaritmo del peso molecular frente a

movilîdad relativa en electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en -

presencia de SDS 0,1 % de varios patrones de peso molecular conocido:

( a ) , ribonucleasa (p.m. 13.700 dalton ); (O) , lisozima(p.m . 14,500

dalton ), ( # ), inhibidor de tripsina de soja (p.m. 22.700 dalton );

{ ■ ), tripsina (p.m. 23-000 dalton ) ; y ( A ) pepsina (p.m. 35.000

dalton ) .

- 1 0 5 -

(movilidad relativa de 1,0 ; correspondiente a un peso molecular maxi-

mo de 1 3 . 0 0 0 dalton ) , Sin embargo la variabilidad en su presencia y/o

contenido de preparacion a preparacion parece sugerir que no conslituyen

componentes intrinsecos del factor BFj . Por el contrario, el hecho de -

que su presencia se vea favorecida por el envejecimiento de la enzima -

parece îndicar que provienen de procesos degradativos sobre las subun[

dades de mayor talla molecular.

3.1.3 Relaciôn estequiométrîca de subunidades .

La medida de las intensidades de cada una de las bandas

( éreas bajo los picos en los perfiles densitométricos ) obtenidas despues -

de analizar distintas preparaciones de -ATPasa en geles con SDS, —

permile realizar un calcule aproximado de la proporciôn relativa en que -

las distintas subunidades se encuenfran en la proteina. Los resultados de

estas estimaciones se muestran en la Tabla XII, aprecî^ndose una gran -

variabilidad en lo que respecta al contenido en subunidad . En la mayo-

rfa de las preparaciones se encuentra una molécula de é por molécula —

de comple jo ^ g j K » considerado previamente como el complejo intrinse-

co de la enzima ( 3 1 9 ) , sin embargo se obtienen preparaciones contenien

do dos copias de subunidad « ( Tabla XII). De este modo, en principîo se

podrîa formular una eslequiometrîa ^ 3 1^3 * 2 las que -

si los pesos moleculares de las Subunidades y del factor 8P^ calculados-

son correctes , se obtendrfan pesos moleculares de 3 7 0 . 0 0 0 6 3 9 0 , 0 0 0 -

dalton respectivamente, compatibles con la talla molecular de 3 4 5 . 0 0 0 —

4 0 0 , 0 0 0 dalton determînad previamente ( 3 1 9 , 3 3 9 ) .

- 1 0 6 -

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3.2. ANTIGENICIDAD DE EA ENZIMA

F^-ATRasa Y SUS SUBUNIDADES

- 1 0 8 -

3 . 2 . 1 . C a r a c t e r i z a c i o n d e a n t î s u e r o s .

Las figuras 12 y 13 rriuestran los experimenlos inmunologi -

COS en los que se pone de manifiesto la antigenicidad de la enzîma puH

ficada de M. lysodeikticus forma A, asi como de sus subunidades oC ,

y ^ aisladas en presencia de urea (véase Matertales y Métodos) . -

En la figura 12 A se observa la presencia de una ünica banda de pre

cipitacion por difusion de la F^-ATPasa contra su antisuero. De igual

modo, la enzîma compléta reacciona con los antîsueros obtenîdos trente

a las subunidades y (3 (véase Fig. 12 B) , los cuales no presentan-

reaccion cruzada entre si (véase Fig. 13 A y 13 B ) , Estas très sub

unidades reaccionan con suero anti-( —ATPasa) y con sus respect! -

vos antîsueros (Figs. 13 A y 13 B) , lo que indica que los determinan

tes antigénicosde las subunidades se exprès an en el conjunto de la enzi_

ma. También merece comentario la mayor movilidad hacia el anodo de

la subunidad ^ respecte a la subunîdad oi , lo que refleja las dîferencias

existantes entre ambas subunidades en cuanto a la relacion entre aminoâ

cidos basicos y écidos de cada una de ellas (320).

Por otra parte, la antigenicidad del factor BF aislado de -

M . lysodeikticus forma B ha si do previamente pues ta de manifiesto, asi

como el diferente comporlamiento de las dos formas de F^-ATPasa pi^

ri ficadas de las subcepas de M. lysodeikticus A y B (33 1 ,332) , debido

al gran polimorfismo de la molécula F^-ATPasa de cada forma (332).

Esta microheterogeneidad de la enzima parece ser consecuencia de su

inestabilidad, basada en la labilidad de sus subunidades (164,3 20,330)

y repercute en su comportamiento como antigeno e inmunégeno (332).

Eslos resultados corroboran la antigenicidad del factor BF -

aislado de M . lysodeikticus descri ta con anterioridad (152, 336), a la

vez que demuestran por primera vez la antigenicidad de las subunidades

de este factor. Ademâs, esta es la primera demostraciôn de que las subu

nidades aisladas en presencia de urea son antigénicas ya que en estudios

(a)

- 1 0 9 -

i d

12)

(3)

('■n

FIC5L4RA 12.- Reactividad y especificidad de los aniicuerpos preparados

(renie a P^-AT~Pasa de M. lysodeikticus y sus subunidades (X: , ^ y ^ .( A) Los experimenlos de inmunodifusion muestran la reaccion de -

suero anti-( P —ATPasa) con la holoenzima. Pocillo central, 35 yjg

de Pj-ATPasa purificada. Pocillos externos, diluciones de suero

anti-(P^-ATPasa) ; ( 1 ) , sin diluir; (2), 1/5; (3) L 10; (4), 1/20;

(5), 1/40; (6), 1/80. (B) Inmunoeleclroforesis de P -ATPasa -

frente a sueros anti - ( P - ATPasa) y anti- ( subunidades (X y ^ ) . -

Mueslras de P -ATPasa (20 ^g) se introdujeron en el pocillo ( 1 ) ;

los canales longitudinales contenian 150 ^1 de los sueros siguientes:

I, anti-( P -ATPasa ) , II, anti- (subunidad <X ) ', Ml, anti-( subunidad

|3i ) ; pero en la mezcia de sueros anti-(subunidad <X ) y anti-(sub

unidad p> ) se utilizaron 75 yul de cada suero.

- 1 l o

ta)

(b)

FIC3URA 1 3 .- Reaclividad y especificidad de los aniicuerpos prepa

rados frente a -A T P a s a de M . lysodeikticus y sus subunidades

OC » ^ y % • (A ) Inmunoeleclroforesis de las subunidades 0( y aig

ladas frente a suero a n ti-(P ^ -A T P a s a ) (1). L_as mueslras de ca

da subunidad contenian 30 de protefna; los canales longitudinales

contenian 150 ^1 de suero (B ) Inmunoeleclroforesis de las subunida

des Od , y aisladas frente a sus antîsueros (II, anti-(X ; I I I ,

anti- ; IV , anti- ^ ) . L as mueslras de cada subunidad conte -

nian 30 yug de proteina, excepto en las mezclas de las subunidades

oC + ^ (15 p g cada una); los canales longitudinales contenian 150 yul

de cada suero .

- 1 1 1 -

previos con -ATPasa aislada de cloroplastos y E .col! . se utilizaron

como antigenos los complejos subunidad-SDS (196,197) y mas reciente

menie en el factor BE^ de la bacteria termofila PS3, las subunidades -

se aislaron en presencia de clorhidrato de guanidina (153),

Las propiedades inrnunologicas de la subunidad i no ban po-

dido ser estudiadas debido a que hasta el memento actual se carece de

un método de purificacion de dicha subunidad que preserve sus propieda

des antigénicas. El %aislamiento de la subunidad é> por electrolorésis en

gel de poliacrilamida en presencia de SDS conduce a una pérdida o carnbio

de sus propiedades inrnunologicas.

3.2.2. Titulo de los sueros.

La figura 14 i lustra los tilulos de los distintos antisueros : -

1/12.000 para anti—( P -A TPasa ) , 1/6.400 para anti-( subunidad o/ ) ,

1/3.200 para anti-(subunidad (3 ) y 1/200 para anti-( subunidad ) . -

Por otra parte, el tîtulo del suero anti-( P -ATPasa) catculado al emplear1 25

su propio antigeno marcado con I asi como sus subunidades (Pig. 15)r 1 25 r125résulta ser de 1/12.000 con 1 P -ATPasa, 1/1.600 con I sub

r1251 [125 1unidad , 1 / 6.400 con I subunidad p y 1/800 I j subunidad y .

GiOPOT!-

- 1 1 2 -

100

90

00*I 70-

60

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1It'

40

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1/2048 1/01921/32 1/128 1/5121/2 1/8

Dllucl6 n

B

1/32 1/128

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30

20

1/2 1/8 1/128 1/512

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D

1/2 LB 1/512_ 1/32 1/128

OIIucl6n

f^lCURA 14.- Titulaclon de sueros: (A j , anlI-(F'^-ATPssa) Iron

ie a P j-A TP asa; (B) , ami-(subunidad (X ) Irenle ^ ]

subunidad oC ; (C) , anti-(subunidad ) irenle a J subunidad

(7i ; (D) , anii-(subunidad ^ ) Irenle a IJ subunidad ^ (ccndi-

ciones en Maleriales y Métodos).

- 1 1 3 -

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«120

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1/32 1/128 1/512

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B

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c

T— '1 1

o

1 1 1 1 1. 11/2 1/8 1/32 1/128

Dlluciôn

1/512

FIGURA I 5 Tîtulo del suero anli-( F^-ATRasa) medido frente a

^ 1 J s u b u n id a d Od ( A ) , J s u b u n îd a d |3> ( B ) y P Js u b u n id a d ( C ) .

119

3 .3 . RADIOINMUNOENSAYO DE -ATPasa

Y SUS SUBUNIDADES. INFLUENCIA

DE LAS s u b u n id a d e s Y

SOBRE LAS PROPIEDADES INMUNO

QUIMIOAS DE LA ENZIMA,

-1 1 5 -

3,3.1. Marcaje y estado molecular de la molécula -ATPasa y de

sus subunidades od . fi y K .

La enzima F -ATPasa asi como sus subunidades o(, ^ y-1 25

^ aisladas en presencia de urea se marcaron con I mediante una

modificacion del mélodo conocido como de la cloramina T (véase Mate_

riales y Métodos) . Un inconveniente que suscité esta técnica de marca

je radicaba en la formacion de agregados durante el proceso de iodoni

zaclôn (compàrense Figs. 16 y 17). Esta dificultad fué facilmente sub-

sanable mediante la adicion del detergents no ionico Triton X-100 al

0,1%, a la mezcia de reaccion y al tampon del gel (Figs. 18 y 19). -

Las proteînas marcadas (enzima compléta y subunidades y ^ ) se co

rrieron en geles de poliacrilamida en condiciones nativas obteniéndose

los resultados mostrados en las figuras 19,20 y 22. Simultaneamente ,

se corrieron las mîsmas proteinas sin marcar en geles de poliacrilamj_

da de idéntica composiciôn a los anteriormente cilados, obteniéndose los

perliles densitométricos ilustrados en las figuras 10 y 21. La perfecta

correspondencia existente entre los per fi les oblenidos en las electrofore

sis de la proteina "fria" y marcada, indica la presencia de una ûnica -

especie molecular y la ausencia de cambios en el estado molecular y en

la movilidad relativa de la molécula F - ATPasa y de cuaIquiera de sus

subunidades después del proceso de marcaje con iodo. La subunidad oL no se teriia con Coomassie P250 cuando se realizaba una electroforesis

en gel de poliacrilamida en condiciones no disociantes y en presencia -

de Triton X-100 al 0,1%.

También fué examinado el estado molecular de la proteina

F^-ATPasa asi como et de sus subunidades y ^ después del mar

caje mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% en presencia

de SDS (Fig. 23) mosirandose de nuevo la preservacion de su integrd

dad molecular.

- 1 1 6 -

Ecin

<

0.2Movilidad rcictiva

FIGURA 16,- Electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% de F^-

ATPasa purificada ( aprox. 20 yjg) (condiciones en Materiales y Mé

todos) .

- 1 1 7 -

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1.000.41

Movilidad relativaFIGURAIS.- Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% en p re

sencia de Triton X-tOO 0,1% de R^-ATPasa purificada {aprox. 20

/jg) (condiciones en Materiales y Métodos) .

-1 1 9 -

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- 1 2 0 -

MOVILIDAO RELATIVA

too0.41

4-

3-Sau

2-

9070 806030 30 40 SO10NUMERO DE ROOAiA

FIGURA 20.- Electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% en pre

sencia de Triton X-100 al 0,1% de ^ 1 J subunidad CX (condicio

nes en Materiales y Métodos) .

— 1 21 —

EcinNm

<

0.35 1.00

Movilidad relative

RIC3LJRA 2 K — Rlec(roforesis en gef de poliacrilamida al 7% en pre

sencia de Triton X-100 al 0,1% de aproximadamente 30 de subu

nidad (condiciones en Maleriales y Métodos) .

-1 2 2 -

Movilidad relativa0.31 1.00

QX

Eexo

'ysi V»4 0 5 0 7 0 8 030 6 010 20

Numéro de rodoja

F1GURA22.- Electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% en pre -

sencia de Triton X-100 al 0, 1% de J subunidad |3 (condicio

nes en Materiales y Métodos) .

•1 23-

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-1 2 4 -

Las radiactivldades especîficas de las diferentes subunidades

oC » ^ résultaron ser de 1,23; 1,35 y 4,5 mCi/pmol respective -

mente mientras que la molécula de -ATPasa posefa una radiactividad

especifica de 260 ^Ci/^mol en condiciones no disociantes, pero en pre

sencia de Triton X-100, necesario para aumentar la eficiencia del mar

caje y la dispersion molecular de la enzima.

3.3.2. Radioinmunoensayo de -ATPasa.

La curva esténdar para el radioinmunoensayo de la enzima

compléta se muestra en la figura 24, a si como la influencia de las sub

unidades y Y sobre el porcentaje de ^^1J P^-ATPasa uni do

los anticuerpos anti-{ P^-ATPasa) . Como puede ap^eciarse, una inhibi.

cion del 30% en la union antigeno marcado-anticuerpo se obtiene al ana

dir 22 ng de P-ATPasa , 220 ng de subunîdad ^ (10% de competîcion) ,

460 ng de subunidad oC (4,8% de competicîon) y 625 ng de subunidad ^

(3,5% de competîcion), lo que en bases molares implica que la sensibi

lidad de la reaccion entre los anticuerpos anti- ( P^ -ATPasa ) y la molé

eu la de P^-ATPasa résulta ser 100 veces mayor que aquella de las -

subunidades y ^ , y més de 500 veces que la correspondiente a la

subunidad ^ . Estos resultados parecen sugerir la exislencia de un efeç

to cooperativo en las propiedades înmunogénicas de las subunidades en

la enzima compléta y/o de déterminantes antigénicos conformacionales -

inducldos por la macromolécula P^-ATPasa en su conjunto.

Las sensibi lldades del ensayo résulta ron ser de 3 ng para

P - ATPasa, 20 ng para la subunidad ^ , 55 ng para la subunidad oC y

65 ng para la subunidad 1 , mientras que los limites superiores dei en

sayo fueron de 1 ,000 ng para P -ATPasa y de 10.000 ng para cada

una de sus subunidades- Por otra parte, las pendientes de las curves

obtenidas difieren significativamente, pero no como consecuencia de sim

pies efectos de dilucion.

- 1 2 5 -

-g 100 - c301

•o*— A—;

Lu 5 0

o

0 00110 0.1 0.01

pg ligando

PIGURA 24.- Radioinmunoensayo de la enzima -ATPasa de -

M. Ivsodeiktiçuis y competicîon de sus subunidades ex; , y (con

diciones en Materiales y Métodos) . Los resultados se exprès an como

porcentaje de J P -ATPasa unida a suero anti-( P^-ATPasa) ,

f O O) , P - ATPasa ; ( A A ) , subunidad (X ; ( O O ) ,

subunidad ; (A 0 ) , subunidad .

- 1 2 6 -

3.3.3. Radioinmunoensayo de las subunidades (X. (3 v .

Se estudio el e fee to de la enzima -ATPasa y sus subum

dades sobre la union de ^^ijsubunidad oL , J subunîdad (3 ysubunidad ^ al suero anti-( P^-ATPasa) con el fin de establecer simi

litudes y dîferencias entre las subunidades od , ^ y ^ (véase Pig. 25) .

En estas gréficas es notoria la dîsparidad existente entre las pendien -

tes de las curvas, particularmento entre aquellas correspondientes a las

subunidades Od y (véanse Pig, 25a y 25c). También es de destacar

el comportamiento înmunologfco intermedio entre od y |3 que présenta la

subunidad (véanse Pigs. 25a y 25b, y también Pig. 24), except o en

el caso representado en la figura 25c, en el que la subunidad ^ se mues

tra como el cornponente mas efectivo en el desplazamiento de sub

unidad ^ del anticuerpo. La posible contaminacion de la subunidad ^ por

parte de la subunidad OL parece exc lu i da por el hecho de que a concen_

traciones pequenas, la adicion de subunidad ^ inhibfa en mayor grado

la union de subunidad cL a sus respectives anticuerpos que la ad[

cion de la propia subunidad qL (véase Pig. 25a) , siendo logico pens a r

que un contaminante nunca séria mas efectivo que el propio componente

puro.

Por su parte, el comportamiento inmunologîco de las subuni_

dades y ^ es muy diferente, pareciendo por lo tanto obvia la aseve-

racion de que las subunidades mayoritarias de la enzima P^-ATPasa -

poseen una idenlidad propia, muy diferenciadas entre si por métodos in

munoquimicos como ya podrîa sugerirse de los resultados obtenidos por

inmunoelectroforesis (véase apartado 3 .2 .).

3.3.4. Reconstitucion de las propiedades antigénicas de la molécula de

P^-ATPasa a partir de sus componentes polîpeptidicos.

Los resultados obtenidos al intentar reconstituir las propie -

- 1 2 7 -

o

opwn ?>poptunqns[|^^ ] % opiun^popiunqns[i ] % opiun ^ popmnqns [| ] %

3

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21 • d)2e>,

— 1 2 0 —

dades antigénicas de la molécula de -ATPasa a partir de sus subu

nidades se ilustran en la figura 26 y la Tabla XIII, en las que se apre

cia la influencia de diferentes combinacîones de subunidades sobre el

radioinmunoensayo de la P -ATPasa ,

I—a tîlulaciôn de una solucion de subunidad (7,36 ^g en 2

^l) con cantidades crecienles de subunidad oL , producfa cambios pro -

gresivos en la pendiente de la curva, aproximàndose ésta al valor co -

rrespondiente de la P -ATPasa ( “ 1,57 , n =1, n = -

0,89, n ^ = 0,92) a medîda que la relacion molar se aproximaba a 1:1

(7,12 yjg de subunidad cL). Asf, el empleo de cantidades equinr.clecula

res de y |5 daba lugar a una curva cuya pendiente era muy semejan -

le a la propia de P^-ATPasa (véase Pig. 26) con una competicîon del

35% (Tabla XIII) . Este resultado indica una reconstitucion parcial de las

propiedades inmunologicas de la molécula de P^-ATPasa de M. Ivsodeik-

ticus, al mîsmo tiempo que apoya la idea de considérer a ta subunidad

^ como un components intrinseco de la enzima con îdentidad propia. Si

la preparaciôn de la subunidad ^ poseyera una fuerte contaminacion por

parte de las subunidades oC. y ^ se obtendria un grado de competîcion -

analogo entre el components ^ y la mezcia sobre la union de

ATPasa a suero anti-(P^-ATPasa) , Como puede apreciar_

se existe una diferencia notable (Tabla XIII): subunidad , 10% de com

peticién y mezcia (X. + , 35% de competiciôn.

Por otra parte, un anélisis cuantitativo de los datos repre -

sentados en la figura 26 indica que el desplazamiento del 100% de ^^1J

P -ATPasa por parte de las subunidades mayoritarias od + f? se obtie

ns con la adicion de 350-400 ng de la mezcia equimolecular y el 50% -

de desplazamiento con 40 ng de la misma, Teniendo en cuenta que el

peso molecular medio de las subunidades mayoritarias oscila alrededor

de 60.000 dalton , puede estimarse que en estas condiciones se hallan

- 1 2 9 -

100o-gc3OWîaCLI -<

5 0ü_

lO

P

10 0.1 0.01 0.001

pg ligando

RIGURA 26,- Efecto de dislintas combinacîones de subunidades Od ,

p) y ^ sobre la union de ^ J R^-ATPasa a suero anti - ( R -

ATPasa). ( O O) , R^-ATPasa; (A A ) , subunidad OC(O — Q) , subunidad , se muestran como contrôles, ( — lS) , >X+ ( razon molar, 1:1); (<^ <^) , o( + ^ + ^ ( proporcion molar,

3:3:2) (condiciones en Materiales y Métodos).

- 1 3 0 -

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1

- 1 3 1-

presentes seis copias de dichas subunidades, lo que lavorecen'a una -

eslequiomelria del tipo para la molécula de F -ATPasa, ya -

que las subunidades se anadieron en proporciones equimoleculares.

Estas observaciones ponen do manifiesto la reconstitucion de

las propiedades inmunoquimicas del factor de M. lysodeikticus . La

adicion de subunidad ^ a la mezcia CkC + jB aumenlaba este grado de re

constitue ion , el cual encontraba su méximo con la adicion de las 1res -

subunidades , (i y en una relacion molar de 3:3:2 (véase Tabla -

XIII y Fig, 26) , dando lugar a una curva con pendiente similar a la de

F^ -ATPasa y con un 57,4% de competicîon.

Estos resultados apoyan una eslequiometria en subunidades -

del lipo (X ^ ^ 2 ’ concordancia con la propues ta recientemente -

para la F - ATPasa de M. lysodeikticus (365) mediante experiencias -

con agentes entrecruzantes. Ademas, estos experimentos resaltan una -

conlribucion a tas propiedades antigénicas de la enzima debida a la in -

teraccion entre las propias subunidades, lo que sugerîria la presencia-

de déterminantes antigénicos, probablemente conformacionales, originados

del plegamiento y ensamblaje de las subunidades en la molécula de

F^ -ATPasa.

Resultados similares se obluvieron al e fee tu a r radioinmunoen-

sayos com piemen tari os con las diferentes subunidades, segùn se ilustra

en la figura 27 para las subunidades oé y ^ .El tilulo tai bajo que exhi -

L'ia el suero a n t i-(subunidad ) (véase apartado 3.2.) dificultaba la -

comparaciôn en términos cuantitativos del radioinmunoensayo de esta sub

unidad a causa del desplazamiento hacia ta derecha de las curvas. Es

tos experimentos muestran como cabia esperar, que la enzima F - ATP

asa compile hasta un 100% con cada suero anti-subunidad. En concordan

cia con lo expuesto anteriormente, la subunidad ^ mostraba un compor

tamiento intermedio entre las subunidades p y cX , si bien mas proximo

a esta ultima. Por otra parte y segun se deduce de la figura 25, la en-

- 1 3 2 -

100

50

too

c£L

50

0O01OOttoyg tigando

PIGURA 27.- Radioinmunoensayo de la subunidad oi (a) y de la sub-

unidad (3, (b) del factor BPj de M. lygodeikticus , mostrando las com-

petictones de la enzitna Fj -ATRasa purificada y de sus très subunida

des de mayor talla molecular. Los resultados se expresan como por

cenfajes de subunidad 06 o subunidad |i unidas a sus res

pecfivos antisueros.O , Pj -AT Rasa ; A , subunidad Od ; Q , subunidad

, subunidad ^

- 1 3 3 -

zima R^-ATPasa es capaz de cornpotir un 300% con la subt-inidad ct , un 150% con la subunidad ^ y un 400-500% con la subunidad [3 , ajos_

tandose a la eslequiomelria y caracleristicas inrnuno logic as descrilas an

(eriormente.

T odas estas experiencias se habrîan vis to completadas con -

la inlroduccion de la subunidad 6 en las mismas, sin embargo, en la -

aclualidad, el unido método de aislamiento de este componente a partir

del factor BR^ de M . lysodeikticus reside en el empleo de electro lore -

sis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, jo que conlleva una

pérdida o modi ficacion de las propiedades inmuno logic as de la subuni -

dad 6 (véase apartado 3.2.) , ya que no se observa ningün lipo de in

munoprecîpitacion al incubar dicho compcnenle con suero anti- ( R -ATP

asa) a distinias diluciones (desde 1/2 has la f/25.600).

Es bien conocido que el detergenfe anionico SDS se une -

fuertemente a las proteinas para formar un complejo ; olubie, rigido y

asimétrico (367,360) , La eliminacién compléta de SDS de estos com-

plejos es muy difîcil de conseguir. Asi el empleo de diâlisis de equili -

brio, método seguido en nuestro caso, requiere varios dias para alcan

zar razones molares de 1:1 (369,370). Han sîdo descritos ofros métq

dos de eliminacién del delergente mas efectivos (370-373), sin embar

go aclualmente se esta intentando aislar esta subunidad 6 a partir de la

R^-ATPasa purificada de M. Ivsodikticus por medio de técnicas que no

necesiten ta accion de delergentes (véase aparlado 3 .3 .).

3,4. PAPEL DE LAS SUBUNIDADES

DE E^-ATPasa EN LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA,

- 1 3 5 -

3.4.1. Dos aproximaciones expérimentales para afrontar un mismo pro-

blema.

El estudio de las subunidades responsables de la actividad en

zimética de los fac fores R puede ser abordado desde dislin las aproxi -

madones expérimentales (véase apartado 1.7.3.) , pero quizas la mas

concluyenle sea la reconstifucion de las propiedades calaliticas de la en_

zima a partir de sus subunidades consliluyentes. En el factor DR de -

M. lysodeikticus estos estudios de reconstitucion se han vis to dificultados

por el h echo de que las subunidades de esta enzima no pueden disociaq

se a menos que se utilicen condiciones totafmente desnaturalizanles (I64,

3 3 9 ) . Por lo lanto el présente trabajo aborda et problema de un modo

indirecte, medianle la aplicacion de: a ) digestiones controladas de la en

zima con tripsina, correlacionando la degradacion progresiva de las dis

tintas subunidades con la disminucion en actividad ATPâsica; y b) incu_

baciôn de la enzima con distintos antisueros obtenidos trente a la moiécu

la R^-ATPasa compléta y frente a sus subunidades consliluyentes.

3.4.2. Efecto de distintos antisueros sobre la actividad ATPésica de la

enzima purificada.

l—a figura 20 ilustra el efecto de los distintos aniîcuerpos sobre

la actividad ATPâsica de la enzima purificada, Como se puede apreciar

el suero anii-{ R - A TPasa ) inhibe totalmenfè la actividad enzimética, lo

que contrasta con la accion de los restantes sueros anti-subunidados.

Tan solo y muy ligeramente el suero anti-(subunidad ^ ) ejerce un lige-

ro poder inhibitorio .

Los resultados obtenidos incubando la enzirr a R^-ATPasa con

combinaciones de diferentes anticuerpos se muestran en la figura 29. Se

logra una inhibicion de hasta el 50% de la actividad enzimética con una

combinacion de sueros anti-( subunidad ) y anti - ( sutiunidad 06 ) o anti -

(subunidad ^ ) y anti-(subunidad ^ ) , sin que este efecto inhibitorio se

- 1 3 6 -

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a Suero a n t i—ATPasa

A Suero a n t i— ût

FIGURA 20.- Efecto de distintos antisueros sobre la actividad ATRé-

sica del factor BF de M. lysodeikticus (condiciones en Materiales

y Métodos ) .

- 1 3 7 -

M 100 Control

8 0CL

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20

20 4 0 6 0 8 0 100 120 140 160/xt suero

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FIGLiRA 29.- Efeclo de distintas combinaciones de sueros anti-sub

unidades sobre la actividad ATPâsica del factor BP^ de M. Ivsodeik-

licus (condiciones en Materiales y Métodos).

- 1 3 8 -

incremente al incubar la enzima con una mezcia de los 1res sueros

anti- subunidades. L_a combinacion de sueros anti-{subunidad od ) y anjl

(subunidad ^ ) no muestra ningün efecto.

3.4.3. Sensibilidad a tripsina de la enzima purificada. Su efecto sobre

la actividad enzimética.

L_a incubacion del factor con tripsina provoca un descen

so gradual en la actividad ATPésica a partir de los 10 primeros minu

tes (véase Fig- 30) hasta alcanzar un valor aproximado de un 50% del

valor original al cabo de unos 50 minutos. Una incubacion con la pro-

teasa durante otro periodo de 2 h no modifica sustancialmente el 40% -

de actividad catalitica residual. Este hecho confirma la presencia de un

nücleo catalftico en la P^-ATPasa de M. lysodeikticus resistente a la -

digestion trfplica como parecfa sugerirse del trabajo previo realizado con

otras formas activas de la enzima(323). En este contexte, merece aten

cion el hecho de que se observe una ligera activacion de la enzima -

(véase Pig. 31) medianle incubacion a 37®U de la misma en ausencia -

de la enzima proteolîtica (expérimentes control) .

A fin de correlacionar estos cambios en la actividad con mo

dîficaciones en la estructura de la enzima, se sometieron muestras di-

geridas a diferentes liempos con tripsina a electroforesis en gel de polia

crilamida en presencia de SDS o urea. El empleo del delergente anioni

co permitfa obtener una gran résolue!on en los componentes minorîtarios

mientras que con urea se lograba una mejor separaciôn entre los corn

ponentes mayoritarios de enzima.

t_a figura 32 A îlustra los experimentos en los sistemas con

SDS, mostrando que la digestion de la subunidad ^ y el desplazamiento

de la subunidad hacia la movilidad cor respond! en te a no se relacio

nan con la pérdida de actividad enzimética (compérense Pigs. 30 y 32).

Por su parte, en la figura 32 B se aprecian los perfiles densiiométricos

- 1 3 9 -

- 100

*o

80

60

40

20

4 0 8 0 120 160 200Tiempo de incubacion (min)

P1G01RA 30.- Efecto de tripsina sobre ia actividad ATPésica del

factor (% referidos a actividad en contrôles, incubados en idéri_

fleas condiciones pero sin pro te asa ) . Las Incubaciones se llevaron a

cabo a 372C, Relacion -ATPasa/tripsina de 20/1 (condiciones en

Materiales y Métodos) .

- T 4 0 .

XI

ex

(uîui/jojdBiu/^ lomri) DOisojix/ popiAiio ^

(uiui/j0jd 6iju/\jicuji1) DOisDdxv popiAiiov

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9 0 min.

30 min.

30 min.

EcICta

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15min.

15 min.

Control Control

SD S UREAf-IQ U R A 3 2 .“ E lectro fores is en gel de poliacrilam ida al 7% en prc

sencia de S D S 0, I?» (A | y en presencia de urea QM (O) de R^

ATPasa ( aprox. 40 ^q ) traïada con tripsina a difer-entes liempos

de incubacion (condiciones en M.ateriales y iVIétodos) .

- 1 4 2 -

de los sistemas conteniendo urea, los cuales muestran claramente la -

progresiva destruccion de la subunidad 06 y la relaliva resistencia de la

subunidad durante la digestion de -ATPasa con tripsina. En ambos

sistemas es posible identificar la presencia de componentes derivados de

la degradacion de las subunidades, tales como, |3 ' (Pig. 3 2 A) y "x"

e "y " (Pig. 32 B) , que permanecen practicamente inalterados a través

del proceso de digestion de la enzima, Lin analisis cuantitativo de estos

resultados se muestra en las Tablas XIV y XV, siendo especialmente

inferesante esta ultima en la que se aprecîa que la actividad ATPésica

residual mantlene una estrecha correlaclon con el porcentaje residual -

de 0 + (? , en general, y con a quel de la subunidad , en particular.

Sin embargo, dicha correlaclon no se observa con la cantidad présente

de subunidad ^ ( Tabla XV ) , aunque no puede ser tolalmente descarta-

do un requerimiento de pequenas cantidades de esta subunidad para el

mantenimiento de una estructura funcionalmente activa.

Por otra parte estos resultados ponen de manifiesto el diferen

le comporfamiento frente a la accion proteolîtica de la P -ATPasa for

ma A de M. lysodeikticus con respecto a aquel correspondiente a la -

forma B de la enzima (323,331) y a la P^-ATPasa de Streptococcus

faecalis (366) .

3.4.4. Aislamiento de distintas formas de P - ATPasa obtenidas por di

gestion con tripsina.

El analisis electroforético en geles de poliacrilamida al 7% en

condiciones nativas de la P^-ATPasa digerida por tripsina se muestra

en la figura 33. La accion de la enzima proteolîtica sobre el factor BP,

induce la aparîcion de cuatro bandas dîstintas de proteîna de movilidades

relatives: 0,34, 0,59, 0,86, 1,00, las cuales presentan una intensidad

variable, dependîente del tiempo de accion de la tripsina sobre la P -

ATPasa. De esta forma, a medida que el tiempo de incubacion aumen

-1 4 3 -

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- 1 4 5 -

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<t

0,34

M ovilidod relotivo

f—IGURA 33.- Electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% de : (

parte superior) , -ATPasa (aprox. 40 yjg) sin tratar con tripsina

(lincion de proteina); (A, parte inferior) , R -ATPasa (aprox. 40

^g) sin tratar con tripsina ( tincion enzimética); ( E3, parte superior) ,

R j-ATPasa (aprox. 40 yug) tratada con tripsina durante 30 min a

379C (tincion de proteina) ; (B, parte inferior) , R^-ATPasa (aprox,

40 jg) tratada con tripsina durante 30 min a 3790 (tincion enzimé

tica) . Relacion R^-ATPasa/tripsina de 20/ 1 (condiciones en Materia

les y Métodos) .

— 1 4 6 —

ta, se observa un incremento en la intensidad de las bandas de mayor

movilidad relative, lo que sugiere que la fraccion més lenta es digerida

en dichos componentes. Ademas, al hecho de que no se obtenga en las

digestiones realizadas ntngùn componente de movilidad electroiorética i-

déntica a aquella de la proteina sin tratar, indica que la enzima nativa

es transformada sin pasos intermedios en los cuatro componentes cita-

dos. De estos, tan solo el correspondiente a movilidad relative 0,34 -

muestra actividad ATPésica (Pig. 33 B) .

En un intente adicional de définir el papel jugado por las -

distintas subunidades en la actividad enzimética de la -ATPasa de -

M. lysodeikticus , se aislan distintas formas de proteina des pues de su

tratamiento con tripsina. l_a figura 34 y la Tabla XVI resumen las pro

piedades de los principales componentes obtenidos tras una digestion de

30 min de P^-ATPasa con tripsina:

-a) Banda de movilidad relaliva 0,34 (Banda activa).- Esta

banda da cuenta del 47,5% de la proteina tehida en el gel y posee una

actividad especifica 2,5 veces mayor que la actividad original de la Pj~

ATPasa nativa, con lo que se sugiere una purificacion del nücleo acti

ve de la enzima. Un anélisis de la composiciôn de esta forma activa -

(figura 34 B) permite conocer la presencia mayoritaria de la subunidad

^ , junto a una cierta proporcion de oC' (proveniente de una reduce ion

de unos 2.000 6 3.000 dalton en la talla molecular de OC ) , asi como

también de una exigua cantidad de ' y ^ (Tabla XVI),

-b) Banda de movilidad relativa 0,59 (Banda inacliva).- Esta

banda représenta el 14,3% de la proteina tehida, no posee actividad

ATPésica y su subestructura se limita a la presencia de los componen

tes : oc ' , (î y j i ' en las proporciones descrilas en la Tabla XVI.

-c) Banda de movilidad relativa 1,00 (Banda inactiva) .-Esta

banda constituye el 26,3% de la proteina tehida estando consti tuida exclu

sivamente por un componente de unos 10.000-13.000 dalton de peso

- 1 4 7 -

inMlO

<0.570 4Z 0.-1/

MOVILIDAD RELATIVAf ^ I G U r î A - A n d l i f ? is p o r e l e c t r o l o r o s is on gel d o [ p o l ia c r i la m i d a al

12% e n p r e s e n c i a do S 0 3 0 , 1% do d i s t i n i a s Inrmas do Bl^^ a i s la -

d a s p o r p a g e a e s c a l o m i c r o - p r e p a r e l i v a I r a s u n a diqesIicSn c o n -

t r i p s i n a ( v é a s e E i g . d J ) . ( A ) E - A T P a s a p u r i l i c a d a ( a p r o x . 4 0

^ ig ) s in t r a t a r c o n t r i p s i n a ( c o m p o n e n t e d e m o v i l i d a d i m l a t iv a 0 , 0 3

e n la E i g . 33 A ) ; ( B ) B a n d a d e m o v i l i d a d r e l a t i v a 0 , 3 4 en la E i g .

3 3 13; (c) B a n d a d e m o v i l i d a d r e l a t i v a d e 0 , 5 9 e n la E i g . 3 3 B ;

( d ) B a n d a d e m o v i l i d a d r - p la l iv a d e 1 , 0 0 e n la E i g . 3 3 B ( c o n d i c i o

n é s en M a l e i ' i a l e s y l 'd é 'c d o s ) .

- 1 4 8 -

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- 1 4 9 -

molecular, lo quo parece indicar que provione de la digestion de las -

distintas subunidades. Este componente , cuya intensidad se incrementa

ai aumentar el tiempo de incubacion del factor BE^ con la enzima pro-

tcolilica, se comporta como el ultimo estadio molecular en la digestion -

de la E^-ATPasa,

De la comparacion de las proporciones de subunidades entre

las diferentes formas (Tabla XVI) puede concluirse que la subunidad ^

desempena el papel de subunidad esencial para la hidroHsis enzimética -

del ATP, si bien se requerirîa una cierta organizacion estructural do

la proteina para que se manifiesle esta accion catalitica. En este senti do,

la presencia de al menos una subunidad oL , aun algo rr adificada (se

ce referenda al componente denominado oé ’ ) , por cada 3 copias de sub

unidad , parece ser necesaria para lograr dicha estructura funcional

mente activa .Sobre esta base, un papel por parte de la subunidad ^ -

en la actividad ATPésica parece muy improbable. Por otra parte, estos

resultados demuestran que el componente denominado , que parece -

ser un producto de degradacion de la subunidad (X. , no esté implicado -

en la actividad A TPésica, Este componente ' suele presentarse en -

preparaciones de enzima donde la subunidad oL se encuentra parcialmen-

te dcgradada.

Los diferentes grados de digestion proteoliticas de las distin -

tas subunidades de E -ATPasa por tripsina se deben de considerar cq_

mo reflejo de la diferente accesibilidad de las mismas a la proteasa, ya

que la incubacion de las subunidades aisladas con tripsina conduce a una

degradacion total de dichas cadenas polipeptidicas a un componente de u -

nos 12.000-13.000 dation de peso molecular (véase Eig. 35).

-1 5 0 -

Peso molecular (xIO dolton )

55 50

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0.2

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L a .02

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0 20 0-10 oro 100

WovilidotJ lelulivO

R IC 3 U R A 3 5 . - Perfil densilométrico de electroforesis en gel de polia

crilamida al 12% en presencia de SDS 0, 1% de : ( A ) , subunidad o6

aislada (aprox, 40 yjg) (trazo coniînuo) y digerida con tripsna (ira

zo discontinue); ( B ), subunidad ^ aislada (aprox. 40 pg) ( r azo con

tinuo ) y digerida con tripsina (trazo discontinue) (condiciones en Ma

leriales y Métodos) .

3.5. irMMUNOQlJIMIC A DEL E AC TOR BE^

UNIDO A MEMBRANA.

— 1 5 2 “

3.5.1. Efecto de los sueros anti-( -ATPasa) sobre la actividad en-

zîmética del factor unido a membranas v purilicado.

I—os sueros anti-{P^-ATPasa, formas A y B) infiiben totaj

mente la actividad ATPésica asociada a membranas (véase Pig. 36) ,

mostréndose el antisuero preparado frente a P -ATPasa (forma A) co

mo el mas efectivo (compérense las partes I y II de la Pig. 36) . Este

hecho apoya la idea de que la forma A de la enzima présenta una na-

yor capacîdad inmunogénica que la respective forma B (332), lo que -

concuerda con la mayor establlldad de la forma A de la proteina y en

particular, con la de su subunidad (320,321) . Por otra parle la -

P -ATPasa forma A unida a membrana parece comportarse como un

mejor aniigeno que la correspondiente forma B, En la parte superior-

de la figura 36, también se observa que el suero anti-( P^-ATPasa -

forma A) présenta un comportamiento muy similar sobre la enzima uni

da a membranas y sobre la enzima purificada, correspondiéndose la ma

yor inhibicion en esta ultima con las diferentes cantidades de antigero -

(P^-ATPasa) présentes en los ensayos, a saber, 50 yug en el caso de

la enzima unida a membranas, asumiendo que este factor de acoplamîen

to représenta un 10% de la proteina de membrana (152) , y 10-20 en

el caso de la enzima purificada.

Estos resultados sugieren que la accion de los anticuerpos -

anti- ( P^-ATPasa) sobre la enzima asociada a membrana no se ve obs

tacullzada por impedimenlos estéricos o limitaciones de accesibilidad, a

la vez que indican que las moiécu las de P^-ATPasa se encuentran libre

mente expuestas a su antisuero. Las diferencias en el comportamiento -

de los antisueros preparados frente a las dos formas dîstintas de la pro

teina no parecen ser debidas a una simple consecuencia del tilulo de ca

da suero, sino mas bien reflejan las diferentes caracteristicas de, cada

forma de factor 8P^ como antigeno e inmunogeno.

- 1 5 3 -

50

50

3 0 0200100

suero (pl)

f - I G L J R A 3 6 . - E f p c l o d e lo s e n t i - ( - A T P r j s o , lo r tT^e'^ y P ) r-o

bre fci ncdviclcid ATPésîea osociodo a membran is de _M_. lysodoikHrys. ru

‘cepns A (1) y S (1(1, { ■*--------* ) . suero aod - { P - A TPnsa forma A);

(G , suero a n t i - ( - A ' l ' P a s O forma F3) ; O 1 , sucr'O eonirol.

l - a l i n c a d o I r a z o d i s c o n t i n u o ( — — A ) i l u s f r ' a e l e l o r i o r.fni % u r r o a r u j -

( P - A T P a s a l o r m o A ) so be r? la e n z i m a n u r i f i r a d a d o e s ta s u l ^ r o p c ( p o r - a

i i ( t e r i o r o ; j d o t a l l r s v e a s e M a i r ^ r i a l o s y M o i o d o s ) ,

- 1 5 4 -

3.5.2. Efecto de los sueros anti-subunidades sobre la actividad enzima-

tica del factor Bf== unido a membranas v purificado.

La figura 37 muestra el diferente comportamiento expresado

por los sueros anti-subunidades sobre la actividad ATPésica dependien_

do del estado Ksico en que se encuentre la enzima. Los sueros anti-(sub

unidad oC) y anti-(subunidad ) infiiben la actividad enzimética de la -

-ATPasa unida a membrana, mientras que esta permanece practica

mente inalterada cuando se trata con el factor BR^ solubilizado, como -

se pu do apreciar en el apartado 3.4. Por otra parte, merece una espe

cial significacion la fuerte inhibicion producida por el suero anti-(subuni-

dad oC ), ya que se ha mostrado en el apartado 3,4. una gran eviden -

cia en favor de ubicar el sitio catalftico en la subunidad (3 de la enzima.

A la luz de estos resultados parece deducirse que la inhibi -

cion de la actividad ATPésica unida a membrana por los sueros anti-

( R -ATPasa ) résulta de la superposicion e interaccion de los anticuer

pos anti-(subunidad oC) y anti - ( subunidad (5 ) présentes en dichos sue

ros. La Tabla XVII resume estos resultados, de los que se deduce que

los anticuerpos anti-(subunidad OC ) participan en un alto grado en la -

reaccion inhibitoria de la enzima asociada a membrana.

Una explicacion que diera cuenta de los datos a qui descritos

podria ser la que a continuacion se describe. En el estado unido a mem

brana, la R -ATPasa présenta restricciones conformacionales. De este

modo, la enzima se encontraria con una (s) cierta (s ) conformacion ( es) ,

més bien rtgida, en la que las subunidades ot y mostrarian una estre

cha interrelaciôn. En estas condiciones, los anticuerpos anti-(subunidad

OC ) afectarian indireclamente a las subunidades , a causa de un gran

acoplamiento existante entre ambos tipos de subunidades o por un efecto

•de coopératividad positiva sobre los anticuerpos anti-(subunidad ) . Por

el contrario, en el estado soluble (la enzima purificada) los anticuerpos

-1 5 5 -

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) r - o d r o in o n x i m ^ ; ^ A T R c i s n f o r m a A on o ;| î -- ( I ) \

f ï r . oc fO do O m f v n h t ' O n . i ( JI) . ( O 0 ) , r ' i . i n m r . o n l f o f , ( O ;.m / r-o -

on(i-(r,\t[n(nifJr(H ); (♦-— , 'suooo nnli- f suhunidnd A ) ; ( 0------0},

r o a n i i - ( s i . i h L i n i d o d A ) -f s ' l o r o o n ( i - ( r=i j I j i j n i d n d P-> ) ( ». n n d i r -. .'><{ •/>- i , o n

ta lo r^ GO M n f o o i a f o s y N 4 / - ) .

— 1 5 6 -

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1 5 7 -

an(i-(subunidad oC ) sei'ian incapacos de afcclar a las subunidades f'» , dcbido a un acoplamienlo y/o interaci6n menos intcnsa de estas subuni-

dades en ta protema (365), o a un efccto de cooperolividad negaliva so

bre los anticuerpos anti - ( subunidad |3 ). Si esta ultima posibilidad lu era

cierta, la progresiva destruccion de las subunidades oC en la enzima so_

luble deberia verse acompanada por una mayor sensihitidad de R^-ATPasa

a los antisueros. L_os resultados mostrados en la figura 30 y la Tabla

XVIII apunfan hacia esta direccion ya que el efecto inhibidor del suero

anti-( Rj-ATPasa) es aumentado cuantilativamente después de la diges

tion proteolftica de la enzima.

- 1 5 8 -

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3,6, PAPEL DE LA SUBUNIDAD Y

LOS ION ES EN LA PIJACION

DE LA MOLECULA F^-ATPasa A

m e m b r a n a s .

- 1 6 1 -

3.6.1. Efecto de la presencia de iones diva lentes __sobre la ceinserciôn

de enzima a membranas.

Las figuras 39,40,41 y 42 muestran los resultados obteni -

dos al estudiar el efecto de dlferentes cationes dîvalentes sobre la rein

sercion de la molécula E^-ATPasa a "membranas D" (véase Maferi%_

les y Métodos) . La enzima objeto de estudio mostraba una relacion mo

lar en subunidades oC : % ^ de 3,48: 3, 00: 1 , 1 1 : 2,37 (Fig.43) -

por PAGE en presencia de SDS. De estos resultados se deduce que

los cationes divalentes perteneclentes al grupo II S del sistema peri6di_ 2+

co junto con el Cu logran una efectividad en la reinsercion de la en_

zima superior a la del res to de los cationes ensayados, lo que conlle-

va la obvia aseveracion que el porcentaje de reinsercion del factor

a membranas depende del cation divalente présente en el medio.

En la Tabla XIX se représenta la reinsercion de la enzima

obtenida en presencia de distintos cationes a una concentracion de ImM.

La presencia de cationes divalentes con afinidades semejantes por ligan

dos provoca grados de reinsercion de là proteina muy similares entre

sf, con independencia de otras caracteristicas ionicas. Esto sugiere que

la presencia de cationes con diferentes afinidades por ligando determine

formas distintas de reinsercion de F^-ATPasa a la membrana,

3.6.2, Reversion de la tijacion de F^-ATPasa a membranes,

A fin de comprobar si la reinsercion de la enzima a la mem

brana llevada a cabo en presencia de distintos cationes divalentes dilerfa

en algün aspecto segün las caracteristicas de afinidad por ligando de es

los y con objeto de determinar si alguna de las fijaciones de proteina a

la membrana obtenidas con el empleo de cationes divalentes poseia algûn

significado fisiologico, se procedio a reverlir dicha tijacion mediante très

métodos :

■ 1 6 2 -

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— 1 6 8 —

-a) Choque osmotico.

-b) Tratamienfo con EIDTA,

-c) Tratamienlo con PCMB.

siendo el primero de ellos el ûnîco factible en la solubilizacion de la mo

lécula de P^-ATPasa de la membrana nafiva.

Para esta experiencia se estudiaron las reinserciones de -

2 +enzima logradas con. el empleo de dos cationes tipo; a) Mg a una -

concentracion de 5 mM (afinidad por ligandos del tipo oxigeno) y b) Zn

a una concentracion de 2 mM (afinidad por ligandos del tipo azufre y -

nîtrôgeno) . Una vez reinsetada la protema a la membrana, se proce -

dio a lavar el complejo E3P membrana con tampon Tris-HCI 30 mM

pH 7,5 en ausencia do cationes divalentes, tal y como se realiza en el

proceso de solubilizacion de la enzima (véase Materiales y Métodos),

no observandose liberacion apreciable de protema (Tabla XX). A con

tinuacion se intenté extraer la enzima por medio de los tratamientos an_

teriormenie descrilos, obteniéndose los resultados expuesios en las figu

ras 44 y 45 y en la Tabla XXI. Estos resultados sugieren que la for

ma en que este factor BP se une a la membrana en presencia de ig

nés Mg^ es anéloga a como dicha molécula se encuentra asociada con

la membrana "in vivo", ya que dicha reinsercion puede revertirse con

la aplicacién de los métodos empleados en la solubilizacion de la protef

na.Por el contrario, la union de la enzima a la membrana en presen - 2+

cia de Zn parece producirse de una forma no fisiologica.

Por oira parte, la reinsercion obtenida en ausencia de io -

nés Mg^ (del 1 0 al 20%) podrîa ser debida probablemente a canlidades 2+

residuales de Mg présentes en tas membranas desprovistas de P^-

ATPasa, sin embargo un pretratamiento de las mismas con EDTA no

afecla al grado de reinsercion.

- 1 6 9 -

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mM

PIGURA 44. - Solubilizacion de1 25

I -ATPasa de M . jysodeik-

licus unida por medio de iones Zn^ ( A A ) y Mg^ (O O) a

membranas desprovistas de esta enzima por tratamiento oon EDTA

( condiciones en Materiales y Métodos) ,

- 1 7 1 -

100

50

OU>

1.00.5

m M

FIGURA 45.- Efecto de PCMB sobre la solubilizacion de

p -ATPasa de M. Ivsodeikticus unida por medio de iones Zn

(jk A ) y Mg^ (O O ) a membranas desprovistas de dicha

enzima (condiciones en Materiales y Métodos)

- 1 7 2 -

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- 1 7 3 -

3.6,3. Estudio comparalivo de la solubilizacion de enzima y de la re

version del compleio SF^-membrana form a do en presencia de 2+

iones Mg

En la Tabla XXII se muestra el efecto de distintos agentes -

sobre la solubilizacion de la enzima F^-ATPasa nativa y unida a mem-

brana en presencia de iones Mg a una concentracion de 5 mM, l_a

analogia de los resultados sugiere que ambas proteinas se encuentran -

asociadas a la membrana en una forma similar. Ademas, la posible par

licipaciôn de cationes rnultivalentes en la formacion y/o eslabilidad del -

complejo -membrana se ve apoyada por et hecho de que la solubi

lizacion de la enzima, por tratamiento de las membranas mediante tam -

p6n a baja fuerza îônica, se impide por la adiciôn de pequeRas canfida-2+ 2+

des de cationes divalentes, taies como Mg y Zn (Tabla XXIII).

Todos estos resultados sugerirtan que un cation multivalente,2+

quizâs Mg "in vivo", actuaria como puente catiônico entre los sitios -

anionicos de la enzima y de la membrana.

Por otra parte, es de particular interés la solubilizacion de

enzima por tratamiento con urea a una concentracion que no a fee ta a su

aclividad ATPasica (Tabla XXII y Fig. 46) . Este procedimiento demues

tra una cierta especifidad por F^-ATPasa, dando lugar a una enzima -

soluble que no muestra eslimulabilidad por tripsina.

3.6.4. Digestion proteolftica controlada de la enzima purificada. Su efec

to sobre la reinsercion a membranas.

La figura 47 i lustra un experimento tipico en el que se mues

tra el efecto de la tripsina sobre la capacidad de reinsercion de la F -

ATPasa y su correlaciôn con los patrones electrofréticos en presencia

de SDS, T ras un tratamiento de 5 segundos con la enzima proteolftica,

la subunidad oC sufre una reduccion en su lalla molecular, convirtîéndose

-1 7 4 -

TABLA XXII

D I S T I N T O S P R O C E D I M I E N T O S D E R E V E R S I O N D E L C O M P L - E J O

B P j - M E M B R A N A C O N S T I T U I D O E N P R E S E N C I A D E M g 2+Y S U

R E L A C I O N C O N L A S O L U B I L I Z A C I O N D E - A T P a s a A P A R T I R

D E M E M B R A N A S N A T I V A S D E M . L Y S O D E I K T I C U S

T r a t a m ie n io

R e s i js p e n c io n en T r i s - H C l 3 0 m M

R e s u s p e n s iô n e n T r i s - H C I 3 m M

E D T A ! , 5 m M

E G T A I , 5 m M

L i C I 1M

U r e o 1 , 5 M

C a r d io l ip in a ( 2 0 0 p g )

E x t r a c c iô n d e

- A T P a s a d e l c o m p le jo r e c o n s - l i f u id o . (%)

1 3 , 4 9 + 2 , 3 7

4 0 , 5 0 + 2 , 1 2

1 8 , 1 3 + 5 , 3 8

2 0 , 4 7 + 5 , 8 5

8 , 0 7 + 0 , 9 3

5 1 , 6 7 + 1 0 , 4 1

9 , 3 3 + 2 , 5 2

9 , 0 0 + 1 . 0 0

S o lu b i l iz a c io n d e F ^ - A T P a s a

% P r o ( e in a % U n id a d e s e n z im é l ic a s

8 , 9 8 + 0 , 3 2 1 2 , 3 2 + 2 , 6 9

2 8 , 0 8 + 3 , 9 7 6 4 , 0 2 + 1 2 , 0 9

1 4 , 9 5 + 1 , 9 7 1 3 , 9 2 1 2 , 3 6

1 2 , 5 7 + 3 , 1 5 1 5 , 9 0 + 0 , 9 6

1 0 , 8 4 + 1 , 3 6 0 , 0 0

2 8 , 3 0 + 2 , 7 5 1 0 0

S e r e a l i z a n p r e v ia .n e n le c u a i r o la v a d o s d e la s m e m b r a n a s c o n ta m p o n

T r i s - M C I 3 0 m M ( p H 7 , 5 ) .

^ V a l o r e s m o d io s d e t r è s e x p é r im e n t e s .

c S e r e l i c r e a la a c l iv id a d A T P a s i c a e s t irn u la d a p o r t r ip s in a . U n ie a m e n

le e n o l c a s o d e u r c a s e o b t ie n e u n a p r c p a r - a c io n n o e s i im u la b in p o t'

t r i p s i n a .

-1 7 5 -

100

Ooinoo_

"Oo"O■> 5 0

542 3

UREA [M ]

FIGURA 46.- Efecto de urea sobre la aclividad enzimatica de -

AXEasa purificada. Se incuban 7 de enzima purificada con can-

tidades crecientes de urea en un volumen final de 100 yul compléta -

do con tampon “Tris-HCI 30 mM (pH 7,5) durante 25 min a tempera

tura ambiante. Posteriormente se mi de la aclividad ATPasica resi -

dual en los incubados (condiciones en Materiales y Métodos).

-1 7 6 -

T A B U A XX III

EFECTO DE IONES DIVALENTES SOBRE LA SOLUBILISA-

CION DE F^-ATRasa DE MICROCOCCUS LYSODEIKTICUS.

Las membranas, una vez lavadas con tampon Tris HCI 30 mM{pH

7,5), se resuspenden en un tampon Tris HCI 3 mM {pH 7,5) en

ausencia o presencia de iones divalentes, segün se especîfica en la

tabla. Los resultados se expresan como % de proteina y unidades

enzimélicas (aclividad ATPésica) solubîlizadas, considerando como

100% el contenido en proteina y aclividad enzimatica de hidrolisis de

ATP de las membranas.

%UnidadesProcedimiento______________________ %Proteina enzimélicas

Tris 3mM 21 ,6 42,22+

Tris 3mM + Zn 1,5 mM 9,4 -2+

Tris 3mM + Zn 2,25 mM 6,02+

Tris 3mM + Mg 0,66 mM 1 ,9 -2+

Tris 3mM + Mg 1 ,88 mM -

El signo '*-» indica que no se détecta una cantidad medible.

- 1 7 7 -

COMTROL.

0.65

I00<

I 803s

< 60zou

5 40

o20

. _ L .

Tiem po d e in c u b a c iô n (min)

R I G U R A 0 7 . - A c c iô n d e t r i p s i n a s o b r e la r e i n s e r c i o n d e R - A T R -

a s a a m e m b r a n a ( B ) y a n â l is is p o r e l e c t r o fo r e s is e n g e l d e p o U a -

c r i la m î d a a l 10% e n p r e s e n c ia d e S D S 0 , 1% d e la s m o d i f ic a c io n e s -

p r o d u c id a s p o r la e n z im a p r o t e o l i l ic a ( A ) , R e la c io n R ^ - A T R a s a /

t r ip s in a d e 1 5 / 1 . C o n t r o l c o n d o b le c a n t id a d d e p r o t e in a (c o n d ic io n e s

e n M a t e r i a l e s y M é t o d o s ) ,

— 1 7 8 " “

cuantilativamente en una forma oC’ de peso molecular entre 2.000 y -

3.000 dalton inferior (Pig. 47 E3) . Por ofra parle, tas subunidades ^

y se desiruyen aproximadamente en un 50% (Pig. 47 B y Tabla XXIV )

lo cual es concomitante con una disminucion del 50% en la cantidad de -

P^-ATPasa fijada a las membranas (Pig. 47 A ), La mesefa observada

en la figura 47 B, relativa a un grado de reinsercion de la enzima re-

ducido en un 50%, se corresponde bien con la proporcion residual de sub

unidad y & , mientras que la desapariciôn total de este ultimo compo-

nente se correlaciona con la pérdida de la capacidad de reconstituir el

complejo BP^-membrana (Pig. 47 B y Tabla XXIV). Estos resultados

parecen asignar a la subunidad un papel esencîal en la union de la en

zima a la membrana, aunque un posible papel de la subunidad en esta

funcion no puede ser to la Im en te excluido. Sin embargo la integridad total

de la subunidad oC no parece ser necesaria para la reinsercion de la

P^-ATPasa de M . lysôdeiklicus a la membrana.

3.6.5. Reinsercion a membrana de una enzima con subunidad oC modi fi-

cada.

La figura 48 ilustra el patron electroforético en gel de polia -

crilamida en presencia del delergente aniônico SDS de una preparaciôn

de enzima en la que Is subunidad oi se encuentra parcialmente degradada

en un componenle oC' de peso molecular 3.000 dalton inferior. El he -

cho de que esta preparaciôn de eslequiomeiria aproximada P 3 ^ ’

muestre una capacidad de reinsercion a membrana similar a la de una

enzima de eslequiometrîa ^ g p* j ^ 6 permite con cluir que no se re

quière una integridad total de la subunidad c/ para reconstituir el compte

jo enzima-membrana.

3.6.6. Reinsercion a membrana de moléculas P^-ATPasa con conteni

do varible en subunidad

- 1 7 9 -

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L_a figura ^9 resume los resultados obtenidos al estudiar

la reinâercîon a membrana de dos preparaciones de factor con

una estequiometria en subunidades distinta; |3> ^ y ^ 3 (^3 ^ ^ 2 '

L_a presencia de dos copias de subunidad por mol de enzima du-

plica el porcentaje de reinsercion de la molécula de -ATPasa a

ta membrana. Por otra parte, el porcentaje de reinsercion en au

sencia de iones multivalentes se ve incrementado al poseer la enzi

ma un mayor contenido en subunidad ^ . Estos resultados, ademés

de apoyar la idea de una participaciôn esencial por parte de la sub

unidad 6 en la capacidad de reinsercion de la enzima a la membra

na, favorecen una estequiometria en subunidades que contaria al me

nos con dos copias de subunidad ^ por mol de F -ATPasa.

Por otra parle, medidas de reinsercion en funcion de la

concentracion de enzima indicaron que la saturacion se producia a

un valor proximo a 100 de -ATPasa unida/mg de proteina de

membrana, lo que concuerda con estimaciones previas de la can

tidad de Fj -ATPasa présente en membranas natives de M. Ivsodeîk-

licus (152).

3.6,7, Reinsercion a membrana de una enzima defective en subuni

dad é obtenida por tratamiento con tripsina.

El aislamiento por electroforesis a escala micro-prepara-

tiva (véase Materiales y Métodos) de una enzima F^-ATPasa defec-

tiva en subunidad por tratamiento de la enzima con tripsina duran

te 20 min, permitio ahondar en el papel Jugado por dicha subunidad

minoritaria en la reinsercion del factor Bl= a la membrana. La pro

teina aislada, con una composicién en subunidades (^ 3 P3 ^ g 3 * ara

incapaz de fijarse a la membrana, ya que menos del 7% de la pro - I 25

teina marcada con I se encontraba en el sedimento después de

realizarse el expérimente de reinsercion.

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2+FIGURA 49.- Efecto de la concentracion de iones Mg (eje de ab

cisas) sobre la reinsercion de distintas preparaciones de F" -ATP-

asa a membranas desprovistas de esta enzima. -------(9 ) R ,-ATRasa

con eslequiometria Cxi ^ ( O— O) R^-ATPasa con es

mefria ^ g 3 X ^ (condiciones en Materiales y Métodos) ,

tequio

- 1 8 3 -

3.6.8, Reinsercion de las subunidades aisladas del factor BF^ a mem

branas .

Este estudio se llevo a cabo con las subunidades oC , ^ y ^

aisladas por electroforesls preparativa en gel de poliacrllamlda en pre-

sencia de urea, ast como con preparaciones de subunidades ^ y ^ obte

nidas por electro foresis en gel de poliacrllamida en presencia de SDS

(vease Materiales y Métodos), lo que présenta problemas înherentes a

la diflcil eliiT.inaciôn del detergenie anionico del complejo SDS-protelna

(veanse apartados 3.2,1. y 3.3.4.). Como se ilustra en la figura 50,

las subunidades y ^ presentan un elevado grado de reinsercion que

puede ser explicado por su caracter parcialmente hidrofobico (339). Por

su parte, la subunidad ^ aislada en presencia de urea manifiesta una -

débil reinsercion a membrana, que résulta ser nula cuando este compo

nente se prépara en los sistemas con SDS (Fig. 51), l~a subunidad

6 présenta un grado de reinsercion intermedio entre aquel de las sub

unidades mayoritarlas y el correspondienle a la subunidad ^ (Fig, 51),

No obstante, este hecho puede ser imputable al método utilizado en el -

aislamiento de dicha subunidad, como queda pues to de manifiesto en el -

caso del components ^ (comparense Figs, 50 y 51),

El estudio del e fee to de las distintas subunidades de la enzi

ma F^-ATPasa sobre la reinsercion de cada una de ellas a la mem -

brana conduce a los resultados expuestos en las Tablas XXV-XXIX, -

I—a adicion de subunidad é> incremenia en todos los casos ensayados el

porcentaje de reinsercion del res to de las subunidades de la enzima, -

Todos estos resultados parecen indlcar la existencia de sitios de fijacion

a membrana en las subunidades iX , ^ y 6 aisladas, Wn hecho que mere

ce comentarse se présenta en el estudio de la reinsercion de la subun^

dad (Tabla XXIX) ; al disminuir el porcentaje de fijaciôn en presencia

de cadena polipeptidica o pi , Esto parece sugerir una interaclon de

los sitios de fijacion a membranas de las respectivas subunidades y p

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- 1 9 1 -

con aquellos correspondienles a la subunidad , ya que el empleo de

grandes cantidades de membrana desprovislas de en contraposi -

cion con la exigua cantidad de protema ulilizada, hace despreciable la -

consideracion de posibles competiciones de las subunidades por los mis

mos sitios de union a membrana. Una comparacion de los porcentajes

de reinsercion obtenidos en las Tablas XXV-XXIX sugerirla que la -

subunidad j podria interacionar con el resto de las subunidades oC, y

^ , en las condiciones expérimentales empleadas.

3.6.9. Efecto de distintos antisueros sobre la reinsercion de la enzima

a la membrana.

Una incubacion previa de 30 min a temperatura ambienie de

P^-ATPasa marcada radiacfivamente con distintas combinaciones de an

tisueros dio lugar a los resultados de reinsercion a membrana descri -

tos en la Tabla XXX. Todos los antisueros inhiben la union en una pe

quena extension. Sin embargo, no se observan descensos significatives,

lo que no es sorprendente por la falta de suero anti-(subunidad <5 ) -

(véase apartado 3.2.) .

- 1 9 2 -

T A B L A X X X

EFECTO DE DISTINTOS ANTISUEROS SOBRE LA REINSER -

CION DE F^-ATPasa DE MICROCOCCUS LYSODEIKTICUS A

MEMBRANA.

Las muestras, conleniendo F^-ATPasa (20.000 cpm), se incu_

baron con dislintos sueros anii-subunidades durante 30 min a tempera

tura ambiente. Posteriormente se mide la cantidad de F^-ATPasa que

puede reinsertarse en membranas desprovistas de dicha enzima, segun

se describio en Materiales y Métodos.

T ratamiento

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anti -

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anti- + anti- + anti- ^

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89,4

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Porcentaje del total de F^-ATPasa présente en el ensayo.

m

3.7. PAPEU DE LOS lONES METALICOS

EN LA E - ATPasa.

-1 9 4 -

3 . 7 . 1 . C o n te n id o en z in c d e la e n z i m a p u r i f î c a d a ,

La Tabla XXXI mues Ira los resultados obtenidos en la de-

terminacion de zinc por absorcion atômica en muestras de -ATPasa

purificada, asî como su aparente correlacîôn con el nivel de actividad

ATPasica. Como puede apreciarse, los valores normales de actividad

ATPésica de este factor BFj se corresponden con un contenido en -

zinc proximo a 1 atomo-gramo/mol de proteina, aunque no existe una

relacion lineal entre ambos valores (véase Tabla XXXI). La disminu_

cion en la cantidad de zinc présente en la enzima a un valor aproxima

do de 0,5 atomo-gramo/mol de protema, se acompana con una perdi-

da de un 50% en el nivel de actividad enzimatica.

Por otra parte, y tal como se muestra en la Tabla XXXI,

una dialisis prolongada de la enzima trente a EDTA provoca la elimi-

nacion cas! compléta del zinc, lo que se corresponde con una pérdida

muy importante de la actividad hidroiftica de ATP por parte de este -

factor BFj . Estos resultados sugieren que el zinc es un componente -

intrinseco de la F^-ATPasa de M. lysodeikticus y esencial para su ac-2+

tividad enzimatica dependîente de Ca

Otros anélîsis de metales por absorcion atômica pusieron -

de manifiesto la carencia de hierro en las preparaciones purificadas -

de esta Fj -ATPasa y la presencia de calcio en cantidades no este- -

quiométricas (0,4 - 0,7 atomo-gramo/mol de proteina).

3.7.2. Efecto de varios agentes guelantes sobre la actividad enzimaii-

ça.

Los agentes complétantes de iones Zincon, EDTA y L-cis-

leina inhibîan la actividad ATPasica de! factor BF de M. lysodeikticus.

segûn se muestra en la figura 52. El mercaptano L-cisteina résulta —

efectivo a concentrée iones muy pequenas, sin embargo este efecto re-

- 1 9 5 -

T A B L A X X X I

C O N T E N I D O E N Z I N C D E D I F E R E N T E S F R E P A B A C I O N E S D E

F ^ - A T P a s a D E M I C R O C O C C U S t_ Y S O D E I K T I C U S A N T E S V -

D E S P U E S D E D I A L I Z A R L A S F R E N T E A E D T A Y C O R R E L A _

C I O N C O N L A A C T I V I D A D A T P é s i c a .

L a s ■ m u e s t r a s d e e n z im a c o n te n te n d o a p i 'o x im a d a m e n te 3 m g d e p r o t e i

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a t e m p e r a t u r a a m b ie n te c o n c a m b io s d e s p u e s d e 1 0 , 2 0 y 3 0 h . E l a g e n

le q u e la n t e s e e x i r a jo p o r d ia l is is e x h a u s i iv a c o n t r a e l m is m o v o lu m e n

( t r è s c a m b io s ) d e 3 x 1 0 ^ M T r i s - H C I ( p H 7 , 5 ) . L a a c t iv id a d

A T P é s i c a lu e m e d îd a s e g û n s e d e s c r ib io e n M a t e r i a l e s y M é to d o s . S t e m

p r e q u e lue p o s ib le lo s r e s u l t a d o s s e e x p r e s a r o n c o m o v a l o r e s m e d io s

g d e s v ia c io n e s e s ié n d a r c o n e l n u m é r o d e a n é l îs is r e a t iz a d o s y le s v a

l o r e s m â x im o y rr;ln im o o b te n id o s e n t r e p a r é n ie s i s .

T r a t a m ie n t o d e C o n te n id o e n z in c A c t i v i d a d A T F é s i c a

la m u e s t r a { é t o m o - g r a m o /m o l B F ^ ) ( u m o l / m în x m g )

_______ 0 , 7 8 7 + 0 , 0 0 8 ( 3 ; 0 , 7 9 8 ; 0 , 7 8 2 ) 5 , 8 5 + 0 , 0 1 9 ( 3 ; 5 , 8 6 ; 5 , 8 2 )

_______ 0 , 6 1 0 5 , 6 1

0 , 5 5 2 2 , 9 3

D i a l i s i s t r e n te a E D T A 0 , 0 2 8 0 , 3 2

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24 35

- Log [agente complejonte de iones]

PIGURA 52.- Inhibiciôn de la -ATPasa de M. lysodeikticus nne_-7

diante agentes quelantes, 3,9 x 10 M de enzima lue incubada con

concen trac Iones crecientes de EDTA {O — O) , Zincon (A A)y L-cisteîna ( D IZ3) durante 1 2 h , 15 min y 24 h respectiva -

mente a temperatura ambiente, midiéndose a continuaciôn la activi -

dad ATPasica residual (condiciones en Materiales y Métodos).

- 1 9 7 -

qulere incubaclones mucho mas prolongadas que los otros agentes que

lantes. De este modo, y tenlendo en cuenta estas dos variables, con

centracion requerlda para alcanzar una Inhibiciôn del 50% y tiempo de

incubacion empleado, résulta que el Zincon se manifiesta como el mas

efectivo. Esta inhibiciôn no se revierte por la adicion del sustrato de

la enzima (8 mM Ca^ -A TP ) ni por una titulacion con Ca^ de la can

tidad de agente quelante présente en el ensayo, Por consiguiente, es

tos resultados aducen la presencia de un ion metélîco como un requeH

miento intrînseco para la actividad enzimatica de la -ATPasa de M.

lysodeikticus ya que la inactivacion puede ser atribuible a su desplaza-

miento por los agentes complétantes de iones estudiados. A partir de -

los datos expuestos en el apartado anterior y conociendo la capacidad

y especificidad de los agentes quelantes para competi.' con la protefna2+

por el ion metélico, parece razonable suponer que e, Zn sea el ion

metalico del que se trata.

La Inhibiciôn producida por L-cisteina muestra évidentes pe

culiaridades (Elg. 53). Como podrîa esperarse, dada la gran alinldad

de todos los elementos del grupo II B de la tabla periodica y por ende

del zinc por los grupos -SH, la inhibiciôn se produce a muy bajas con

centraciones, sIn embargo, a medîda que se aumenta la concentracion

del mercaptano, la inhibiciôn desciende paulatinamente hasta ser nula a

una concentracion de 10 mM en las condiciones expérimentales emplea

das. También merece ser comentado que este efecto se ve reduc i do con

el aumento del tiempo de incubacion del mercaptano con la enzima —

(Eig. 53). En la actualidad no se tiene una explîcacion para este corn

portamiento, si bien la posible existencia de sitios actives y reguladores

capaces de interaccionar con la L-cislefna podrîa estar relacionada con

el susodicho comportamiento.

El efecto de otros agentes complejantes de iones sobre la —

actividad ATPasica de la enzima se muestra en la Tabla XXXII. Com

~ \ 9 8 -

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- 1 9 9 -

T A B L . A X X X I I

EFECTO DE DISTINTOS COMPUESTOS CON CAPACIDAD

COMPLEJANTE DE IONES SOBRE LA ACTIVIDAD HIDRO-

LITICA DE -ATPasa.

Se incuban 1 5 ^çi de enzima en presencia de los compueslos abajo

especificados en un vo lumen final de 200 1 de Tris HCI 30 mM

(pH 7,5) durante toda la noche a temperatura ambiente. Los re

sultados se expresan como % de actividad ATPasica respecte de

aquella correspondiente a ensayos control en los que no se anadîa

ningun com pu esto.

Adiciones [ m ]%ActividadATPésica

Ninguna 1 00

KSCN 1 X 10-3 149,4

Imidazol 1 X 10-3 116,6

Imidazol 1 X 10-3 117,1

Imidazol 2 X 10-3 1 27, 1

Imidazol 5 X 10-3 133,7

Imidazol 1 X 10-’ 143,3

KCN 1,84 X 10^3 156,8

KCN 9,16 X 10-3 209,3

KCN 1 ,84 X 10-’ 218,9

Balofenantrolina 2 X 10-3 105,4

- 2 0 0 -

puestos tales como KSCN, KCN e imidazol activan apreciablemente la

actividad hidroiftica sobre el A t P de la enzima purificada, mienfras

que balofenantrolina no manifiesta ningun efecto.

3.7.3. Reconstitue ion de (Zn^ ) -ATPasa y de su actividad.

I_a reconslitucion de la metalo (Zn ) -ATRasa lue demos

trada por ta incorporacion de en la apoprotefna segûn se îlustra

en la figura 54. Sin embargo, la enzima nativa, (Zn ) R^-ATPasa, -

era incapaz de incorporer . La confirmacion de que el in

corporado a la enzima se enconiraba fuertemente unido se obtuvo por re

cromatograffa de la (Zn ) R -ATPasa reconstituida. Este segundo paso1 2-1

eliminaba parte de la radîactividad, correspondiente a Zn debilmente -

unido ( aproximadamente 5 atomo-gramo/mol de protefna) , y rendfa una2+

R -ATPasa conteniendo aproximadamnete 1 atomo-gramo de Zn por -’ 2+

mol de protefna. La reconslitucion de la ( Zn ) R^-ATPasa lue acom-

pahada por una recuperacion de la actividad enzimatica como se mues

tra en el recuadro de la figura 54.

3.7.4. Açciôn de cationes divalentes en la prevencion v reversion

del efecto de los agentes quelantes.

Los ensayos de "prevencion" y "reversion" de la inhibiciôn

producida por agentes complejantes de iones constituyen pruebas adicio-

nales para examinar la especificidad de las inferacciones de los mencio

nados agentes con las metaloprotefnas y determinar que iones divalentes

estan implicados en el efecto de los agentes quelantes.

Si un agente quelante interacciona especfficamente con un ion

metélico de una metaioenzima, la inhibiciôn puede prevenirse ocupando -

previamente el sitio complétante del agente con un étomo metélico. Por

otra parte, una vez que se ha formado el complejo enzima-inhibidor, un

exceso crftico de iones metalicos podrfa rever tir la inhibiciôn al compe-

- 2 0 1 -

D O IS O d iV P 0 P !A |P D %

(U p iO O D J j/U J d D ) p O p iA ip D ip o y

:2 o

2

II<

c ) " =3 S ® C O 0n ^

- E

] }UJ ®

3 E

à E

U) 2 UJ

- 2 0 2 -

tir con la metaloenzima por el inhibidor unido a su atomo metaiic». Am

bos tipos do exporiencias ban si do utilizadas ampiiamente para inerpre

tar el significado de dalos de inhibiciôn por agentes quelantes obtenidos

con un gran numéro de sistemas (374-376), constituyendo dos p-'uebas

clasicas y , a su vez, electivas en la exploracion del papel funcicnal de

los iones metélicos en las metalo en zim as (un amplio tratamiento ce estos

aspectos se ofrece en (377)).

I—os expérimentes de reversion en los que los cationes diva

lentes se incuban con una -ATPasa modificada, debido a su inferac-

cion previa con los agentes quelantes, se llevaron a cabo empleando -

Zincon y EDTA, L_a Tabla XXXIII resume los resultados obtenidos.

La inhibiciôn producida por EDTA era total y especfficamente revertida 2 +

por la adicion de Zn . Por su parte, la inhibiciôn por Zincon era —2+ , 2+

parcialmente revertida por Zn , La adicion de Ca se mostro indife

rente o ligeramente activa, mientras que los iones divalentes restantes2+mostraban un efecto inhibitorio adicional, a excepcion de Mn , que —

ejercfa una cierta reversion de la inhibiciôn producida por EDTA o -2+

Zincon, si bien en una menor extension cque el Zn . La adiciôn de - 2+

iones Hg provoca resultados cuantitativamente distintos segun el tipo

de expérimente realizado (comparense las columnas relativas a Zincon

y EDTA en la Tabla XXXIII).

El efecto del Zincon era prevenido unicamente por zinc, - -

cuando la concentracion de éste era algo superior a la del agen e que

lante. Sin embargo, esto no acontece con el efecto del EDTA, La —

Tabla XXXIV ilustra el efecto de diverses cationes divalentes scbre -

la prevencion de la inhibiciôn producida por EDTA (10 mM ) sobre

la actividad ATPasica dependîente de Ca de dos tipos de Pj -A T P ^

sa de M. lysodeikticus : uno de ellos con actividad enzimatica normal - -

y otro poseyendo una escasa actividad. Como puede apreciarse, los - 2 + 2+ 2+

cationes Ca , Ni y Co no protegen en ningun caso el efec o de

- 2 0 3 -

T A B L A X X X I I I

REVERSION POR IONES METALICOS DE LA INHIBICION POR

EDTA Y ZINCON DE LA -ATPasa DE MICROCOCCUS LYSO

DEIKTICUS .

Muestras de enzima (3,9 x 10^ - 2,7 x 10 M protefna) de actividad

ATPasica normal y baja (véase texte) fueron incubadas durante toda

la noche en presencia de I x 10 M EDTA en 0, Î ml de vo lumen fi

nal de I M Tris-HCI (pH 7,5) o con 2 x 10 ^M Zincon en 30 mM Tris-

HCI (pH 7,5) durante 7 h a temperature ambiente. A continuaciôn se

ahadieron iones metélicos diferentes en una concentracion final de 10 rrM

(experimentos con EDTA) o de 3 x 10 M (experimentos con Zincon).

Despues de 2 h a temperatura ambiente, la actividad ATPasica se de-

lermino segun se ha descrito en Materiales y Métodos, expresandose -

como porcentaje de inhibiciôn con res pec to a ensayos control, incubados

bajo idénticas condiciones pero sin la adiciôn de ningun compuesto. Siem

pre que es posible los resultados se expresan como valores medios+

desviaciones esténdar con el numéro de anélîsis realizados y los valores

màximo y mfnimo obtenidos entre paréniesis.

Ion metalico Inhibiciôn de la actividad ATPasica porahadido EDTA sobre enzima de Zincon sobre enzima de

Actividad normal Actividad baja Actividad normal

Niq^no

II i

% % %44,1+5,4(3;50;36,9) 53,7 33,8

56, 9 63, 1 96,346,0 35,7 25,362,0 69,0 37,262, 8 71 ,4 40,2

— 88, 1 — —

6,4+2,4(3;9,3;3,4) 4,8 12,840,5+1,7(3;42,6;38,5) 54,8 29, 1

51 , 8 55,2 69,3— 54,8 56,4

ferroso se oxidaba a Fe^ durante los experimentos.

- 2 0 4 -

TA3LA XXXIV

PREVENCION POR IONES METALICOS BIVALENTE: DE LA

INHIBICION POR EDTA DE -ATPasa DE MICROCOCCUS

LYSODEIKTICUS ,

Muestras de enzima ( 2 x 1 0 M protefna) de diferente actividad ATP

ésica; normal (4,2-5,8 ^nol/min x mg) o baja (1,9-2,0 ^nol/min x mg)

fueron incubadas con 1 xlO^ M EDTA y 1 xlO de cada uno de los

iones metélicos divalentes descritos en la parte inferior en Tris-HCI

1 M (pH 7,5) durante 14 fi a temperatura ambiente. Las actividades

enziméticas residuales se ensayaron segun se indicé en Materiales y

Métodos, expresandose como porcentaje de inhibiciôn con respeclo a

ensayos control , incubados bajo Idénticas condiciones pero sin ahadir

ningun compuesto, Siempre que es posible los resultados se expresan

como valores mediosj;_desviaciones esténdar con el numéro de analisis

realizados y los valores méximo y mfnimo obtenidos entre paréntesis.

El signo + en las columnas de diferencia indica un incremento en la

inhibiciôn, mientras que el signo - indica una disminuciôn en la inhibi

ciôn o activaciôn.

Ion metélico Inhibiciôn de la actividad ATPésicaahadido Enzima con act. normal Enzima con act. baja

Ninguno

Hg^'"

Mn

M.„

Co

Zn

2 +

2+

Ca

2+

2+

2+

Ni2+

Cd2+

%

43,8+4(4;48;37,6)

83, 1

34.7

47.7

— 5, 6

46+3(2;49,7;42,3)

49, 1

25,9

Diferencia (Me -Ninguno)

0

+ 39,3

-9, 1

+3,9

-49,4

+ 2 , 2

+ 5,3

-17,9

% Di f ^ (Txzia(Me -Ninguno)

60,3 0

100 +39,7

-2,98 -63,3

47,8 -12,5

65.7 +5,4

3,0 -57,3

62.7 + 2 , 4

71,6 +11,3

32.8 -27,5

- 2 0 5 -

2+ 2+tiD TA ; Mg y Cd mues (ran un ligero efecto de prevencion, mien

tras que Zn^ y Mn^ resultaban ser los mas eficaces en la protec-

cion de la actividad enzimética, También es de destacar el efecto de

los iones Hg , aumentando la inhibiciôn de la actividad ATPasica, -

probablemente por desplazamiento del ion metalico nalivo de la enzima.

Por otra parte, merece a tendon el distinto comportamiento2 + 2+ 2+

de diversos iones metélicos divalentes, taies como, Mg , Cd , Mn , 2+ 2+

Co y Hg , en los experimentos de "reversion" y "prevencion"

(compérense Tablas XXXIU y XXXIV) y probablemente reflejen los

prolundos cambios y/o modificaciones inducidas en la molécula de -

ATPasa por los agentes quelantes, y en particular por EDTA (véase

apartado 3 .8 .) .

3.7.5. Distinta funcionalidad de los iones metélicos divalentes.

De lo expuesto hasta el momento parece razonable concluir

que existen, al menos, dos tipos de cationes divalentes implicados en

la manifestacion de la actividad enzimatica de la P^-ATPasa de M . Ivso-

deikticus. Uno de ellos representarfa un componente intrinseco de la -

proteina, fuer temente unido a la misma, y que ha sido identificado como 2+

Zn . El otro, se uniria a la proteina con una afinidad muy inferior,

direcfamente o formando complejo con ATP, y actuaria como activador.

De los experimentos aqui descritos se deduce que este papel séria —2+

desempehado por los iones Ca , confîrmando de este modo suposicio

nés previas ( 152,328) . Ambos cationes divalentes asi como sus fun-

ciones no parecen ser intercambiables como se infîere de los experi

mentos descritos anteriormente y de los ilustrados en la figura 55, —

que muestra la actividad ATPésica de la P -ATPasa purificada en —2 + 2+

funcion de la concentracion de los iones Zn y Ca présentés en -

en el ensayo de actividad enzimética (véase Materiales y Métodos). -

— 2 0 6 —

0.3

CL

3o6- 0.20_h-<<v

i2

2 4 6 8 10 Î2 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32mM

FIGURA 55.- Efecto de Zn 2+( A A ) y Ca^ ( O O ) como

acüvadores de fa actividad ATRasica del factor BF de M. lysodeik

ticus . Este efecto se examiné en los experimentos de actividad en -

zimatica (véase Materiales y Métodos) variando la concentracion de2 + 2+

iones Ca o susiituyendo estos iones por Zn en las concentra -

clones indicadas en el eje de ai>ctsas. I_a concentracion de ATP se

mantuvo constante (8 mM ) y el pH del ensayo se mantiene a 6,9 -2+

para evitar variaciones artefactuales inducidas por los iones Zn

- 2 0 7 -

2+l_a presencia de ton Zn activa la enzima cuando este se anade a ba

ja concentracion, mientras que a concentracl6n elevada actua como inhi2+

bidor. Los tones Ca muestran un efecto distlnto res pec to a la concert

traciôn.

3.7.6. Efecto de cationes divalentes sobre la actlvidad enzimatica.

El res to de los tones metallcos pueden desempenar papeles 2+ 2+

similares a los del Zn o Ca , o comportarse independlentemente, -

segun las propias caracterfsticas de cada uno, De este modo, se exa

mino el efecto de distintos cationes divalentes aMadidos externamente a

la R-.^TPasa (véase Tabla XXXV). La actividad enzimatica lue tn-2+ 2+ 2+ 2+ 2+

hibida en orden decreciente por Hg , Re , Co , Cd , Mn ,2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+

Mg , Por el contrario, Zn , Ca , Ni , Ba , Cu no mostra

ban efecto alguno sobre la actividad en las concentraciones empleadas.

En estas experiencias debe de tenerse en considereciôn que el tampon

Tris utilizado puede formar compiejos con los iones metâlicos (375).

Por ende, la aparentes discrepancias en el efecto pro du ci do por los

diferentes iones metâlicos dependiendo de la fuerza ionica del tampon

(comparense las dos columnas de la Tabla XXXV) , puede airibuirse

a la competiciôn existante entre el anion del tampon y la enztma por

el cation aftadido (375, 370 y DIscusion) . La efectividad de la ma-

yorîa de los cationes divalentes inhibldores de la R -ATPasa, por e- 2+ 2+ 2+ 2+ 2+

jemplo, Mn , Co , Cd , Re y Hg , parece afecfarse por este2+

hecho. Sîn embargo, en el caso de ios tones Mg este efecto es me

nos évidente. El empleo de tampon Tris-HCI 1 M (pH 7,5) se re

quière para mantener un pH constante de 7,4 + 0,1 en presencia de

elevadas concentraciones (hasta 10 mM) de cationes.

3.7.7. Influencia de diverses cationes sobre las propiedades épticas

- 2 0 8 -

TABU A. X

iN m m c io N DE UA AC TIVIDAD ENZIMATICA d e LA f ^-ATB.

* # DE MICROCCCCU3 UYSCO E iK T ic u a r c B INCL'^jACICN

CON O N E S METALICOS.

de enzima (2,7 x Î0 M| se incubaror» cnn b, ;ti.-.ias c.'.n-

cenfrecione* de Iones metallcos en Tria-HCI 30 nM ï pM 7,51 n

TH9_HCI 1 M (pH 7 ,5 ), <*.jranie 72 h a I am par alu r a a,~'blenta. b?oe

terlorrrenre *se midieron las sciividades ATPAsicae r'aaib, alaa da^an

dIentM de Ca *;epûn sa rfescrîbîc. en Maiarialea y Mâ(bdos.

Ion meillllco ar\sdîdo Conceniracicîn Aetîuidad ATRâstca an

naMTr-ia-UCI 30 mM T ria-M E 1 1

" ,

0, t 54.3 ——

** 1,0 2.2 70,9

1.5 0 ------

« 10,0 43,7

Mn^* 0.1 97,9 ------

" 1 .0 73,8 97,5

" 3.2 0 --------

" 10,0 ------- 31,2

Mg^* 0 .1 93.4 --------

" t .0 50,0 68 , 4

" 2 .* 53.4 -------

" 10,0 43,8

0,1 94, a -------

" 1,0 35,fi 65,8

" 2,2 34,9 --------

" 10,0 -------

2n** 0.1 99,7 ---------

" 1.0 96,9 92,4

" 1.5 97,7 ---------

" 10,0 118,8

0,1 31,9 ---------

" 1.0 I1.fi 65,8

C d '*

10,0

0.1 93.9

39,4

c . ' *

' .0

0.1

64.4

90.5

98. 7

" 1.0 38. 1 84. 3" 1,3 90,7 _____

" 5.0 83,7

" 10,0

B » '* 0.1 90,5

N l'*

1.0

0.1

98.8

79.8

98,6

" 1.0 91 ,6 73.4

" 10,0 ---------

C u '* 0. t 92.0

1.0 96,9 92,3

d ion forroso oxidabo a dunanic (ns a,-.3a,

- 2 0 9 -

de la molécula de -ATPasa estudiadas por especlroscopta de

fluorescencla.

Una especial atencion ha sîdo pues la en el efeclo de la pre-2+ 2+ 2+ 2+

sencia de Hg , Ca , Mg y Zn a una concentracion de 1 mM so

bre las propiedades ôpticas de ta molécula de P^-ATPasa. Primer amen

te se intenté correlacionar las acciones producîdas por estos iones so

bre la actividad enzimàtica (véase apartado 3.7.6,) con posibles dîieren

cl as en el espectro de fluorescencla de la protefna. Sin embargo, no se

producfa ningùn cambio notable en la forma del espectro cuando los cam

bios en la actividad tenfan lugar; tan sélo la protefna incubada con Hg

mostraba un ligero hombro a 302 + 1 nm correspondiente a tirosina.

No obstante, al aumentarse el tiempo de incubacion de los -

cationes divalentes con la protefna se produc fan modi ficaciones muy no

tables en los espectros de émision de la F^-ATPasa, llegandose al cabo

de 30 dfas a la situacién mostrada en la figura 56. El espectro de ftuo

rescencia de la protefna nativa présenta dos maximos a 326 y 337 nm,

La incubacion con Hg^ o Mg^ provoca la aparicion de un mâximo a

307 nm y un hombro a unos 337 nm, si bien ambos espectros muestran

ctaras diferencîas entre sf (Pigs. 56 B y 56 D) . Por su parte, la pre2+

sencia prolongada de Zn provoca la aparicion de dos maximos a 314

nm y 341 nm, ensanchando el espectro de émision caracterfstico de la

enzima nativa (Pig. 56 C ). Solamente la presencia de Ca manliene -

las propiedades opticas de la protefna original (Pig. 56 C ). Incluso la 2+

presencia de Ca revertfa el espectro de fluorescencla modifîcado de -

una preparacion envejecida de protefna al del estado nativo de la mis-

m a ( Pi g. 57).

Los cambios resenados en los espectros de émision de una -

preparacion reciente de P^-ATPasa son coïncidentes con aquellos produ

cidos al incubar los cuatro cationes citados con una preparacion enveje_

- 2 1 0 -

I 3 lI UI C

CO

o

( s o î J O J ( ( q i o S ' p n p i u n ) o i j i n o s d j o n i ^

(0>5c(0wIt)

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0 1aEV 'r<0 1■D0 tn■D (00 '•5La> 0a fO0 4JE CU) fO

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2

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8§ÜTJCoÜ

—21 2 —

cida de enzima, si bien en este caso el tiempo do incubacion requerido

para obfener los espectros mostrados en la figura 56 résulta ser muy

inferior (3 dias) .

De estas experiencias se puede concluir que los cambios -

producidos en la actividad enzimatica de la F^-ATPasa por parte de ~

los iones estudiados no se corresponden con cambios apreciables en -

las formas de los espectros de fluorescencla de la protefna y que la -2+

presencia de iones Ca parece mantener una cierta conformacion de

la molécula de -ATPasa de M. lysodeikticus . Por otra parte debe -

recordarse que esta enzima muestra una clara actividad cataiftica de- 2+

pendiente de Ca . Es tentador plantearse si esta conformacion man2+

tenida por los iones Ca no constituyera un requisite previo para la

funcionalldad cataiftica de la enzima.

3.8. EFECTO DEL AGENTE QUELANTE

EDTA SOBRE LA SUBESTRUCTURA

DEL FACTOR BF .

— 21 4 —

3.8.1 . Disociacion de componentes polipeptfdicos por tralamienio de -

F ^-ATPasa con EDTA.

La accion del agente quelante EDTA sobre el factor de acg

plamiento BF^ de M. lysodeikticus produce cambios muy notables tanto

en la subestructura de la enzima como en la expresion do su actividad

ATPasica (véase apartado 3 .7 .), dependiendo de las concentraciones

de EDTA empleadas as( como de los tiempos do incubacion. De esta -

manera se pueden distinguir cuatro fases en los efectos de este agente

quelante:

a) La incubacion de EDTA a baja concentracion (1-4 mM)

con distintas preparaciones de BF^ de M. lysodeikticus da lugar a la

obtencion de moléculas de enzima cuyo patron electroforético en presen

cia de SDS se encuentra constituido exclusivamente por las subunidades

, (i , y y (5 ; desapareciendo ciertos polipéptidos que con frecuencia

se encuentran interaccionando de alguna forma con la enzima (véase -

Fig, 58) y que pudieramos clasificarlos como contaminantes o artefac -

tos ya que su presencia no es constante y no parecen participer de nin

guna funcion conocida de la enzima. Su disociacion no a fee ta a las pro

piedades cataliticas ni a la reinsercion de la enzima a la membrana.

También, como puede apreciarse en la figura 58, el componente de mg

vilidad relativa 1,00 se ve muy disminuido tras el tratamiento con EDTA,

For otra parte, las concentraciones empleadas en este caso de EDTA

no afectan en modo alguno la actividad enzimatica del factor BF (véase

Fig. 52) . Estos resultados sugieren que ciertos cationes pudienan estar

implicados en la asociacion de cadenas polipeptidicas al nücleo de la mg

lécula de F^-ATFasa, que estaria compuesto unicamente por cuatro ti-

pos de subunidades, a saber, «V , ^ y 4 .

b) La incubacion de EDTA a concentraciones comprendîdas

entre 5 y 90 mM con la enzima no produce alteraciones en la subestruc

- 2 1 5 -

%

_JlUq ;

Q<Q

>o

G2S,

IQV)IQÛ-f“E

3 0E -a

01a .

m

8ID•o0Ü

X I

Ê2%8RIDXI

- 2 1 6 -

tura de la misma segun el anallsis por electroforesis analîtica (Rtg, 59) .

Se obtienen ios mismos efectos descri tos en el apartado anterior, si bien

més acusados. En este caso, el componente de movilidad relativa 1,00

se élimina totalmente. En lo que se refiere a la actividad enzimatica, -

esta es claramente infiibida (véase apartado 3 .7 .2 .).

c) l—a incubacion de EDTA a concentracion elevada (0,1 M)

con distintas preparaciones de factor BE durante 12 horas a tempera

lura ambiente provoca la aparicion de très bandas distintas de protefna

al realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% en presen

cia de EDTA 2 mM ( Eig. 59). Estas bandas muestran movilidades re

lativas de : 0,59; 0,78 y 1 ,00. Su aislamiento y posterior analisis por

electroforesis anaiftica en gel de poliacrilamida al 1 2% en presencia de

SDS permite identificar los distintos componentes constituyentes de di -

chas bandas;

- Banda de movilidad relativa 0,59- Esta banda que da eu en

ta del 66,60% de la protefna tenida en el gel no posee actividad enzima

tica (véase apartado 3.7.2.) y consta exclusivamente de las subunida

des y •

- Banda de movilidad relativa 0,78 - Esta banda se corres

ponde con el 3,42% de la protefna tenida, tampoco muestra actividad en

zimatica y se encuentra constituida por tan solo un componente de unos

47.000 dalton de peso molecular, asimilable al componente denominado

como p ' de esta protefna -ATFasa (véase apartado 3 .1 .).

- Banda de movilidad relativa 1 ,00 - Esta banda que represen

ta el 29,98% de la protefna tenida esté constituida principalmente por un

componente de unos 20.000 dalton de peso molecular, segün electrofg

resis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS, que coinc[

de con el peso molecular asîgnado a la subunidad é de la molécula

E^-ATPasa. También, como puede apreciarse en la figura 59, se ob

tienen componentes de pequeho peso molecular (menos de 12.000 dalton )

-2 1 7 -

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-2 1 8 -

que migran con el (rente en las condiciones expérimentales empleadas.

d) I—a incubacion de EDTA a concentraciones elevadas -

(0,1 M) con distintas preparaciones dc enzima durante 24 horas a tern

peratura ambiente produce la aparicion de très bandas diferentes de pro

teina al anaiizarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al -

7% en presencia de EDTA 2mM (Pig. 60) . Estas bandas muestran mo

vilidades relativas de : 0,77; 0,92 y 1 ,00. El aislamiento de la prime

ra y ultima banda y su posterior anélisis conduce a los siguientes re -

sultados (Pig. 60) :

-Banda de movilidad relativa 0,77- Esta banda da cuenta del

68,46% de la protefna tenida en el gel, no posee actividad enzimatica -

(véase apartado 3.7.2.) y su subestructura se limita a la presencia de

las subunidades mayoritarias o(y (i .

- Banda de movilidad relativa 1,00 - Esta banda représenta

el 23,94% de la protefna tenida y su analisis por electroforesis en con

diciones desnaturalizantes muestra la presencia prépondérante de los -

componentes minoritarios y 6 de la molécula de P^-ATPasa.

Estos efectos disociaPtes del EDTA sobre la subestructura -

de P^-ATPasa pueden explicarse por très causas posibles :

a) Presencia de determinados cationes que jueguen un papel

crucial en el mantenimiento de la estructura molecular. La necesidad -

de utilizer concentraciones elevadas de EDTA sugerirfa una diffcil acce

sibilidad a dichos iones.

b) Union de EDTA a la enzima de modo que las repulsiones

provocadas por sus grupos carboxiI os hicieran facfible la disociacion y

separacion de los polipéptidos constituyentes de la enzima medianie eleç

troforesis. En este sentido, es de destacar la imposibilidad de poner de

manifiesto la acciôn del EDTA sobre la subestructura de P - ATPasa,

al intenter separar los compiejos tormados al interaccionar el EDTA -

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con la enzima, por fiitracion en columnas de Sephadex G-100. Por otra

parte, se ha descrito que el factor aislado de mitocondrias de cora

zon de buey fija EDTA (265).

c) Acciones analogas a las provocadas por dislintos agentes

caolropicos (cloruro de guanidina, urea) al emplear elevadas concentra

clones de EDTA.

3.8.2. Efecto del EDTA sobre la tincion PAS de la enzima

Como se menciono en apartado 1.7,2. de la Introduccion -

este factor de M. lysodeikticus consti lu ye el unico factor de aco -

plamiento en el que se ha descrito la presencia de hidratos de carbono.

Sin embargo, segun se muestra en la figura 61 , la incubacion de la -

enzima con EDTA 5mM produce una disminucion apreciable en la tin -

cion por reaccion PAS de la protefna. Por otra parte, el tratamiento

de -ATPasa con EDTA a mayores concentraciones (SOmM) prove-

ca que la banda de protefna no se tina en absolute con la reaccion -

PAS. Estos resultados concordarian con los publicados por Nalin y -

col. ( 160) en el sentido de la no presencia de hidratos de carbono u—

nidos covalentemente a la enzima. Parece probable avenlurar que la -

porcion sacarfdica se encontrarfa unida al factor BP^ , en un mayor o

mener grade, medianie interacciones ionicas o per su presencia en los

pequehos polipéptidos contaminantes que a menudo acompahan a las pre

paraciones de P^-ATPasa y que pueden ser separados facilmenle con

tratamientos suaves de EDTA (véase aparado 3.0.1.)

3,8.3. Reinsercion a membrana de una enzima defectiva en las subuni

dades minoritarias.

Como se ha descrito en apartado 3 .8 ,1 ,, un tratamiento pro

longado de P -ATPasa con EDTA 0,1 M permite el aislamiento de una

- 2 2 1

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movilidad relative.0

RIGOR A 61 Efecto de EDTA sobre la fîncion de hidratos de car

bono de la -ATPasa de M . lysodeikticus . Se incuba la enzi -

ma en distintas concentraciones de EDTA ; (a) 0 mM EDTA; (b)

5 mM EDTA; (c) 50 mM EDTA, (--------) tincion de hidratos de -

carbono ; ( ---------) linciôn de proteina (condiciones en Materiales y Mé

todos) .

- 2 2 2 -

enzima defectiva en las subunidades minoritarias. El estudio comparai!

VO de la union a membrana de esta proteina, constituida unicamente por

las subunidades cL y , con respecfo a la correspondiente a la enzima

nativa y a las subunidades (%! y p aisladas, muestra ta pérdida total de

la capacidad de reinsercion a membrana de esta nueva forma de E3R

en contraste con el elevado grado de reinsercion de las subunidades —

mayoritarias aisladas (véase Tabla XXXVI), La adicion de las subuni

dades ^ y aumenta apreciablemente el grado de reinsercion de la en

zima Rj-ATPasa defectiva (Tabla XXXVII), lo que corrobora el pa

pel asîgnado a las subunidades minoritarias en esta funcion (véase apar

tado 3.6.) y proporciona nuevos dates sobre la distribucion lopogréfica

de esta enzima (véase DIscusion) .

Estos resultados sugieren que las interacciones responsables

de la reinsercion a membrana de cada una de las subunidades mayori

tarias aisladas mantienen la estructura del complejo ( ^ + ^ ) . Ya que

ha sido demostrada la presencia de dominios hidrofobicos en las super

ficies de estas subunidades (339), resultarfa bastante faclible que dichas

interacciones sean principalmente hidrofôbicas.

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3.9. FlJACiON DE FOSRATO

A F^-ATPasa,

- 2 2 6 .

3.9.1. Medida de fijacion de Pi.

El mélodo utilizado para el estudio de la union de ios lato a -

la enzima se basa en el aislamiento del complejo enzima-ligando exclui-

do de una columna de Sephadex (véase Materiales y Métodos) (272).

l—os resultados de un experimento tTpico de lljacion de Pi se

muestran en la figura 62. I—a validez de los câlculos de razones molares

de fijacion, obtcnidos por este método, puede ser cueslionada sobre ta -

base de un a disociacion parcial de Pi unido a la proteina durante el pe

so de liltracion en gel.

3.9.2. Fijacion en funciôn de la concentracion de fosfato.

l_a canlidad de fosfato unido a la enzima como una funcion —

de la concentracion de Na^HPO^, determinada en experimentos de filtra

ciôn en gel, se muestra en la figura 63. La afinidad del factor Fj por -

el fosfato bajo las condiciones expérimentales utilizadas se obtuvo a partir

de una represeniacion de Scatchard (379) de los daios representados en

la grafica de la figura 63. La extrapolacion de estos datos indica la pre

sencia de un ûnico sitio de fijacion por molécula de enzima con una cons

tante de disociacion de 105 yjM (véase Fig. 64), valor algo superior al

descrito en F^-ATPasa milocondrial de corazon de buey (Kq= 80 ^M) -

(265) y en F^-ATPasa de E . coli ( K, I 20 yuM ) (380), los dos ùnicos

sistemas en los que se ha estudiado la fijacion de Pi hasta el présente.

El hecho de que la union de fosfato al factor F de M . lyso-

deikticus no requiera la presencia de cationes divalentes (véase Fig. 63)

refleja una notable diferencia con los dos sistemas homôlogos de mitocon-2+

dria y E . coli en los que la adicion de iones Mg u oiro tipo de iôn bi

valente constituia un requerimiento esenclal para la fijacion de fosfato --

(265,380).

También es de destacar el que una incubacion prolongada —-

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FIGURA 62.— Separacion de R unido a la enzima del exceso de32 '

R libre en un experimento tfpico de fijacion de R al factor BFj

de M. lysodeikticus. Condiciones en Materiales y Métodos.

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funcion de la concentracion de Pi anadido (condiciones en Materiales

y Métodos ) .

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F^IGURA 64.- Gràfîca de Scatchard para la fijacion de Pi a la

P^-ATPasa de M . lysodeikticus (véase lexto) .

- 2 3 0 -

(24 horas) de ta enzima con fosfato no aumenfataa la cantidad de ligan

do fijado al cabo de 30 minutos de incubacion.

Por otra parle la incubacion del factor BP de M . lysodeik-

ticus en presencia de concentraciones elevadas de Na^HPO^ (4 mM)

da origen a la aparicion de un segundo sitio de fijacion de fosfato a la

enzima (1,79 mol Pi/mol enzima), lo que concuerda con la existencia

de més de un sitio de union en los factores Pj de mitocondrias y E .co-

Ji (266,300). L_a presencia de este nuevo sitio se ponia de manifiesto

por la accion de determinados agentes, taies como, Mn^ , SO^ o —

aurovertina, en P^-ATPasa milocondrial (266) y por prolongados liem

pos de incubacion en Fj-ATPasa de E . coli (380) .

3.9.3. Efecto de la fuerza ionica. pH y temperatura.

La fijacion de fosfato al factor BE es afectada por una va-

riedad de condiciones expérimentales. El aumento de la fuerza ionica

del tampon provoca una llgera reduccion en la fijacion (Eig. 65). La

variacion de pH produce efectos mas drasîicos (véase Eig. 66) . En

las condiciones expérimentales empleadas, la maxima fijacion liene lu

gar a pH 0,0; disminuyendo a valores de pH inferiores y superiores.

La disminucion de la fijacion de ligando a pH acidos puede relacionarse

con la inestabilîdad de la enzima a estos valores de pH (164). Estos

resultados estân en clara contradiccion con los descri tos para la fijacion

de Pi en E^-ATPasa milocondrial de corazon de buey (265) .

La Tabla XXXVHI resume los resultados de fijacion obtenidos

al incubar E^-ATPasa (6,43 x 10 ^ mM ) en presencia de Pi (60 )

durante 30 min a tempera tu ras de 42C , 232C y 372C, El hecho de que

la fijacion se incrçmenie al descender la temperatura no se correspon

de con ta mayor activacién enzimatica producida al preincubar el factor

BEj a 3 7 SC (véase apartado 3 .4 .2 .).

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INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA FIJACION DE

Pi A Fj-ATPasa de M. LVSODEIKTICUS

Las mezclas de reaccion contenfan 0,20 mg/ml de enzîma y 60 -

Pi ( 3x10 cpm de Pi) en 100 pl de tampon Tris-HCI 30 mM (pH 7,5),

incubândose a continuaclon durante 30 min. a las femperaturas abajo in

dicadas. La separacion de Pi no fijado se realizo mediante filtracion en

gel (Véase Materiales y Métodos).

T emperatura P i/ F.-ATPasa '

4&C1

0,,418

2320 0,, 220

3720 0,,175

— 2 3 4 “

5.9.4. Inftuencîa de nucleotidos de adenina. cationos divalenies y

ED TA.

Los resultados îluslrados en la figura 67 muestran que el

agente quelante EDTA reduce el grado de fijacion de Pi al factor BF .

Esta inhibicion se inicia a conceniraciones de EDTA inferiores a las

requeridas para afectar a la aciividad enzimafica de la enzima (véase

Figs. 52 y 67). Esta accion del EDTA parece ser semejanle a la ya

descri ta sobre el factor F mîtocondrial (265) , en el que no se obser-

vaba virtualmenfe ninguna fijacion de Pi a la enzima al emplear concen

traciones del agente quelante superiores a 2 mM.

Los nucleotidos de adenina muestran un comportamiento des

igual en cuanto a la fijacion de Pi al factor BFj ; mientras que ATP y

su analogo, AMP-PNP, se comporfan como inhibidores de la union,

ADP, anadido en concentraciones similares, no muestra ningun efecto

(véase Tabla XXXIX) .2+ 2+

Los catîones divalentes Ca y Mg (este ultimo, inhibidor

de la activîdad enzimàtica dependiente de Ca ) también presentan e-

fectos diferentes sobre la fijacion de Pi a la enzima, estimulando el - -

primero e inhibiendo el segundo (Tabla XXXIX).

- 2 3 5

CLÜ JÛ

Og12ü_•wO

8 0 -

6 0

4 0

20

10 3 020

EDTA (mM)

PIGURA 67.- Inhibicion de la fijacion de Pi a P^-ATPasa de M. jy ■

sodeikticus por EDTA. La mezcia de reaccion contenfa 0,20 mg/ml

de enzima, 60 Pi (3 x 10 cpm de Pi) y EDTA en las con

centraciones especîficadas en un volumen final de 1 00 yjl de tampon -

Tris-HCI 30 mM ( pH 7,5) . T ras una încubacion de 30 min a 23^0,

el Pi no fijado se separo mediante filtracion en gel (véase Materiales

y Métodos ) .

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4. DISCUSION

4.1. PROPIEDADES e s t r u c t u r a l e s

DEL FACTOR BP^ DE

M. LYSODEIKTICUS .

- 2 3 9 -

4 . 1 . 1 . C o m PO n e n t e s i n t r i n s e c o s .

Una importante conclusion deducida del présente trabajo re ^

de en la definicion de la subestruc*ura de este factor BP purifie ado -

(384), constituida por cuairo tipos de subunidades: cJL (peso molecular=

55.000+5.000 dalton ), ^ (peso molecular= 52.000+ 4.000 dadton ), ^

(peso molecu!ar= 34.000+ 2.000 dalton ) y ^ (peso molecular= 20.000

+ 700 dalton ). Las diferentes propiedades inmunoquimicas (384, 385),

de funcionalidad catalîtîca (384 y apartado 3.4.) y de reinserciôn a -

membrana (386) ponen de manîfiesto la individualidad y absolufa indepen

dencia de estos cuatro componentes esenciales de la molécula de P -

ATPasa purificada de M. tvsodeikticus . Estudios biosinlieticos llevados

a cabo en esta proteîna conducen a una conclusion similar (387). Estos

resultados exclu yen la posibilidad de que alguna de lus subunidades pro

venga de una degradacion proteolîtica de otros componentes, como ha -

si do sugerido por Kozlov y Mikelsaar (87) para las subunidades mino-

ritarias de P mîtocondrial.

No obstante, en la mayorfa de las preparaciones de esta en

zîma se observa con bastante frecuencia la presencia de dos polipéptidos

adicionales designados como p ' (peso molecular= 45.000+ 2.000 ) y

componentes de movilidad relative 1.0. Estos componentes no pueden -

considerarse como subunidades propias a consecuencia de su variabili-

dad y desigual estequiometria. El polîpéptido p ' puede provenir de u-

na proteolfsis de las subunidades mayoritarias, particularmente de od ,

ya que su presencia es mas patente con preparaciones enziméticas en

las que la subunidad od se encuentra parcialmente degradada. Este pun-

to de vista se ve apoyado por la aparicion de un polîpéptido de peso mg

lecular similar al de p ' por digestion con fripsina de F^-ATRasa nati

ve (323, 331, 384). En lo cfje respecta a los componentes de movilidad

relative 1.0 es interesante observer que la adicion de EDTA a bajas

concentraciones élimina dichos componentes de la molécula de F^-ATRasa

—2 4 0 -

sin afectar en absolute a sus propiedades. Este hecho indica que cier

tas cadenas polipeptidic as contaminantes o relacionadas con cierta mo du

lacion de la protefna pueden unirse, en mayor o menor extension , al

factor propiamente dicho mediante interacciones electrostâticas o

mediadas por iones mu itivafentes.

l_a asociacion del componente i al resto de la molécula de

F j—ATFasa parece ser dependiente de cationes divalentes, ya que pue

de disociarse facilmente por tratamiento del factor BF^ purificado con

EDTA (384 y apartado 3 .8 .). En cualquier caso, su asociacion con

el resto de la enzima es particularmente débil (384), dependiendo en

gran manera su presencia cuantitativa en la estructura cuaiernaria de

la enzima del método y condiciones de aîslamiento y purificacion de la

misma. Esta labilidad en la interaccion de la subunidad é> con el resto

del factor BF^ parece ser la causa de su ausencia en la descripcion

de la composicién en subunidades de esta enzima en trabajos previos -

(321, 339). Estos resultados muestran cier tas analogias con los descH

to s por Abrams y col. ( 204) en S . faecalis. quienes encontraron que

la purificacion de la enzima F^-ATFasa por electroforesis en gel de -2+

polîacrilamîda en presencia o ausencia de iones Mg implicaba la obten

cion de una enzima confeniendo o no la subunidad k .

Ademâs, tratamientos prolongados de la molécula F^-ATPasa

con EDTA provocan la disociacion del componente ^ , lo cual puede re

flejar 1res posibtes acciones del agente quelante al anadirse en cantida-

des elevadas e incubarse durante largos periodos de tîempo: a) corn -

plejante de iones, b) formacion de repulsiones electros ta tic as y c ) cag

tropica; tal y como se senalo en el apartado 3.8.. Estos h echos indi-

can que el agente quelante EDTA se comporta en determinadas condi

ciones expérimentales como un verdadero agente dîsociante de la enzi

ma, prometiendo ser una excelente herramienia de trabajo en el aisla -

miento de las subunidades minoritarias. Por otra parte, la disociacion

- 2 4 1 -

de un componente de igual talla molecular que fi ’ por efecto de EDTA,

podria ser una premonicion de su accion sobre las subunidades mayo

ritarias. Este lema seré abordado en un futuro proximo.

Los resultados descritos en este trabajo sobre la estructura

cuaternaria de ta -ATPasa de M. Ivsodeikticus parecen extender las

analogias estructurales entre los diferentes factores, a la vez que po -

nen de manifiesto las débiles interacciones que mantienen unidos a los

polipéptidos minoritarios y . En este sentido la gran diversidad de

composiciones en subunidades detectadas en las distintas P^-ATPasas,

particularmente en aquellas de origen bacteriano (véase Introduccion) ,

podria reflejar propiedades irtrinsecas de cada enzima o, muy probable

mente, un di fer ente grado de interaccion entre los polipéptidos consti tu

yentes en cada factor P^ . Quizés, las mayores diferencias existantes

entre las P^-ATPasas de distinta procedencia radiquen en el tipo y/o

intensidad de las interacciones que mantienen sus respect!vas estruclu-

ras cuaternarias. En este sentido el efecto disociante del EDTA sobre

el factor BP^ de M. Ivsodeikticus muestra ciertas semejanzas con la

disociacion del factor BP^ de E.coli por frio en soluciones altamente -

satinas (142).

4.1.2. Latencia.

La enzima P -ATPasa solubilizada de M. Ivsodeikticus posee

una actividad hidrolftica basal sobre el ATP, que puede activarse por

la accion de la tripsina (152). Por el contrario, la enzima purificada -

o la enzima solubilizada en presencia de urea (véase apartado 3 ,6 .3 .)

no muestra esta propiedad.

La activacion por tripsina de la actividad ATPasica en el -

factor P , con indepen dencia de su origen, parece relacionarse con la

dislocacion o degradacion de un péptîdo inhibidor de pequeno peso mole

cular que en determinados fac tor es P se identificaba con la subunidad

- 2 4 2 -

5 de los mismos (véase Introduccion) . En el caso de -ATPasa -

de M. Ivsodeikticus. Carreira y col, (330), îdentîficaron un componon

te de peso molecular aproximado de 25.000 dalton como el inhibidor-

natural de la enzima. Sin embargo, una preparacion parcialmente puH

ficada de este componente se mostro incapaz de inhibir, en diversas -

condiciones expérimentales, la actividad ATPésica de la enzima purifi

cada. Nuestros resultados, por lo tanto, aconsejan una reconsideracion

en la asignacion de la responsabilidad de esta importante regulacién de

la actividad ATPasica, y permiten adelantar dos posibilîdades; a) si se

confirmase que el componente de peso molecular aproximado de 25 -

kilodalton fuese el inhibidor natural de la enzima, su interaccion con

el factor BP^ requeriria unas condiciones expérimentales diferentes de

las realizadas en el présente trabajo; b) otra posibilidad, quizas mas

plausible, harîa recaer la responsabilidad de la estimulaciôn por tripsi

na sobre un componente de peso molecular maximo de unos 13.000 -

dalton , que migrarîa con el colorante marcador al realizar una electrg

foresis en gel de polîacrilamida al 12% en presencia de SDS y que se

encontraria débilmente unido al factor BP^ . Ademés, la hipotética par

ticipacion de este ultimo componente en la latencia de la actividad ATP

âsica no puede excluirse de los resultados descritos por Carreira y

col. (330) .

4.1.3. Microheterooeneidad y labilidad.

l_a microheterogeneidad de las preparaciones de P^-ATPasa

ha sido observada en mitocondrias, cloroplastos, A. faecalis y M . Iv

sodeikticus (163,164).

BP^ de M. Ivsodeikticus ademas suf re una degradacion en

medio alcalino , no habiéndose detectado înicialmente ningun tipo de acti-

vidad proteolîtica convencional (164). Estos hechos llevaron a especular

con la posible existencia de enlaces ester o glucosidicos insertados en

— 2 4 3 -

Ire las cadeias peptidicas (318), Sin embargo, recienfemente se ha -

mostrado cla'ta evidencia sobre la presencia de proteasas asociadas a

las membraras de M. Ivsodeikticus (388) , que podrfan afectar a la mo

lécula de F^-ATPasa. El hecho de que estas actividades proteolîticas

de membrani puedan solubilizarse en las mismas condiciones qpjo la en

zima Fj-ATPasa y permanecer, màs o menos intensamente, asociadas

con el factor BF^ podria explicar la labilidad de ciertas preparaciones

de F^-ATPisa asi como su microheterogeneidad. Otra posible explica

cion, que se deduce de los resultados obtenidos en este trabajo, podria

residir en la fécil disociacion de las subunidades minoritarias de la en

zima, propîeiad general de todos los factores F^ estudiados, que daria

cuenta del ablamiento y purificacion de preparaciones enziméticas cons

tituidas por noléculas de F^—ATPasa con un desigual contenido en di-

chas subunidides.

Et cuanto a las distintas cadenas polipeptidicas de este fac

tor BF^ , la subunidad ^ se muestra como el polîpéptido mas astable o

mes protegid» en la enzima (384) . Por el contrario, la subunidad cL présenta una extremada labilidad, degradéndose bajo ciertas condiciones

expérimentales a los componentes denominados oL ' 6 oc’ ’ por ruptura

de fragmente; peptidîcos de 2.000 a 5.000 dalton (321 , 331, 389). Es

ta transformazion molecular se présenta, en términos cuantitativos, de

una forma similar en preparaciones de enzima inactiva (321 , 389) y -

por la accion de la tripsina en la activacion (323) o, al menos, conser

vacién (384) de la actividad ATPasica. Por lo tanto, parece logico su

poner que las modificaciones de las cadenas polipeptidicas oL del factor

BF^ de M*. i/sodeikticus inducidas por tripsina o probablemenle por pro

teasas endogtnas "in vivo", se deben a la ruptura de distintos fragmen

los de analog) peso molecular pero ubicados en diferentes regiones o -

dominios de la F^—ATPasa.

- 2 4 4 -

4 . 1 . 4 . E s te q u io m e tr ia en s u b u n id a d e s .

L_a medida de la intensidad de banda tenida en gel de polia-

c ri lamida (véase apartado 3 .1 .3 .), asi como los estudios de reinser -

cién (véase apartado 3 .6 .6 .) y de reconstitucién de las propiedades -

inmunoquimicas de la molécula de -ATPasa a partir de sus compo

nentes purificados (385 y apartado 3.3.4.) , sugieren una estequiometria

en subunidades de OC 1^3 ^ 2 7. ' realizados con los -

agentes entrecruzantes dimetil suberimidato y dit! obis succinimîdil pro -

pionato sobre este factor BP^ (365) conducen a una estequiometria si

milar. I—a débil asociacion de las subunidades minoritarias y en particu

lar de la subunidad al resto de la enzima, podria indicar a presencia

de alguna copia mas del componente éi por mol de enzima. Esta este -

quiometria conduce a un peso molecular aproximado de 425.100-445.000

dalton , perfectamente compatible con el peso molecular de ^30.000 daj

ton determinado recientemenle para este factor BF^ por eqjilibrio de

sedimentacion por centrifugacion a baja velocidad (390). Ademés, el va

lor de coeficiente de sedimentacion (13,6+0,2 S) y del radio de la es

tera ecpjivalente (7,5+0, 2 nm) (390), sustentan pesos molecJlares su -

perfores a 400.000 dalton .

4.1.5. Consideracîones sobre la presencia de hidratos de carbono,

Andreu y col. (155,156) han descrito la presencia de oligo_

sacâridos en la molécula de F^-ATPasa de M. Ivsodeikticus y cloroplas

tes. Sin embargo, Nalin y col (160) no han podido detectar la natura-

leza glucoproteica en los factores F^ mîtocondrial de cloropfeslo y de -

E . coli . utilizando la tinciôn PAS después de electroforesis en gel de

polîacri lamida en presencia de dodecil su lia to sodico, una vez eliminado

escrupulosamente el detergente anîonico. Por o ira parte, Verheijen (380)

ha encontrado por cromatografia de gases un cierto porcenlaje de azu-

cares en preparaciones F^ de E . coli y cloroplastos, si bien la canli-

- 2 4 5 -

dad y naturaleza de los mismos era muy variable de preparacion a pre

paracion. Ademés, los resultados obtenidos por Verheijen sobre la pre

paracién de CF^ mostraban unas grandes diferencias con los publica -

dos por Andreu y col. (véase Tabla X L ). Esta gran variabilidad en -

el contenido de oligosacéridos condujo a Verheijen a concluir que estos

factores no poseian hidratos de carbono unidos covalentemente a la en

zima. No obstante, la polemica sobre este tema continua, habiéndose *—•

descrito resultados distintos sobre el estudio del efecto de la concanava

lina A (Con A) , lectina especifica para resfduos de glucosa o manosa,

en diferentes F^~ATPasas. Mientras que no se observa efecto alguno o

muy débil sobre el factor F^ de E . coli (380) y de mitocondrias de -

corazon bovino (391), Satav y col. (391) han demostrado que esta lec

tina se une e inhibe la actividad enzimética del complejo de ATPasa y de

la F^-ATPasa de mitocondrias de levadura, sugiriendo el carécter glu

coproteico de la enzima. La potente inhibicion descri ta por estos au to

res les hace sugerir que el sitio de fijacion de Con A sobre F debe

localizarse en las proximidades del sitio catalitico o tener un importante

efecto estructural sobre el mismo. En este sentido, es interesante men

cionar que al menos un sitio de union para Con A parece ubicarse en

la subunidad oC de la F -ATPasa de mitocondrias de levadura (391).

La posible naturaleza glucoproteica de la F - ATPasa de M. Ivsodeikticus

también se favorece por experimentos de marcaje de la proteina "in vi

vo" por incorporacion de {j^C J azùcares (157).

EI présente trabajo ofrece una explicacion a estos hechos a-

parentemente contradictorios al sugerir que la presencia de oligosacéri-

dos en el factor BF^ de M. Ivsodeikticus se debe a una interaccion io-

nica y/o mediada por iones multivalentes. La ausencia dé hidratos de -

carbono unidos covalentemente a F -ATPasa queda pu es ta de manifiesto

al disociar fa parte sacarTdica por tratamientos con EDTA que no afeç

(an a la estructura cuaternaria de la enzima. De este modo, la deteccion

^ '1

' 2 4 6 —

i i ( r < 5 0 ü ü ü

- 2 4 7 -

descrita anteriormente de hidratos de carbono en las preparaciones de

-ATPasa de M. ivsodeikticus podria deberse a la presencia de cade_

nas oligosacarfdicas asociadas a la enzima por interacciones ionicas es

pecfficas y/o mediadas por cationes multivalentes. En este contexte, es

notoria la capacidad de interacciôn de los cationes divalentes con la pro

teina, posibilitando asi posibles interacciones cation-azucar. De conlir -

marse esta posibilidad, la funcion de la porcion sacaridica podria estar

dîrigida hacia la regulacîon de interacciones especificas y/o al enmasca

ramiento de las cadenas polipeptidicas a la accion de proteasas (392) .

Sin embargo, no puede excluirse la posibilidad de que la presencia de

azùcares en la molécula de P,-ATPasa sea debida a contaminantes asg

ciados a la enzima o a artefactos introducidos durante el proceso de ais.

lamiento y purificacion. En este caso, interacciones, presumiblemente -

inespecificas, se corresponderian con grandes variaciones en la compg

stcion cuanti tali va y/o cualitativa de los hidratos de carbono detectados -

en diferentes preparaciones de BP^ .

En cualquier caso, una variabilidad moderada o esencialmen-

te cuantitativa en el contenido de azùcares de distintos factores P , no -

puede considerarse por sf sola como una prueba en favor de una presen

cia inespecifica e irrelevante de hidratos de carbono, ya que variaciones

apreciables también se han descrito en otro tipo de ligandos (nucleotidos

de adenina, iones metélicos divalentes) , para los que se intenta encon -

trar una posible funcion. Ulieriores estudios deben realizarse para acla_

ra r todas estas interrogantes.

4.2. PROPIEDADES INMUNOQUIMICAS

DE LA ENZIMA.

- 2 4 9 -

4 . 2 . 1 . A n t is u e r o s y a c t iv id a d e n z im é t ic a .

Los estudios înmunolégicos realizados en el presents trabajo

am pli an los realizados previamente por Whiteside y Salton (336) . Estos

au tores demostraron que los anticuerpos anti-( -ATPasa) inhibfan corn

pletamente la actividad ATPasica de forma no competitîva, sugiriendo -

que el antisuero actuaba sobre sitios adyacentes al sitio catalitico e indu

cia cambîos con formac ion a I es. Es to puede explicar los resultados descri

tos en este trabajo, mostrando una baja eficiencia de los anticuerpos an

ti-subunidades para inhibir la actividad ATPésica de la enzima purificada,

aunque el mayor efecto obtenido con el suero anti-(subunidad |% ) con -

cuerda con el papel asignado a esta subunidad en las propiedades cata_

Ifticas de la enzima P^-ATPasa de M. Ivsodeikticus (384 y apartado 3.4.)

Por otra parte, la falta de reaccion inmunolégica de la subu

nidad aislada en presencia de SDS, en contraste con la obtenida en

las subunidades c / , ^ y aisladas en presencia de urea, muestra la in

fluencia del método de aîslamiento sobre las propiedades de una cierta -

cadena polipeptidica. Mientras que en presencia de urea se obtlenen es-

tructuras que pueden asimilarse a la estructura nativa del factor BP^ -

(3 3 9 ), en presencia de SDS parece muy improbable que tal replegamien

to lenga lugar. Asf, los estudios llevados a cabo en los factores P de

E . coli ( 1 9 7 ) y cloroplastos (196), en los que los anticuerpos ami-(sub

unidad Oé ) o combinée iones de anticuerpos anti-(subunidad (X ) y anticuer

pos anti-(subunidad ) se mostraban como los més eficaces en la inhi

bicion de la actividad enzimética, deben considerarse con ciertas precau

ciones (153), debido a que los antisueros se prepararon trente a las -

diferentes subunidades aisladas en sistemas con dodecil sulfato sodico. -

Por su parte, Voshida y col. (153) observaron, en estudios similares

a los a qui descritos, que entre los distintos anticuerpos preparados fren

te a cada una de las cinco subunidades del factor TP^ de la bacteria -

lermo f ila PS3, aisladas en condiciones en las que la estructura secun-

- 2 5 0 -

daria de las mismas se asemejaba en gran medida a la correspon-

diente a la enzima nativa, tan solo los anticuerpos anti-(subunidad06)

y anti-(subunidad ) inhibian eficazmente la actividad ATPésica de

esta enzima transduclora de energia.

Los resultados expuestos en el apartado 3.5. demues-

Iran que las diferencias existantes entre las dos formas A y B de

la proteina, tanto como inmunogenos o como antigenos (332,393), -

son independientes del estado fisico de la enzima : soluble o asociada

a membrana (393). Ademas, los experimentos alii descritos permi

ten dar una explicacion molecular de estas diferencias. La subunidad

C6 parece constituir un componente de gran importancia en la expre-

sion de las propiedades antigénicas de la enzima -ATPasa de M.

Ivsodeikticus . De esta manera, las diferencias inmunologicas entre

ambas formas, A y B, de la proteina reflejan una distinla expresion

de los déterminantes antigénicos de las subunidades o6 como conse

cuencia de su grado de inlegridad molecular, Asi, es probable pos

tuler que la subunidad o/ juegue un papel regulatorio en la expresion

de las propiedades inmunologicas de la P^-ATPasa de M. Ivsodeik

ticus . como ya ha sido propuesto para la actividad enzimética (392) .

Sin embargo, esta observacion pone de manifiesto la gran cautela que

debe tenerse en la interpreiacion de los resultados obtenidos al aplicar

tecnicas inmunologicas al estudio del papel de las subunidades en la -

actividad enzimética. Ademas, el hecho de que los sueros empleados

contengan "familias" de anticuerpos, cada una de elles especTlica para

una parte diferente de la molécula y capaz de provocar efectos dislin

tos o incluse o pu es tos sobre la actividad enzimética (469) , ofrece una

complicacion adicional al estudio de la relacion estructura-funcion de

la enzima por estas técnicas.

Por otra parte, los resultados descritos en este trabajo in

dican que la accesibilidad de la molécula de P -ATPasa y de sus dos

- 2 5 1 -

subunidades mayoritarias, 06 y |3 , a sus respeclivos anticuerpos -

no se haya afectada cuando la enzima esta asociada a la membrana.

De hecho, los resultados obtenidos apuntan en la direccion opuesta,

observandose un aparente incremento en la accesibilidad y/o sensiN

lidad a los anticuerpos del factor asociado a membrana, lo que

podria explicarse por la diferente flexibilldad conforméeional de la -

proteina dependiendo del medio en que se encuentre.

4.2.2. Radloinmunoensayo v estructura molecular.

Dada la complejidad de los patrones de subunidades de los

diferentes factores Pj aislados de distintos orfgenes: mitocondrias, cig

roplastos y bacterias (55,62,67), se ha planteado si lodos esos com

ponentes se encuentran realmente en los factores Pj "in vivo", o son

artefactos producidos por los métodos de aîslamiento o analisis. De -

este modo, se ha sugerido, como ya se menciono en el apartado 4.1.

1 . , que las subunidades minoritarias, ^ y , procediesen de una

ruptura proteolîtica de una subunidad de peso molecular comparable al

de Od y ^ en el factor P mîtocondrial (S7) . Ror otra parte, la exis

tencia de microheterogeneidad en las preparaciones de esta enzima,

asî como el posible efecto de proteasas asociadas a membrana no peg

ml ten, a p rio ri, despejar las dudas antes mencionadas.

Este trabajo ofrece una cierta evidencia sobre una compo^

cion intrînseca en subunidades de este factor BF acorde con la ex-

puesta en el apartado 4.1.1. En este sentido, la técnica del radioin-

munoensayo se mostré como una excelente aproximaciôn experimental

al estudio de la identidad propia de très subunidades ( o6 , y ^ )

de las cuatro descri tas en el factor Bf^ purificado de M. Ivsodeikticus

(384), como paso previo al conocimiento de las funciones especîficas

que pudieran ser atribuibles a cada una de eilas.

La aplicacion del radloinmunoensayo a esta enzima ha per

- 2 5 2 -

mitîdo, a su vez, explorar el papel de las subunidades en les pro

piedades inmunoquimicas de la molécula de -ATPasa, Estos resid

lados (véase apartado 3-3.) indican que los componentes oé , |3> y

^ contribuyen a las propiedades antigénicas del factor BPj de M .

Ivsodeikticus. pero a su vez, muestran la existencia de determinan

tes antigénicos adicionales, probablemente conformacionales, origina

dos del plegamiento y ensamblaje de las subunidades en la molécula

de -ATPasa.

Intentes previos de reconsti tucién de las propiedades en:d

maticas de este factor BPj a partir de sus subunidades aisladas no

fueron culminados con éxito (143,339). Sin embargo, ha sido pos[

ble reconstituir parcialmente las propiedades inmunologicas de la mg

lécula de P -ATPasa de M. Ivsodeikticus ( 385 y apartado 3 .3 .4 .),

lograndose la maxima efectividad al ahadir las subunidades 06 , y

^ en una relacién molar de 3:3:2.

Estos resultados con firm an también la individualidad y es

pecifîcidad de las subunidades o6 , y de este factor BP (la

subunidad ci no pudo examinarse por problemas de aîslamiento, se

gun se describe en el apartado 3.3.4.) .

Por otra parte la técnica de radioinmunoensayo, utilizada

en nuesfro estudio, puede aplicarse - debido a su especificidad, sen

sibilidad y rapidez - en la comparacion de posibles similitudes entre

las diferentes P^-ATPasas y homologias entre las subunidades de

un factor P determinado. Ademés, dada la sensibîlidad del método

se podria detectar la concentracion en que la molécula de P^-ATPg

sa y cualquiera de sus subunidades se encuentran en la membrana,

lo que permitiria detectar cambios en la concentracion de la enzima

o de cualquiera de sus componentes en funcién de las condiciones de

crecimiento del organismo. En este sentido, la aplicacion del método

a estudios de biosintesis parece obvîo.

— 2 5 3 —

Por otra parte estos resultados presentan a la técnica

de radioinmunoensayo como una aproximacion experimental de gran

efectividad en el estudio a nivel molecular de las proteinas oligomé-

ricas, asf como en el estudio biosintético de las mismas.

1 K

4.3. SUBUNIDADES Y ACTIVIDAD

ATPasica.

- 2 5 5 -

4 . 3 . 1 . P a p e l d e l a s s u b u n i d a d e s m a y o r i t a r i a s . y j3 .

l_a aplicacion combinada de la digestion proteoliiica y de an

ticuerpos especfticos ha permifido dernostrar que la subunidad |3 es esen

cial para la actividad ATPasica del factor E3P de M. Ivsodeikticus. —

aunque esta subunidad requeriria una cierta proporclon minoritaria del -

componente 0/ , a saber una molécula de 06 por cada 1res molécules de

P , para ser activa (384). Una conclusion similar se obluvo en la —

-ATPasa de Micrococcus A .T .C .C . 398 (172). Deters y col. (198)

han descrito que CP^ poseia una cierta actividad ATPasica residual —

très un tratamiento prolongado con tripsina, aunque unicamenle las sub

unidades od y p permanecian en el complejo.

Esta participacion de las dos subunidades mayoritarias en -

las propiedades cataliticas de la enzima parece ser una constante en to

dos los factores P estudiados.

P^ —ATPasas activas conteniendo unicamenle estas dos sub

unidades han sido aisladas de S . meoaterium (117), B . subtilis (119) y -

formas l_ de Proteus (114). Complejos similares del factor P también

se han obtenido, bajo determinadas condiciones expérimentales, en E .coli

( 1 1 5 , 2 0 0 ) , M. Ivsodeikticus (134) y mitocondrias (07) .

Estudios de reconstitucion de la actividad enzimética a par—

tir de distintas combinaciones de subunidades, llevados a cabo en las P^-

ATPasas de la bacteria termofila PS^ (176, 208)y de E.coli (199,395),

conducen a conclusiones similares. Las subunidades aisladas de estos -

factores de acoplamiento no poseen por si mismas actividad ATPésica -

pero en ambos casos esta se podia reconstituir mediante mezclas apro—

piadas de subunidades. Sin embargo, exister algunas diferencias infere -

santés entre los experimentos de reconstitue ion de estos factores P de -

bacteria termofila PS^ (denominado también TP^ ) y de E .coli (denomi-

nado también ECP^ ) (176,199,208):

a) Mg y ATP se requieren para la reconsti tucion de —

- 2 5 6 -

ECR^ , mientras que ATP no présenta ningun efecto sobre la r?cons

tl tucion de TR . Es conocido el hecho de que el ATP estabiliza los

factores R mesofilos, sin embargo, no se requiers para la eshbiliza

cion del factor TR^ (131), aunque las conformaciones de las subuni

dades 06 y p de TR^ son estabilizadas con ATP (396) , En cuaquier

caso, debe sehalarse que ECR^ posee 3 moles de nucleotido fu»rte -

mente asociados que no pueden eliminarse durante el proceso de puri_

ficacion (397), mientras que TR^ no présenta nucleotidos fijado? (131).

b) Una combinacion de las subunidades Od , (2> y ^ de —

ECR^ présenta una elevada actividad ATPasica. Una combinéeiSn de

^ o de o(+f^+<i de TR^ daba lugar a una apreciable activicbd, -

pero una combinacion similar de subunidades en ECR^ se mostraba -

inactiva. Este resultado en ECR^ estaria aparentemente en conhadic-

cion con el aîslamiento de un complejo (OC + (i ) funcionalmente attivo -

obtenido por tratamiento con fripsina (2 0 0 ). Sin embargo, experimen

tos llevados a cabo con antisueros especfficos indicaron que un frag -

men to del componente g permanecfa en dicho complejo (06 + |3 ) ((98) ,-

por lo que podria pensarse en la necesidad de la presencia de la sub

unidad ^ para un correcte emsamblaie de las subunidades 06 y |? .

Ademés recientemente Rutai y col. (399 ) han conseguido

reconstituir "in vitro" la actividad ATPésica partiendo de las stbunida

des aisladas de los factores ECR^ y TR^ . Las combinaciones que

resultaron ser activas se resumen a continuaclon :

y de ECR^ y ^ de TR^ en presencia de ATP

y F de TR^ y de ECR^ en presencia o ausercia de AT

et y ^ de ECR^ y de TR^ en presencia de ATP.

Estos au tores también observaron que la subunidac p de

TR^ podia complementar el factor ECR^ procédante de un mutaite de

E . coli defectivo en dicha subunidad, Estos resultados indican qie las

subunidades y ^ de ECR y TR^ desempenan funciones similares -

ya que estas subunidades de EC R podian subtituirse por las o rres -

- 2 5 7 -

dientes de TF ; lo que da muestra de las analogfas existenles entre

las enzimas transductoras de energia, aunque estas procedan de orga

mismos totalmentes dlferentes. En este sentido, la bacteria termofila -

, grarrt positiva, es capaz de crecer a 80^C ( I3 l) , mientras que

E . coll. gram negativa, no puede deserrolarse a températures superio

res a los 452C. Sin embargo, lam bien se aprecian algunas diferen -

cias. -Asi, la presencia de ATP se mostro como un requisite impres

cindible para la reconstitue ion de la activided ATPésIca a partir de -

comblnaciones de subunldades que incluyeran la subunidad C/. de ECP^ ,

mientras que una mezcia de oi y de TP^ y de ^ de ECP^ en —

ausencia de ATP mostraba una apreciable activldad. Esios résulta -

dos sugieren que la interaccion de la subunidad de ECP^ con nucleg

tidos parece ser esencial para el ensamblaje con oiras subunldades,

A este respecto, se ha detectado un camblo conformacional en esta -

subunidad despues de su interacion con ATP (400). La subunidad pC

de TP^ o de ECP^ no reconstltufa la activldad ATPésIca al ahadirla

a una combinacion de subunldades y g de un origen diferente, sugî_

riéndose que las subunîdades son especificas para cada especie.

El tratamiento de crom a to loros de R . rubrum con LiCI -

2 M en presencia de ATP conduce a la extraccion de la subunidad ji

del factor BP^ (182). Las veslculas tratadas con LiCI perdîan las -

capacidades de sîntesis o hidrolîsis de ATP. De forma analoga la -

subunidad ft purl ficada tampoco posefa activldad ATPésIca, pero po-2 +

dfa fijarse a las vesfculas tratadas en presencia de Mg y A T P . -

Las vesfculas asf reconstitufdas reçu per aban las acfividades A T P â -

sica y fotofosforilante.

Estudios de modificacion qufmica (198,200,237,270,290,

291 , 401-403) y de marcaje de afinidad (4 O4 -409 , 425) han puesto de

rnanifîesto que unîcamente las subunldades 0 y poseen sitios de fi-

jacion de nucleolidos esenciales para la actividad cataiflica de la en-

zima. Sin embargo los resultados obtenidoo muestran diferencias en

— 2 5 8 —

fre los distinlos factores P , lo que en principle podrfa reflejar la gran

diversldad exislenle en el numéro y afinidad de los sitios de fijacion de

nucieotido de las distintas P^—ATPasas. Asf Wagenvoord y col. (406) -

encontraron dos sitios de fijacion para 8-azido-ATP sobre la subunidad

|3 del factor P mitocondrial.

La union de una ûnica molécule de 8-azido-ATP sobre —

una de les subunldades del factor BP^ de Micrococcus luteus causaba

una inhibicion total de la enzima (405) . Por el contrario, la mayor parte

de este mismo analogo marcade radiéeticemente se fijaba sobre la sub -

unidad oC de factor BP^ de E.coii (70% de radiactividad en oC y 30% en (3)

(404). El empleo de otro anélogo, p-fluorsulfonilbenzoii-5-adenosine, in

hibfa de forma irreversible la P^-ATPasa mitocondrial, si bien esta in-

bicion era prevenida parcialmente por nucleolidos de adenina (410), Des

pues de una inactivacion del 90%, la subunidad pC contenfa 0,45 moles del

analogo por mol, y la subunidad fi , 0,88 moles. No obstante, el grado

de inactivacion de la actividad ATPâsica se correspondia basiante bien -

con el numéro de moléculas de reactivo incorporadas en la subunidad f3 ,

sugiriéndose que el sitio cataiîtico se encontraba en dicha subunidad.

Todos estos resultados parecen indicar que la subunidad fialberga el sitio activo de la enzima, mientras que la subunidad oC podrta

conslituir un polipéptido regulador. En este sentido es înteresante obser

var que el aislamiento de una forma de proteîna conslituIda por très co

pias de y una de 0 ' con proporciones mu y minoritarias de ^ poseia

una actividad especifica 2,5 veces superior a la de una preparacion —

normal de factor BP^ de M. lysodeikticus (384 ) . Por otra parle la sub

unidad c< es capaz de unir ATP y ADP (411,418). Ademés, una inter

accion co rrecta entre las subunldades y ^ parece ser esencial para

la expresion de actividad enzimatica. Por lo tanio, el papel desempena

do por la subunidad o(. parece estar intimamente relacionado con la ma

nifestacion de la actividad ATPésica. Asî, Kanazawa y col. (413) ob-

luvieron un factor ECP^ carente de actividad ATPésica y defectivo en

2 5 9 -

subunidad Ot a partir de un mutante de E .çol l . La adicion de esta -

subunidad reconstltufa la actividad enzimatica.

Experimentos recientes han demostrado la existencia de

cambios conformacionales en la subunidad oC por acciôn de ATP - -

(4 1 2 ), asf como la Influencia de la subunidad sobre la conforma -

cion de la subunidad |î (414). De este modo, y suponiendo que las

propiedades observadas en el componente CC aislado no se vieran —

drasticamente alteradas al incorporarse en la enzima P^-ATPasa se

podrfa especular que la modificacion de la subunidad (X afectara a la

protefna conduciendo a una ectivacidn o inhibicion de factor . Es

tas modificaciones probablemente inducirian un cambio en la interac-

ŒÎo'h entre las subunldades que se reflejarfa en cambios conforma —

cionales de la protefna (392). En este sentido, existe una amplia

evidencia de cambios conformacionales en la enzima P^-ATPasa de

M . lysodeikticus ( 1 64.321 .3 23,415, apar tado 3 .7 .7 .) constl tuyéndose

esta extraordinaria flexibilidad conformacional en una de las principa

les caracterfsticas de este factor de acoplamiento. Distintas confor

mée i ones de la enzima pueden detectarse por cromatograffa hidrofo-

bica ( 416) , asf como por resultado de la adicion de distintos e fee to

res , por ejemplo cationes divalentes y EDTA (apartados 3,7, y 3 .0 .)

Este ultimo, ademés, puede disociar las subunldades minoritarias -

del resto de la proteina (apartado 3 .0 .) , Esta peculiar moldeabilidad

de la enzima podrfa ser una consecuencia de su multifuncionalidad -

(417).

4.3.2. Interacciones entre las subunldades v comportamiento catalf-

tico.

De lo anteriormente éxpuesto parece deducirse que la

subunidad p contiene el sitio cataiftico del factor F , mientras que -

la subunidad c i puede constituir un polipéptido regulador. Sin embar-

- 2 6 0 -

go, una interaccion apropiada entre ambas subunldades aunque no ne-

cesariamente en una relacion equimolecuiar, parcce ser esencial pa

ra la expresion de la actividad enzimatica. Quizas la subunidad ^ , -

aun en pequena proporcion, podria requerirse para configurer esta -

estructura funcionalmente activa. Este posîble papel de la subunidad

proviens principalmente de estudios de reconstitucion. No obstante, en

experimentos de digestion proteoiftica esta posibilidad no parece tan -

évidente. Estos hechos podrian explicarse asumiendo que la forma -

cion del nucleo (O ^+pr) a partir de las subunldades aisladas requiè

re la presencia de g (experimentos de reconstitucion) , mientras que

en los ensayos de digestion proteoiftica dicho nucleo ya se haya pre

formado.

Como puede apreciarse, se ha avanzado bastante en -

la elucidacion de las subunldades responsables de la actividad ATEé

sîca en los distintos factores , observandose grandes analogfas -

entre los mismos. Pero d cûal es el proceso a nivel molecular por

el cual la enzima hidroliza el ATP? Esta es una interrogante que -

todavfa permanece por aciarer. Sin embargo el trabajo pionero de

Perguson y col. (270) ofrece ideas sugestivas a este respecto. Es

tos autores observaron que la modificacion de una unica subunidad

^ con N BD—Cl producia una pérdida total de là actividad del fac -

tor P mitocondrial. La presencia de très o quizas dos subunldades

p (véase fntroduccion) , aparentemente homogéneas al purificarlas-

(83,160,212), sugiere la posible existencia de asîmetrfa en la mis-

mas inducida por la fijacion de ligandos. Asf, la pérdida de activi -

dad ATPésica podrfa explicarse en termines de interacciones es en

claies entre subunldades, de modo que la modificacion de un aminoé

cido esencial en una subunidad, împosibililase por medio de un cam

bio conformacional (6 impidiendo un cambio conformacional necesa-

rio) la manifestacion de actividad en cualquier otra subunidad.

- 2 6 1 -

Ademés, se han descrifo Iransicîones entre distintos es-

lados astables en esta enzima P^-ATPasa, dependientes de la tempe

ratura (419) y de distintos efectores (256,420,424), mostrando aigu-

no de estos est ados cooperatividad negativa (419). La posible exis —

tencia de sitios cataifticos alternatives (421,422) siguiendo un mecanis

mo similar al denominado "fllp-llop" (423) constituye una hipotesis bas

tante atractlva y plausible para este sistema. Tal mécanisme permiti-

ria un aprovechamîento gracLial de pequenos "paquetes" de energîa -

en la sfntesis de A TP . De esta manera, el sistema disehado para -

acoplan la oxidaclôn al proceso de fosforüaciôn operarîa en una situa

cion més proxima al equilibrio termodinémico, incrementéndose la ef|_

ciencia del acoplamiento energético.

El présente trabajo también ha reallzado una importante

contrîbuclon al esclarecimiento a nivel molecular del proceso cataifti

co, derrvostrando la interaccl6n, més o menos intensa de los iones -

metélicos con la enzima y ponîendo de manifiesto su importante e fee to

catalrtico y regulador (véase apartado 4 .5 .).

En cualquier caso, el comportamiento cinético de ia en

zima es dfffcil de abordar (véase Introducciôn) ya que en el medio -

de reacciôn siempre se encuentran très parémetros; nucieotido libre,

cationes libres y ATP.fvIe^ » interaccîonando cada uno de estos ligan

dos con la protefna y provocando distintos e fee tos todavfa no totalmente

conocldos.

4.4. UNION DE F-ATPasa A

MEMBRANAS.

- 2 6 3 -

4 . 4 . 1 . R e q u e r i m i e n t o s i o n i c o s .

El estudio de la reinsercion "In vitro", afiadiendo Fj-ATRa

sa a membranas desprovistas de dicha enzima, ha puesto de manifies

to que la presencia de cationes divalentes es necesaria para la forma-

cion de complejos BF^-membrana astables (384) . Estos requerimientos

ionicos no parecen ser totalmente inespecfficos, es decir, su papel no

parece llmitarse a una simple compesacion de cargas sobre la super

ficie de la membrana, ya que la adicion de cationes divalentes diferen-

tes provoca'distintos grades de reinsercion de la proteina. El empleo

de dilerenfes procedim i en tos para solubilizar la enzima, reinsertada en

la membrana en presencia de distintos lones multivalentes, podria cons,

tituir un reflejo de una disposicion dilerente del factor BF| en la mem

brana, segun el cation utilizado en la reinsercion. En este contexto, -

una interaccion directa del ion correspondiente con fa enzima parece -2+

obvia. Dentro de los distintos cationes ensayados, los iones Mg son

los unicos en conseguir una reasociacion del factor BF a la membrana

de tai forma que las membranas as F obtenidas comparten propiedades -

analogas con las membranas natives, o dicho en otras palabras, los lo 2+

nes Mg parecen inducir una fijacion de la enzima a la membrana con

tugnificado fisiologico. Asi, se requieren identicos procesos para solubi

lizar la enzima en ambos tipos de membrana. De particular interés es

la imposibilidad de extraer el factor BF por accion de agentes quolan-

tes (EDTA,EGTA) o por "choque osmotico" en presencia de pequenas

cantidades de cation divalente.

For otra parte, un porcentaje pequeno de F^-ATPasa puede

reinsertarse en la membrana sin necesidad de ahadir Mg , no a fee tan

dose por un tratamiento previo de la membrana con agentes quelantes.

Este hecho podria deberse a la presencia de dominios hidrofobicos so

bre la superficie de la enzima (339,416). Es de destacar que este por

centaje de reinsercion en ausencia de iones multivalentes sea dependîen

- 2 6 4 -

tG del contenido en subunidad ^ de la enzima (véase apartado 3 .6 .6 .),

aumentando al increm en tarse la presencia de en la preparacion enzi

matica, lo que aboga en favor de una participacion de esta subunidad

en este tipo de interaccion.

No obstante, el requerimiento de cationes divalentes en la —

reinsercion de la molécule de -ATPasa a la membrana no explica el

modo en que estos se ven implicados en la asociacion "in vivo" de la -

proteina con la membrana. En este sentido, pueden aventurarse très —

posibles funciones, no excluyentes entre si, para estos cationes divalen

tes ;

a) Pueden actuar como puentes ionicos entre la enzima y la

membrana.

b) Pueden actuar como eiementos compensatorios de cargas

negativas localizadas en la superficie de la membrana, e

liminando o dismînuyendo posibles repulsiones electrosla-

ticas entre la molécufa de F -ATPasa y la membrana.

c) Pueden producir cambios conformacionales en la molécula

de Fj - ATPasa a fin de lograr una determinada conforma -

cion més favorable para su asociacion con la membrana.

Los resultados descri tos en este trabajo favorecen la pri

mera y ültima alternativas, mientras que la segunda posibilidad no po

dria explicar por si sola diversos hechos expérimentales, taies como:

especificidad por distintos cationes en la reinsercion y asociacion "fi-

siolôgica" de la enzima con la membrana en presencia ünicamente de 2 +

iones Mg . La induccion de cambios conformacionales en la molécula

de Fj -ATPasa por adicion de iones metélicos divalentes ha sido pu es ta

de manifiesto en este trabajo (véase apartado 3.7.7.) aunque su reiaciôn

con la constitucion del complejo enzima-membrana permanece por diluc[

dar, asi como el hipoiético pue n te ionico entre el factor BF y la mem

brana. Si este ultimo punto se confirmase, los iones Mg^ debertan in

— 2 6 5 —

teraccionar entre cierlas partes anionîcas de la molécula de -ATPasa

y de la membrana, de ,tal forma que se obluviese una dîsposicion mole-2 +

cular de la enzima en la que los iones Mg se encontrarian protegidos

trente a la accion de los agentes quelantes, impidiendo de este modo la

solubilizaciôn de la enzima por estos medio s .

Estos resultados que demuestran la importancia de los iones2 + ^

metélicos divalentes, y en particular de los iones Mg , en la union del

factor Bf=j a las membranes de M. lysodeikticus . concuerdan con los ob

tenidos por Abrams y col. (204,426) en S . faecalis , si bien estos auto_

res no realizaron un estudio de la fijacion del factor BP en la membra

na en funcion de distintos iones divalentes, si no que se limitaron a estu_2+

diar el papel del cation Mg en la reconstitucion "in vitro" del complejo

BPj -membrana.

Por otra parte los estudios de reinsercion y solubilizaciôn Ile

vados a cabo (véase apartado 3 .6 .) , sugieren que la molécula de Pj -

ATPasa se encuentra unida a la membrana mediante dos tipos de interaç2 +

clones : una interaccion en la que participarian iones Mg y otra que --

probablemente séria de tipo hidrofôbico. De este modo, el tratamiento de

las membranas con tampon a baja fuerza iônica conducirta a la Itberaciôn

de la enzima por fa combinaciôn de dos efectos, un debiIItamiento de las

interacciones hidrofôbicas y una lixiviacîôn de los cationes multivalentes.

De esta manera una de las numerosas funciones de los iones2+

Mg "in vivo" serta mantener unida la enzima Pj -ATPasa a la membra

4.4.2. Datos cuantitativos.

I—os aspectos cuantitativos de ia union "in vitro", estudiados por

adicion de distintas cantidades de P -ATPasa a una canlidad constante de

membranas desprovistas de BP , permîtieron determinar que la enzima2^

se reinserta a la membrana en presencia de iones Mg siguiendo una -

— 2 6 6*"

curva de saturacion, alcanzéndose esta a un valor aproximado de 100

pg de -ATPasa unida/mg de protefna de membrana. Este valor se

correlacionaba perfeclamente con estîmaciones previas de la cantidad de

Rj -ATPasa présente en las membranas nativas de M. lysodeikticus

(152). Estas caracterfsticas del sistema de reinsercion indican que la

membrana présenta un numéro bien definido de sitios receptores que -

son especflicos para la enzima. Ademés, ya que el maxime grado de

reinsercion de ia enzima restaura la actividad especifica original de la

membrana, puede concluirse que todos los sitios receptores se encuen

tran totalmente ocupados en las membranas nativas. Esto se confirmé

por la incapacidad de reinsertar enzima adicional a las membranas na

tivas.

4.4.3. Papel de la subunidad ^ .

La identificacion del componente polipeptfdico en el factor -

BR| de M. lysodeikticus fue decisive para entender la union de la enzi_

ma a la membrana (304). Tan to los estudios de digestion proteoiftica -

como los de reconstitucion "in vitro" del complejo BP^-membrana a —

partir de distintas formas de Pj -ATPasa indican el papel de la subuni

dad A en la reinsercion de la enzima a la membrana. La Tabla XLI -

resume los grados de reinsercion a membranas obtenidos con distintas

preparaciones enziméticas defectivas en aiguna subunidad. Estos datos

sugieren la participacion esencial de la subunidad en la union de la -

enzima a la membrana y, al mismo tiempo, indican la presencia de al

menos dos copias de componente por mol de enzima.

Este papel asignado a la subunidad ci de este factor de aco

plamiento se corresponde con una mayor hidrofobicidad relativa de dicho

componente con respecto a las subunldades oé , ^ y ^ (véase Tabla —

XLII) .

Experimentos recientes llevados a cabo en nuestro laboratorio

- 2 6 7 -

T A B L A X L I

REINSERCION A MEMBRANA DE DISTINTAS PREPARACIONES

DE -ATPasa DE M. LYSODEIKTICUS

Relacion molar de subunidades

de la enzima% Reinsercion ®

. . 2+-Mg 2++Mg^

a

13 * S 18,50 70,65

^3 y J a9,5 43, 8

^3 f sa

10,3 43,5

""3 P3 ^ . 3b

7, 15 7, 20

° 3 ( 3c

7,15 0, 05

Obfenida por el mélodo normal de aislamiento y pu ri II ;acion de la en

zima.

Obtenida por digestion proteoiftica de la molécula de -ATPasa puH

ficada.

Obtenida por tratamiento de la molécula de P -ATPasa purfficada con

EDTA,

Hace referenda al grado de reinsercion obtenido en presencia de -

Mg^ 2 0 mfvt.

Porcentaje respecto del total de enzima présente.

- 2 6 8 -

(/)tui-Ztutrt5'Uo

-0

M3

mn

o nt «Ou> ^ is o »o r* f m N m <o oi

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I :

J 2

— 2 6 9 —

apoyan esta conclusion. El tratamiento de las membranas natives con

tripsîna no afecta a la subunidad cî de la enzima (Larraga, V . y Mim

brera, A ., comunicaciôn personal) indicando una cierta proteccion de

la mîsma trente a la accion proteoiftica por parte de la membrana.

P o r otra parte, el hecho de que el complejo (06 + ) solo

pueda re insertarse en la membrana mediante la adicion conjunta de las

subunidades m inoritarias, ^ y , y no por la adicion de cualquiera de

eilas individualmente (apartado 3 . 8 . ) parece sugerir que la subunidad ^

se requlera para la union de la subunidad ^ al resto de la protefna —

-A T P a s a . En este sentido, Munoz y col. (365) han demostrado la

proximidad de ambas subunidades, ^ y & , en et factor BP de M . Ivso-

deikticus mediante estudios con agentes entrecruzantes.

El papel de las subunidades minoritarias en la union del fac

tor Pj a la membrana parece constituir una propiedad general de todos

los sistemas estudiados (141,189,202-205,384). Sin embargo, este Ira

bajo no apoya la idea de que la subunidad d. o cualquiera de sus frag

mentes juegue un papel en la reinsercion de la -ATPasa de M. Ivso-

deikticus a la membrana, confirmando de esta manera observaciones —

previas de Salton y Schor (134) .

Estudios de reinsercion realizados en la enzima P -ATPasa

de E .coli indicaban que las subunidades y è desempehaban un papel

crftico en la union de la protefna a la membrana (207,395,428). Sin em

bargo se ha descri to que las subunidades o6 de algunos factores de aco

plamiento también pueden jugar un papel en la union de F -ATPasa a la

membrana. Abrams y col. (205,366,429) obluvieron una digestion limitada

del factor BF de S . faecalis por tratamiento con quimotripsina. Esta pre

paracion contenta tas subunldades o6 modificadas, con un peso molecular,

determinado por electroforesls en gel de poliacrilamida en presencia de -

SDS, aproximadamente 2.000 dalton inferior al correspondiente a una

subunidad 06 normal. Esta enzima modi ficada (no se detectaron alteracio-

- 2 7 0 -

nes en las subunidades > , ^ y 5 ) posefa una activldad enzimatica

normal, pero era incapaz de unirse a membranas. Estos autores sugi-

rieron la existencia de pequenos fragmentes de subunidad d , sensibles a

quimotripsina, que sobresalian de la molécula de P -ATPasa y se re-

querirfan para su union a la membrana, posiblemenfe a través de inter

acciones con sitios especflicos. Tratamientos de P -ATPasa de E .coli

(115,427) y de Mycobacterium phleî (430 ) con tripsina provoc aban mo

difie aciones similares de las subunidades oCy pérdida de la capacidad de

reinsercion a la membrane. Sin embargo, la degradacion simultanée de

las subunidades i y £ de ECP^ dificultaba la inter pre tacion de los re-

sullados. Recienlemente Dunn y col. (431) han indicado en experimentos

de reconstitucion de la molécula de -ATPasa a partir de sus subuni_

dades que enzimas reconstituidas conteniendo subunidades oC modi ficadas

por la accion de tripsina o quimotripsina, con la consiguiente pérdida de

15 6 19 residues respectivemente de la region amino terminal, se mos-

traban incapaces de unir subunidad ci . Este hecho proporciona una ex-

piicacion de la pérdida de la capacidad de reinsercion a membrana, ya

que el papel de ia subunidad ^ en la union de ECP^ a membranas ha -

sido ampliamente documentado ( 207,395,432) . En este sentido, Bragg

y Hou ( 433 ) han demostrado la proximidad de las subunidades d y ^ en

ECP mediante estudias con agentes entrecruzantes,

Todos estos resultados parecen generalizar el papel de la sub, 2+ ,

unidad o y de los iones Mg en la union "fisiologica" de la enzima P -

ATPasa a la membrana. Sirr embargo, como ya ha sido comentado al

comienzo de este apartado, la protefna puede reinsertarse en la membra

na en diferentes formas, no todas con un significado fisiologico.

Serfa muy Interesante realizar un estudio de la union de la en

zima a membrana en los factores BP de B .megaterium. S.subtilis y for

mas L. de Proteus (114,110,119), constituidos ünicamente por las subu —

nidades (X y (3 . Este estudio resultarfa altamente rentable , ya que nos

- 2 7 1 -

darfa una informacion muy valiosa sobre si la estructura de estas enzi

mas "In vivo" se corresponde con la descrita para las enzimas purifica

das o cons tan de un mayor numéro de subunidades que se hebrian diso

ciado durante el proceso de aislamiento y purificacion de la proteina de

bido a su débil interaccion con el resto del factor de acoplamiento, como

ocurre en M. lysodeikticus. Si esta ultima posibilidad fuese correç

fa, se ampliarfan las analogfas estructurales entre las enzimas transduc

toras procédantes de orfgenes distintos.

4.4.4. Reinsercion de las subunldades aisladas.

El estudio de la reinsercion de las subunidades aisladas del

factor BP de M . lysodeikticus a la membrana présenta ciertos hechos -

notables. Las subunldades mayoritarias de la enzima, 06 y , mani-

fiestan una elevada capacidad de reinsercion, aùn en ausencia de iones

multivalentes. Este hecho oodrfa explicarse por la oresencia de domi

nios hidrofobicos en sus superficies (339). Sin embargo, al constituir

se et complejo (06 + ^ ) se pierde totalmente esta capacidad de reinser

ciôn, lo que podrfa indicar una contribucion de los enlaces hidrofobicos

en el mantenimlento de la estructura del complejo. Una conclusion sirm

lar se obtuvo de los estudios de desnaturalizaciôn por pH en la P -

ATPasa de M . lysodeikticus (164).

La relativamente débil reinsercion a membrana de la subun|

dad aislada en presencia de SDS puede atribuirse al método emplea

do en su aislamiento, como queda puesto de manifiesto en el caso del

componente y en el apartado referente a las propiedades inmunoquf-

micas de la enzima (véase Resuhados) . En cualquier caso, la adicion

de subunidad incrementa, en todos los casos ensayados, el porcen

taje de reinsercion del resto de las subunidades de la enzima.

Todos estos resultados parecen indicar la existencia de si

tios de fijacion a membrana en las subunidades 0( , ^ y 6 aisladas, de

- 2 7 2 -

los cuales solo permanecerian funcionalmente actives los correspondien-

tes a la subunidad cuando se considéra la reinsercion "fisiologica" de

la molécula de P -ATPasa. Asimismo, se pone de manifiesto la altera

cion de las propiedades de las subunidades d y ^ aisladas cuando estas

se encuentran en el factor BPj .

La disminucion del porcentaje de reinsercion del componente

en presencia de cantidades elevadas de cadena polipeptfdica od o ,

sugiere una interaccion de los sitios de fijacion a membranas de las res

pectivas subunidades cL y ^ con aquellos correspondientes a la subunidad

6.

4.5. PAPEL DE LOS IONES

METALICOS EN LAS

Fj - ATPasas.

- 2 7 4 -

4 . 5 . 1 . L a s - A T P a s a s c o m o m e ta lo p p o te in a s .

El presente trabajo muestra una serie de experimentos que

permifen identificar la presencia de zinc como un componente intrfnseco

de la enzima -ATPasa de M. lysodeikticus v esencial para su activi

dad catalftica (434) . La estequiometrfa en que este ion metâlico se en

cuentra en la proteina puriîicada parece ser aparentemente de 1 atomo-

gramo por mol de BP , si bien no puede descartarse la posibilidad de

que en su es tado natîvo contenga mas de un étomo metélico por molé

cula de proteîna. La presencia de zinc fue ya sugerida en Pj—ATPasa

de E.coii (435), sin embargo no se ofrecia una evidencia directa y —

concluyenle. En el ci tado trabajo se indicaba un contenido de 4,1 Zn/Fj

en una preparacion parcialmente purificada de Bf= de E .coli . Estudios

recientes realizados por Senior y col. (436) sobre P^-ATPasa purifica

da de E . coli muestran un contenido en étomos metélicos de 2 Mg/ECP^

junto con cantidades subestequiométricas de Zn y de 1 a 2 Pe/ECP^ . -

El procedimiento de purfUcacion utilizado en este ult imo caso darîa una

preparacion de - ATPasa aitamente purificada, lo que probablemente -

explicarîa las diferencias encontradas en ambos laboratorios. Por otra

parte se ha detectado magnesio como un componente luertemente fi j ado -

al factor P mitocondrial de corazon de buey (436,437) habiéndose de

mostrado que es esencial para su actividad enzimética. La presencia de

hierro no se ha detectado en todas las muestras de P -ATPasa o no se

ha encontrado en cantidades estequiométricas (436 , 437 , 438) , sugiriéndose

que estos iones metélicos podrian unirse a sitios de baja afinidad. Sin -

embargo, se ha identificado la presencia de 6 Pe/Pj en el factor F=j m[

tocondrial de hîgado de rata (439). Este hecho condujo a Santiago y

Lopez-Moratalfa (440) a proponer un modelo para la fosforilacion oxida

tiva basado en la interconversiôn del complejo de ATPasa entre dos for

mas, oxidada y reducida, por una reaccion redox reversible. Los re-

- 2 7 5 -

sultados obtenidos en el presents trabajo sobre una -ATPasa bacte-

riana no permiten evldentemente !a aplicacion de dicho rrtodelo a este -

factor BP^ .

En cualquier caso la deteccion de iones metélicos, esencia

les para la actividad enzimatica, en las P^-ATPasas mitocondriales - -

(436,437) y bactorianas (434) permits clasificar a estas enzimas como

metaloproteinas, abriendo nuevas perspectivas para entender sus pro

piedades estructurales y funcionales- I—as diferencias en la naturafeza

del l6n metélico esencial para la actividad ATPésica , dependiendo del

origen de las enzimas transductoras de energia, podrian constituir una

explicacion molecular al diferente comportamiento cataiitico de las mis-

mas.Asimismo, la identificacion de estas enzimas P^-ATPasas

como metaloproteinas puede explicar observaciones previas que hacian

referenda a la deteccion de hidrôlisis de ATP sin adicion de cationes

divalentes (152,232-236) en preparaciones de P -ATPasa de S . faecalis.

f\/1. lysodeikticus . A. faecalis y mitocondrias, que se inhibia en presen

cia de EDTA. Asimismo los experimentos lie vados a cabo por el grupo

de Crane con agentes quelantes encuentran ahora una nueva justificacion.

Es bien conocido que agentes quelantes lipofilicos inhiben la cadena —

transportadora de electrones y la actividad ATPésica asociada a mem

brana en mitocondrias, cloroplastos y E.coii (441-443), En estos es

tudios también se mostraba que la solubilizaciôn de la Pj -ATPasa era

acompahada pon una a parente disminucion en el efecto inhîbitorio de es

tos agentes quelantes cuando se encontraban presentee en el medio con

centraciones elevadas de Mg (>10 mfvl) . Sin embargo, en presencia

de bajos niveles de f^g^ (’*?2 mfvt ) determinadas sustancias complejan-

tes de iones inhibfan la actividad ATPésica soluble (435,442). Estos

hechos condujeron a Sun y Crane (435) a concluir que la Pj - ATPasa

de E .coli contenia zinc que se protegia de la accion de los agentes —

- 2 7 6 -

2+quelanles por cone en tr aciones elevadas de Mg o por la asociacion de

la enzima a la membrana. Ademas, estos autores proponfan la existen

cia de otro sitio sensible a la accion de agentes quelantes lipofilicos en

la membrana que controlaba la actividad de la proteina unida a membra

na.

En este sentido es interesante observer las diferencias exis

tentes en la respues ta de distintas P^-ATF^sas de M. lysodeikticus (434)

E .coli (435) y mitocondria (437), frente a fa accion de diversos agen

tes quelantes. Estos resultados podrian sugerir la presencia de distintos

iones metélicos y/o sitios en las -ATPasas que presentarian una —

accesibilidad variable al ataque de los agentes quelantes, dependiendo -

del estado soluble o asociado a membrana y del origen de la enzima.

4,5.2. Punciones estructurales y cataliticas de los iones metélicos di

valentes .

El papel de los iones metélicos divalentes en estas proteinas

puede ser estructural y funeional. Este comportamiento dual puede ser

efectuado por los iones metélicos intrinsecos, es decir, por aquellos -

que se encuentran luertemente unidos a la proteina y que confieren a

esta el caracter de metaloproteina. Ctros cationes divalentes pueden -

regular ia actividad (actùan como activadores o inhibidores) , bien di-

rectamente o a través del complejo Me -A TP . En este sentido, la

apoproteina (P-ATPasa libre de ion metélico) séria inacliva incluso2+

en presencia del mejor sustrato Me -A TP y a su vez, la metalopro

teina requeriria la presencia adicional de cationes para hidrolizar el -

ATP, Por lo tanto, el papel de los iones metélicos divalentes parece

més complejo que el que originalmente se supuso (439,440). Asi, la2+

presencia de iones Zn en el factor BP de M. lysodeikticus consH

tuye una condicion necesaria pero no suficiente para la manifestacion

- 2 7 7 -

de la actividad ATPâsica, requlriéndose la subsiguiente adicion exter- 2+

na de Sones Ca

Es de gran importancia mencionar que los resultados obte

nidos con una -ATPasa bacterîana (434) asî como los descritos por

Senior y col. (436,437) sobre -ATPasa mitocondrial, sugieren la

existencia de diferentes iones metélicos y/o sitios de fijacion implicados

en las propiedades cataifticas de las f=j - ATPasas. En este contexte,

los resultados aqui descritos favorecen la idea de que cada ion metal£

co descmpeha un papel distinto y especîfico. Esto es particularmente2+ 2+

evident© para los iones Zn y Ca que parecen ser los efectores

natural©s de la F=j -ATPasa de M . lysodeikticus. no siendo sus funciones

intercaimbiabfes. La especificidad en el papel de otros iones metélicos2+ 2+ 2 +

diyalenstes taies como Mg , Mn y Hg también se deduce de estos

estudios. Sin embargo, estas interpretaciones sobre la especificidad

de de term inados iones metélicos deben ser consideradas con cierta -

cautela en el sentido de que las diferencias observadas al incubar d[

chos cationes con la enzima pueden ser atribuidas a efectos de com-

peticion entre el aniôn del tampon empleado y la proteîna por los iones

metélicos ( 444) .

Este comportamiento dual por parte de los iones metélicos

parece estar bastante extendi do entre las metaloproteinas que pudiera

mos denomînar convencionales, taies como, fosfatasa alcalina y su-

peroxido-dismutasa. Simpson y Vallee (445) demostraron la existen

cia de dos clases de étomos de zinc en la fosfatasa alcalina de E.coii .

mientras que Anderson y col. (446) han identificado, més recientemen

te, magnesio en la misma enzima, poniendo de manifiesto su importât^

te papel regulador en la actividad enzimatica. Por otra parte, Valen

tine y col. (447) han descrito, en la superoxido-dismutasa de eritrocl2+

to boviino, una mjgraciôn de iones Cu dependiente del pH al sitio de

fijacion del zinc cuando éste se encuentra vacio, discutiéndose una hi-

- 2 7 8 -

potéfica funcién fisiologica.

Por otra parte, los estudios llevados a cabo en el presen

te trabajo sobre la influencia de ciertos cationes divalentes en las —

propiedades opticas de la Fj-ATPasa de M . lysodeikticus . indican,

una vez mas, el grado de flexibilidad de esta proteîna asî como el2+

interesante efecto de Ca , m anteniendo una cierta conformée ion de2+

la proteîna. Este hecfio junto con la notoria dependencia de Ca -

de la actividad ATPésica de este factor BPj podrîa sugerir que cÿ

cha conformacion constituyera un requisite previo para la funcion ca-

taiîtica de la enzima.

De esta manera parece deducirse la posible existencia de

dos sitios para iones metélicos que jugarîan importantes papeles es

tructurales y regulatorios en el factor BPj de M. lysodeikticus (434,

448). En este sentido, se ha mostrado evidencia de la modulacion

de los cambios conformacionales y de la actividad enzimética en es

te factor BP por cationes divalentes (446 y apartado 3.7.7.) . Es

ta funcion reguladora que se asigna a los iones metélicos divalentes

en la Pj -ATPasa de fvf. lysodeikticus puede , muy probablemente, -

extenderse a otros factores Pj • Asî, se ha sugerido que la interaç 2+

cion de Mg con P mitocondrial conduce a una lenta iransîciôn con

formacional de la enzima (256,449).

Por otra parte, el efecto disociante del EDTA sobre el

factor BP de M. lysodeikticus (apartado 3.8.) sugiere que la pre

sencia de iones multivalentes desempena una funcion importante en

el mantenimiento de la estructura cuaternaria de la enzima. Concrs

tsmente, y de los experimentos descritos en este trabajo, parece

deducirse que la subunidad ^ se encuentra unida al resto de la enzi

ma mediante iones multivalentes. En este sentido, es significative

que los experimentos de reconstitucion realizados a partir de las sub

unidades aisladas de los factores P de bacteria termofila PS^ (176,

- 2 7 9 -

208) y de E .coli (199,395) requieren la presencia de iones Mg^ ,

asf como la pjrificacion del factor BPj conteniendo todas sus subun[

dades en S . fiecalis (204).

4.6. RJACION DE Pi,

— 28 1 —

4 . 6 . 1 . C a r a c t e r ts t icas d e la f i ja c io n .

En la acfualidad es generalmente aceptado cpje las enzimas

Fj-ATPasas constituyen el ultimo eslabon en el proceso de la fosfori

lacion oxidativa, catalizando la sistesis de ATP a partir de ADP y

P i, por lo que parece razonable esperar que dichas enzimas posean

sitios de fijacion para Pi.

De los resultados descritos en el apartado 3.9. puede de

ducirse que el Pi se une al factor de M. lysodeikticus sin necesi

dad de ahadir cationes divalentes (454) , lo que indica una évidente dî

dîferencia con la fijacion de Pi en las enzimas homologas de E .coli y

mitocondrias de corazon de buey (265,266,380), ûnicos sistemas en

les que se ha abordado este tema.

Aparentemente, la enzima Pj -ATPasa de M. lysodeikticus -

muestra un unico sitio de fijacion para Pi, caracterizado por una cons

tante de dîsociacion de 185 a pH 7,5. No obstante, debe indicarse

que esta constante de disociacion fue c a leu fada asumiendo que todo el

Pi présenté en la mezcia de reacciôn era capaz de fijarse al factor -

BF . La fuerte dependencia de la union de Pi por el pH podria suge_

r ir que una unica especie iônica de fosfato participa en la reacciôn de

fijaciôn, que un grupo ionizable y especîfico sobre la proteîna esta sien

do titulado o que determinados cambios conformacionales importantes -

es tan teniendo lugar en la proteîna. Estos valores obtenidos con BF -

pueden compararse con la constante de disociacion de 1,5 mM calcula

da para el complejo miosina. Pi (453). Por otra parte, el valor rela

tivamente bajo de la constante de disociacion podrîa sugerir que el Pi

se hubiese fijado al sitio de sfntesis de ATP, o bien que ia enzima se

encontrara en una cierta conformacion que di fieu Itase la disociacion del

complejo Fj -ATPasa. P i, independientemente del sitio de fijaciôn del fos

fato, ya sea un sitio cataiîtico de hidrôlisis, de sîntesis (en el supuesto

- 2 8 2 -

de que sean dis(inlos) o un sitio regulador. En este sentido, se ha

descrito que el fosfato inorganlco . se muestra como un Inhibidor com

petitivo del factor de S . taecalis (128). Experimentos recientes

sobre E^-ATPasa de M. lysodeiklicus tambien sugieren un efecto in-

hibilorio del Pi sobre la aclividad ATPasica de fa enzima purificada

(Mollinedo, E. , observaciones no publicadas) .

La temperafura ejerce una gran Influencia en la fljacion,

presenténdose un efecto opuesfo al observado sobre la aclividad hi-

drolitica del ATP (véase aparlado 3 .4 .3 .). La fijacion de Pi au-

menta al disminuir la temperatura, lo que también podria alribuirse

a una menor reversibilidad de la fijacion en estas condiciones.

Por oira parte, la incubacion de la enzima con cantidades

elevadas de Pi pone de manifiesto la presencia de un segundo sitio

de fijacion. El estudio de estos nuevos sitios présenta Interesantes

perspectlvas en relacion con posibles interacciones cooperativas -

entre las subunidades de este factor BE .

4.6.2. Efecto de nucieotidos. cationes divalentes v agentes quelan-

tes.

Los resultados descritos en el apartado 3.9.4. muestran

una cierta relacion entre los agentes que inhiben la fijacion de Pi y

aquellos que inhiben la actividad hldrolftica de la enzima.

Tanto ATP como su analogo, AMP-PNP, inhiben la fija-

ci6n de Pi, mientras que ADP, ahadido en las mismas concentracio

nes, no muestra ningun efecto. La relacion entre el sitio de fijacion

de Pi y los restantes sitios de fijacion sobre este factor BEj es de

considerable interés. Si ta union del Pi a la enzima tuviese lugar en

un sitio de union de nucleotido podria sugerirse con bastante plausilD

lidad que el sitio de fijacion de Pi coincidiese con aquel del grupo --

- 2 8 3 -

y —fosfato del ATP . Sin embargo un posible desplazamiento del Pi u

nido a la enzima por adicion de ATP podria relacionarse con la pre

sencia de sitios cataliticos alternatives, como se comento en el aparta

do 4.3.2.

La observacion de que la fijacion se inhibe por EDTA pare

ce sugerir la participacion de iones metalicos multîValentes en la reac-

ci6n de fijacion. En este sentido y debido a que no se requiere la ad[

cion de cationes divalentes para la asociacîon de Pi a la enzima, el e

fee to del EDTA implicaria una accion directe sobre ciertos iones me-

télicos fuertemente unidos al factor BF .

Por otra parte, el distinto comportamienlo de dos cationes

divalentes, Ca^ y Mg^ , sobre la fijacion, activando el prîmero e —

inhibiendo el segundo puede reflejar la existencia de efectos alostéricos.

Para encontrar un significado fisiol6gico, si existiese, a es

la fijacion de Pi debe realizarse un mayor numéro de experimentos.-

Las experiencias descrilas en el apartado 3.9. constituyen solamente

el comienzo de un trabajo futuro encaminado hacia el conocimiento del

numéro méximo de sitios de fijacion, de la relacion de estos con los

sitios cataliticos o de fijacion de ligandos y de la posible existencia de

efectos cooperativos y/o alostéricos en este factor B .

4,7. RESUMEN DEL ESTUIDIO

DE LA ENZIMA R_ATPasa

DE MICROCOCCUS

LYSODEIKTICUS.

- 2 8 5 -

Esfe trabajo ha contribuido apreciablemente a un mejor

conocimiento de los aspecios estructurales y funcionales de las en-

zimas transduc lor as de energfa y , en particular, de la aîslada a

partir de membranas de M. Ivsodeikticus. La Tabla XLIII ilustra de

forma esquemélica las propiedades mas sobresalientes de este fac_

tor de acoplamiento bacteriano.

La enzima P^-ATPasa de M . Ivsodeikticus constituye la

parte hidrosoluble de la ATPasa translocadora de protones de esta

membrana bacleriana (223). Como ya se ha mencionado anterior-

mente, su solubilizacion de la membrana se efectua mediante lava-

dos ccn tampon de baja fuerza ionica (123,124). Este proceso da

lugar a una enzima P^-ATPasa soluble, cuya actividad ATPasica

se muîstra estîmulable por trîpsîna (152). Esta iatencia de la ac

tividad enzimética se ha explicado por la presencia de un péptido

inhibidîr de 25.000 dallon (330), sensible a tripsina y debilmen

te unico a la enzima. No obstante, algunos resultados descritos en

el présente trabajo hacen cor responder al mencionado péptido inN

bldor jn peso molecular méximo de 13.000 dalton (apartado 4.1.)

en corcordancia con los otros sistemas Fj estudiados. La solu-

bîlîzacôn selectiva de la enzima también puede realizarse median

te urea 1,5 M (aparlado 3 .6 .3 .), obteniéndose en este caso una

preparacion de enzima soluble no estîmulable por tripsina. La ex-

traccicn de la proteina por tratamiento con cloroformo, utilizada

ampllamente en otros factores (véase Introducciôn) , no se mues

tra eficaz en el factor E3P| de M. Ivsodeikticus . al no solubilizar -

un pcrcentaje del mismo superior al obtenido mediante lavados de

membrana con tampon a baja fuerza iénica y dar lugar a prepa-

racion?s de pj-ATPasa con un patron elecfroforético complejo al

analizcrlas por electroforesis en gel de poliacrilamida en presen

cia de dodecil sulfato sédico (Pivel, J .P , , Carreira, J. y Molli-

- 2 8 6 -

TABU.A XL.ni

P R O P tE D A D E S D E l_A E N Z IM A -A T P a s a DE Mtcrococeus lysodeiklicus

ProDtedad Rafaranela

Paso molecular

Coeflclenla da sadimeniacfén

/Volumen especllleo parclal CooHclonI# Irlcctonal relatlvo Radio do la as fera eqjivalenta

340.000 ± 10.000 D430.000 D

13,6 + 0 , 2 3 0,720 + 0,005 mig" 1,34

75 1 2 ^

(319)(390)

(319)(390)(390)

(390)

Subunidades Oi (55.000 D) , (5 (50.000 D) , (35.000 D) , i (20.000 D) (384, esta trabajc^

Esloquiomeerfa probabla* ^ 3 ^ 3 ^ 2 ^ 2 0 3

(365,305, esta trabajo)

l_ebllldad a frio No (152)

pH 6ptlmo 7,3 (152)

Aclividad enzlmAiIca dapandlanio da c a Hones (152)

Inhlbldores da la i^lMdod dap endian la da Ca A D P , N" (152)

E D T A , ZIncon, l_-clslefna

H g ^ , Pa^^, Co^^, Cd '*’,

Mn^'*', Mg^”

(434,

(esta

este trabajcj

trabajo)

lones mel4Hcoa asociados luarlamenia a la enzima zp:»" (434, este trabajo)

Esiado flslolâglco Asoclada a mambrana plasmAitca (123)

Exlraccl6n da la membrana Lavados con tampon a baja fuarza fénlca; urea 1,5 M (124, aata trabajo)

TIpo da Iniaraccton con la mambrana MecHada por lonas Mg^ ; Inlaraccio

nos hldrol6blca#( ? ) (esta trabajo)

" 2 8 7 —

nedo, P ., observaciones no publicadas). L.a accion de agentes —

quelantes y de elvadas concentraciones de sales no extraen este -

factor de la membrana (apartado 3 .6 .3 .).

t_a purificacion de la enzima por filtracion en gel (152)

o electroforesis en gel de poliacrilamida a escala preparative (143)

da lugar a una -ATRasa no estîmulable por tripsina y capaz

de reinsertarse en la membrana bajo ciertas condiciones expéri

mentales (apartado 3 .6 .). Esta enzima purificada consta de cua-

tro cadenas polipeptfdicas distintas: oé , ^ ^ y ^(384 y apartado

4.1.) con pesos moleculares aproximados de 55.000, 5 0 .0 00 ,------

35.000 y 20.000 dalton respectivamente. Ademas, en num erosas

preparaciones del factor se observan polipeplidos asociados -

debilmente a la enzima que pueden disociarse con relative facilidad

por tratamiento con EDTA (apartado 4 .1 .). De igual form a, tam

bien se detecta la presencia de hidratos de carbono unidos de forma

no covalente al factor BF (apartado 3 ,8 .). El mantenimiento de la

estructura cuaternaria de la protefna parece obedecer a interaccio

nes fnidrofobicas y/o mediadas por iones mullivalentes (164 y Re

sultados). En cualquier caso, es évidente la debilidad de estas —

interacciones, obteniéndose preparaciones de enzima con un conte

nido distinto en subunidades segùri el método de aislamiento y puri

ficacion empleado (véase Resultados) . Este hecho constituye una --

car acier is lica general de todos los fac tores estudiados y podria

explicar el aislamiento de -ATPasas con un reducido numéro de

subunidades (114,118,119) y la microheterogeneidad de ciertas pre

paraciones de enzima (163,164,321,323). Ror otra parte, el em-

pleo de procedimientos diferentes para disociar distintos foc tores —

Rj en sus subunidades componentes: por frio, en E . coli (199); -

por agentes desnaturalizantes, en M. Ivsodeikticus y RS^ (208,339);

por agentes quelantes, en M . Ivsodeikticus (apartado 3 .8 .), etc, in

- 2 8 8 -

dica las grandes discrepancies refer en tes al tipo y/o grado de inton

sided de las interacciones que mantienen la estructura cuaternaria -

de las diferentes -ATPasas fransduc(oras de energfa. A este res

pecto, parece probable que al menos la subunldad ^ se una al resto

de la proteina por medio de iones multivalentes (apartados 3.8. y -

4.1.) en el caso del factor BPj de M. Ivsodeikticus.

I—os experimentos descritos en este trabajo favorecen una

estequiometria en subunidades de 6^, si bien debe indicar

se que al haber sido deducida a partir de experimentos de reconsti-

tucion, en los cuales no se llegaba a alcanzar una reconstitucion to

tal de las pro pie da des estudiadas (apartados 3.3.4. y 3 .6 .6 ,) , pue

de no ser del todo connecta. En este sentido no séria improbable la

presencia de alguna copia adicional del polipéptldo ^ (apartado 4.1.4.)

La comparacion de las composiciones de aminoécidos de

las distintas subunidades del factor BF de M. Ivsodeikticus muestra

un mayor porcentaje de residues no polares en la subunldad <S , sin

embargo este resullado no constituye una propiedad general de las

P^-ATPasas (véase Tabla LXll) . Lina caracteristica notable de las

subunidades constituyentes del factor Bf=j de M. Ivsodeikticus radica

en la aparente ausencia de residuos de cisteina (319). Este fiechor 14 1

so ve apoyado por la carencia de marcaje por I C I p-doro-mer.

curibenzoato (PCf^4B) cuando la enzima se incuba con este reactivo

en condiciones natives (Mollinedo, P ., observaciones no publicadas);

no obstante, se fian encontrado ciertos indicios que podrtan sugerir

la presencia de grupos -SH en la subunldad ^ de la enzima desna

turalizada (Mollinedo, P. , observaciones no publicadas).

La Tabla XLIV resume las funciones asignadas a cada -

una de las subunidades de este factor BP de acoplamiento.

Por otra parte se ha mostrado evidencia del papel desem

penado por los iones divalentes en esta P^-ATPasa. Asi, los iones

- 2 8 9 -

TABl-A XL.IV

FUNCIONES DESEMPENADAS POR LAS SUBUNIDADES DEL

FACTOR DE M. LYSODEIKTICUS .

Subunidad Funclon

se

“Junto con la.subunîdadip constituye

ta estructura minima con aclividad

ATPésica.

-Papel regulador.

-Centro calalitico de la tiidrolisis

de ATP,-Junto con la subunldad oC forma la

Referencias

(384, este trabajo)

(392, este trabajo)

(384, este trabajo)

(384, este trabajo) estructura minima con aclividad ATPasica

—Posible papel en la (ormacion de la

estructura minima ( ) con

aclividad ATPésica

-Unidn de la enzima a membrana.

—Inhibidor natural

(este trabajo)

(384, este trabajo)

(330)

- 2 9 0 -

Mg se requerirîan para la union fisiologica de la enzima a la menn

brana, mientras que otros cationes (Zn , Ca ) desempenartan - -

funciones estructurales y catalîticas. La identificacion de iones metà-

licos fuertemente asociados a la enzima (434, apartado 3 .7 .) repre

senta un importante avance en el conocimiento del mecanismo mole

cular de la transduccion de energia y abre nuevos caminos a estu-

dios de reconstitucion de actividad enzimética.

Todos estos datos, mostrados a lo largo del présente tra

bajo, ponen de manifiesto las grandes semejanzas existantes entre la

enzima Fj —ATPasa de M . Ivsodeikticus y a quelles procédantes de rrU

tocondrîas, cloroplastos y otras bacterîas; sîn embargo, también se

observan claras diferencias entre ellas. Estas diferencias son facil-

mente comprensibies si se tiene en cuenta el entorno tan diferente en

que ac lu an los diferentes fac tores P , las distintas funciones fisiol6g[

cas que desempenan y las diferentes condiciones regulatorias a que

se encuentran sometidos.

Se ha propuesto un modelo espacial para el factor BP de

M . Ivsodeikticus (365,417) que se ajustarfa en gran medida a los re

sultados olTtenidos en este trabajo. Este modelo, representado en la

figura 68, muestra la existencia de dos pianos en los que se situa-

rfan las subunidades c/ y respectivamente de una forma totalmen-

te asimétrica, en la cual la subunldad c/. serfa capaz de interaccio-

nar unicamente con una subunidad y en la que tas interacciones -

p “ no tendrfan lugar. Esta disposicîon de las subunidades

ha sido sugerida principeImente a raiz de los datos obtenidos con a-

gentes entrecruzantes sobre este factor BPj (365); sin embargo, en

este tipo de experimentos los resultados negatives deben de conside-

rarse con extremada cautela (115,288).

De este modo, no se puede excluir la posibilidad de una -

disposicion espacial en la que las subunidades interaccionaran entre

- 2 9 1 -

FIC31JRA 68.— Modelo del factor BR de Micrococcus Ivsodeikticus

propuesto por MuMoz y col, (365), mostrando dos visiones bajo

dos Angulos de 09 y 459 aproxîmadamente. El modelo es asimétr i

co, agrupandose las subunidades oC. y en dos pianos diferentes.

- 2 9 2 -

SI y/o en la que la subunidad 06 pudlese inleraccionar con mas de -

una subunidad ^ . Estos supuestos se dan en los modèles espaciales

disenados a partir de los resultados obtenidos en este trabajo para -

el factor BF de M. Ivsodeikticus y representados en la figura 69, En

estos modelos, que a su vez pueden extenderse a otros fac tores ,

puede observarse la înteraccion directa de las subunidades <5 con la

membrana, asf como la disposicion central de la subunidad ^ , que -

explîcarfa su posible participacion en la organizacion de las subunida

des y ^ para form a r una estructura funcionalmente activa. Ror

otra parte, la posibilidad de interacciones entre las subunidades cata-

liticas l?t y de la subunidad (X con mas de una subunidad yS podria ex

plicar plausîblemente la formacion de un complejo con actividad

ATRésica (384, apartado 3.4.4.) asf como una probable existencia

de fenomenos cooperativos en las interacciones entre subunidades,

Sin embargo, la disposicion estructural de los factores - -

puede depender del proceso de aislamiento y purificacion, asi co

mo de su estado funcional y/o de su Interaccion con distintos ligan

dos ,

- 2 9 3 -

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4.8. COMRARACION EN TRI

DISTINTAS ATPasas,

- 2 9 5 -

Enlre las diferentes enzimas que se clasifîcan bajo el —

nombre genérico de ATPasas se encuentran las que pudieramos a-

grupar como "ATPasas bombeadoras de iones". Estas ultimas son

uliitzadas por las células para crear gradientes de iones a expenses

de la hidrolisis de ATP o para generar ATP a partir de un gra

dients de iones. Dentro de las "ATPasas bombeadoras de iones",

très de ellas han sido profusamente estudiadas: la ATPasa translo

cadora de protones, de mitocondrias, cloroplastos y microorganis-2+

mos, objelo del présente trabajo; la Ca -ATPasa, localizada en+ +

las membranas de reticulo sarcoplasmico y la Na , K -ATPasa de

membrana plasmética. Sin embargo, sus funciones fîsiologicas difie

ren. Mientras que la ATPasa translocadora de protones utiliza el

flujo de protones generado por la cadena transportadora de electro

nes durante la oxidacion de diverses sustancias o por la bacterioro2+

dopsina ( 4 6 6 ) para formar ATP a partir de ADP y P ., la Ca -

ATPasa y la Na , K -ATPasa emplean el ATP para bombear —

iones en contra de un gradiente de concentracion. Estas funciones

fîsiologicas diferentes se traducen en una fuerte discrepancia en —

las propiedades estructurales de estas enzimas. Asi, frente a la -

complejidad de la H -ATPasa (véase Introduccion) destaca la ma-2 + +

yor simplicidad de ias bombas de Ca y de Na - K , como tam

bién se denominan.

l_a Na , K -ATPasa purificada consta de dos tîpos de

cadenas polipeptidicas cuando se analiza por electroforesis en gel

de poliacrilamida en presencia de S D S , Una de ellas posee un pe

so molecular de 8 4 . 0 0 0 a 1 3 9 . 0 0 0 dalton , mientras que la més -

pequena (una glucoproteina) présenta un peso molecular de 3 5 . 0 0 0

a 5 7 . 0 0 0 dalton ( 4 5 5 - 4 5 9 ) . La relacion moiar en la que ambas -

subunidades se encuentran en la enzima permanece sujeta a contro

versia, habiéndose descrito razones de 1:2, 1:1 y 2:1 (el peso -

- 2 9 6 -

molecular de la enzima se ha esîimado en unos 250.000 daiton )(459).

La subunidad de mayor talla molecular puede fosforiiarse en presen

cia de Mg , Na y ATP (460) , consideràndose como la subunidad

catalitica. Sin embargo, la funcion de la glucoproteina permanece por

eslablecer. Se ha sugerido que este polîpéplido de menor peso mole

cular estaria expuesto a la superficie externa de la membrana, mien

tras que la cadena polipeptidica de mayor peso molecular se orienia-

ria predominantemente hacia la superficie interna (458) . Por otra —+ 4"

parte, y a diferencîa de las P’^-ATPasas (62), la Na , K -ATRa-

sa muestra una cierta modulacion por lipidos, aunque el papel preciso

de estos no es conocido (459).2 +

La bomba de calcio o Ca -ATPasa de reticulo sarcoplas

mico es la mas simple de las très ATPasas bombeadoras de iones.

Consiste de una cadena polipeptidica de 102.000 dalton que contiene

el sitio catalitico de hidrolisis de ATP (461) y un sitio de actividad

ionofora de Ca^ (462)*, y de un proteolipido de 12.000 dalton de pe

50 molecular, que contiene acidos grasos unidos covalentemente (463)

y actua como ionoforo (464). La Ca -ATPasa probablemente se dis

pone en la membrana como un sistema oligomérico, ya que se han -

encontrado varias subunidades del mismo peso molecular, pero con -

diferentes puntos isoelecIricos (472) . Como ocurria en la Na , K -

ATPasa, la enzima puede ser fosforilada, envolviendo el ciclo cataU

tico de esta la formacion e hidrolisis de una enzima fosforilada, aco-2+

plando la hidrolisis de ATP al transporte vectorial de iones Ca —

(473). La presencia de Mg acelera la hidrolisis dei intermedio fos

forilado (474) .

Por lo tanto, existen claras diferencias entre los très ti

po s de ATPasas. No obstante, También pueden deducirse afgunas -

analogtas (51,459,467). Los 1res sistemas son proteinas de membra

na, se encuentran embebidas en la misma de una forma asimétrica.

- 2 9 7 -

pueden formar gradientes de iones a expenses de la hidrolisis de —

ATP y se ven influidas en su actividad enzimética por la presencia

de iones divalentes. En este sentido es curioso destacar que estos -

cationes divalentes (Mg^ y Ca^ , principalmente) se requieren para

la manifestacion de la actividad ATPésica de estas très enzimas. A-

demés se ha descrito la existencia de cambios conformacionales que

afectan a la actividad enzimética de estas ATPasas, De forma inver

sa, los gradientes de iones pueden ser, a su vez, aprovechados en

determinadas condiciones por las distintas bombas de iones para sin-

tetizar ATP (467,468).

Otro tipo de ATPasas, como la ATPasa de miosina o la

Apirasa, también muestran diferencias estructurales notables con las

H -ATPasas o con la parte cataiftica de éstas, las F ^-ATPasas.

Mientras que la ATPasa de miosina se compone de cuatro tipos de

subunidades con pesos moleculares de 220.000, 25.000, 18.000 y -

16.000 dalton (475), la Apirasa parece estar constituida por una -

unica subunidad de peso molecular, 58.000 dalton . Sin embargo,

el proceso por el cual la ATPasa de miosina hidroliza el ATP a -

ADP y Fj (véase Pig. 70) es de particular interés para el estudio

del mecanismo molecular de la sintesis e hidrolisis de ATP en las

ATPasas franslocadoras de protones. De una forma esquemàtica, el

proceso global, Mg-ATP^ + H M g —4.DP + P + H

(ATPasa de miosina) , puede desglosarse en très pasos fundamenla

ies (473) :

(a) ATP (Mg-ATP^ ) se une con avidez, pero de una for

ma no covalente a miosina ( A D ' = -20,6 kJ/mol) e in

duce un cambio conformacional en la estructura de la en

zima para formar un complejo miosina-ATP activado —

( ûk -53 , 8 kJ/mol) . (Pasos I y II de la Fig. 70),

(b) El ATP unido a la enzima es hidrolizado con un peque

- 2 9 0 -

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- 2 9 9 -

Ro cambio de energia ( £iG^= -5,4 kJ/mol) . El comple

jo Mg-ADE-F-?-Mlosina sufre otro reajuste estructural -

con un ulterior cambio de energia relativamente peque-

no ( -6,6 kJ/mol) , (Pasos III y IV de la Eig. 70).

( c Disociacion de R (AG^=+11,0 kJ/mol) ( Paso V , Eig.

70)y posteriormente de Mg-ADP . La disociacion de -

ADP implica, a su vez, dos acciones: un cambio con

formacional del complejo miosina-Mg-ADP ( AG^=

+ 13,8 kJ/mol), seguido de la disociacion de Mg-ADP

( +20, 1 kJ/mol) . (Pasos V I y V II, Eig. 70).

Por lo tanto, el esquema global del proceso nos îndica

que en la union de ATP (y de ADP) tienen lugar grandes cambios

de energia y que la rupture de la molécula de ATP a ADP y R -

envuelve un cambio de energia libre muy pequeno. Una consecuen-

cia de las relaciones energéticas representadas en la figura 70, es

que cuando se anaden ADP y R a miosina, la molécula de ADP se

une fuertemente a la enzima y se sintetiza ATP, Sin embargo, es

ta molécula de ATP permanece unida a la miosina, ya que su libe-

raclén reqjeriria un gran cambio positivo de energia libre. No obs

tante, debido a que los cambios de energia implicados en la inter

conversion de miosina-Mg-ATP^ y miosina-Mg-ADP -R (reac-

cl6n IV ) son pequefïos, el atomo de ' de es facllmente

incorporado al fosfato inorganico, Sobre la base de la reaccion en

la que una molécula de ATP es hidrollzada, deberia esperarse la

presencia de un ' en la molécula de R . Sin embargo, los resud

tados expérimentales muestran que cuando el ATP es hidrolizado -

por la miosina en presencia de H , se encuentra més de un a-18

tomo de O en la molécula de P., Este hecho indica que las reaç

clones entre miosina-Mg-ADP -P. y miosina-Mg-ATP^ (reaccio —

nes III y IV) son réversibles y sus velocidades son mayores que

- 3 0 0 -

las cor respond!entes a la liberacion de Mg-ADP y P.. Ademas, el

R unido a miosina debe poseer una libertad compléta de movimienlos

rotacionales a fin de no presenter siempre el mismo atomo de oxige-

no para la eliminacion.

En conjunto, la hidrolisis de Mg-ATP^ por miosina es

un proceso relativamente lento; muy probablemente, debido a la difi-

cultad de disociar el producto Mg -ADP del complejo miosina-Mg-

ADP . Sin embargo, en presencia de actina, ia hidrolisis de ATP

evoluciona mucho més rapidamente.

Recientemente, el grupo de Boyer ha proporcionado cier

la evidencia que sugiere que el mecanismo de sihtesis de ATP en -

las enzimas H -ATPasas mitocondriales es muy similar en algunos

aspectos al mecanismo conocido de la ATPasa de miosina (275,476,

477). Asî, se ha demostrado que en presencia de agentes desaco-

plantes, que inhiben la sintesis neta de ATP mitocondrial , las par

ticules submitocondriales catalizan una pequena, pero reproducible

sihtesis de ATP unido a la enzima a partir de ADP y P. Esta

sihtesis de ATP es inhibida por oligomicina. La reaccion de inter-

cambio ATP-H^^ se inhibe completamente por agentes desacoplan

tes, pero no asi la reaccion de intercambio entre R-H^^^O. Esta

ultima reaccion se inhibe por oligomicina.

De esta manera, las reacciones de intercambio y la sin

tesis de ATP parecen discurrir por cauces muy parecidos en la -

ATPasa de miosina y la H -ATPasa mitocondrial. Boyer postula

que la sintesis neta de ATP en mitocondrias tiene lugar utilizando

la energia procédante de la cadena respiraloria en convertir ATP

fuertemente unido a la enzima en ATP debilmente unido, y por lo

tanto, facilmenie disociable (Pig. 71), Boyer supone que la energia

procédante de la respiracion no se utiliza para la sintesis de nuevo

ATP sino para la disociacion del ATP ya preformado, para lo - -

cual se necesitaria un cambio conformacional en la estructura de -

- 3 0 1 -

o~ O"- \ < Mq—A D P —O; P ^ O H

O

A T P a s a i

0 “ O 'N / 18

Mg-AD P -0 |.^ :OH

O

Reaccl6n de intercambio

ATPasa

(Inhibida por oligomicina)

A T P

Cambio conformacional debido al acoplamiento con la energia procedente de la cade cadena respiratoria

(ATPasa)

(Inhibida por agentes desacoplantes )

FIGURA 71.- Posible mecanismo de sintesis de ATP propuesto por

Boyer pera el complejo de ATPasa mitocondrial (véase texlo) .

- 3 0 2 -

la e n z i m a .

La hipotesis de Boyer parece ser bastante satisfactoria y

estimulante, pero se necesitarâ realîzar una gran cantidad de trabajo

antes de establecer su verisimllitud. La flexibilidad de estas enzimas

asi como la posible participacion de iones metalicos fuertemente uni

dos a la enzima en el proceso catalitico se ajustan facilmenie a es

ta hipotesis. Sin embargo, debe entenderse que este postulado de

Boyer no intenta ofrecer una alternativa a la hipotesis quimiosmolica

de Mitchell (véase apartado 1 .2 .), totalmente aceptada en la actua-

lidad en sus postulados basicos, sino que constituye una posible ex-

plicacion de como la fuerza "proton-motriz", creada por la extru

sion de H por la cadena respiratoria y la consecuente formacion

de un potencial de membrana, puede ser utilizada para sintetizar —

ATP.

Muy recientemente, Boyer y col. han propuesto un meca

nismo de "sitios alternatives'• basados en los puntos ci tados anterior

mente y que da cuenta de un gran cumulo de datos expérimentales.

Este mecanismo postula que la energia producida durante el transpor

te electronico se utiliza para promover simultaneamente la union de

P en un "sitio" de la molécula de -ATPasa y la liberacion de ATP

unido en un segundo "sitio". Este mecanismo es tratado con detalle

en (421,422,470) y no seré comentado en este trabajo.

También se han descrito otras muchas ATPasas capaces

de translocar protones, taies como la ATPasa lisosomal (479) y la

ATPasa secretora de HCI (480,481). Sin embargo, todavia existe

poca evidencia para poder conduîr si estas ATPasas son del tipo

(F . F ) h "^-ATPasas, o 1

4.9. PERSPECTIVAS

- 3 0 4 -

De este estudio se deduce que los compiejos de ATPasa

de mitocondrias, cloroplastos y bacterîas constituyen uno de los sis

tern as enzimaticos mas compiejos construidos por la celula. Sus fun

clones en la sintesis de ATP y en los procesos dependientes de —

ATP han sido preservados a lo largo de la évolue ion y son esencia

les para la mayoria de los procesos vitales. Por lo tanto, la eluci-

dacion del mecanismo de accion de estas enzimas represents uno de

los problemas mas importantes y desaliantes en la biologie molecular

actual,

l_a resolucîon de este problema es de gran interés para

el bioenergético, a qui en agradaria entender como las mitocondrias ,

cloroplastos y bacterîas utilizan sistemas enziméticos bîfuncionales

para fabricar ATP bajo ciertas condiciones y emplean ATP para -

realizar un trabajo bajo otras condiciones. De igual modo, resul-

taria de gran interés para el enzimologo de membrana, quien esta

ria particularmente interesado en conocer en detalle como trabajan

las enzimas vectoriales, asi como para el patologo, a quien gusta-

ria conocer si durante algunos es tados patologicos se produc en al-

teraciones en el métabolisme energético (66) ,

En la década de los anos 70 se ha realizado un avance

considerable en la comprensiôn de las estructuras responsables de

la transduccion de energia en los sistemas fotosintéticos y no fotosin

tétîcos. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual dicho pro

ceso tiene lugar continua siendo desconocido. En este sentido, pare

ce légico pensar que en los aPios venideros se prestara una mayor

a tendon al complejo de ATPasa en su conjunlo (compuesto por

y ) , ya que unicamente este sistema es capaz de acoplar el trans

porte de protones a la sintesis o hidrolisis de ATP, pudiendo consi

dérer de esta forma la naturaleza bifuncional (sintesis e hidrolisis de

ATP), o mas propiamente, multifuncional (sintesis de ATP y reac-

—3 0 5 —

cones dependientes de ATR) de esta clase de enzimas transducto-

ras de energia, asi como los e fee tores fisiologicos que dirigen sus

cîniros actives hacia la sintesis de ATP o hacia funciones dépen

dantes de ATP. Asi se tendré que esperar a obtener una mayor

irformacion quimica y estructural del complejo de ATPasa antes de

dîsvelar el mecanismo de la transduccion de energia.

Sin embargo, e independientemente de los importantes es

tidios estructurales que deben llevarse a cabo sobre la H -ATPasa,

p'incipalmente sobre la parte de la enzima embebida dentro de la —

nembrana o P , un gran esfuerzo del trabajo futuro deberé encamî-

rerse hacia ta consecucion de un conocimiento profundo sobre c ier-

tfs aspectos de un interés fundamental: (a) el papel jugado por los

imes metalicos en esta enzima; (b) la naturaleza y numéro de los s

tbs cataliticos; (c) las propiedades cinéticas y (d) les mécanismes

cte regulaciôn de estos sistemas.

5. CONCLUSIONES

- 3 0 7 -

1 . - Se ha identificado un nuevo componenle intrînseco de la enzima,

denominado como subunidad de peso molecular 20.000 i 700

dalfon ,

2. - L_a subestructura del factor de M. lysodeîkticus se encuen-

tra constituida por cuairo tlpos de subunidades: , (3 , ^ y .

También pueden encontrarse dlstîntos polipéptidos asociados a la

enzima, que pueden disociarse de la rnisma por tralamiento con

EDTA.

3 .- L_as subuhidades rninarltariao ^ y se encuentran debilmenfe

unldofs al resto de la enzima, particularmenle la subunidad S , cuya asocîacion a la protefna parece estar mediada por iones

multivalentes. Este hecho justifie a el contenido variable con que

el componente é se halla présente en la P^-ATPasa.

4 .- La estequiometria en subunidades de la protefna parece ajustar-

se a <^3 ^ 2 ^ 2 ^ 2 ' ^^nque es posible la presencia de alguna —

copia adicional del polipéptido ^ .

5 .- La parle sacarfdica descrita en este factor BP parece estar -

asociada a la enzima de una forma no covalente, probablemen-

te a través de interacciones electrostéticas y/o mediadas por ca

tiones multivalentes.

6 .- Tanto la enzima P^-ATPasa de M. lysodeikticus como sus subuni

dades constltuyentes resultan ser anlîgénicas.

7 .- Estudios inmunoqufmicos de este factor ponen de manifiesto la i-

denlldad propia de cada una de sus subunidades y la contribucion

de las mismas a las propiedades antigénicas de la enzima. A su

vez, exister déterminantes antigénicos adicîonales, posiblemente

conformacionales, que se originan del plegamiento y ensamblaje

de las subunidades en la molécule de P^-ATPasa.

- 3 0 8 -

8 .- La molécula de R^-ATPasa y sus componentes polipeptfdicos

mayoritarios, oC! y (3 , se muestran accesibles a sus respectives

anticuerpos cuando la enzima se encuentra asociada a la mem

brane .

9 .- La subunidad o6 parece jugar un papel regulatorio en la expre-

sion de las propiedades inmunolôgicas de la enzima.

10.- Se encuentran diferencias en el comportamiento înmunologico de

las formas A y B de la enzima que son independientes del esta

do fisico de la protefna: soluble o asociada a membrane.

11.- La subunidad parece albergar el sflio active de la enzima, si

bien requlere de la presencia de subunidad cC , aun en propor-

ciones no equlmoleculares, para la expresion de la capacidad

hidroiftica sobre el ATP . En este sentido se ha descri to la es

tructura mfnima de una -ATPasa activa, constituida por las

subunidades o i P » P' y ^ , en la siguiente relacion molar 1,67;

3,00; 0, 16; 0 , 1 7 , respect! vamente.

12.- La subunidad oC parece desemperlar un papel regulador en las

propiedades cataifticas de la enzima y se requiere, como se ha

mencionado çn el punio anterior, para cons il tu ir una estructura

funcionalmenle activa.

13.- La subunidad S y los cationes Mg^ constituyen los componentes

responsables de la union de la enzima a la membrana. Las sub

unidades y (3, aisladas muestran una elevada capacidad de rein

sercion a membrana, pero dicha capacidad se pierde al const! —

tuirse el complejo (oi + (3> ) ,

14.- El factor BP puede reasociarse de multiples formas a la mem

brana, sin embargo, no todas presentan un significado fisiolôgi-

co .15.- Se ha detectado la presencia de zinc como un componente intrfn

- 3 0 9 -

seco de la enzima -ATPasa y esencial pare su actividad

catalftica, l_a estequiometria en que este ion metélico se en-

cuenlra en la proteina purificada parece ser de 1 étomo-gra-

mo/mol BP .

ci

ticus constituye una condlcion necesaria pero no suficiente pa

ra la manîfestacién de la actividad ATPésica, requiriéndose la2 + 2+

subsiguiente adicion externa de iones Ca . Los iones Zn y2+

Ca parecen ser los electores naturales de este factor BP ,

sîendo sus funciones dis tintas y no intercambiables.

17.- Los cationes dîvalentes modulan los cambios conformacionales

y la actividad enzimatica de la enzima P^-ATPasa, sugiriéndg

se un papel regulador de los mismos en la proteina.

18.- El agente quelante EDTA es capaz de disociar, al menos, las

subunidades minoritarias de la proteina. Se postula un impor

tante papel funcional y estructural de los iones metalicos en es

ta enzima.

19.- El se une al factor BP de M . lysodeikticus sin necesidad

de ahadir cationes divalentes. Aparentemente, la enzima exhi

be un ùnico si Ho de fijacién para R, caracterizado por una

constante de dîsociaciôn de 185 yuM a pH 7,5. La incubacion

de la enzima con cantidades elevadas de R indica, sin embar

go, la presencia de un segundo silio de fijaciôn.

20.- En las P^-ATPasas procédantes de origenes distintos se apre

cian grandes analogies, sin embargo, un estudio més minuclo-

so de les mismas pone de manifiesto la existencia de diferen

cias entre ellas.

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