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Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas
FACULTAD QUÍMICA-FARMACIA
Departamento de Ciencias Farmacéuticas
Tesis en opción al título de Máster en Desarrollo de
Medicamentos de Origen Natural
Título: Composición química y estudios
farmacológicos de las hojas de tres especies de
Mirtáceas.
AUTOR: Lic. Yadira Morales Fernández
TUTOR: Dra C. María Elisa Jorge Rodríguez Dra C. Yanelis Saucedo Hernández
“Año 56 de la Revolución”
2014
Hago constar que el presente trabajo de maestría fue realizado en la Universidad
Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la
maestría en Desarrollo de Medicamentos de Origen Natural, autorizando a que el
mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de
forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni
publicados sin autorización de la Universidad.
Firma del Autor
Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según
acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que
debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.
Firma del Autor Firma del Jefe de Departamento
donde se defiende el trabajo
Firma del Responsable de
Información Científico-Técnica
Pensamiento
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” II
Si yo tuve la suerte de alcanzar algo, solamente se debe a que me apoyé en
hombros de gigantes.
Isaac Newton
Dedicatoria
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” IV
Dedicatoria
Hay personas que con solo existir hacen de nuestras vidas un sendero feliz, que
iluminan tu camino con su amor y dedicación. A ellos les dedico este triunfo.
A mi mamá, por ser la luz de mi vida dedico este trabajo con mucho amor, por ser
madre, compañera y amiga, por confiar en mí y darme seguridad infinita, por
hacerme comprender que siempre se puede llegar más lejos, por enseñarme que no hay
nada imposible, solo hay que proponérselo y que para llegar al final del camino
Solamente hay que luchar.
A mi papá, por su infinita bondad, por ser mi compañero en todo momento y por
guiarme por el camino correcto.
A mis hermanos, les dedico este importante momento de mi vida, por formar
parte de mí y porque en ellos he encontrado el apoyo y la fuerza necesaria para
llevar a cabo todos mis propósitos.
A mis cinco sobrinos que adoro con el alma y que me han brindado todo el amor y el
cariño que necesito.
Agradecimientos
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” VI
Agradecimientos A mis padres por el esfuerzo, cariño, admiración, confianza y la dedicación que han tenido
durante toda su vida, a quienes les debo mucho porque se han sacrificado, dando todo para que
yo sea la persona que soy hoy, porque con su apoyo incondicional pude seguir adelante y vencer
todos los obstáculos, pero sobre todo por haberme regalado la vida.
A mis Hermanos por la buena fe, la confianza, el apoyo inigualable que siempre me brindaron,
por darme lo que necesitaba en los momentos más oportunos de mi carrera y además por formar
parte mi vida profesional.
A mis cinco sobrinos que adoro con el alma; que me cambiaron la vida y la llenaron de alegría y
amor.
A mi novio que estuvo ahí siempre que lo necesité, dándome su apoyo en los buenos y malos momentos de mi vida y las fuerzas necesarias para lograr el triunfo final.
A mis amigos por brindarme su amistad, solidaridad, por compartir momentos buenos y malos,
por estar siempre ahí cuando los necesité, en especial a William porque más que un amigo, es mi
hermano del alma, a Yuriam por ser incondicional y, a todos en general por llenarme de alegría y
sobre todo por dejarme ocupar un espacio importante dentro de sus corazones.
A mis tutoras por su paciencia y dedicación, por trasmitirme sus conocimientos, por los
momentos de alegría y de tristeza que pasamos y por brindarme toda la ayuda incondicional
para que mi trabajo fuera un éxito.
Agradecimientos
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” VII
A todos los profesores de la maestría que me brindaron su apoyo incondicional y tuvieron
confianza en mí.
A mi familia que fue un factor fundamental dentro del círculo de mi vida, por brindarme todo
el apoyo siempre y cuando lo que necesité para que pudiera hacer este sueño realidad.
A Urbano, Xiomara, Mario y los técnicos de laboratorio por la ayuda incondicional que me
brindaron hasta el último momento.
En fin deseo agradecer a todas aquella personas que me apoyaron incondicionalmente y no me
abandonaron, a los que me enseñaron que en la vida se lucha hasta el final por lo que uno quiere
y pusieron en mí su esperanza, su confianza, su respeto para que sea un mejor ser humano y una
mejor profesional en el futuro.
“Sentir gratitud y no expresarla es como envolver un regalo y no darlo.”
William Arthur Ward
Resumen
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” IX
Resumen
En el presente trabajo se estudió la composición de aceites esenciales y extractos obtenidos de tres
especies de mirtáceas. El rendimiento de aceite para cada planta fue de 0,38 para el Psidium guajava L,
0,44% para la Eugenia axillaris y 1,72% para la Melaleuca leucadendrom L; mientras que el rendimientos
de extracto para cada especie fue 0,43, 1,57 y 1,43 %, en base a droga seca, respectivamente. En la
determinación de la composición química de los aceites, empleando la cromatografía gaseosa acoplada a
masa (GC-MS, siglas en inglés), se obtuvo la presencia del Cineol en las tres especies, siendo este el
componente mayoritario en las especies P. guajava y M. leucadendrom, mientras que la E. axillaris
muestra una composición compleja con una gran cantidad y variedad de compuestos . Los perfiles
cromatográficos por Cromatografía Gaseosa con detección por ionización por llama (GC-FID, siglas en
inglés) para todas las muestras evaluadas aportó que los aceites de la M. leucadendrom y el P. guajava
poseen cromatogramas muy limpios con un componente mayoritario, cuya cuantía en el aceite es muy
superior a los restantes, el 1,8 cineol; este componente está presente entre los 14 que fueron identificados
en el aceite de E. axillaris y también se encuentra en los extractos evaluados de cada planta. En el
presente trabajo se validó la GC-FID como ensayo cuantitativo para la identificación y cuantificación del
cineol presente en las muestras, la técnica fue fiable y con ella se determinó que el contenido de este
metabolito, el cual resultó ser 0.44; 0,04 y 0,37% para el aceite esencial de P. guajava, E. axillaris y la M.
leucadendrom, respectivamente y 0,56; 0,28 y 0,63% para sus extractos en el mismo orden. La evaluación
cualitativa de la actividad antimicrobiana arrojó que los extractos poseen una actividad antimicrobiana muy
superior a los aceites frente a los gérmenes positivos y negativos seleccionados y la actividad antioxidante,
realizada a través de cuatro ensayos in vitro, permitió determinar que la especie P. guajava posee esta
actividad muy superior a las otras dos especies, lo que está en total correspondencia con el contenido
fenólico de la misma que supera a las restantes.
Introducción
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 1
Índice
Introducción. ................................................................................................ ¡Error! Marcador no definido. Capítulo 1: Revisión Bibliográfica. ............................................................. ¡Error! Marcador no definido. 1.1. Consideraciones generales sobre plantas medicinales y aromáticas. . ¡Error! Marcador no definido. 1.2. Estudios realizados en el campo farmacéutico de las plantas estudiadas en el presente trabajo. ¡Error! Marcador no definido. 1.2.1. Psidium Guajava L. ............................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.2.1.1. Usos tradicionales de la planta. ............................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.2.1.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta. ..................... ¡Error! Marcador no definido.
1.2.1.3. Propiedades farmacológicas y toxicológicas ......................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.2. Eugenia axillaris (Sw.) Willd. ............................................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.2.1. Usos tradicionales de la planta. ............................................ ¡Error! Marcador no definido.
1.2.2.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta. ....................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.3. Melaleuca leucadendrom L. .................................................... ¡Error! Marcador no definido.
1.2.3.1. Usos tradicionales de la planta. ........................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.3.2. Estudios fitoquímicos y farmacológicos reportados de la planta.¡Error! Marcador no
definido. 1.3. Generalidades en la obtención y composición de aceites esenciales y extractos.¡Error! Marcador no definido. 1.3.1. Extractos. Obtención. .............................................................. ¡Error! Marcador no definido.
1.3.2. Aceites esenciales. Obtención. ................................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.3.3. Análisis de componentes volátiles presentes en aceites esenciales y extractos de plantas. Cromatografía gaseosa. ................................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.4. Validación de los métodos analíticos. Determinación de los parámetros de desempeño. .......... ¡Error! Marcador no definido. 1.4.1. Linealidad .............................................................................. ¡Error! Marcador no definido.
1.4.2. Precisión. ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.4.3. Especificidad. ......................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
1.4.4. Exactitud. ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
1.4.5. Límite de detección y cuantificación. ........................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.5. Evaluación de la actividad antioxidante en productos naturales. ......... ¡Error! Marcador no definido. 1.5.1. Mecanismos de acción de los antioxidantes y métodos para determinar la actividad antioxidante.
.......................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana en productos naturales. ..... ¡Error! Marcador no definido. 1.6.1. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana. Ejemplos....... ¡Error! Marcador no definido. 1.7. Consideraciones finales del estudio bibliográfico. ............................... ¡Error! Marcador no definido. Capítulo 2: Materiales y Métodos ............................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.1. Material vegetal, equipos y reactivos químicos. ...................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.2. Metodología de obtención del aceite esencial y de los extractos a partir de las hojas de las tres
especies. ............................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 2.2.1. Obtención del aceite esencial. ................................................. ¡Error! Marcador no definido. 2.2.2. Obtención de los extractos ..................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Introducción
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 2
2.3. Determinación del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie estudiada. ...................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4. Determinación de la composición de los aceites esenciales y los extractos de las tres especies de
Mirtáceas estudiadas. .......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.1. Determinación cuantitativa de Cineol en los aceites y extractos de las tres especies. ........... ¡Error!
Marcador no definido. 2.4.1.1. Desarrollo del método. ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.1.2. Validación del método. ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.2. Determinación del contenido de cineol presente en cada aceite estudiado.¡Error! Marcador no
definido. 2.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos obtenidos de las
tres especies de Mirtáceas estudiadas. .................................. ¡Error! Marcador no definido.
2.6. Resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.
2.6.1. Actividad secuestradora del radical libre DPPH. ........................ ¡Error! Marcador no definido.
2.6.2. Fuerza reductora .................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.6.3. Actividad antioxidante por el método tiocianato férrico. .............. ¡Error! Marcador no definido. 2.6.4. Capacidad antioxidante total (TAOC)........................................ ¡Error! Marcador no definido.
2.6.5. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) .... ¡Error! Marcador no definido. 2.7. Determinación del contenido total de compuestos fenólicos. ........ ¡Error! Marcador no definido. Capítulo 3: Resultados y Discusión. .......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.1. Resultados del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie estudiada. ¡Error! Marcador no definido. 3.2. Resultados obtenidos en la determinación de componentes volátiles presentes en los aceites esenciales y extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de Mirtáceas estudiadas. ............. ¡Error! Marcador no definido. 3.2.1. Composición de los aceites esenciales. .................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales y extractos por GC-FID. Identificación de
componentes con el uso de patrones. .................................... ¡Error! Marcador no definido.
3.2.2.1. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales. ...................... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2.2. Perfil cromatográfico de los extractos. ................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.3. Determinación cuantitativa del contenido de cineol en los aceites esenciales y extractos obtenidos de las tres especies estudiadas. ......................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.3.1. Validación de la técnica cromatográfica (GC-FID) para la determinación de 1,8-Cineol. ........ ¡Error!
Marcador no definido. 3.3.2. Aplicación de la técnica validada a la determinación de cineol presente en los aceites y extractos
obtenidos de las especies de mirtáceas estudiadas en el presente trabajo.¡Error! Marcador no
definido. 3.4. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas. ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.5. Resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas. ................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 3.5.1. Cuantificación de los compuestos fenólicos – método de Folin-Ciocalteu.¡Error! Marcador no
definido.
Introducción
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 3
3.5.2. Actividad secuestradora del radical libre DPPH. ........................ ¡Error! Marcador no definido. 3.5.3. Fuerza reducida. .................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.5.4. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) .... ¡Error! Marcador no definido.
3.5.5. Capacidad antioxidante total. ................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.5.6. Relación entre el contenido fenólico total con la actividad antioxidante evaluada en el presente
trabajo, a través de diferentes ensayos. ................................. ¡Error! Marcador no definido. Conclusiones ................................................................................................. ¡Error! Marcador no definido. Recomendaciones ......................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. Bibliografía ................................................................................................................................................... 24
Introducción
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 4
Introducción.
Las plantas han sido usadas como fuente de medicina a través de la historia y continúan siendo la base de
muchos fármacos empleados actualmente, contienen una gran cantidad de compuestos bioactivos como
lípidos, fitoquímicos, saborizantes, fragancias y pigmentos. Los problemas de salud y la difícil consecución
de medicamentos comerciales, han llevado nuevamente a la búsqueda de la medicina tradicional a través
del uso y manejo de las plantas. Lo anterior justifica que hoy, las grandes industrias farmacéuticas a nivel
mundial dependen en gran medida de las plantas medicinales, numerosos medicamentos modernos
provienen de plantas utilizadas desde hace siglos. Además ellas cumplen todavía un rol primordial en la
atención primaria de la salud en las comunidades rurales que viven con un bajo acceso a la salud
(Estomba y col., 2006).
La Organización Mundial de la Salud estructuró en 1985 un
Programa de Medicina Tradicional Herbolaria, reconociendo la
existencia de 119 sustancias químicas de origen vegetal que
pueden considerarse fármacos importantes, útiles en más de 60
categorías terapéuticas y obtenidas principalmente de
91 especies. Aún hoy día, esta organización mundial
considera que la atención primaria de la salud de
cerca del 80 % de los habitantes del mundo se realiza
con plantas salutíferas, o con los principios extraídos de ellas.
Introducción
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 5
Ello se justifica en la probada eficacia y ausencia de efectos secundarios de las fitomedicinas bien
empleadas, aunadas a las graves condiciones socioeconómicas de franjas cada vez mayores de la
humanidad, que impiden el acceso al medicamento industrializado. Así, los fitomedicamentos están
tomando una importancia cada vez mayor para la atención de la salud humana, tanto sea por su probada
efectividad como por sus escasos efectos colaterales. Se agrega a esto los graves problemas económicos
por los que atraviesan grandes sectores de la humanidad en general, que impide el acceso a
medicamentos industrializados. Las plantas medicinales, que han sido empleadas desde la más remota
antigüedad, han resultado una fuente casi inagotable de sustancias activas para combatir las
enfermedades. A través de la investigación multidisciplinaria llevada a cabo por botánicos, etnobotánicos,
farmacognostas, farmacólogos, etc. ha podido ser recabado, sistematizado y contrastado un gran caudal
de conocimientos empíricos, el que llega hoy a la comunidad a través de productos naturales genuinos, o
modificados por semisíntesis o síntesis mediante una avanzada tecnología farmacéutica (Carballo y col.,
2005).
Nuestro país presenta una riqueza y mega diversidad de plantas nativas, es uno de los pilares de la
etnofarmacología y la medicina tradicional, desde la época del Incario hasta la actualidad. Siendo estas
utilizadas en forma empírica por sus bondades terapéuticas en el cuidado y restauración de la salud, de
forma similar a lo que ocurre en la mayoría de los países, las plantas medicinales se encuentran incluidas
en la categoría de medicamentos. Asimismo, el Ministerio de Salud tiene establecido un Programa de
Investigaciones de Medicina Tradicional, que fue aprobado en 1991, para estudiar las plantas medicinales
más utilizadas por la población y evaluar con métodos científicos actuales sus efectos farmacológicos y
tóxicos. Permitiendo incorporar a la llamada medicina moderna los medios medicinales tradicionales con
verdadera efectividad, ganando prestigio en la práctica médica actual (González., 2007). Lo anterior
justifica que, se hace necesario hacer llegar a la sociedad la idea de que todo fitopreparado, empleado con
fines terapéuticos (preventivo, curativo, sintomático), es un medicamento al que hay que exigir el
cumplimiento de los parámetros de: calidad, seguridad y eficacia. Su uso racional (indicaciones,
dosificación, posología, consejo sanitario), conjuntamente con los controles preestablecidos en cuanto a
calidad y seguridad, son los factores determinantes de la eficacia terapéutica en los preparados
elaborados a partir de plantas (Navarro C., 2000).
Dentro de las plantas aromáticas que crecen silvestres en Cuba se encuentra la Melaleuca leucadendrom
L. (Cayeput), Psidium guajava L. (Guayaba) y la Eugenia axillaris (Sw.) Willd. (Clavo), tres mirtáceas que
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 6
son usadas tradicionalmente por su acción antimicrobiana. El Cayeput y la Guayaba se encuentra
insertado en el programa de medicina natural y tradicional del Ministerio de Salud Pública siendo
recomendado el uso de extractos alcohólicos, que se produce en todos los laboratorios de fitofármacos del
país y se expenden por su uso como antisépticos (Formulario Nacional Fitofármacos y Apifármacos,
2010), mientras que la Eugenia tiene demostrada su acción antimicrobiana (Setzer., 2006)
Teniendo en cuenta el efecto terapéutico propuesto y la poca información de estas plantas en la literatura,
el presente trabajo se propone estudiar el aceite esencial y extractos obtenidos de las hojas de estas
especies de la familia Mirtáceas, constituyendo, por tanto, el problema científico del presente trabajo que
las especies de la familia Mirtáceas han demostrado tener potencialidad farmacológica, fundamentalmente
como antimicrobianos, sin embargo, son escasos los estudios fitoquímicos y farmacológicos que permitan
fundamentar científicamente su posible introducción en la terapéutica y establecer su calidad para ser
registradas como drogas vegetales.
Teniendo en cuenta el problema planteado se propone para resolver el mismo la siguiente hipótesis: Si
se realizan estudios que permitan conocer la composición y evaluar acciones farmacológicas de aceites
esenciales y extractos de estas especies se realizará un aporte importante a la información necesaria
para proponer su uso en la industria farmacéutica, alimentaria o cosmética. Para fundamentar dicha
hipótesis se plantea el siguiente objetivo general:
Evaluar la composición química y la actividad farmacológica de los aceites esenciales y extractos
obtenidos de las hojas de tres especies de mirtáceas (Psidium guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y
Melaleuca leucadendrom L.).
Para ello se trazaron los siguientes objetivos específicos:
Determinar el rendimiento de aceites esenciales y extractos obtenidos de las hojas de Psidium guajava
L., Eugenia axillaris (Sw) Willd. y Melaleuca leucadendrom L.
Identificar y cuantificar componentes mayoritarios presentes en los aceites esenciales y extractos
obtenidos de las tres especies mediante Cromatografía de Gases (GC-FID, por sus siglas en inglés.)
Evaluar la actividad antimicrobiana de los aceites y de los extractos obtenidos de las tres especies a
través de métodos in vitro.
Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies estudiadas, empleando métodos in vitro.
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 7
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 4
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica.
1.1. Consideraciones generales sobre plantas medicinales y aromáticas.
Las plantas medicinales son todas aquellas plantas que contienen, en alguno de sus órganos, principios
activos, los cuales, administrados en dosis suficientes, producen efectos curativos en las enfermedades de
los hombres y de los animales en general. Se calcula en unas, 260,000 especies de plantas que se
conocen en la actualidad, de las que el 10% se pueden considerar medicinales, es decir se encuentran
recogidas en tratados médicos de fitoterapia modernos y de épocas pasadas, por presentar algún uso.
Evidentemente, sobre todo en las regiones ecuatoriales, la proporción de especies medicinales puede
variar sensiblemente de este porcentaje, ya que ni siquiera se conoce la totalidad de la flora (Navarro.,
2000).
El uso de las plantas en medicina tiene una historia honorable, ya que en determinados momentos todos
los medicamentos se obtenían de fuentes naturales. Los primeros herbolarios datan de la época de los
asirios, los babilonios y los fenicios y constituyen una recopilación de los conocimientos de la época sobre
las propiedades curativas de las plantas, comenzando así la historia de la fitoterapia (Carballo y col.,
2005). En 1948 se imprimió la primera farmacopea, y la Botánica, que hasta aquel momento había sido
patrimonio exclusivo de médicos, boticarios y yerbateros, empieza a estudiarse de forma racional, ayudada
por los grabados en madera que se realizan de las plantas. El primer gran libro sobre las propiedades
medicinales de las plantas es “De materia médica”, en el año 50 a. C. y que aún hoy, se s igue
consultando. Posteriormente en el siglo XI, los monasterios tomaron el relevo convirtiéndose en grandes
botánicos. A finales del siglo XIX principios del siglo XX, debido al gran avance de la ciencia, se comenzó
a aislar y a sintetizar en el laboratorio los principios activos, surgiendo entonces fármacos de síntesis, en
detrimento de los remedios naturales (Font y col., 1983).
La gran variedad de principios activos, que están asociadas a los procesos vitales básicos en las plantas, y
los metabolitos secundarios presentes participan activamente en el ajuste del vegetal a las condiciones
ambientales así como con la interrelación con parásitos y simbiontes. Para el ser humano, los metabolitos
secundarios, especialmente aquellos de origen vegetal, poseen diversas aplicaciones siendo utilizadas en
salud, alimentación, perfumería e higiene personal. En las últimas décadas puede observarse como
tendencia mundial, un aumento del consumo de plantas medicinales, tanto en los países industrializados
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 5
como los del tercer mundo. Se estima que alrededor del 80 % de la población mundial, aproximadamente
unos cuatro mil millones de personas, recurre a la medicina tradicional herbolaria para la atención primaria
de la salud. En Asia, millones de personas mantienen su salud a través del uso de hojas, raíces y cortezas
de árboles. De hecho el 25 % de las medicinas prescritas por los médicos europeos y estadounidenses se
derivan de plantas existentes en los bosques. Según reconocidos investigadores, prácticamente todas
esas plantas se han descubierto gracias a la información derivada de su uso en medicina tradicional
(Boletín de Plantas Medicinales y Aromáticas., 2002).
Entre las plantas medicinales, las aromáticas ocupan un lugar muy especial por el contenido sobresaliente
de aceites esenciales que las distingue y representan una amplia variedad de especies, constituyendo las
más estudiadas en la actualidad, ya sean sus extractos o los propios aceites esenciales. Como grupo son
especies valoradas por sus aromas y sabores característicos así como por sus propiedades medicinales;
representan alrededor de un 0,7% del total de las plantas medicinales. El comercio de los aceites
esenciales mantiene un crecimiento sostenido debido a su aplicación en diversas industrias como:
cosmética, farmacéutica, alimenticia, de productos de limpieza, plaguicidas, entre otras (Davies., 2004).
No siempre es válido suponer que una planta aromática es simplemente aquella que genera un olor o
sabor particular, sea este agradable o no. En esta caracterización deben plantearse muchas veces
excepciones. Una planta puede carecer de olor típico en condiciones naturales, pero puede generar una
esencia de gran valor si se le procesa adecuadamente. Tal es el caso del pachulí (Pogostemon patchouli),
cuyas hojas es necesario fermentarlas para lograr el aceite esencial tan afamado. También debe tenerse
en cuenta que no necesariamente todo producto aromático debe tener características organolépticas
agradables, sea por su olor o su sabor (Bandoni., 2000).
Según (Lawrence., 1995), fueron encontradas en el mundo, alrededor de 17 500 plantas aromáticas
donde las familias Mirtáceas, Lauráceas, Rutáceas, Verbenácea, Zingiberáceas y Piperáceas, representan
las plantas con mayor contenido de esencias. Sin embargo, el universo de las plantas aromáticas es
muchísimo mayor, si se considera su origen biológico y su significación comercial. La variabilidad genética
de las plantas es una de sus más valiosas virtudes, al aportar una casi infinita riqueza de posibilidades. La
naturaleza expresa con esto una libertad de creación aún no igualada por la imaginación del hombre. A
esta variabilidad deben sumarse factores ecológicos, culturales, metodológicos agrícolas e industriales,
que relativizan casi cualquier intención de querer acortar en un número la cantidad de plantas aromáticas.
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 6
1.2. Estudios realizados en el campo farmacéutico de las plantas estudiadas en el presente trabajo.
1.2.1. Psidium Guajava L.
Según Roig., (1974), la guayaba como se le conoce popularmente en Cuba, tiene como nombre científico
Psidium guajava Lin y pertenece a la Familia Mirtáceas. Es un arbusto que crece silvestre en toda Cuba.
Como parte de su descripción botánica se presenta como un arbusto, a veces de siete metros de altura; el
tronco hasta de dos decímetros de diámetro; las ramillas pubescentes.
1.2.1.1. Usos tradicionales de la planta.
Roig describe que las partes empleadas de Psidium guayaba L. son las hojas, los frutos y la corteza. En
Cuba usan las hojas, en baños, como astringente en la cura de lesiones de la piel, la decocción de las
hojas en las diarreas, como remedio para la sarna y una decocción de la corteza es astringente, se aplica
a las úlceras y se toma internamente para los dolores de estómago. La raíces, hojas, corteza y frutos,
especialmente verdes, son muy astringentes (Roig., 1974).
El Formulario Nacional Fitofármacos y Apifármacos, (2010), refiere el uso de la planta con las partes
utilizadas en dos formas farmacéuticas: Talco de guayaba de acción fungicida, tópica y la Tintura al 20%
de acción Antidiarreica. En Cuba le es reconocida oficialmente esta acción por el Ministerio de Salud
Pública. En su composición tiene Flavonoides (quercetina, guyaverina), taninos hidrolizables, aceite
esencial (cariofileno, óxido de cariofileno, beta-bisaboleno, aromadendreno, beta-selineno, alfa-pineno,
1,8-cineol, selin-11-en-4-alfa-ol), triterpenoides, ácido oleánico, ácido ursólico, ácido crataególico, ácido
guayavólico, beta-sitosterol.
Según Vademecum de prescripción de plantas medicinales (Vanacloxta., 2003) esta planta, en
decocción o infusión de las hojas, se le atribuyen propiedades antibióticas, antifúngicas cicatrizantes y
para curar la dermatitis seborreica. Se usa para tratar diarreas, disentería y dolores de estómago. Sus
frutos son antiescorbúticos, debido a su riqueza en vitamina C (ácido ascórbico).
1.2.1.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta.
Los estudios fitoquímicos de la planta se iniciaron en el año 1985, en el cual Idstein H, y col identificaron
la presencia de ácidos volátiles en frutas tropicales entre las cuales se encontraba la guayaba (Idstein y
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 7
col., 1985). En la década 90 fueron caracterizados varios flavonoles, derivados de la quercetina, presentes
en un extracto metabólico de las hojas de la guayaba y se relacionaron estos con la acción
antiespasmódica (Lozoya y col., 1994).
Posteriormente en el aceite esencial de las hojas de guayaba fueron analizados cualitativa y
cuantitativamente por Cromatografía de Gases- Espectrometría de masa (CG-MS) 60 compuestos que
representaban una proporción de 90.56% (Li y col., 1999). En este mismo año en Brazil se aislaron 60
caratenoides de guayabas frescas coloradas (Mercadante y col., 1999).
Entre los componentes químicos de la guayaba se encuentra la vitamina C, muy abundante en los frutos,
mientras que en las hojas hay flavonoides como quercetina, aviculatina y guaijaverina a los que se les
atribuye el efecto antimicrobiano (Martínez y col., 2001) y en las hojas un grupo de investigadores
pakistanies han aislado y caracterizado por métodos espectroscópicos diferentes triterpenoides (Begun y
col., 2002 a; Begun y col., 2002 b Begun y col., 2002c).
De la fruta de guayaba se aislaron compuestos volátiles, se realizó una extración mediante un proceso de
destilación a vapor utilizando solventes de acuerdo con el método de Likens-Nickerson y caracterizado por
Cromatografía de Gases (GC), la cantidad de ésteres alifáticos y compuestos terpenicos contribuían al
único sabor de la fruta (Pino y col., 2002). Un estudio realizado en el zumo congelado y fresco de
guayaba se cuantificó la vitamina C determinado por el método directo de titración con yodo. Después de
ocho semanas las muestras deshidratadas por congelación contenían solo rastros de vitamina C, esto se
comprobó mediante la técnica de Cromatografía en Capa Delgada (CCD) (Suntornsuk y col., 2002).
En el año 2003 dos investigaciones marcan la continuidad de los trabajos de investigación de la planta.
(Masuda y col., 2003) aislaron e identificaron, con la ayuda de la Cromatografía Líquida de Alta
Eficacia(CLAE) un poderoso compuesto antiradical en los extractos de tres plantas con actividad
antioxidante entre las cuales se encontraba la Psidium guajava L., mientras que Jordan y col.
caracterizaron y cuantificaron un total de 51 componentes por Cromatografia de Gases y Espectrometría
de Masa (CG- MS, siglas en inglés) en el aceite esencial y el puré de la fruta fresca de la guayaba. El
aceite esencial comercial fue caracterizada por presentar un perfil vólatil rico en los componentes de bajo
peso molecular sobre todo alcoholes, aldehídos y ésteres considerando que en el puré fresco de la fruta
estaba más abundante los hidrocarburos terpenicos y la 3-hidroxi-2-butanona (Jordan y col., 2003).
Posteriormente las hojas molidas de guayaba se usaron para la realización de una extracción acuosa y
otra alcohólica al 50% (1:100) obteniendo compuestos fenólicos por una determinación
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espectrofotométrica de acuerdo con el método de Folin-Ciocalteu y calculado como ácido gálico
equivalente (Qian y col., 2004), mientras que el equipo pakistani, citado anteriormente, aisló de las hojas
de Psidium guajava L. cinco constituyentes incluyendo un nuevo triterpenoide pentacíclico (ácido
guajanoico) y cuatro compuestos conocidos (beta –sitosterol, uvaol,ácido oleanólico y ácido ursólico),
determinándose por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) las transformaciones químicas del nuevo
compuesto (Begun y col., 2004 ).
(Liang y col., 2005) identificaron en el extracto alcohólico de las hojas de Psidium guajava L. dos
compuestos fenólicos conocidos y cinco recientemente informados usando CLAE con detección
espectrofotométrica. Se obtuvo información estructural de los compuestos en los espectros UV y de masa
sin la necesidad de aislar los compuestos individuales.
1.2.1.3. Propiedades farmacológicas y toxicológicas
Los primeros reportes de la planta, de interés farmacéutico, aparecen en la década del 80, en los cuales
investigadores de Taiwan estudiaron el efecto antidiabético de la misma y como resultado concluyeron
que puede ser utilizada para mejorar y prevenir la Diabetes Mellitus (Cheng y col., 1983). La actividad
más estudiada para esta planta ha resultado ser su acción antidiarreica y la acción antibacteriana
relacionada con esta. En la década del 90 aparecen varios trabajos que se realizan para demostrar
diversas acciones relacionadas con esta. (Cáceres y coL., 1993) comprobaron la efectividad de un
extracto etanólico de la guayaba in vitro frente a diferentes desórdenes gastrointestinales causados por
diferentes tipos de bacterias entero patógenas (Escherichia coli, Salmonella enteritidis y Shigella flexneri),
mientras que (Morales y col., 1994) evaluaron las propiedades antidiarreicas de los extractos acuosos y
metanólicos y el efecto espasmolítico de las hojas de Psidium guajava se le atribuyeron a la quercetina
flavonoide presente en ella debido a que produce relajación de la musculatura lisa intestinal. Por su parte
investigadores Mexicanos probaron in vitro la efectividad de 14 extractos de plantas incluidas dentro de
ellas la guayaba frente a la giardia y solo 9 mostraron ser efectiva a este parásito (Ponce- Macotela y
col., 1994), mientras que (Almeida y col., 1995) realizaron un estudio en animales infectados con
agentes enteropatogénos que mostró la efectividad de extractos acuosos de la planta debido a su efecto
antidiarreico.
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 9
En África del Sur extractos crudos de 21 plantas medicinales se han usado tradicionalmente con actividad
antibacteriana. La actividad más alta fue exhibida por los extractos metanólicos de Psidium guajava L.
frente a las bacterias Gram-positivas (Rabe y col., 1997); mientras que en el Congo esta planta formó
parte de una lista de 45 extractos de plantas usadas como antidiarreicos que mostraron que 35 (77,78%)
tenían actividad antiparasitaria (Tona L y col., 1998) y un año más tarde se demostró que eran agentes
antidiarreicos, mostrando actividad antibacteriana, antiparasitaria y antiespasmódica (Tona y col., 1999).
Posteriormente estos autores demostraron que ambas actividades biológicas estaban dadas por la
presencia de polifenoles en los fragmentos de estos. (Tona y col., 2000).
En España (Vieira y col., 2001) estudiaron los extractos de brote de guayaba diluidos al 50% en etanol,
los cuales inhibieron eficazmente el crecimiento de E. coli, mientras aquellos al 50% en acetona fueron
menos eficaces. Concluyeron que los extractos de brote de guayaba constituyen una opción del
tratamiento factible para diarrea causada por E. coli o por las toxinas aureus producidas.
La actividad antidiarreica, asociada directamente a la actividad antibacteriana, ha constituido objeto de
investigación de múltiples trabajos publicados en la pasada década. En el año 2002 se comprobó que la
corteza, fruto y hojas de la guayaba poseen actividad antibacteriana, hipoglicemiante, antinflamatoria,
analgésica, antipirética, espasmolítica y depresora del SNC (Begun y col., 2002 b). También se
demostró que los extractos acuosos y metanólicos de la corteza poseen actividad antibacteriana
(Abdelrahim y col., 2002); Holetz y col., (2002); Lozoya y col., (2002) y se empleó en la medicina del
sur de África por su actividad antimalárica (Nundkumar y col., 2002).
Un estudio para establecer el mecanismo de acción antidiarreico del extracto de guayaba mostró que la
quercetina inhibió la concentración in vitro del íleon de cobayo y la movilidad peristáltica del intestino
delgado de ratón; así como redujo la permeabilidad de los capilares abdominales (Zhang y col., 2003),
mientras que investigadores japoneses evaluaron el efecto cardioprotector del extracto de Psidium guajava
L. frente lesiones isquémicas-reperfusión en corazones de ratas aislados, quercetina y ácido gálico
también ejercieron efectos beneficiosos similares (Yamashiro y col., 2003).
Estos estudios antimicrobianos, iniciados en la década del 80, continúan hasta nuestros días, los trabajos
que se relacionan a continuación dan fe de esta afirmación: Varios investigadores estudiaron el efecto
inhibitorio in vitro del extracto de hojas de Psidium guajava L. y Juglans regia frente al desarrollo de
microorganismos aislados en lesiones de la acné de diferentes jóvenes concluyendo que los extractos son
beneficiosos en el tratamiento de ellas por sus propiedades antiinflamatorias (Qadan y col., 2005). Se
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evaluó el extracto metanólico con actividad antimicrobiana frente a diferentes microorganismos, tales como
stafilococus aureus, Eschericha Coli, Pseudomonas aeruginosa, proteus sp y Shigella sp usando el
método de difusión. (Chah y col., 2006). Investigadores en Brasil verificaron el sinergismo entre 13 drogas
intimicrobianas y 8 extractos de plantas, incluido entre los extractos al Psidium guajava L., frente a
enfermedades producidas por Stafilococus aureus, (Betoni y col., 2006) y en un estudio realizado en la
India se demostró que uno de los flavonoides activos aislado de la guayaba (guaijaverina) inhibió el
crecimiento de estreptococus mutans resultando ser bacteriostático (Prabu y col., 2006).
Otra actividad farmacológica evaluada en la planta es la actividad antioxidante. En Madrid España
realizaron un estudio con la fruta de guayaba y los resultados indicaron que podría ser una fuente
conveniente de antioxidantes naturales (Jiménez-Escrig y col., 2001); mientras que en China se evaluó el
extracto liofilizado de las hojas de la guayaba y el estudio reveló que el mismo contiene un principio activo
potencial, efectivo de antioxidantes naturales. Además se demostró que el ácido asçórbico fue
sustancialmente un poderoso antioxidante, esta actividad fue determinada a temperatura ambiente con
detección colorimétrica y evaluada por la disminución en la absorbancia (Qian y col., 2004). Estos
estudios fueron continuados en los EEUU donde correlacionó con la vitamina C, y los fenólicos totales y se
demostró que no tenía relación con los beta-caroteno (Thaipong y col., 2005).
La planta ha sido sometida a varios estudios toxicológicos que han permitido dar garantía de su uso en la
terapéutica, así como una evaluación genotóxica de los extractos. Los resultados toxicológicos no
arrojaron muertes en ninguno de los 2 modelos experimentales y los resultados histológicos no sugieren
daños atribuibles a toxicidad del material vegetal probado. En el estudio in vitro con Aspergillus nidulans D-
30, los resultados demuestran la ausencia de efecto genotóxico de estos extractos, así como en el sistema
de inducción de micro-núcleos en médula ósea de ratón. Estos estudios farmacológicos preclínicos han
demostrado su efecto antimicrobiano sobre patógenos gastrointestinales que incluye un efecto
antigiardiásico, contra diferentes gérmenes Gram positivo y negativo y otros microorganismos como los
dermatofitos. Existen reportes en la literatura del efecto antimutagénico en el sistema de ensayos de
Salmonella typhimurium aunque son escasos los estudios toxicológicos publicados (Martínez y col., 2001;
Echemendia y col., 2004).
.
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1.2.2. Eugenia axillaris (Sw.) Willd.
La Eugenia axillaris (Sw.) Willd pertenece a la familia Myrtaceae, género Eugenia (clavo). Se desarrolla
creciendo en alturas y desarrolla un tronco deshojado, que lleva una densa copa. Esta planta en invierno
asume una coloración verde blanco; es de talla grande y puede alcanzar los 19 m de grandeza. Mantiene
las hojas en invierno. Esta planta tiene el desarrollo de un árbol, necesita al menos de algunas horas de
luz solar, soporta también las temperaturas rígidas, entonces se puede cultivar al abierto sin temer las
bajas temperaturas. Durante el invierno, las plantas jóvenes, pueden necesitar de una ligera protección del
viento o del frío (Fitomed., 1991).
1.2.2.1. Usos tradicionales de la planta.
El aceite de clavo se emplea en jabones de tocador y cosméticos y en aplicaciones dentales. El clavo de
olor es una especie aromática que forma parte de la composición de muchos compuestos que actúan
sobre el aparato digestivo, ejerce un discreto efecto antivomitivo. En uso externo, es un antiséptico y
desinfectante con un poder analgésico bastante efectivo, esta es una de las razones por la cual el clavo de
olor es tan utilizada por los dentistas en el tratamiento de las caries dentales, pulpitis o dolores de dientes
y muelas.
1.2.2.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta.
Los estudios publicados de esta planta son escasos, habiéndose encontrado en la literatura consultada
solo dos reportes relacionados con la presencia del aceite esencial en sus hojas. El primero incluye los
estudios realizados en Cuba donde se analizó la composición química del aceite obtenido de las hojas de
esta planta empleando la GC-MS y se obtuvo que los componentes mayoritarios eran el guajol (35.4%)
and germacreno D (12.1%). (Pino., 2003). Posteriormente (Schmidt y col., 2006), estudiaron el aceite
esencial de las hojas de la Eugenia axillaris que crece en las Bahamas y obtuvieron que el mismo posee
una variada composición siendo sus componentes mayoritarios el β-pineno (15.5%), dihidroagarofurano
(9.2%), β-cariofileno (8.8%), β-humuleo (6.9%), 1,8-cineol (6.6%), and germacreno D (6.2%). Estos
componentes contribuyen a su apreciable acción antimicrobiana y citotóxica.
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1.2.3. Melaleuca leucadendrom L.
Es una planta natural de Australia e Islas del Océano Índico, pertenece a la familia Mirtáceas y se conoce
comúnmente como Cayeput o simplemente Melaleuca. Se utilizan las hojas y ramas, las que contienen
aceite esencial (1%), rico en cineol o eucaliptol (entre 50 y 60%), L-pineno, terpineol, L-limoneno,
dipenteno, aldehídos (valeraldehído, benzaldehído), sesquiterpenos, azuleno; este presenta una tonalidad
verdoso-amarillento lo cual lo distingue de otros aceites de especies provenientes del género Melaleuca y
tiene un olor muy penetrante, medicinal y alcanforado (Roig., 1991 y Fitomed., 1991).
1.2.3.1. Usos tradicionales de la planta.
Las primeras comunicaciones sobre esta planta fueron hechas por (Roig., 1991), quien refiere
propiedades como expectorante, estimulante, antiséptico urinario, contrairritante en el reumatismo y
parasiticida en enfermedades de la piel, mientras que el (Fitomed., 1991), refiere las propiedades como
insecticida, analgésico, antirreumático, carminativo y el aceite esencial como antimicrobiano. Lo anterior
sirvió de base para la elaboración de la tintura al 20%, fitofármaco utilizado por la población cubana
indicado como antiséptico de las vías respiratorias (Guía Terapéutica de Fitofármacos y Apifármacos.,
1992). El aceite volátil de M. armillaris fue el más efectivo (99%) seguido por el de M. leucadendrom L. (92
%) y M. ericifolia (91,5 %). Recientemente (Farag y col., 2004), realizaron la evaluación química y
biológica de los aceites esenciales de diferentes especies de Melaleuca, cultivadas en Egipto. En este
estudio se analizaron los aceites esenciales de las hojas frescas de M. ericifolia, M. leucadendrom L., M.
armillaris y M. styphelioides, los cuales fueron aislados por hidrodestilación y analizados con un
cromatógrafo de gases y espectrometría de masa. Este aceite esencial resultó ser rico en 1,8-cineol (64,3
%); los aceites esenciales de estas especies mostraron actividad antibacteriana y antifúngica.
1.2.3.2. Estudios fitoquímicos y farmacológicos reportados de la planta.
Los estudios realizados a la planta son pocos y los primeros datan de principios de la década de los 90.
(Tsuruga y col., 1991), realizaron un estudio en la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad
de Tokio en Japón quienes obtuvieron extractos en cloroformo y en metanol de los frutos de la Melaleuca
leucadendrom L., los cuales inhibieron fuertemente la liberación de histamina. El ácido ursólico, un
triterpeno, fue el compuesto más activo contenido en el extracto clorofórmico. (Hiermann y Bufar., 1994),
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publicaron un trabajo sobre la influencia de algunas plantas medicinales tradicionales de Senegal en la
biosíntesis de prostaglandinas donde se investigaron extractos acuosos de Melaleuca leucadendrom L.
para el cual no se obtuvo resultado sobre la biosíntesis de prostaglandinas, mientras que (Sweeney y
col., 1994), realizaron un estudio sobre la inmunodetección y comparación del polen de la Melaleuca
leucadendrom L., los extractos de polen de dicha planta se analizaron para comprobar la reactividad
cruzada antigénica y alérgica, con resultados satisfactorios.
Los primeros estudios fitoquímicos de la planta fueron realizados por (Lee., 1998), quien aisló un nuevo
nortriterpeno nombrado como 28-norlup-20(29)-ene-3β, 17β-diol y 13 compuestos conocidos fueron
aislados de las hojas de Melaleuca leucadendrom L. por métodos químicos y espectrales.
(Nawawi y col., 1999), estudiaron los efectos inhibitorios de plantas medicinales de Indonesia sobre la
infección del virus del herpes simple tipo 1, realizando un estudio con extractos de metanol de la fruta de
Melaleuca leucadendrom L. para ensayos de infección en ratones, donde dicho extracto prolongó
significativamente el desarrollo de las lesiones cutáneas y redujo la mortalidad.
Los estudios de (Lee y Chang., 1999), determinaron cuatro nuevos triterpenos presentes en el corazón de
la Melaleuca leucadendrom L.
Más recientemente (Farag y col., 2004), realizaron la evaluación química y biológica de los aceites
esenciales de diferentes especies de Melaleuca, cultivadas en Egipto. En este estudio se analizaron los
aceites esenciales de las hojas frescas de M. ericifolia, M. leucadendrom L., M. armillaris y M.
styphelioides, los cuales fueron aislados por hidrodestilación y analizados con un cromatógrafo de gases y
espectrometría de masa. Los aceites mostraron actividad antibacteriana y antifúngica.
En el año 2006 fueron publicados dos trabajos de la planta. (Subehan y col., 2006) realizaron un estudio
para evaluar su acción basada en sus mecanismos de inhibición del citocromo P450 obteniéndose como
resultado que los extractos en metanol de las hojas de Melaleuca leucadendrom L. producían un 30 % de
inhibición del citocromo, dependiente del NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato). Por su parte
(Amer y Mehlhorn., 2006) evaluaron el aceite como repelente de mosquitos, para el estudio se disolvió el
mismo en diferentes solventes al 1% y se obtuvieron resultados muy satisfactorios en todos los casos.
Recientemente, extractos etanólicos de la planta fueron estudiados por investigadores cubanos,
(Fernández-Calienes y col., 2008), quienes evaluaron la actividad antifúngica, in vitro, frente a
Microsporum canis y Candida albicans, la actividad antibacteriana (Escherichia coli y
Staphylococcusaureus) y la actividad antiprotozoaria (Trypanosoma b. brucei, Trypanosoma cruzi,
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Leishmania infantum y Plasmodium falciparum), obteniéndose que el extracto de la Melaleuca
leucadendrom L tenía una actividad selectiva frente a los microorganismos analizados.
1.3. Generalidades en la obtención y composición de aceites esenciales y extractos.
1.3.1. Extractos. Obtención.
Los procesos más popularmente conocidos para transformar una Planta Medicinal en fitomedicamento para
el hombre son la infusión y la decocción. En estos procesos, se usa el agua hirviendo como líquido para
extraer las sustancias activas de dentro de los tejidos vegetales. El agua en ebullición, en contacto con la
planta fresca o seca, hace que las células vegetales estallen vertiendo su contenido de sustancias activas.
Los preparados como estos se denominan técnicamente "Extractos acuosos" y su ventaja principal es que
son fáciles y rápidos de preparar en la casa. Sin embargo, los extractos acuosos deben ser usados en el
momento, o dentro de un período reducido de tiempo, ya que no son estables. La degradación bioquímica y
la contaminación microbiana hacen que rápidamente estos preparados ya no sean aptos para el consumo
humano o que pierdan sus propiedades curativas. Otra limitación importante de los extractos acuosos tales
como las infusiones y decocciones es que algunas sustancias activas vegetales son sensibles a las altas
temperaturas y entonces pierden sus propiedades cuando son sometidas al agua en ebullición.
(http://www.natureduca.com/anat_nutric_vitaminas.php).
Esta limitación en la estabilidad de los extractos acuosos es subsanada mediante el empleo de otras
sustancias disolventes tales como los alcoholes u otros disolventes orgánicos, entre los cuales hay autores
que recomiendan al metanol como el disolvente de extracción más eficiente respecto a otros como el etanol,
acetona, hexano y acetato de etilo. La presencia de solventes orgánicos en los extractos trae consigo
aparejada una limitación que es preciso remarcar, su toxicidad para el organismo, por lo que actualmente se
recomienda eliminar el mismo por evaporación, quedando los ingredientes de la planta listos para su
formulación como ingrediente farmacéutico activo o para realizar los estudios investigativos
correspondientes.(Jayasinghe y col., 2003).
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1.3.2. Aceites esenciales. Obtención.
Los aceites esenciales proceden de las flores, frutos, hojas, raíces, semillas y corteza de los vegetales. El
aceite de espliego, por ejemplo, procede de una flor, el aceite de pachulí, de una hoja, y el aceite de
naranja, de un fruto. Los aceites se forman en las partes verdes (con clorofila) del vegetal y al crecer la
planta son transportadas a otros tejidos, en concreto a los brotes en flor. Se desconoce la función exacta
de un aceite esencial en un vegetal; puede ser para atraer los insectos para la polinización, o para repeler
a los insectos nocivos, o puede ser simplemente un producto metabólico intermedio (Bandoni., 2000).
La hidrodestilación es el método tradicional más utilizado que prescribe la mayoría de las farmacopeas
vigentes (Ej: Farmacopea Europea., 2005). Se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso
conocido de material vegetal y recoger el aceite esencial en un tubo graduado (1 mL dividido en 0,01 mL)
que se encuentra en un colector de destilación especialmente diseñado para este tipo de análisis. El
colector se acopla a un matraz que contiene el material vegetal y un cierto volumen de agua, el cual se
calienta mediante una manta calefactora de potencia regulable para provocar la destilación. Tras la
destilación, podemos medir el volumen de esencia destilado y fácilmente calcular el contenido, que se
expresa en porcentaje volumen/peso (mL de aceite esencial por 100 g de material vegetal). Aunque este
equipo (también llamado trampa de tipo Clevenger) está universalmente aceptado, y está citado salvo
mínimas variaciones, por casi todas las normas existente sobre extracción de esencia, conviene tener en
cuenta que los resultados que se obtienen con el mismo no siempre puede extrapolarse a un proceso
realizado a escala industrial. Pero si se quiere utilizar la información obtenida del equipo siempre es
conveniente ensayar previamente en una escala intermedia o piloto, para confirmar los resultados en
escala de laboratorio y así poder extrapolar a escala industrial. Finalmente, debe considerarse que el
proceso que se realiza en esta trampa, es más un proceso de cohobación que de destilación simple, pues
el agua condensada en el refrigerante vuelve al matraz o balón extractor, por lo que permite hacer una
extracción más exhaustiva de los componentes hidrosolubles (Bandoni., 2000).
Este método de extracción aparece reportado en la mayoría de las investigaciones relacionadas con
aceites esenciales. Algunos ejemplos de los artículos publicados en los dos últimos años muestran su
amplio uso: Yousefzadi y col., (2007); Loizzo y col., (2007); Kosar y col., (2008); Safaralie y col.,
(2008); Hajhashemi y Abbasi., (2008); Oladipupo y Adebola., (2009); Ogunbinu y col., (2009) y Hu y
col., (2009).
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1.3.3. Análisis de componentes volátiles presentes en aceites esenciales y extractos de plantas. Cromatografía gaseosa.
Teniendo en cuenta que los aceites esenciales son mezclas que pueden llegar a ser muy complejas, la
identificación de sus componentes no es una tarea simple. Antiguamente esta identificación se convertían
en una larga y tediosa operación, que consumía muchísimo tiempo ya que requería del aislamiento y
purificación de cada componente, utilizaban por ejemplo (la cromatografía en capa fina, cromatografía en
columna, destilación fraccionada), y su posterior determinación estructural por métodos químicos
tradicionales (obtención de derivados, reacción de coloración, pruebas de grupos funcionales, etc.). Por su
parte en los extractos confluyen componentes de muy variada naturaleza, volátiles y no volátiles. Sin
embargo, para el presente trabajo resultaron de interés los componentes volátiles, por disponer de
mayores facilidades analíticas para su identificación y cuantificación. Para el análisis de estos compuestos
volátiles presentes en las plantas medicinales las técnicas de elección son las cromatográficas y entre
estas especialmente la Cromatografía Gaseosa la cual en las últimas décadas ha tenido un desarrollo
vertiginoso con el acoplamiento a sistemas informático y base de datos que han cambiado
sustancialmente el panorama, agilizando de forma notable la identificación de los componentes. Además,
han contribuido especialmente a este cambio, al desarrollo de esta técnica, el surgimiento de las columnas
capilares y el acoplamiento a técnicas espectroscópicas, particularmente la espectroscopía de masas
(EM), la espectroscopía infrarroja (IR) y la espectroscopía de resonancia magnéticas nuclear (RMN)
(Bubbert. y Jennet., 2002).
La cromatografía gaseosa (CG) es una técnica de separación basada principalmente en fenómenos de
partición entre una fase móvil gaseosa (helio, argón, hidrógeno, nitrógeno) y una fase estacionaria constituida
por un líquido muy viscoso retenido en el interior de una columna cromatográfica, es un proceso por el cual
los componentes de una muestra son volatilizados y separados. El cromatógrafo se completa con un sistema
de inyección, que nos permite introducir la muestra en la columna y es rápidamente volatilizada y transportada
por la fase móvil a través de una columna. La columna se coloca en un horno con temperatura regulable y
programable, los que nos permite influir de forma decisiva en la separación de los componentes de la mezcla
(Skoog., 2000). La separación se produce debido a que los diferentes componentes de la muestra tienden a
desplazarse a través de la columna a distintas velocidades debido a su diferente solubilidad y velocidad de
difusión en la fase estacionaria, esta técnica requiere que los componentes a separar sean volátiles o
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volatilizados por efecto de la temperatura. Los componentes de la muestra son eluídos de la columna por el
gas portador y transportados hasta el detector, cuya función es detectar las diferentes sustancias a medida
que van saliendo de la columna, una vez separadas. La respuesta del detector es ampliada y enviada a un
registrador dando una representación gráfica (Cela., 2002).
Como variables respuestas importantes de la CG se pueden agrupar según el uso que se le de a la misma;
para la identificación de los componentes de una muestra son utilizados fundamentalmente el tiempo de
retención (tiempo que tarda cada uno de los picos en aparecer registrado, esta es una característica de un
componente particular en un sistema dado) y los índices de retención que se calculan a partir de los tiempo de
retención y por comparación con una serie de sustancia a las cuales se le asignan valores arbitrarios de índice
de retención, mientras que para la cuantificación de los componentes son utilizadas como variables
respuestas la altura y el área de los picos (Cela., 2002).
En esta técnica, de elección para el análisis de componentes volátiles de aceites esenciales y extractos,
suelen emplearse dos tipos de fase estacionaria: polietilenglicol de peso molecular 20000 (Carbowax 20M)
que es una fase polar, y polidimetilsiloxano en diferentes variantes (OV101, ultra 1, HP-5, DB-1, etc.), que es
una fase apolar. La CG no solo es útil para estudiar la composición de un aceite esencial, como veremos
seguidamente, sino que también es una herramienta indispensable en el control de la calidad de estos
compuestos. Para la identificación de los componentes del aceite esencial mediante CG se utiliza
frecuentemente la comparación de sus tiempos de retención con los patrones. Sin embargo, los tiempos de
retención están fuertemente influenciados por numerosas variables, como la técnica de inyección, las
variaciones de temperatura o flujo de los gases y por esto son empleados con mayor frecuencia los índices de
retención. Estos índices se calculan a partir de los tiempos de retención y por comparación con una serie de
sustancia a las cuales se les asignan valores arbitrarios de índice de retención. La identificación de los
componentes del aceite se realiza a través de comparación de los índices de retención de las sustancias
patrones en dos fases estacionarias polar y apolar, con los índices obtenidos para los componentes del aceite
esencial (Bandoni., 2000) para lo cual existe una recopilación muy importante de estos índices en bases de
datos especializadas entre las cuales se destaca la realizada por Adams RP (Adams., 2001).
Generalmente la cuantificación de los componentes de un aceite esencial o de los componentes volátiles en
un extracto se efectúa por normalización de las áreas de los pico del cromatograma obtenido con un detector
FID. No suelen utilizarse factores de corrección. Esta simplificación, que supone que todos los componentes
de la esencia tienen el mismo grado de respuesta al detector, es comúnmente aceptada dada la dificultad para
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disponer de los patrones necesarios para otros tipos de análisis más exactos. A pesar de que este detector
resulta el más utilizado en el análisis de los aceites esenciales, en los últimos años la necesidad de disponer
de aplicar otras técnicas más sensibles y específicas como detectores ha llevado al uso de la Espectrometría
de masas que es una técnica experimental que permite la medición de iones derivados de moléculas. El
espectrómetro de masas es un instrumento que permite analizar con gran precisión la composición de
diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación
masa-carga (m/z). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos (Bandoni., 2000).
Teniendo en cuenta que la técnica utilizada en el presente trabajo fue la GC-FID y la GC-MS, a
continuación en la (Tabla 1.1), se cita unos trabajos, como ejemplos, de los cientos que aparecen en la
literatura especializada en la última década empleando esta técnica como método de análisis para estudio
de la composición química de los aceites esenciales y extractos, describiéndose también las condiciones
cromatográficas utilizadas en cada caso.
Tabla 1.1. Ejemplos de investigaciones que emplean la GC y la GC-MS, para la determinación de la
composición de aceites esenciales y extractos, y las condiciones cromatográficas utilizadas en cada caso.
Nombre de la
Planta Columna T. Horno oC
T.Inyector(oC)
/T. Interfase
oC
Detector
Gas / V. de
Flujo Referencias
Calocedrus
macrolepis
(aceite esencial)
Capilar (100%
dimetilpolisiloxan
e)
Inicial 50 * 5 min.+
120 a 2 °C/min-1 + 220
a 2 °C/min-1 * 5 min.
FID Helio/1,0
ml/min.
(Hui-Ting y
col., 2008)
Pericarpium citri
reticulatae(aceite
esencial)
Capilar de sílica
OV-1
Inicial 65 + 260 a
razón de 6 °C/min. 300/280°C MS
Helio/1,0
ml/min.
(Lunzhao y
col., 2008)
Piper nigrum
(Oleoresinas) Capilar DB5
Inicial 60 °C (1 min),
60-185 °C (1.5°C/min),
185-275°C(9 °C/min),
275 °C (2 min).
300°C MS Helio/1,0
ml/min Kapoor, 2009
Thymus vulgaris
(Extracto) Capilar DB5
Inicial 40°C, a 3°C
hasta 230 y 15°C - FID
Helio/1,0
ml/min
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 19
Nombre de la
Planta Columna T. Horno oC
T.Inyector(oC)
/T. Interfase
oC
Detector
Gas / V. de
Flujo Referencias
hasta 310°C
1.4. Validación de los métodos analíticos. Determinación de los parámetros de desempeño.
El uso de una técnica analítica para la cuantificación de componentes en una muestra obliga a que la
misma sea sometida previamente a su validación, siguiendo normativas nacionales e internacionales al
efecto. Dicha validación desempeña un papel determinante pues de ellos depende la comprobación
confiable y reproducible de los resultados, lo cual contribuye a obtener resultados confiables. En el
presente trabajo se realizó la validación de la técnica de Cromatografía Gaseosa siguiendo las normativas
descritas en las normas de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH, siglas en inglés) y del
Centro Estatal para el Control de la Calidad de los Medicamentos de Cuba, (CECMED). A continuación se
resumen los aspectos de los parámetros de validación que fueron tomados en consideración en el trabajo.
Bibliografía consultada:(ICH., 2005 y Validación de métodos analíticos (CECMED., 2007).
1.4.1. Linealidad
Este estudio se efectuará tanto sobre soluciones patrón de analito como sobre muestras problemas que
contengan concentraciones crecientes del analito. Los estudios de linealidad responderán a diseños
similares a los que se describen a continuación:
a) El ensayo se puede efectuar tanto con material de referencia del analito, como con muestras problemas
que contengan concentraciones crecientes de analito que cubran el intervalo del método. El análisis se
realizará como mínimo por triplicado.
b) Se evaluarán los datos estadísticamente a fin de verificar la linealidad y proporcionalidad según se
describe a continuación:
Significación de la regresión: Se determinará el coeficiente de correlación (debe ser ≥ 0.990) y el
de determinación (valores superiores a 0.98).
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 20
Verificación de linealidad: Se efectuará por determinación del CV de los factores de respuesta
(cociente respuesta / concentración), el cual no será superior al 5%. También se evaluará la
varianza de la pendiente de la línea de regresión.
Verificación de proporcionalidad: Los resultados de este ensayo deberán incluir el 0 para el grado
de probabilidad definido.
Prueba de falta de ajuste: Se implementará para demostrar que los valores se ajustan a una línea
recta.
1.4.2. Precisión.
La precisión de un procedimiento analítico expresa el grado de concordancia entre una serie de
mediciones obtenidas a partir de la misma muestra homogénea bajo las condiciones prescritas.
Debe investigarse la precisión utilizando muestras homogéneas, auténticas. Sin embargo, si no es posible
obtener una muestra homogénea se emplean muestras artificialmente preparadas o una disolución de la
muestra.
La determinación de la precisión se realizará a 3 niveles, siempre que proceda: intraensayo (repetibilidad),
interensayo (precisión intermedia) e interlaboratorios (reproducibilidad).
a) Evaluación de la repetibilidad: realizar un mínimo de 6 determinaciones a la concentración del 100 %.
b) Evaluación de la precisión intermedia: Se implementará un diseño donde se evaluarán 3
concentraciones de una muestra (como mínimo) en duplicado, por al menos 2 analistas en 3 días
diferentes. Se recomienda, siempre que sea posible, que cada analista emplee instrumentos y materiales
diferentes.
1.4.3. Especificidad.
La especificidad es la capacidad de un método analítico de detectar inequívocamente el analito en
presencia de compuestos que pueden estar presentes en la muestra (impurezas, productos de
degradación, componentes de la matriz, etc.).
La especificidad de un método analítico se determina comparando los resultados del análisis de muestras
conteniendo impurezas, productos de degradación, sustancias relacionadas o excipientes con los
resultados del análisis de muestras que no contienen dichas sustancias.
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 21
La determinación cuantitativa de un componente (o para ensayos de actividad): Se asegurará que la señal
medida por el método analítico corresponde exclusivamente al analito sin interferencias posibles.
1.4.4. Exactitud.
La determinación de la exactitud deberá realizarse por estudios de adición y recuperación de cantidades
conocidas de muestras de referencia o patrones a excipientes a fin de comparar el valor medido
experimentalmente (observado) con el valor real (esperado).
La determinación de este parámetro podrá realizarse por diferentes métodos, de los cuales la adición del
patrón constituye el más utilizado en muestras vegetales, ante la poca disponibilidad de patrones de
referencias certificados:
Método de adición de patrón: Se tomarán alícuotas de una muestra a las que se añaden cantidades
conocidas de un patrón, dejando una alícuota como control de muestra. Dichas muestras se analizarán en
paralelo por triplicado y se evaluarán contra una curva de calibración preparada con soluciones patrones.
Se calculará la recuperación como medida de exactitud y su significación por pruebas estadísticas
apropiadas.
Para que la evaluación de la exactitud se considere satisfactoria, no existirán diferencias significativas
entre los valores obtenidos experimentalmente y los valores verdaderos. Si esta diferencia es pequeña, la
exactitud es buena.
1.4.5. Límite de detección y cuantificación.
Límite de cuantificación: Cantidad más baja de analito que puede medirse cuantitativamente en una
muestra con exactitud y precisión aceptables.
Límite de detección: Cantidad más baja de analito que puede detectarse, pero no necesariamente
cuantificarse, como una concentración o cantidad exacta.
La evaluación de ambos parámetros puede efectuarse y responder a diferentes diseños entre los cuales
uno de los más empleados es la relación señal ruido. Se compararán la respuesta del blanco (matriz sin
analito) con las muestras que contienen pequeñas cantidades de analito adicionadas al blanco. Deberá
obtenerse el nivel medio de ruido del blanco y se multiplicará por 2 ó 3 para el límite de detección o por 6 ó
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 22
10 para el de cuantificación. Posteriormente se compararán estos valores con las respuestas de las series
blanco + analito y se hallará la concentración de analito que corresponda al valor de la señal.
1.5. Evaluación de la actividad antioxidante en productos naturales.
Se consideran radicales libres (RL) aquellas moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón
desapareado o impar en el orbital externo, dándole una configuración espacial que genera una alta
inestabilidad. Es una entidad química que contrario a la normal tendencia espontánea de los electrones
localizados en los átomos y moléculas a la formación de parejas es desapareado. Esto lo hace muy
inestable, extraordinariamente reactivo y de vida efímera, con una enorme capacidad para combinarse
inespecíficamente en la mayoría de los casos, así como con la diversidad de moléculas integrantes de
estructura celular: carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y derivados de cada uno de ellos.
(Halliwell B, Gutterioge, JMC., 1989)
En 1954 una investigadora argentina, Rebeca Gerschman, sugirió por primera vez que los RL eran
agentes tóxicos y generadores de enfermedades. (Gerschman R., 1954). Los RL son elaborados
continuamente como un producto del metabolismo normal de cada célula e inactivados por un conjunto de
mecanismos (unos enzimáticos y otros de atrapamiento). Son componentes normales de células y tejidos,
existiendo una poza de RL particular en cada estirpe celular y en algunos tipos celulares permiten la mejor
adaptación a su hábitat. Al elevarse o disminuir las concentraciones fisiológicas de las especies reactivas
de oxígeno (EROS) puede acarrear importantes alteraciones funcionales. Las principales especies
reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes son: Hidroxilo, Alcoxilo, Superóxido, peróxido, entre otros
(Cabrera., 2000, Moreira et al., 2000). El desbalance entre la producción de EROS y la defensa
antioxidante provoca un daño orgánico conocido como estrés oxidativo, que lleva a una variedad de
cambios fisiológicos y bioquímicos los cuales ocasionan el deterioro y muerte celular. Este desequilibrio en
favor de los oxidantes conduce a un potencial daño oxidativo sobre biomoléculas (Avello and Suwalsky.,
2006, Ortega et al., 2003).
El ser humano está protegido del estrés oxidativo gracias a la acción de estas sustancias antioxidantes
que poseen diferentes funciones (Shi, Noguchi y Niki., 2001). Es difícil intentar definir los antioxidantes
naturales, pero en general el término alude a aquellas sustancias que se presentan o pueden ser extraídas
de los tejidos de las plantas y los animales y aquellos que se forman durante la cocción o el procesado de
compuestos alimenticios de origen vegetal o animal. Los antioxidantes naturales se encuentran presentes
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 23
en prácticamente todas las plantas, microorganismos, hongos e incluso en los tejidos animales
(Yanishlieva-Maslarova., 2001).
(Gastell and Luis., 2000) señalaron que uno de los mecanismos de acción de los antioxidantes presentes
en el cuerpo es aquél en que la molécula de antioxidante, al colisionar con un radical libre de oxígeno, le
cede un electrón, que se oxida a su vez y se transforma en un radical libre de oxígeno débil no tóxico. No
todos los antioxidantes actúan de esta manera, los llamados enzimáticos catalizan o aceleran reacciones
químicas que utilizan sustratos que a su vez reaccionan con los RL. Cada antioxidante posee una afinidad
hacia un determinado RL o hacia varios RL. (Maestri et al., 2006).
1.5.1. Mecanismos de acción de los antioxidantes y métodos para determinar la actividad antioxidante.
Los antioxidantes engloban un grupo de sustancias que presentan estructuras químicas y mecanismos de
acción muy variados. Así que no hay una definición internacional para el mejor antioxidante. (Gordon.,
2001).
En la realidad, las propiedades antioxidantes de diferentes extractos, aceites esenciales y compuestos
puros se podrían ser evaluados utilizando varios ensayos in vitro que pueden se divididos en dos grupos
(Macdonald-Wicks., 2006):
1. Los que evalúan la peroxidación lipídica.
2. Los que miden la habilidad secuestradora a los radicales libres.
En la valoración de la peroxidación lipídica, la actividad antioxidante del sistema podría ser detectada
midiendo la formación de los substratos y el consumo de los antioxidantes, y los intermedios o los
productos finales. Estas medidas se lleva a cabo en los ensayos como:
Valor peróxido.
Valor de ácido tiobarbitúrico (TBA).
Contenido de ácidos grasos libres.
Formación de los dienos conjugados por la absorción a 232 y 268nm.
Composición de los ácidos grasos.
Proporción de los ácidos grasos insaturados y los ácidos saturados.
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 24
La mayoría de estos ensayos basados en los sustratos lipídicos necesitan las condiciones de oxidación
aceleradas: incrementando presión parcial de oxígeno y la temperatura, adicionando los catalizadores de
la transmisión metálica, expuesto a la luz, varias fuentes de agitación y radicales libres.
Para medir la habilidad secuestradora a los radicales libres, el método se divide en dos grupos de acuerdo
a las reacciones químicas involucradas: uno basado en la transferencia de los átomos de hidrógenos u
otro basado en la transferencia de los electrones singulares. Ambas transferencias pueden ocurrir
simultáneamente y la reacción dominante en el sistema se puede determinar según las propiedades y la
estructura de los antioxidantes, los coeficientes de partición y solubilidad, el solvente.
En el método basado en la transferencia de los átomos de hidrógenos, los antioxidantes pueden apaciguar
los radicales libres dándole hidrógeno.
Las reacciones son rápidas, no dependen del solvente y pH. Ellos son: inhibición de la inducción de
oxidación de LDL, capacidad absorbida de los radicales de oxígeno (ORAC).
El método basado en la transferencia de electrón singular detecta la habilidad de un antioxidante para
transferir un electrón o reducir cualquier compuesto, incluyendo metales, grupos carbonilos y radicales. Es
un método depende del valor de pH. Ellos son: ensayo de fenólicos totales por reactivo Folin-Ciocalteu,
capacidad antioxidante equivalente Trolox (TEAC, siglas en inglés), 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPD, siglas
en inglés), la fuerza antioxidante reducida del ión férrico (FRAP, siglas en inglés), ensayo de potencial total
antioxidante utilizando el complejo de Cu(II) como antioxidante.
Los métodos basados en este principio incluyen que un oxidante (substrato) puede abstraer un electrón
desde el antioxidante, dando el cambio de color del substrato. El grado del cambio de color es proporcional
a la concentración del antioxidante. El punto final de la reacción se alcanzaría cuando el cambio de color
se había parado. A través de la pendiente de la curva trazada de la variación de absorbancia contra la
concentración de antioxidante se refleja la actividad antioxidante.
Algunos autores proponen el orden de tres pasos principales en la evaluación de la muestra (Huang.,
2005):
Cuantificación e identificación de los compuestos fenólicos.
Cuantificación de la actividad secuestradora de radical, utilizando más que un método y
considerando el efecto del solvente en el mecanismo de antioxidante.
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 25
Evaluación de habilidad de los antioxidantes para inhibir o suspender la oxidación lipídica en el
sistema adecuado.
Esta actividad ha sido muy estudiada por múltiples grupos de investigadores en todo el mucho, los
siguientes trabajos, como ejemplos, dan fe de esta afirmación; Firuzi y col., (2011) evaluaron la actividad
antioxidante del aceite esencial y varios extractos del Tanacetum sonbolii Mozaff, obteniendo los mejores
resultados para el extracto acuoso y el de acetato de etilo. En este mismo año se evaluaron extractos
metanólicos y el aceite esencial del Eucalyptus loxophleba que aportó mejor actividad antioxidante en los
extractos que en el aceite. (Rahimi-Nasrabadi., 2011); mientras en Malasia se realizaron estudios
similiares en la especie Tetrastigma con resultados muy buenos para el extracto metanólico (Hossain M
Amzad., 2011). Más recientemente se pudiera citar el trabajo realizado por (Cavar y Maksimovi., 2012),
quienes determinaron la actividad antioxidante del aceite esencial y los extractos metanólicos de las hojas
y las flores Pelargonium graveolens, obteniendo mejores resultados para las hojas en todos los ensayos.
1.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana en productos naturales.
Los antimicrobianos son sustancias que atacan a los microorganismos, de diferentes maneras: por
inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones de la membrana celular, de la traducción del
material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos. Estos pueden actuar, matando las formas
vegetativas de los gérmenes (bactericida, refiriéndose a bacterias y fungicida, refiriéndose a hongos) o
inhibiendo el creciemiento de los microorganismos (bacteriostático, refiriéndose a bacterias y fungistático,
refiriéndose a hongos) (Lizcano y Vergara., 2008).
La sociedad actual, demanda también, productos con menos aditivos químicos ya que, algunos de estos
poseen cierto grado de toxicidad. Es así, como los productores han sido forzados a remover completamente
el uso de antimicrobianos químicos y adoptar alternativas para el mantenimiento o extensión de la vida útil
de sus productos. La mayoría de los compuestos con actividad antimicrobiana encontrados en plantas,
hierbas y especias, son compuestos fenólicos, terpenos, alcoholes alifáticos, aldehídos, cetonas, ácidos e
isoflavonoides (Figueroa y col., 2007).
De las plantas se pueden obtener extractos y aceites esenciales para muchos y diversos fines; por un lado
estos aceites presentes en variada proporción en la planta protegen la mima de plagas, enfermedades e
inclusive de la invasión de otras plantas, para atraer insectos y aves (polinizantes). Estas cualidades de
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 26
protección y atracción, se ven reflejadas en propiedades: antisépticas, antiinflamatorias, antidepresivas,
afrodisíacas y otras, presentes en mayor o menor grado en la totalidad de los aceites (Müller., 1981;
Morales de Godoy., 1996; Smith y col., 1998; Martínez., 2003).
1.6.1. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana. Ejemplos.
Existen diferentes métodos que prueban la eficacia “in vitro” en medios microbiológicos, en los que
generalmente el agente antimicrobiano se aplica directamente al producto que se desea probar. Entre estos
métodos tenemos el de Dilución en agar y caldo y el de Difusión en agar o “Proceder de Kirby-Bauer”. Este
último se trata de un método sencillo que se basa fundamentalmente en incorporar al medio de cultivo el
antibiótico o el microorganismo en concentración conocida, para que luego de solidificado el medio, se
adicione la contraparte y observar la inhibición del crecimiento o halos de inhibición según la técnica
utilizada. Esta técnica también abarca el método de difusión en discos de papel, en la cual el antimicrobiano
a ensayar viene incorporado a discos de papel absorbente en concentración conocida que se colocan sobre
la superficie de una placa de agar sembrada masivamente con el microorganismo en estudio, luego de
incubar a la temperatura y tiempo adecuados, se observarán halos de inhibición del crecimiento; donde el
efecto inhibitorio del compuesto que se va a evaluar depende de su habilidad de difundirse en el medio
(Mitscher y col., 1987; Arévalo y Enciso., 1996; Alderman y Smith., 2001; NCCLS., 2003; NCCLS.,
2009).
El tamaño de esta zona de inhibición indica si las bacterias objeto de análisis tienen una sensibilidad alta,
intermedia o baja frente a las soluciones del aceite esencial. Se considera inhibitorio un valor mayor de 2
mm alrededor de cada orificio o disco (Dabbah y col., 1970; Dellacasa y col., 1999; Figueroa y col.,
2007).
Las ventajas de los métodos de difusión es que utilizan pequeñas cantidades de muestra y ofrecen la
posibilidad de ensayar varias sustancias contra un mismo microorganismo. (Arévalo y Enciso., 1996,
Déciga., 2007). Además permite medir la susceptibilidad “in vitro” de microorganismos patógenos y
fitopatógenos frente a una sustancia o la mezcla de varias sustancias desconocidas de origen vegetal con
potencial antimicrobiano (Torres., 2007).
Las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales y extractos han sido reconocidas por muchos
años y sus preparaciones han encontrado aplicaciones como agentes antimicrobianos en el campo
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 27
terapéutico y como preservos de alimento. Los aceites esenciales y extractos que poseen actividad
antimicrobiana han sido blanco de muchas investigaciones, realizándosele el screening a una gran variedad
de especies de plantas que han revelado estructuralmente compuestos activos (Zaika., 1988). En los
últimos años múltiples investigadores reportan la actividad antimicrobiana y antifúngica de aceites
esenciales y extractos de diferentes especies de plantas, siendo destacable que en la mayoría de los
trabajos que aparecen reportados en los últimos 6 años relacionan estas actividades farmacológicas con los
componentes mayoritarios presentes en las mismas (Tabla 1.2).
Tabla 1.2. Reporte de plantas con acciones farmacológicas demostradas.
Planta Medicinal Acción demostrada M.O Fuente
Ambrosia trífida (Aceite esencial)
bactericida y fungicida 6 especies bacterias y 2 de hongos
Wang y col. (2006)
Arracacia tolucensis var. Multifida. (Aceite esencial)
Antibacteriana Mycobacterium tuberculosis.
Figueroa y col. (2007)
Woodfordia fruticosa Antibacteriana Staphylococcus Parekh (2008)
Cleistocalyx operculatus (Extractos etanólicos)
Bacterias Gram positivas y Gran negativas P. aeruginosa
Staphylococcus aureus.
Thi Dung (2008)
Moringa oleifera Lan (aceites esenciales y extractos)
Antifúngica Staphylococcus aureus.
Chiang y col. (2007)
Clalocedrus macrolepis (aceites esenciales y extractos)
Antifúngica Staphylococcus aureus.
Chang y col. (2008),
Satureja montana actividad antimicrobiana Streptococcus. Serrano y col., (2011)
1.7. Consideraciones finales del estudio bibliográfico.
Después de haberse realizado una exhaustiva revisión de la literatura especializada se puede resumir lo
siguiente: (I)- Los aceites esenciales poseen una gran cantidad y variedad de componentes, entre los
cuales abundan aldehídos de cadena corta, terpenos, sesquiterpenos etc. Y las técnica de extracción de
aceite más empleada suele ser la hidrodestilación (II)-La técnica analítica de elección para identificar y
cuantificar los componentes volátiles presentes en aceites esenciales y extractos de plantas medicinales
suele ser la cromatografía de gases con detección FID y/o acoplada a la espectrometría de masa (GC–
MS); (III)- La acción antioxidante y la antibacteriana constituyen las acciones farmacológicas más
Capítulo 1: Revisión Bibliográfica
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 28
estudiadas en los aceites esenciales y ya se encuentran ampliamente comprobadas en extractos; (IV)- Los
estudios reportados para la Melaleuca leucadendrom L. y el Psidium guajava L. muestran la presencia de
1,8 cineol en sus hojas y su acción antifúngica y antibacteriana; mientras que los estudios reportados para
la Eugenia axillaris(Sw.) Willd. son muy escasos, apareciendo solo algunos reportes sobre sus usos
tradicionales y su composición.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 24
Capítulo 2: Materiales y Métodos
2.1. Material vegetal, equipos y reactivos químicos.
La presente investigación se realizó en el Departamento de Farmacia de la Facultad de Química y
Farmacia, durante la etapa comprendida desde septiembre de 2010 hasta diciembre del 2013. En todos
los procedimientos desarrollados se emplearon: cristalería específica de laboratorio previamente
descontaminada, reactivos de calidad analítica y equipos e instrumentos de medición certificados como
aptos para el uso.
Para la obtención del aceite esencial y los extractos se utilizaron las hojas secas de las especies Psidium
guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L. . Las especies Eugenia axillaris
(Sw.) Willd y Psidium guajava L., fueron recolectadas en las áreas del Jardín botánico de la UCLV,
mientras que la especie Melaleuca Leucadendrom L. fue recolectada en las montañas del macizo
Guamuaya en la zona de Topes de Collantes y las tres especies fueron identificadas por botánicos
especialistas del Jardín Botánico donde aparecen registradas con la siguiente numeración:
La identificación taxonómica del material vegetal se realizó en el lugar de colecta por el especialista Dr. C.
Alfredo Noa Monzón, se lavó con abundante agua potable y se secó con la estufa durante 3 días a 30oC
para su evaluación analítica.
Se utilizó, en todos los procedimientos desarrollados, cristalería específica de laboratorio, previamente
descontaminada, empleando reactivos de calidad analítica y equipos certificados como aptos para el uso.
Equipos, instrumentos de medición y reactivos.
Autoclave, RAYPA modelo AES-28 España.
Balanza digital, BOECO, Alemania.
Baño ultrasónico, BRANSON 1510, México.
Cámara para cromatografía (25 x 10 cm)
Centrífuga, 5702 EPENDORF, Alemania
Cristalería de laboratorio.
Cromatógrafo Gaseoso, AGILENT 6890N series, Estados Unidos.
Cromatógrafo GC-MS, QP5050A, SHIMADZU.
Rotoevaporador BUCHI R-200, Alemania.
Espectrofotómetro UV-VIS, Termo electrón, Genesys 10UV, Estados Unidos.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 25
Estufa, BINDER
Filtro miliporo de 0,45 µm, MILLEX-HA
Flujo laminar, FASTER
Incubadoras, HERAEUS modelo IP-20 Klasse 3.1. Alemania
Lámpara UV, CAMAG.
Micropipetas de 5, 20, 100, 1000 µL, EPENDORF, Alemania.
Máquina sacudidora THYS 2, Alemania.
Molino de Cuchillas (Retsh GMBH). Alemania.
Reactivos y disolventes utilizados:
2, 2-difenil-1-picril-hidracilo (DPPH), SIGMA- ALDRICH.
n-butanol, Merck.
Acetona, UNI-CHEM.
Ácido ascórbico, UNI-CHEM.
Ácido linoleico, Merck.
. 2,4,6/tripiridil/s/triazina (TPTZ).
Ácido tricloroacético, EPB “Carlos J Finlay”.
Agar Mueller-Hinton, BioCen.
Agua desionizada y destilada.
Anisaldehído, Merck.
Buffer fosfato (0.2 M, pH 6.6)
Buffer fosfato (300 mM)
Buffer fosfato (40mM).
Caldo Mueller-Hinton, BioCen.
Carbonato de sodio, Merck.
Ciclohexanol, SAFC.
Cineol, SAFC.
Cloruro férrico, Panreac.
Cloruro ferroso, Merck
Dimetilsufóxido (DMSO), Riedel de Haën
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 26
Etanol, UNI-CHEM.
Ferricianuro de potasio, UNI-CHEM.
Hidroxianisol butilado (BHA), SIGMA- ALDRICH.
Ácido sulfúrico 0,6M.
Hidroxitolueno butilado (BHT), SIGMA- ALDRICH.
Mentol, SAFC.
Metanol, Lichrosolv, Merck.
Pirogalol, SCHARLAU.
Propilgalato, SAFC.
Reactivo Folin–Ciocalteau, SIGMA- ALDRICH
Salicilato de metilo, SAFC.
Sulfato de sodio anhidro, UNI-CHEM.
Terpineno, SAFC.
Timol, SAFC.
Tiocianato de amonio, Merck.
Tolueno, Panreac.
α-pineno, SAFC.
Molibdato de amomio (4mM).
Fosfato de sodio (28mM).
Eugenol
Ácido sulfúrico
Vitamina E.
Ácido gálico
Disco de Amikacina 30 µg, BioCen.
Disco de Eritromicina 15 µg, BioCen.
Disco de Ácido nalidixico 30 µg, BioCen.
Disco de Penicilina 10 IU, BioCen.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 27
2.2. Metodología de obtención del aceite esencial y de los extractos a partir de las hojas de las tres
especies.
2.2.1. Obtención del aceite esencial.
El aceite esencial de las tres especies evaluadas se obtuvo empleando el método de hidrodestilación que
describe la Farmacopea Europea (2005), el cual se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso
conocido de material vegetal y recoger el aceite esencial en un tubo graduado (1mL dividido en 0,01mL)
que se encuentra en un colector de destilación especialmente diseñado para este tipo de análisis, trampa
de tipo Clevenger, (Figura 2.1.), este equipo está universalmente aceptado, y está citado salvo mínimas
variaciones, por casi todas las normas existentes sobre extracción de esencias. Este equipo se acopló a
un balón que contenía 50 g de material vegetal y un volumen de agua que ocupó las ¾ partes del mismo,
el cual se calentó mediante una manta calefactora de potencia regulable para provocar la destilación. Tras
la destilación, se separó la fase acuosa del aceite esencial y se agregó a este último la cantidad necesaria
de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente.
Figura 2.1. Equipo de destilación de aceite esencial (Trampa Clevenger)
2.2.2. Obtención de los extractos
Los extractos se obtienen utilizando las hojas de cada especie previamente secada y molida. Se pesaron
10g del polvo y se añadieron en los mismos 100mL de acetona. Fueron colocados en una agitador
(Zaranda) 24h a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se filtró cada extracto utilizando filtros de
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 28
papel 0,45µm y se procedió a repetir la extracción en iguales condiciones otras 24h. A continuación se
juntan los extractos obtenidos en cada extracción, para cada planta por separado, y el solvente se evaporó
utilizando un rotoevaporador en vacío a 400C hasta la sequedad. Las muestras obtenidas se almacenaron
a 40C hasta el próximo uso. Para obtener el rendimiento, se realiza el cálculo en base de extracto seco
obtenido después de la rotoevaporación (%).
2.3. Determinación del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie
estudiada.
Antes de proceder a realizar la determinación del contenido de aceite esencial y extracto, aplicando los
métodos descritos anteriormente, fue necesario determinar el contenido de humedad del material vegetal
sometido a los procesos de extracción, lo cual permitió realizar el cálculo en base a droga seca. Esta se
determinó por el método azeotrópico, que es el que se emplea para plantas que contienen aceites
esenciales, el cual se describe a continuación:
A un balón de 500 mL se transfirieron 200 mL de Tolueno, se le añadió 2 mL de agua, se colocó en la
plancha de calentamiento, se destiló en el equipo para tolueno (Figura 2.2.), hasta que el volumen del
agua en el tubo colector permaneció constante, se midió el volumen inicial (V1). Se dejó enfriar el tolueno
(tolueno saturado). De la muestra de ensayo pulverizada y tamizada, se pesó 10 g y se transfirieron al
balón que contenía el tolueno saturado; se colocó en la plancha de calentamiento, se destiló hasta que el
volumen del agua en el tubo colector permaneció constante, se midió el volumen final de agua (V2).
El contenido de humedad (H) de la porción de ensayo expresada en por ciento (v/p) se calculó mediante la
fórmula siguiente:
Donde: m masa de la porción de ensayo
100 factor matemático para los cálculos
V2 volumen de agua final
V1 volumen de agua inicial
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 29
.
Figura 2. 2. Equipo de arrastre de agua en aceites esenciales (método del tolueno)
Tras la destilación y de cada extracción, se midió el volumen de esencia destilado se pesó el extracto
obtenido, respectivamente y se calculó el contenido de aceite y/o extracto, que se expresó en porcentaje
volumen/peso (mL de aceite esencial o g de extracto por 100 g de material vegetal) en base a la droga
seca, según la siguiente expresión:
Donde: R contenido de aceite esencial o extracto en % (v/p)
C cantidad de aceite esencial obtenida en mL
M masa de la droga sin humedad residual en gramos, que se calcula:
Donde: H humedad de la droga
M0 cantidad de planta sometida a la destilación en gramos
100 factor matemático
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 30
2.4. Determinación de la composición de los aceites esenciales y los extractos de las tres especies
de Mirtáceas estudiadas.
2.4.1. Determinación de la composición de los aceites esenciales
Para la determinación de la composición de los aceites obtenidos se utilizó la técnica GC-MS. El análisis
se realizó en un cromatógrafo GCMS-QP5050A Shimadzu, empleando las siguientes condiciones
cromatográficas:
Se utilizó una columna capilar DB-5MS.
Como gas portador se utilizó Helio.
Programa de temperatura del horno: 50-150 a razón de 3 oC·min-1 manteniendo la temperatura de 150
oC durante 15 min (el tiempo del análisis es de 48 min).
Temperatura del inyector de 250 oC.
Flujo del gas a través de la columna de 0,7 mL/min.
Temperatura de la interface de 290 oC.
Impacto electrónico (IE).
Intervalo de barrido de masas de 50-500 amu a 70 eV; una velocidad de barrido de 2000 y un voltaje
de 0,80 kV.
Preparación de la muestra
Se realizaron dos identificaciones a partir de los aceites obtenidos por los métodos de hidrodestilación y
arrastre con vapor respectivamente. Para ambas muestras de aceite esencial se tomó:
50µL y se diluyeron en 1mL de acetona (muestra concentrada).
20 µL y se diluyeron en 1mL de acetona (muestra diluida)
2.4.2. Determinación del perfil cromatográfico de los extractos y el aceite esencial por GC.
Identificación de componentes con el uso de patrones.
El perfil cromatográfico de los aceites y extractos obtenidos se realizó en un Cromatógrafo gaseoso
AGILENT, empleando el siguiente procedimiento:
Disolución problema: Se preparó una dilución del aceite en acetona (50 µL/1000 µL), mientras que los
extractos se diluyeron 20 µL/1000 µL
Capítulo 3: Resultados y discusión
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 31
Disoluciones de referencia: Fueron probadas 8 sustancias de referencias, que constituyen componentes
comunes reportados en múltiples aceites esenciales: 1,8-cineol, eugenol, DL-mentol, α- pineno, alcanfor.
Todas fueron preparadas en acetona en la proporción 50 µL/1000 µL.
La cromatografía se llevó a cabo utilizando las siguientes condiciones cromatográficas:
Columna capilar de sílice fundida de 30 m de longitud y 0,32 mm de diámetro interno.
Nitrógeno para cromatografía como gas portador.
Programa de temperatura: temperatura de la columna a 55 OC durante 1 min, luego aumentándola a
una velocidad de 3 OC por minuto hasta 150 OC y aumentar nuevamente a razón de 2 OC por minuto
hasta 200 OC y luego mantener durante 5 min antes de inyectar.
Inyectar aproximadamente 1 μL de la disolución de referencia y la muestra problema.
Detector de ionización por llama, 280 OC.
Los tiempos de retención de los compuestos que eluyeron en el aceite esencial fueron comparados con los
de los patrones de referencia.
2.4.3. Determinación cuantitativa de Cineol en los aceites y extractos de las tres especies.
2.4.3.1. Desarrollo del método.
La determinación de cineol presente en el aceite de Psidium guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y
Melaleuca leucadendrom L. se realizó por la técnica de cromatografía de gases (CG-FID).
Preparación de las Muestras:
Psidium guajava L:
Solución madre: Se pesó 10 mg de aceite, se disolvió en 100µL de acetona (A).
Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de (γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL.
Disolución problema de aceite de P. guajava: Se toma 5 µL de la solución madre, se añade 5 µL de la
solución de estándar interno y se completó volumen hasta 100 µL de acetona. Se procedió a inyectar en
el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.
Eugenia axillaris (Sw.) Willd:
Solución madre: Se pesó 9,4mg de aceite, se disolvió en 100µL de acetona (A).
Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de (γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL.
Disolución problema de aceite de Eugenia: Se toma 10 µL de la solución madre de Eugenia, se añade 5
µL de la solución de estándar interno y se completó volumen hasta 100 µL de acetona. Se procedió a
inyectar en el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.
Capítulo 3: Resultados y discusión
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“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 32
Melaleuca leucadendrom L:
Solución madre: Se pesó 96mg de aceite esencial, se disolvió en 1000µL de acetona (A).
Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL
Disolución problema de aceite de Melaleuca: Se toma 10 µL de la solución madre de Melaleuca, se añade
20 µL de la solución de estándar interno y se completó volumen hasta 1000 µL de acetona. Se procedió
a inyectar en el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.
Preparación de los extractos:
Se toma 100 µL de la solución madre de cada extracto, se añade 20 µL de la solución de estándar interno
y se completó a volumen hasta 1000 µL de metanol. Se filtraron las tres muestras y se procedió a inyectar
en el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.
Disolución de referencia (cineol):
Solución madre: Se pesó 100mg de cineol, se disolvió en 5mL de acetona (A).
Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL.
Disolución de referencia (cineol): Se toma 100 µL de la solución madre de cineol, se añade 10 µL de la
solución de estándar interno y se completó volumen hasta 1000 µL de acetona. Se procedió a inyectar en
el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.
2.4.3.2. Condiciones cromatográficas:
Fase Estacionaria: Columna capilar de Silice fundida de 30 m de longitud y 0,53 mm de diámetro
interno (250 °C durante 55 min) Polimetilsiloxano 5% DB5
Fase móvil: Nitrógeno e hidrógeno para cromatografía R, como gas portador y auxiliar,
respectivamente, a un caudal de 1,3 mL/min,
Detector: Ionización por llama (T=280 °C.)
Inyector: Modo Splitless y la T=250 °C
Programa de temperatura: temperatura de la columna a 60 OC durante 1 min, luego aumentándola a
una velocidad de 2 OC por minuto hasta 120 OC por 40 min y aumentar nuevamente a razón de 10 OC
por minuto hasta 220 OC.
Se calculó la concentración (%) de cineol utilizando la ecuación de la recta teniendo en cuenta las
diluciones realizadas en cada muestra.
Capítulo 3: Resultados y discusión
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2.4.3.3. Validación del método.
Se evaluaron algunos parámetros de desempeño para este método, según la literatura consultada (ICH.,
2005 y Validación de métodos analíticos, (CEDMED., 2007). El procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de cálculo estadístico del Microsoft Office Excel, 2003.
Linealidad
Procedimiento: Se construyeron dos curvas de calibración de cada uno de los patrones en el intervalo de
concentraciones siguiente:
Preparación del estándar interno (γ-Terpineno)
Se preparó una solución A de 100 µl de (γ-terpineno) en 5 mL de acetona, constituyendo la solución
madre, Preparación del Patrón (cineol)
Se pesó 94,9 mg del 1.8 cineol, se enrasó a 5 m l acetona constituyendo la solución madre de las cuales
se tomaron las alícuotas siguientes: Las concentraciones del patrón 1,8 cineol fueron: 25 ug/mL, 50 ug/mL,
75 ug/mL, 100 ug/mL, 125 ug/mL, 150 ug/mL, 175 ug/mL y se procedió a inyectar en el cromatógrafo de
gases.
Criterios adoptados: r: Coeficiente de correlación múltiple (Criterio ≥ 0.9900); C.V.F: Coeficiente de
variación de los factores de respuestas (Criterio < 5%); Sbrel %: Desviación stándard relativa de la
pendiente (Criterio < 2%); Error típico (Et) Desviación Standard de Y (Sy) Criterio Et < Sy; a tSa y b tSb
Límites de confianza del intercepto y de la pendiente respectivamente (Criterio: Para a Contener el cero y
para b no contenerlo). También se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y se determinó el coeficiente
de calidad (CC) (Criterio CC < 2,5%)
Precisión
Procedimiento: Este parámetro incluyó la repetibilidad y la precisión intermedia para las muestras de los
tres aceites esenciales y los tres extractos estudiados, siguiendo la preparación de muestra descrita en el
(epígrafe 2.4.3.1.).
Para la repetibilidad se procesaron seis muestras (concentración 100%) a las cuales se les aplicó la
técnica a validar en condiciones homogéneas, un mismo analista y en un mismo día; mientras que la
precisión intermedia consistió en un procedimiento similar, con la misma concentración, realizado en
diferentes días. En ambos casos se determinó el coeficiente de variación de los resultados.
Capítulo 3: Resultados y discusión
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Criterios adoptados: El coeficiente de variación (CV) para la repetibilidad CV ≤ 1,5% y para la precisión
intermedia CV ≤ 3%. Para evaluar la precisión intermedia se usó, además, el Test de Cochran, el
Coeficiente de Variación de Horwitz y un análisis de varianza.
Exactitud
Procedimiento: Se utilizó el método de adición del patrón. Las muestras (concentración 10%) se analizaron
por triplicado, aplicándoles el procedimiento de muestra. Para ello se adicionaron a una cantidad conocida
de la muestra (10 %) cantidades crecientes del patrón de cineol (Concentración: 20mg/mL) 5 μL, 10 μL,
15 μL. En cada caso se completó a 100 μL con acetona. Se realizaron tres réplicas de cada una de las
concentraciones añadidas. Las concentraciones añadidas y recuperadas se representaron en un gráfico y
se evaluó el recobrado como el valor obtenido para la pendiente del mismo. Además, se calcularon los
porcentajes de recuperación para cada una de las muestras analizadas. Este parámetro se desarrolló en la
técnica de cromatografía gaseosa para los dos patrones analizados en este trabajo (cineol).
Criterio adoptado: Recobrado en el intervalo 97–103% (Fernández A., 1996).
Especificidad
Procedimiento: Se compararon los tiempos de retención de las sustancias presentes en la muestra y en el
patrón. Se midió, el ancho de la semialtura y se calcularon los factores de simetría de los picos en los
cromatogramas correspondientes a once inyecciones de patrón y once de muestras; se determinó la
media y la varianza del patrón y de la muestra, se halló la T de Student y se calculó la F de Fisher, se
compararon los valores de T y de F con los tabulados, con el objetivo de descartar posibles solapamientos
de picos. Para ello se calcularon los límites de confianza para los factores de simetría por la siguiente
ecuación.
Cálculo de los Límites de Confianza para los factores de simetría:
n
Stx
Para comparar los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se calcularon los intervalos
de confianza de dichos factores, de forma tal que unos intervalos incluyan a los otros.
Límite de detección y Límite de cuantificación
Procedimiento: Como una medida de la sensibilidad se tomó el valor de la pendiente de la curva así como
los límites de detección (LD) y límite de cuantificación (LC). Los cálculos se realizaron por el criterio de 3S
Capítulo 3: Resultados y discusión
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y 10S, es decir el límite de detección (LD) como la concentración de analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo las condiciones experimentales
óptimas. Por su parte el límite de cuantificación (LC) la concentración de analito que produce una señal
igual a diez veces la desviación estándar del blanco bajo las condiciones experimentales óptimas. Una
vez calculados los LD y LC se comprobaron los mismos, aplicando las dos técnicas evaluadas.
2.4.4. Determinación del contenido de cineol presente en cada aceite estudiado.
Se aplicó la técnica de Cromatografía Gaseosa, descrita y validada según la metodología en el epígrafe
2.4.3 a los tres aceites y extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas y se determinó el contenido
de cineol en cada muestra, aplicando la fórmula descrita en el propio epígrafe.
2.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos
obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.
Este ensayo tuvo como objetivos realizar un tamizaje primario frente a cepas de referencia mediante
difusión en agar con discos cargados y determinar la Concentración Inhibitoria Mínima mediante
microdilución en caldo.
Sustancias de ensayo: Se empleó el aceite esencial y los extractos de las hojas de tres especies de
Mirtáceas: Psidium guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L. y como
disolvente se utilizó el dimetilsulfóxido (DMSO) de calidad farmacéutica. Además fueron probados cuatro
metabolitos encontrados en plantas medicinales de la familia mirtáceas (1,8-cineol, Eugenol, γ-terpineno y
α-pineno), todos disueltos en el mismo disolvente que las muestras.
Microorganismos de ensayo: El estudio se realizó con cuatro cepas de bacterias, dos Gram-positivo
(Bacillus subtilis ATCC 6633 y Staphylococus aureus ATCC 25932) y dos Gram-negativo (Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25922) pertenecientes a la colección de cultivos
microbianos del Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central de Las Villas. Las cepas se
encuentran en medio de conservación semisólido para garantizar su disponibilidad en el laboratorio
Medios de cultivo: Para el tamizaje primario se empleó el método difusión en agar según la norma M02-
A10 (CLSI; 2009). Se utilizó como medio de cultivo Agar de Mueller – Hinton (BioCen, Cuba), el cual se
dispensó en placas petri (Anumbra) garantizando una altura de 4 mm x placa y discos de 6 mm de
diámetro de papel de filtro Watman 3.
Capítulo 3: Resultados y discusión
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Controles positivos: Se emplearon discos de antibacterianos de referencia como: Ampicilina (10 ug),
Eritromicina (15 ug), Amikacina (30 ug) y Ácido nalidixico (30ug).
Control negativo: Se utilizó el disolvente DMSO.
Procedimientos y técnicas: La secuencia de las operaciones fue la siguiente:
Preparación de los medios: El agar Mueller-Hinton fue preparado de acuerdo con las instrucciones del
productor. Inmediatamente después, se esterilizaron en autoclave a 120 ºC, por 15 min. Los medios fueron
vertidos en placas Petri de 100 mm de diámetro, previamente esterilizadas, añadiéndose de 25 a 30 mL de
medio en cada una, para lograr una altura uniforme de alrededor de 4 mm.
Preparación del inóculo: El inóculo se preparó mediante una suspensión directa de colonias que se
estandarizó con el patrón 0,5 de Mc Farland. Luego de inocular las placas, se colocaron los discos
cargados con 5 µL de las muestras a su máxima concentración y se incubaron a 37°C x 18h. Transcurrido
el tiempo de incubación se midió con una regla el halo de inhibición incluyendo el diámetro del disco.
Preparación de las concentraciones de las sustancias de ensayo: Las diluciones del aceite esencial y
los extractos en DMSO se prepararon a partir de una concentración aceite esencial del 100 %. Se
prepararon concentraciones de muestras de ensayo de 25, 50 % y 100 % (aceite puro), posteriormente se
cargaron los discos con las diferentes concentraciones del aceite (Figueroa y col., 2007).
Carga de los discos: Se utilizaron discos de papel Whatman No. 3 con un diámetro de 6 mm los que se
esterilizaron en autoclave a 120 ºC por 30 min. Para el ensayo se cargó cada disco con 10 µL de cada una
de las concentraciones preparadas de las sustancias de ensayo, teniendo en cuenta que la misma es un
aceite esencial de composición variada, por lo que no todos sus componentes tienen que tener actividad
biológica, a diferencia de los productos sintéticos que cuentan con un alto porcentaje de pureza (Lizcano y
Vergara., 2008; Vukovic y col., 2007). Se colocaron en placa Petri (anumbra) y se secaron a 35 ºC por 30
min. También se prepararon discos cargados con 10µL de DMSO como blanco.
Inoculación de las placas: De los tubos que contenían la suspensión de los microorganismos
seleccionados en el medio de cultivo líquido, se embebió un hisopo de algodón previamente esterilizado,
se eliminó el exceso y estrió sobre las placas con los medios de agar, en tres direcciones con ángulos de
60º entre cada una, quedando la placa totalmente cubierta con el inóculo. Se invirtieron y colocaron en una
incubadora a 35 ºC por 15 min. Transcurrido este tiempo se colocaron 5 discos en cada placa. Un disco
con el DMSO como control negativo, otro con el antibiótico seleccionado como control positivo y tres
concentraciones diferentes de la muestra. Después de 24 horas de incubación a 35 ºC para las bacterias
Capítulo 3: Resultados y discusión
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fueron examinadas las placas y se midió el diámetro de la zona de inhibición incluyendo el diámetro del
disco. Valores menores de 8mm fueron considerados no activos (Alzamora y col. 2001 y Figueroa y col.,
2007).
Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.
2.6. Actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas
Se evaluó la actividad antioxidante de los aceites esenciales y los extractos obtenidos de las tres especies
de Mirtáceas estudiadas, empleando diferentes métodos: actividad secuestradora del radical libre (DPPH),
fuerza reductora, método FRAP y el método capacidad Antioxidante total (TAOC). Fueron empleados
como controles de referencia los antioxidantes Vitamina E y Vitamina C, Eugenol y Cineol.
2.6.1. Actividad secuestradora del radical libre DPPH.
La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada en base a la actividad secuestradora del radical
libre estable 1,1-difenil-2-picril-hidracilo (DPPH). A 3 mL de una solución de DPPH de concentración 0.004
% (p/v) fue adicionado 1 mL de cada muestra a diferentes concentraciones en metanol. Las muestras
fueron colocadas durante 30 minutos en la oscuridad y fue medida la absorbancia a 517 nm frente a un
blanco (Shimada y col., 1992). El porcentaje de inhibición del radical libre DPPT fue calculado por:
Donde: ADPPH es la absorbancia del blanco (contiene todos los reactivos excepto la muestra)
AS es la absorbancia de la muestra.
El valor de IC50 (concentración de muestra que se requiere para reducir el 50 % los radicales libres) fue
calculado empleando de la ecuación de regresión, preparada a partir de concentraciones de extractos y el
porcentaje de inhibición de la formación de radicales libres. El mismo procedimiento fue utilizado para los
antioxidantes empleados como controles de referencia. Las curvas de calibración se realizaron en el rango
de concentraciones para el Eugenol (10-50 µg/mL ), BHT (50-200 µg/mL), Vitamina C (5-50 µg/mL) y
para el cineol (200-800 µg/mL. Los ensayos fueron realizados por triplicado.
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2.6.2. Fuerza reductora
La fuerza reductora de las muestras fue analizada por el método descrito por Senevirathne y col., (2006).
Una alícuota de 1 mL de cada extracto y de los antioxidantes sintéticos (concentraciones de 1,25-5,0
mg/mL en metanol) fueron mezclados con 1mL de buffer fosfato (0,2 M, pH 6,6) y 1mL de 1g/L de
ferricianuro de potasio; la mezcla fue incubada a 50 °C durante 30 min. Después de enfriar rápidamente,
fue mezclada con 1 mL de ácido tricloroacético al 10 % y centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. A 2,5
mL de la fracción sobrenadante fue añadida 2,5 mL de cloruro férrico (FeCl3) al 0,1 %. Después de 10
minutos fue registrada la absorbancia a 700 nm.
El cineol, el eugenol y la Vitamina E fueron usados como controles de referencia. Los ensayos fueron
realizados por triplicado.
2.6.4. Capacidad antioxidante total (TAOC).
La capacidad antioxidante total (TAOC) en los extractos de las tres especies de Mirtáceas fue determinada
por el método del molibdato de amonio según el método de (Umamaheswari y Chatterjee 2008),
utilizando ácido ascórbico como sustancia de referencia.
Preparación de la curva de calibración de ácido ascórbico:
Solución madre de ácido ascórbico: Se pesó 5 mg del compuesto se disolvió en H2O destilada y se enrasó
a un volumen de 1 mL para obtener una solución madre con concentración 5 mg/mL (Disolución A). Se
pipetearon a partir de la disolución A las siguientes alícuotas: 20, 40, 60, 80, 100 µL y se completaron a
1mL con H2O destilada para completar la curva de calibración.
Procedimiento: Se tomó 300 µL de cada disolución de la curva, se adicionó 3mL de la mezcla de los
siguientes reactivos (1 mL de ácido sulfúrico 0,6M, 1 mL de fosfato de sodio 28 mM y 1 mL de molibdato
de amonio 4 mM). Las muestras se calentaron durante 90 min a 95oC, se enfriaron y se midió la
absorbancia a 695 nm, utilizando la solución preparada con el mismo procedimiento sin la muestra como
blanco.
Preparación de los extractos:
Solución madre de cada extracto: Se pipeteó 80 µL de cada disolución de los extractos de las hojas
(concentración 10 mg/mL) y se disolvió en 1 mL con metanol.
Procedimiento: Se tomó 300 µL de cada disolución de cada muestra y se siguió el mismo procedimiento
descrito para la curva de calibración del ácido ascórbico. La capacidad antioxidante total en cada extracto
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se determinó en mg equivalente de ácido ascórbico/ g de extracto, utilizando la ecuación obtenida de la
curva de calibración de ácido ascórbico.
2.6.5. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP)
Preparación del reactivo (FRAP): 10 volúmenes de buffer fosfato 300 mM volumen de
2,4,6/tripiridil/s/triazina (TPTZ) 10 mM y 1 volumen de cloruro férrico 20 mM.
Preparación de las muestras:
Extractos: Se toman 15 µL del extracto de P. guajava, 25 µL del extracto de E. axillaris, 25 µL del extracto
de M. leucadendrom y cada uno se diluye en 1 mL de agua destilada.
Procedimiento: Se toman 200 µl de cada muestra, se le adiciona 3.8 mL del reactivo FRAP. Transcurrido 5
minutos se realiza la lectura a 593nm.
2.7. Determinación del contenido total de compuestos fenólicos.
Teniendo que en múltiples estudios se refiere que la actividad antioxidante está relacionada con el
contenido de fenoles totales, en el presente trabajo se determinó espectrofotométricamente el contenido
de estos en los extractos, utilizando el método de Folin-Ciocalteau, de acuerdo con el procedimiento
descrito por (Nurmi y col., 1996). Para ello, a 100 μL de la muestra (7,58 μg/mL en metanol) se adicionó
20 μL de reactivo Folin–Ciocalteau, 2 mL de agua y 1 mL de solución de carbonato de sodio al 15 %.
Después de 30 minutos de reacción, se midió la absorbancia a 765 nm. Las medidas fueron realizadas,
por triplicado y frente a un blanco. La recta de calibrado para la estimación de las concentraciones de
compuestos fenólicos se realizó utilizando el pirogalol (compuesto fenólico) disuelto en metanol,
empleando un rango de concentraciones comprendidas entre 1,21 a 6,06 μg/mL. El contenido de fenoles
totales en los extractos se determinó en µg equivalentes a pirogalol/mg de extracto.
Capítulo 3: Resultados y discusión
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Capítulo 3: Resultados y discusión
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Capítulo 3: Resultados y discusión 3.1. Resultados del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie
estudiada.
Para cada aceite se determinó el tiempo de destilación, siendo este de 4h, 6h y 1h, para la Psidium
guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L, respectivamente. A partir de este
tiempo se mantuvo constante la cantidad de aceite esencial en el tubo graduado acoplado al colector del
destilador. Mediante el procedimiento descrito en el (epígrafe 2.3.) se obtuvo un contenido de humedad de
8.5% para las hojas secas de Psidium guajava L, un 10 % para la Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y un 9 %
para las hojas secas de Melaleuca leucadendrom L,. Este valor fue utilizado en la determinación del
contenido de aceite en la planta, para expresar el mismo en base a droga seca.
Realizando la extracción por el método de hidrodestilación, se obtuvo un contenido de aceite esencial en
las hojas de Psidium guajava L. de 0.38%, valor similar al obtenido en Brasil por (Da Silva y col. 2003),
en las hojas de la Eugenia axillaris (Sw.) Willd. se obtuvo 0,44%, valor que no aparece reportado en la
literatura, mientras que el contenido de aceite esencial en las hojas de Melaleuca leucadendrom L. fue de
1,72 %, este valor resultó ser mayor que el obtenido por (Farag y col., 2004), para la planta cultivada en
Egipto, donde el contenido de aceite fue de 1,2 %.
Teniendo en cuenta los bajos rendimientos de aceite presentes en las hojas, las dificultades para su
obtención y la necesidad de considerar otros componentes presentes en la planta que pudieran contribuir
a las acciones farmacológicas de esta, se decidió obtener y evaluar un extracto de cada una, para lo cual
fue seleccionado como solvente la acetona, por ser de elección para los aceites esenciales y otros
componentes de posible interés como compuestos oxigenados, fenoles etc. Los rendimientos de extracto
para cada especie de planta fueron 0,43, 1,57 y 1,43 %, en base a droga seco, para la Psidium guajava L,
Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L, respectivamente.
3.2. Resultados obtenidos en la determinación de componentes volátiles presentes en los aceites
esenciales y extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.
3.2.1. Composición de los aceites esenciales.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 42
La composición de los aceites esenciales es estudiada por un gran número de investigadores en todo el
mundo, empleando la técnica de GC-MS gracias a la volatilidad de estos compuestos (Bandoni., 2000).
Los cromatogramas obtenidos para cada aceite al aplicar la técnica GC-MS aparecen en las figuras 3.1.,
3.2. y 3.3.
RT: 0.00 - 68.03
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relativ
e Abun
dance
7.38
17.71
12.47
18.95
30.95 65.2257.8653.7923.20 31.98 48.17
NL:2.46E9
TIC MS aceite_esencial_1_13julio
Figura 3.1. Cromatograma obtenido para el aceite obtenido de Psidium guajava L. al aplicar la técnica
GC-MS.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 43
RT: 1.11 - 69.98
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
3.29
47.73
43.15
46.69
8.69
29.05
32.61
34.79
41.5735.44
25.67 48.7336.87
37.59
60.1613.90 49.38 62.90 67.34
16.98 59.7954.7212.22 17.81
NL:3.25E7
TIC MS Eugenia5-2
Figura 3.2. Cromatograma obtenido para el aceite obtenido de Eugenia axillaris (Sw.) Willd al aplicar la
técnica GC-MS.
Figura 3.3. Cromatograma obtenido para el aceite obtenido de Melaleuca leucadendrom L. al aplicar la
técnica GC-MS.
El análisis exhaustivo del espectro de masa de cada pico empleando la librería NIST, permitió identificar
los compuestos mayoritarios de cada planta, siendo 3 para el Psidium guajava, 11 compuestos para la
Eugenia axillaris y 4 para la Melaleuca leucadendrom, los cuales aparecen descritos en la Tabla 3.1 Las
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 44
pequeñas variaciones en los tiempos de retención obtenidos para los compuestos coincidentes son
debidas a la variación en las condiciones cromatográficas utilizadas, especialmente la variación en los
gradientes de temperatura para cada aceite.
Tabla 3.1. Compuestos mayoritarios identificados en los aceites esenciales de cada planta al aplicar la técnica GC-MS.
Nombre de la planta
No. Pico
Tiempo de retención
% Área RI Compuesto identificado
Psidium guajava L.
1 7,38 68,36 1024 1,8-cineol
2 12,47 9,63 1138 DL-mentol
3 17,71 12,3 1350 α-Cubebeno
Eugenia axillaris (Sw.) Willd.
1 3,79 8,27 917 α -Tujeno
2 5.35 43,5 993,8 α-Pineno
3 8.69 6,45 1042 1,8-cineol
4 25,67 1,46 1352 Eugenol
5 29,05 5,68 1378 Copaeno
6 32,61 5,46 927 Cariofileno
7 34,79 4,78 967 α -Cariofileno
8 41,19 9,19 1496 α -Selineno
9 43,15 7,56 1584 Viridiflorol
10 44,35 9,78 1647 Ƭ.-Cadinol
11 47,73 3,56 1689 Humeleno
Melaleuca leucadendrom L.
1 7,60 53,4 1031 1,8-cineol
2 12,68 15,44 1142 DL-mentol
3 20,60 6,56 944 Germacreno
4 28,28 11,86 919 Cariofileno
En los resultados obtenidos es significativo en las tres especies la presencia del Cineol, siendo el
componente mayoritario en las especies P. guajava y M. leucadendrom. Los resultados obtenidos en la
Eugenia axillaris muestran una composición compleja con una gran cantidad y variedad de compuestos.
De forma individual es importante señalar que al emplear la misma técnica analítica en el estudio de la
composición de los aceites esenciales, para el aceite en las hojas de P. guajava cultivdas en Brazil tuvo
en su componente mayoritario el 1,8 cineol, aunque en menor proporción que la obtenida por el aceite
estudiado en el presente trabajo (Da Silva y col. 2003), Por su parte el aceite obtenido de las hojas de E.
axillaris el α-Pineno constituye el componente mayoritario, seguido por el 1,8 cineol, resultados que
coinciden con los reportados por (Schmidt y col. 2006), únicos reportes del aceite de esta planta en la
literatura, mientras que para la M. leucadendrom los compuestos 1 y 2 coinciden con lo reportado en un
artículo publicado sobre la composición química del aceite de la planta cultivada en Egipto, cuyos autores
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 45
obtuvieron un 64,30 % de 1,8 cineol como el componente mayoritario y un 11,02 % de DL-mentol (Farag y
col., 2004), mientras que la única publicación que existe en Cuba sobre el aceite de esta planta cita una
composición más variada pero mantiene la coincidencia con el componente mayoritario, el 1,8-Cineol con
un 43% en área. Este comportamiento se puede justificar por la influencia, demostrada, que poseen en la
composición de las plantas factores externos como el clima, el tipo de suelo, la época de recolección, etc.
(Calcines, 1993).
Teniendo en cuenta que la determinación de los componentes de una muestra por GC-MS, empleando
como vía de caracterización las librerías de espectros, no ofrece una garantía de correcta caracterización
de dichos componentes, se procedió a obtener los perfiles cromatográficos de cada aceite por GC-FID y
ratificar con patrones analíticos disponibles la presencia de los componentes mayoritarios anteriormente
identificados, con el objetivo de buscar la relación de estos con acciones farmacológicas que serán
estudiadas para las plantas incluidas en el presente trabajo.
Estos estudios fueron extendidos a los extractos de cada planta y los resultados se muestran a
continuación.
3.2.2. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales y extractos por GC-FID. Identificación de
componentes con el uso de patrones.
3.2.2.1. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales.
El perfil cromatográfico de los aceites se realizó empleando la técnica de cromatografía gaseosa con
detección por Ionización por llama (GC-FID). Los perfiles obtenidos se muestran en las Figuras 3.4., 3.5. y
3.6., para los aceites obtenidos de las hojas de Psidium guajava L, Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y la
Melaleuca leucadendrom L, respectivamente. Como se observa en la Figura 3.6, a diferencia de la
mayoría de los aceites esenciales, la cantidad de componentes presentes en la Melaleuca es muy baja
sólo se distinguen claramente pocos picos que tienen correspondencia con los compuestos presentes en
el aceite. Por su parte el aceite de la Eugenia muestra una gran cantidad de componentes. En la Tabla 3.2
se muestran los tiempos de retención obtenidos para cada pico en ambos cromatogramas.
.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 46
Figura 3.4. Cromatograma GC del aceite esencial de las hojas de Psidium guajava L.
Figura 3.5. Cromatograma GC-FID del aceite esencial de las hojas de Eugenia axillaris (Sw.) Willd.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 47
Figura 3.6. Cromatograma GC del aceite esencial de las hojas de Melaleuca leucadendrom L.
Tabla 3.2. Tiempos de retención obtenidos en los cromatogramas de los tres aceites estudiados.
No. Pico
Psidium guajava L Eugenia axillaris (Sw.)
Willd. Melaleuca leucadendrom L
t. retención (min) t. retención (min) t. retención (min)
1 - 3.58 3.58
2 6.6 6.6 6.59
3 - 8.06 8.05
4 10,42 10.32 10.27
5 - 14.69 -
6 - 15.84 -
7 - 16.65 -
8 - 17.37 -
9 - 18.11 -
10 18.85 18.85 18.85
11 - 29.01 -
12 31.52 32.41 -
13 34.82 34.27 -
14 37.12 36.95 -
Los perfiles cromatográficos de los aceites de la M. leucadendrom y el P. guajava poseen cromatogramas
muy limpios con un componente mayoritario, cuya cuantía en el aceite es muy superior a los restantes
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 48
componentes, el 1,8 cineol. Por su parte el aceite de E. axillaris posee 14 componentes entre los cuales
hay dos que se destacan como los mayoritarios, dan muestra de tres aceites que difieren
significativamente en su composición en cuanto a la cantidad de compuestos presentes en cada aceite.
Sin embargo, es representativo que los compuestos presentes en la M. leucadendrom y en el P. guajava
se encuentran también presentes en la E. axillaris, algo aceptable si se tiene en cuenta que son plantas de
la misma familia.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudios GC-MS se seleccionaron los patrones: α-
pineno, 1,8 cineol, alcanfor, DL-mentol y Eugenol, los cuales al aplicar la técnica GC, bajo las mismas
condiciones cromatográficas que la muestra, aportaron los cromatogramas que se muestran en las figuras
3.7 A-E.
min4 6 8 10 12 14 16 18
pA
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
FID1 A, (YAMIRI\PATRONES\PINENE000220.D)
6.832
A: α-Pineno (tr=6,8)
min6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
pA
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
FID1 A, (YURIAM\CINEOLA000043.D)
10.387
B: 1,8 Cineol (tr=10,4)
min5 10 15 20 25 30
pA
70
80
90
100
110
120
FID1 A, (YAMIRI\ALCANFORA100694.D)
15.51
5
C: Alcanfor(tr=15,5)
min6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
pA
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
FID1 A, (YURIAM\DL-MENTOL000041.D)
18.825
D: DL-Mentol (tr=18,8)
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 49
min5 10 15 20 25 30
pA
0
50
100
150
200
250
300
350
400
FID1 A, (YAMIRI\EUGENOL2B000548.D)
29.037
E: Eugenol
Figura 3.7. Cromatograma de los patrones evaluados, obtenidos al aplicar la técnica GC.(A: α-Pineno;
B:1,8 cineol; C:Alcanfor; D:DL-Mentol y E: Eugenol.
Al evaluar la coincidencia de los tiempos de retención de cada patrón en el cromatograma obtenido para
cada aceite esencial se pudo reafirmar la presencia del α-Pineno, 1,8 cineol y el DL-mentol en los tres
aceites estudiados, mientras que el alcanfor y el eugenol solo está presente en el aceite obtenido de las
hojas de la Eugenia axillaris (Sw.) Willd.
3.2.2.2. Perfil cromatográfico de los extractos
Con el objetivo de comparar la composición, en cuanto a componentes volátiles, del extracto obtenido y el
aceite esencial de cada planta se obtuvo el perfil cromatográfico de cada extracto aplicando iguales
condiciones cromatográficas.
La Figura 3.8 muestra el cromatograma obtenido para el extracto de P. guajava. Al comparar este con el
cromatograma del aceite (Figura 3.4) se observa la aparición de cuatro picos adicionales en el
cromatograma del extracto y una coincidencia en los tiempos de retención para el α-Pineno y 1,8 cineol.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 50
min5 10 15 20 25 30 35
pA
80
100
120
140
160
180
200
220
FID1 A, (YURIAM\GUAYABA7R000080.D)
6.946
8.474
10.38
1 10.78
8
19.58
0
26.52
2
29.89
4
35.29
7
38.88
7
Figura 3.8. Cromatograma obtenido para el extracto de P. guajava, aplicando la técnica GC.
El cromatograma obtenido para el extracto de E. axillaris (Figura 3.9) muestra un incremento significativo
de picos con respecto al cromatograma del aceite esencial obtenido de las hojas de esta planta (Figura
3.5), observándose una coincidencia en los tiempos de retención de los compuestos α-Pineno, 1,8 cineol y
el eugenol.
min5 10 15 20 25 30 35
pA
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
FID1 A, (YAMIRI\EUGENIA10000325.D)
1.08
5 1.
124
1.16
3
6.86
7 7.
094
8.07
2
9.90
6 10.34
9
11.77
4
16.07
6 16
.760
17.45
1
18.94
7
29.03
8
31.50
2 32.49
3
34.34
1
37.03
5
39.59
6 40
.148
Figura 3.9. Cromatograma obtenido para el extracto de E. axillaris, aplicando la técnica GC.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 51
La Figura 3.10 muestra el cromatograma obtenido para el extracto de M. leucadendrom. Al comparar este
con el cromatograma del aceite (Figura 3.6) se observa una coincidencia en los tiempos de retención para
el 1,8 cineol, apareciendo cinco picos adicionales que no pudieron ser identificados por falta de patrón.
min5 10 15 20 25 30 35
pA
80
100
120
140
160
180
FID1 A, (YURIAM\YADIRA7000057.D)
6.932
10.76
3
19.52
5
29.85
0
35.24
5
38.81
5
Figura 3.10. Cromatograma obtenido para el extracto de M. leucadendrom, aplicando la técnica GC
De forma general en la comparación de los perfiles cromatográficos de aceites esenciales y extractos de
cada planta aportó la aparición de nuevos picos en el cromatograma de los extractos que poseen una
mayor variedad y cantidad de componentes, aunque se hace evidente la coincidencia de compuestos en
ambas extracciones. Este resultado debe ser tenido en cuenta al evaluar las actividades farmacológicas de
uno u otro producto.
La presencia del 1,8-Cineol como compuesto mayoritario en los aceites y extractos evaluados del P.
guajava y la M. leucadendrom, así como la presencia en la especie E. axillaris constituyó una buena razón
para decidir su cuantificación en estas muestras y buscar una posible relación de este metabolito con las
acciones farmacológicas que serán estudiadas en las plantas. A continuación se exponen los resultados
de esta determinación.
3.3. Determinación cuantitativa del contenido de cineol en los aceites esenciales y extractos
obtenidos de las tres especies estudiadas.
Varios miembros de la familia Mirtácea han sido estudiados por su potente acción antimicrobiana,
resaltándose su uso en enfermedades de la piel provocadas por varias bacterias resistentes entre los que
se cita el Staphylococcus aureus (MRSA, siglas en inglés). Las especies C. operculatus, Eugenia globulus,
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 52
Melaleuca alternifolia son algunos de los ejemplos que se pueden citar. Estas plantas poseen como
metabolitos principales el 1,8-cineol y el terpineol a los cuales se les pudiera atribuir la acción citada, ya
que para los mismos aparecen reportes que justifican esta razón (Loughlin, 2008,); (McMahon, 2008) y
(Gudrun, 2011). Teniendo en cuenta lo anterior resulta de gran importancia evaluar en los aceites
estudiados la presencia y el contenido de estos metabolitos, con vistas a su posible uso en el campo
farmacéutico.
Una vez obtenidos los cromatogramas de cada aceite (Figuras 3.4-3.6), extractos (Figuras 3.8-3.10),
tomando como referencia el cromatograma del patrón de cineol y el γ-terpineno como estándar interno
(tr=11.7. (Figura 3.11.) se procedió a la validación de dicha técnica, aplicando las normas del CECMED,
2007
min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
pA
200
400
600
800
1000
FID1 A, (YAMIRI\CINEOL10000448.D)
1.108
1.173
3.581
10.28
0
11.77
0
Figura 3.11. Cromatograma GC correspondiente al cineol (tiempo de retención (tr) = 10,28) y el γ-
terpineno (tiempo de retención (tr) = 11,77).
3.3.1. Validación de la técnica cromatográfica (GC) para la determinación de 1,8-Cineol.
Linealidad
La Figura 3.12 muestra la curva de calibración obtenida al evaluar el parámetro linealidad en la técnica
cromatografía gaseosa usada para la determinación de cineol en los aceites esenciales. Los criterios
estadísticos utilizados para evaluar el parámetro aparecen en la Tabla 3.3. Si se comparan los valores
obtenidos en cada parámetro con los criterios establecidos por las normas ICH (2005a y b), se puede
afirmar que en todos los casos se encuentran dentro del intervalo especificado. La ecuación de la recta
obtenida fue Área=0.509*Conc–0.0438 con un coeficiente de correlación de 0.99, un coeficiente de
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 53
variación de los factores respuesta 4.2 (inferior al 5%) y una desviación estándar de la pendiente de
0.025 (menor que el 2 %). La fiabilidad de la ecuación se evaluó, además, a través del error típico cuyo
valor es muy inferior a la desviación estándar de la variable Y. Finalmente se determinó el coeficiente de
calidad que resultó ser muy inferior a 2,5 (1,18 E-06) por lo que se puede plantear que el método es
lineal en el rango de concentración evaluado.
Figura 3.12. Curva de calibración para la determinación de cineol en aceites esenciales, empleando la
GC.
Tabla 3.3. Resultados de los criterios estadísticos utilizados para evaluar la linealidad en la técnica de GC.
Parámetro Valor obtenido Criterio Establecido
Ecuación de la recta Área=0.509X-0.04387
ri;
Coeficiente de correlación 0.998 ri ≥ 0,99
C.V.F: Coeficiente de variación de los factores de respuestas.
4.2% C.V.F ≤ 5%
Sbrel %: Desviación estándar relativa de la pendiente.
0.0256% Sbrel %≤ 2%
Error típico de la regresión 0≤0.0034≤0.6 0 ≤ Error típico ≤ Sy (Sy desviación Estándar de Y)
Intervalo de confianza del intercepto
+29.2 -29.14
Incluir el cero
CC: Coeficiente de calidad 1,18 E-06 CC<2,5%
Precisión
Este parámetro incluye los términos repetibilidad y precisión intermedia. Para el primer caso la técnica se
repitió sin alterar las condiciones, mientras que en el segundo la técnica se desarrolló en diferentes días.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 54
La Tabla 3.4 muestra los resultados estadísticos obtenidos al evaluar ambos parámetros. El coeficiente de
variación obtenido para la repetibilidad (1,48 %) resultó ser menor que el establecido para este ensayo
cuando es realizado a materias primas farmacéuticas (1,5 %) lo que indica que la técnica posee buena
repetibilidad. Por su parte en la precisión intermedia se obtuvo también un coeficiente de variación (2.02
%) inferior al establecido (3 %), además, en este parámetro se evaluaron otros parámetros estadísticos
que garantizan la veracidad de los resultados y cuyos estadígrafos aparecen también reflejados en la
misma tabla.
El análisis de varianza realizado muestra que no hay diferencias significativas entre los grupos al
obtenerse en la prueba Fischer una Fcal < CCrítica. Esto es ratificado por el Test de Cochrans (Ccal.=
0,59) en el cual se obtuvo una Ccal < CCrítica. Finalmente el Coeficiente de variación entre los grupos (CV
(%) = 2.09) resultó ser menor que el valor obtenido para el coeficiente de variación de Horwitz (3.83)
ratificando con esto la veracidad del resto de las pruebas.
Los resultados obtenidos en ambos parámetros permiten asegurar que la técnica de Cromatografía
Gaseosa es “precisa” para la determinación de cineol en los aceites esenciales y extractos.
Tabla 3.4. Resultados estadísticos obtenidos al evaluar el parámetro precisión en la técnica de GC.
REPETIBILIDAD
Réplica 1 (Am/AsI) Parámetros estadísticos
1,38
1,364 Media 1,358
1,368 SD 0,020
1,329 CV (%) 1,48
1,336
1.369
PRECISIÓN INTERMEDIA
Dia 1 (Am/AsI) Dia 2 (Am/AsI) Dia 3 (Am/AsI)
1,38 1,381 1,316
1,364 1,282 1,36 Media 1,345
1,368 1,312 1,345 SD = 0,027
1,329 1,317 1,365 CV (%) = 2,02
1,336 1,336 1,369 Horwitz = 3,83
1,369 1,329 1,352
Dentro de los Grupos S =0,025% ; CV(%) = 1,84
Entre los Grupos S =0,028% ; CV(%) =2,09
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 55
Cochrans (C calculada)= 0,23 Cochrans (C crítica) 0,59
Horwitz 3,83
Exactitud
Existen diferentes procedimientos para evaluar la exactitud de un método. Cuando se trabaja con matrices
complejas, como es el caso de los productos herbarios, cualquiera sea su forma de presentación, el
procedimiento de adición de estándar es de gran utilidad, siempre que se cuente con el apropiado
marcador químico o metabolito mayoritario de interés. En el presente estudio se cuenta con el cineol como
patrón. Según el método de adición de estándar la recuperación obtenida fue de 103,7 % en
correspondencia con la pendiente de la curva de recuperación con el siguiente modelo matemático: y =
1,013X+0,034 (Figura 3.13.).
Estos valores demuestran una elevada exactitud en las determinaciones de cineol, con el procedimiento
utilizado. Para confirmarla, se aplicó una prueba t de Student. Al ser texp< ttab no existen diferencias
significativas entre recuperación media y 100, por lo que el método es exacto.
Figura 3.13. Curva de recuperación para la técnica GC.
Especificidad
La inyección del blanco, demostró la no existencia de interferencias al tiempo de retención de las
sustancias presentes en la muestra (Figura 3.13.) Si se compara el pico cromatográfico del patrón de
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 56
cineol (Figura 3.11.) con el pico correspondiente en la muestra bajo las condiciones óptimas de análisis, no
se observaron a simple vista colas, frentes difusos ni hombros y se puede inferir que no debe existir
solapamientos de picos. Tampoco se observaron variaciones significativas en los tiempos de retención, los
cuales se mantienen dentro de un intervalo de ± 2%.
min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
pA
0
500
1000
1500
2000
2500
FID1 A, (YAMIRI\BLANCO3000488.D)
0.13
5 0.80
1 1.
101
1.15
5
2.07
9
2.98
4 3.57
9
Figura 3.14. Cromatograma GC correspondiente al blanco.
Estos resultados muestran la no existencia interferencias apreciables que puedan afectar la determinación
confiable del cineol en los aceites esenciales y extractos. Sin embargo, con vistas a ratificar los mismos se
analizaron los factores de simetría de picos del patrón y las muestras de aceites y extractos en estudio.
Los intervalos de confianza de los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se incluían
entre sí. Para el patrón estos intervalos van desde 1,073 hasta 1,46 y en el caso de la muestra los
intervalos oscilan desde 1,15 hasta 1,37 (Tabla 3.5.).
Tabla 3.5. Resultados estadísticos al calcular el intervalo de confianza del cineol (patrón y muestra)
Patrón Muestra
x
= 1,41 x
= 1.11
t = 1,83 t = 1,83
S = 0,13 S = 0,11
n = 10 n = 10
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 57
Límite de detección (LD) y de cuantificación (LC).
Los resultados del LD y LC para el cineol se recogen en la Tabla 3.6. Como límite de detección para el
cineol se obtuvo un valor de 0,25 µg/mL y como límite de cuantificación 0.60 µg/mL, valores que se
encuentran por debajo del valor más bajo de concentración evaluado en la técnica, la cual incluye un
intervalo amplio de concentración, teniendo en cuenta la variabilidad de este componente en los diferentes
aceites esenciales.
Tabla 3.6. Resultados obtenidos del LD y LC para el cineol en la técnica GC.
Resp. Blanco (Am/ASI)
Media Desv. Estándar
Pendiente Límite de detección (LD) (µg/mL)
Límite de cuantificación (LC) (µg/mL)
2,30 2,32
0,01
0,509
0,25
0,60
2,33
2,32
2,32
Teniendo en cuenta el cumplimiento de todos los parámetros de desempeño, la técnica analítica es fiable y
por tanto se concluye que la técnica analítica GC-FID puede ser utilizada en la determinación cuantitativa
de cineol en los aceites esenciales.
3.3.2. Aplicación de la técnica validada a la determinación de cineol presente en los aceites y
extractos obtenidos de las especies de mirtáceas estudiadas en el presente trabajo.
Una vez validada la técnica se aplicó en la determinación del contenido de cineol presente en las muestras
de aceite esencial y extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de plantas evaluadas, cultivadas
en la zona central de Cuba. La Tabla 3.7 muestra los valores promedios de este compuesto obtenido para
las especies. Como se observa las especies M. leucadendrom y P. guajava poseen mayor contenido de
cineol que la E. axillaris tanto en el aceite esencial como en los extractos, lo que debe lograr un
comportamiento farmacológico similar para estas plantas si se tienen en cuenta que para ambas este es el
metabolito mayoritario.
Tabla 3.7. Valores promedios del porcentaje de cineol presente en las especies de Mirtáceas.
Muestra Psidium guajava L.
Eugenia axillaris (Sw.) Willd.
Melaleuca leucadendrom L.
Aceite Esencial 0,37± 0.025 0,04 ± 0,01 0,44 ± 0,014
Extractos 0,56±0.025 0,28 ± 0,14 0,63 ± 0,045
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 58
3.4. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos
obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.
Los resultados del tamizaje primario realizado frente a bacterias Gram positivas aparecen reportado en la
Tabla 3.8 y en la Figura 3.15. Como se observa frente a bacterias Gram positivas, Bacillus subtilis ATCC
6633 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, los aceites esenciales de Guayaba y Cayeput tuvieron
actividad frente al primero, no así frente al segundo, mientras que el aceite esencial de la Eugenia no
mostró actividad frente a las bacterias Gram positivas. Por su parte los tres extractos resultaron activos
frente a estos dos microorganismos. La evaluación de los patrones aportó que el eugenol manifestó
actividad frente al Bacillus subtilis ATCC 6633 y frente al Staphylococcus aureus mostraron actividad,
además, el Cineol y el α- pineno (Figura 3.15.). El diámetro de la zona de inhibición de los antibacterianos
de referencia fue superior al mínimo reportado por el CLSI en su norma M100-S20.
Tabla 3.8. Resultados del tamizaje primario realizado a aceites esenciales y extractos frente a bacterias Gram positivas.
Producto Bacillus subtilis ATCC 6633 Halo (mm)
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Halo (mm)
AE-Guayaba 9 N.S
AE-Eugenia N.S N.S
AE-Cayeput 10 N.S
Ext-Guayaba 10 11
Ext-Eugenia 10 10
Ext-Cayeput 10 11
Eugenol 17 16
Cineol N.S 8
α-Pineno N.S 8
Terpineol N.S N.S
DMSO N.S N.S
Eritromicina 20 29
Ampicilina No evaluado 31
Leyenda: N.S. no sensible, 0mm. Ext: Extracto. AE: Aceite esencial
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 59
Figura 3.15. Resultados del tamizaje primario realizado a aceites esenciales y extractos frente a bacterias Gram positivas. Leyenda P1: 1, Eritromicina; 2, AE Guayaba; 3, AE Eugenia; 4, AE Cayeput. P2: 1, Extractos:1 Eugenia; 2, Guayaba; 3, Cayeput; 4, Eugenol P3: 1, DMSO; 2, Cineol; 3, α-Pinene; 4 Terpineol; Eugenia 100ug Los resultados del tamizaje primario realizado frente a bacterias a bacterias Gram negativas aparecen
reportado en la Tabla 3.9 y en la Figura 3.16. Frente a la Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
mostraron actividad los extractos de Eugenia, Guayaba y Cayeput, así como el patrón Eugenol, mientras
que frente a Escherichia coli ATCC 25922 solamente tuvieron actividad los patrones Eugenol y Terpinol.
Según la norma M100-S20 el ácido nalidixico es sensible frente a enterobacterias cuando el diámetro de la
zona de inhibición es mayor a 19 mm y la Amikacina es sensible frente a Pseudomonas aeruginosa
cuando el diámetro de la zona de inhibición es mayor que 17 mm. Teniendo en cuenta los resultados de
este ensayo ambos antibacterianos mostraron diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano
superiores al mínimo establecido por la norma demostrando la sensibilidad de las cepas bacterianas
ensayadas.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 60
Tabla 3.9. Actividad de las muestras evaluadas frente a bacterias Gram negativas. .
Producto Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Halo (mm)
Escherichia coli ATCC 25922 Halo (mm)
AE-Guayaba N.S N.S
AE-Eugenia N.S N.S
AE-Cayeput N.S N.S
Ext-Guayaba 11 N.S
Ext-Eugenia 9 N.S
Ext-Cayeput 9 N.S
Eugenol 7 14
Cineol N.S 10
α-Pinene N.S 0
Terpineol N.S 17
DMSO N.S N.S
Amikacina 23 No evaluado
Ácido Nalidixico No evaluado 30
Leyenda: N.S. no sensible, 0mm. Ext: Extracto. AE: Aceite esencial
Figura 3.15. Resultados del tamizaje primario realizado a aceites esenciales y extractos frente a bacterias Gram negativas. Leyenda: P1: 1, Amikacina o Ácido nalidixico; 2, AE Guayaba; 3, AE Eugenia; 4 AE Cayeput. P2: Extractos: 1, Eugenia; 2, Guayaba; 3, Cayeput; 4, Eugenol P3: 1, DMSO; 2, Cineol; 3, a-Pinene; 4 Terpinol; Eugenia 100ug.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 61
Los resultados anteriormente expuestos relacionados con la actividad antimicrobiana permiten asegurar
que los extractos de las tres Mirtáceas poseen buenas potencialidades como antimicrobianos, no así los
aceites esenciales, para los cuales está bien disminuida esta actividad.
3.5. Resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres
especies de Mirtáceas estudiadas.
Como etapa inicial de la evaluación de la actividad antioxidante fue determinada en cada muestra el
contenido fenólico, lo que se explica porque múltiples reportes dan cuenta de la relación directa entre la
actividad antioxidante y el contenido fenólico total presente en las muestras obtenidas de plantas
medicinales (Singh y col., 2008). Esta actividad fue evaluada en los extractos obtenidos de las tres
especies de Mirtáceas estudiadas frente a los antioxidantes BHT, Vitamina E y C, eugenol y cineol por
diferentes métodos: actividad secuestradora del radical libre DPPH, fuerza reductora, método del
tiocianato férrico (FTC), poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) y actividad antioxidante total.
3.5.1. Cuantificación de los compuestos fenólicos – método de Folin-Ciocalteu.
El ensayo espectrofotométrico desarrollado por Folin-Ciocalteau se utiliza para determinar los compuestos
fenólicos totales. Se fundamenta en una reacción de oxidación/reducción que es el mecanismo básico;
gracias al carácter reductor del reactivo Folin-Ciocalteau (3H2O-P2O513WO3-5MoO3-10H2O:
Heteropolianión molibdofosfowolfrámico) en el cual el Mo (VI) es reducido a Mo (V) con un e- donado por
un antioxidante. Mo (VI) (amarillo) + e- (de AH) → Mo (V) (azul) (Boveris, 1976). El contenido total de
compuestos fenólicos fue calculado empleando la curva de calibración del Ácido Gálico (Figura 3.17.)
como mg de ácido gálico/g de extracto (mg AGE/g de extracto).
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 62
Figura 3.17. Curva de Calibración del Ácido Gálico. Como resultado se obtuvo que el contenido total de compuestos fenólicos para cada extracto fue: para el
extracto del Psidium guajava de 259,2 ± 0,56 mg de ácido gálico equivalentes/g de extracto, superior al
obtenido para los extractos de la Eugenia axillaris y la Melaleuca leucadendrom, en los cuales se obtuvo
108,6 ± 1,86 y 90,3 ± 0,94 mg de ácido gálico equivalentes/g de extracto, respectivamente. Estos
resultados sugieren que el extracto de Psidium guajava debe mostrar mayor actividad antioxidante. Estos
valores obtenidos son específicos para cada extracto y no se encuentran reportados en la literatura para
estas plantas.
Al comparar el valor del contenido fenólico obtenido con los valores reportados para otros extractos de
plantas medicinales, se observa que estos valores varían en gran medida para plantas de diferentes
especies, familias etc. Lo anterior se puede observar al comparar los resultados obtenidos con los valores
descritos para varias plantas en la Tabla 3.10. Como se observa en los extractos evaluados los resultados
obtenidos para las hojas de las tres especies estudiadas superan considerablemente los valores
reportados para las especies de Lavanda (Messaoud., 2011), mientras que los extractos de la Melaleuca y
la Eugenia poseen valores similares al Satureja montana (Serrano., 2011) e inferior con respecto a los
valores obtenidos para la Rosa micrantha. El extracto del Psidium guajava superó en contenido fenólico a
las plantas citadas y su valor es inferior al obtenido para la Rosa micrantha, considerándose por tanto el
más enriquecido con estos metabolitos.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 63
Tabla 3.10. El contenido fenólico total del extracto de algunas plantas medicinales publicado en la literatura.
Nombre de planta Contenido fenólico total reportado (mg/g)
Referencias bibliográficas
Satureja montana (Ext. Etanólico) 111,18 ± 1,59 Serrano, 2011
Rosa Micrantha (Ext. Metanólico-Pétalos)
424,20± 31,77 Guimaraes, 2010
L.coronopifolia 31,20±4,67 Messaoud, 2011
N. bettonicifolia 25,20±8,3 Messaoud, 2011
L. stoechas 25,30±6,56 Messaoud, 2011
3.5.2. Actividad secuestradora del radical libre DPPH.
En este ensayo se procesaron las curvas de calibración correspondientes a cada uno de los patrones
antioxidantes utilizados (BHT, Eugenol, Cineol y Vitamina C) y los extractos, de las cuales se obtuvo las
ecuaciones de las rectas y el coeficiente de correlación para cada caso. La Figura 3.18 muestra las curvas
obtenidas para los patrones antioxidantes (A: BHT; B: Eugenol; C: Cineol y D: Vitamina C), mientras que la
Figura 3.19 muestra las curvas obtenidas para los extractos evaluados (D: Extracto de Guayaba; E:
Extracto de Eugenia; F: Extracto de Cayeput). Como se obseva la actividad secuestradora se incrementa
con el aumento de la concentración de la muestra debido a la reacción de donación de electrones entre las
moléculas de antioxidante y los radicales libre (Huang., 2005), estas curvas permitieron determinar el valor
de IC50 para cada muestra, utilizando el método de Litchfield and Wilcoxon, valores que aparecen
descritos en la Tabla 3.11. Los bajos valores de IC50 indican alta actividad secuestradora de radicales
libres.
A
B
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 64
C
D
Figura 3.18. Curvas de calibración obtenidas para los patrones evaluados en el ensayo de la actividad secuestradora del radical libre DPPH (A: BHT; B: Eugenol; C: Cineol y D: Vitamina C).
D
E
F
Figura 3.19. Curvas de calibración obtenidas para los extractos evaluados en el ensayo de la actividad secuestradora del radical libre DPPH (D: Guayaba; E: Eugenia; F: Cayeput).
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 65
Tabla 3.11. Resultados de la actividad secuestradora del radical DPPH para los extractos y patrones evaluados.
Muestras Concentración
(μg/mL) Inhibición (%)
IC50 (μg/mL)
Vitamina C
5 10,26
5,4 7,5 53,28
9 79,48
12 94,64
Cineol
200 40,79
230,1 250 55,04
300 74,01
350 48,54
BHT
50 13,74
128,4
80 23,32
127 35,96
162 46,07
200 59,07
232 13,74
Eugenol
10 25,75
29,0
20 35,72
30 45,79
40 54,92
50 61,56
Extracto Psidium guajava
0,2 80,97
0,48 0,4 82,90
0,6 85,10
0,8 87,74
Extracto de Eugenia axillaris
3,85 63,87
10,8 7,7 71,10
11,6 76,32
15,4 87,81
Extracto Melaleuca
leucadendrom
14 67,23
35,7 28 76,77
42 83,35
56 92,97
Si se tiene en cuenta que los bajos valores de IC50 obtenidos para los patrones de antioxidantes son
representativos de una marcada actividad antioxidante se puede inferir que la actividad antioxidante de los
tres extractos evaluados es muy buena para las concentraciones estudiadas, por este mecanismo de
acción antioxidante. El valor obtenido de IC50 para el extracto de la Psidium guajava permite afirmar que
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 66
este extracto posee una alta actividad antioxidante, siendo superior a la Vitamina C, compuesto
antioxidante de referencia.
El efecto secuestrador del radical DPPH de las muestras estudiadas se resume en el siguiente orden:
Extracto Psidium guajava > Vitamina C >Extracto de Eugenia axillaris > Eugenol > Extracto
Melaleuca leucadendrom >BHT > Cineol.
Los altos valores de la actividad antioxidante en los extractos permiten proponer la valoración de estas
plantas para su uso en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria.
3.5.3. Fuerza reducida.
La determinación de la fuerza reducida de los compuestos presentes en la muestra se lleva cabo por la
reducción de Fe3+a la forma de Fe2+, el color amarillo de la solución examinada cambia en varios tonos de
verde tinto o azul prusiano dependiendo en fuerza reducida de cada muestra. A mayor valor de la
absorbancia, mayor será la fuerza reducida. En la Tabla 3.12 se muestran los valores de la absorbancia de
los antioxidantes patrones y los extractos evaluados en el sistema de fuerza reducida.
Tabla 3.12. Valores de la absorbancia de los patrones antioxidantes y los extractos evaluados en el sistema de fuerza reducida.
Concentración (mg/mL)
Valores de absorbancia
Vitamina E Cineol Eugenol Extracto Psidium guajava
Extracto de
Eugenia axillaris
Extracto Melaleuca leucadendrom
1,25 0,296 0,182 0,586 0,97 1,53 0,23
2,5 0,907 0,64 1,167 2,29 2,22 0,79
3,75 1,437 0,923 1,487 2,63 2,68 1,07
5 2,464 1,745 1,965 3,23 3,19 1,92
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 67
Figura 3.20. Efecto antioxidante de los patrones antioxidantes y los extractos evaluados en el sistema de fuerza reducida. En la Figura 3.20. se describe el efecto antioxidante de los patrones antioxidantes y los extractos
evaluados en el sistema de fuerza reducida. Es de destacar que los mejores resultados se obtienen para
los extractos de guayaba y de Eugenia, superiores incluso a los patrones antioxidantes, quedando muy por
debajo el extracto de cayeput que posee actividad antioxidante similar al cineol. El efecto antioxidante en
el sistema fuerza reducida de las muestras estudiadas se resume en el siguiente orden:
Extracto Psidium guajava ≈ Extracto de Eugenia axillaris > Eugenol > Vitamina E > Extracto cayeput >cineol.
3.5.4. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP)
La determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) fue calculado empleando la curva de
calibración de Sulfato de Hierro II (Figura 3.21) y está expresado en mmol de FeSO4 equivalentes por
gramo de extracto. Los resultados obtenidos para este ensayo se reflejan en la Figura 3.22 donde se
observa con claridad que los mejores resultados fueron obtenidos para el extracto de Guayaba, seguido
por el extracto de Eugenia y el de Cayeput. Lo anterior muestra que el extracto con mayor poder reductor
tiene mayor potencial que el resto para reducir el ion férrico a ion ferroso.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 68
Figura 3.21. Curva de calibración del Sulfato de Hierro II
Figura 3.22. Comportamiento del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) de los extractos
3.5.5. Capacidad antioxidante total.
La capacidad antioxidante total fue calculada empleando la curva de calibración del Ácido ascórbico
(Figura 3.23.).
Figura 3.23. Curva de calibración del Ácido Ascórbico o Vitamina C
A partir de la ecuación de la recta se determinó la capacidad antioxidante total obtenida para cada extracto
(Figura 3.23), como se observa el extracto de Psidium guajava mostró la mayor actividad antioxidante con
un valor de 20,2 mg de ácido ascórbico equivalentes /g de extracto, seguido por el extracto de Cayeput y
el de Eugenia, en los cuales se obtuvo 5,21 y 1,63 mg de ácido ascórbico equivalentes/g de extracto,
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 69
respectivamente. Estos resultados se corresponden totalmente con los resultados obtenidos en los
ensayos de DPPH y FRAP. Estos valores son específicos para cada extracto y no se encuentran
reportados en la literatura para esta planta.
Figura 3.24. Actividad antioxidante total de los extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de
Mirtáceas evaluada.
3.5.6. Relación entre el contenido fenólico total con la actividad antioxidante evaluada en el presente trabajo, a través de diferentes ensayos.
Múltiples reportes dan cuenta de la relación directa entre la actividad antioxidante y el contenido fenólico
total en los extractos de plantas medicinales.(Singh et al., 2008a).
La (figura 3.25A) muestra la curva de regresión que permite correlacionar el contenido fenólico con la
actividad antioxidante, mientras que la (Figura 3.25B) muestra la curva de regresión que permite
correlacionar el contenido fenólico con el poder reductor\antioxidante férrico (FRAP). En ambos casos se
observa una excelente relación entre ambos parámetros para los tres extractos evaluados, el extracto de
la guayaba posee el mayor contenido fenólico y en correspondencia la mayor capacidad antioxidante,
seguido en orden por el extracto de la Eugenia y el extracto de Cayeput. Estos resultados tienen total
correspondencia con los resultados obtenidos para los restantes ensayos antioxidantes incluidos en el
presente trabajo.
Capítulo 3: Resultados y discusión
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 70
A
B
Figura 3.25. Relación entre el contenido fenólico total con el poder reductor y la capacidad antioxidante
total en los extractos evaluados.
Conclusiones 1- El contenido de aceites esenciales en las hojas de Psidium guajava L fue 0,38%, para la
Melaleuca leucadendron L de 0,44% y para la Eugenia axillaris resultó ser; y 1,72%, mientras que
el rendimiento de los extractos fue 0,43, 1,57 y 1,43 %, en base a droga seco, respectivamente.
2- El perfil cromatográfico de los extractos y aceites obtenidos de las tres especies, confirma la
presencia de 1,8 cineol, siendo este metabolito mayoritario en las en las especies P. guajava y M.
leucadendrom.
3- La técnica GC-FID resultó ser fiable para la determinación cuantitativa de cineol en el aceite y los
extractos y al aplicarla se comprobó que el contenido de este metabolito en las muestras de M.
leucadendrom es superior a las restantes especies evaluadas.
4- .Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antimicrobiana demuestran que los
extractos de las tres Mirtáceas poseen buenas potencialidades como antimicrobianos, muy
superior a los aceites esenciales obtenidos de estas plantas.
5- Los extractos de Psidium guajava muestran un alto poder antioxidante en comparación con la
Vitamina C, antioxidante de referencia de mejores resultados; mientras que los extractos de
Eugenia axillaris y de Melaleuca leucalendron superan los patrones BHT y cineol.
Recomendaciones
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 24
Recomendaciones
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 25
Recomendaciones
1. Continuar los estudios de la composición de aceite y extractos de estas especies, hasta lograr
identificar todos los componentes presentes en los mismos.
2. Realizar otros ensayos antioxidantes in vitro e in vivo, que permitan llegar a conclusiones
definitorias con respecto a esta actividad.
3. Determinar la Mínima Concentración inhibitoria para todas las muestras evaluadas con resultados
positivos en el ensayo de determinación de la actividad antimicrobiana.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 24
Bibliografía ABDELRAHIM, SI., ALMAGBOUL, AZ., OMER, ME., ELEGAMI, A. 2002.
Antimicrobial activity of Psidium guajava L. Fitoterapia, 73 (7-8), pp. 713-5.
ADAMS, R.P., 2001. Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Quadruple Mass
Spectrometry. Third ed, ed. C. Stream.
ALDERMAN, D. J., SMITH, P. 2001. Development of draft protocols of standard reference methods for
antimicrobial agent susceptibility testing of bacteria associated with fish diseases. Aquaculture. 196, pp.
211-243.
ALMEIDA, CE., KARNIKOWSKI, MG., FOLETO, R., BALDISSEROTTO, B. 1995.
Analysis of antidiarrhoeic effect of plants used in popular medicine. Rev Saude Publica, 29 (6), pp. 428-33.
ALZAMORA, L., MORALES, L., ARMAS, L., FERNÁNDEZ, G. 2001. Medicina tradicional en el Perú:
Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extraídos de algunas plantas aromáticas. Anales
de la Facultad de Medicina, 62 (2), pp. 156-161.
AMER, A., MEHLHORN, H. 2006. The sensilla of Aedes and Anopheles mosquitoes and their importance
in repellency. Parasitol Res., 99, pp. 491-9.
ARÉVALO, M., ENCISO, A. 1996. Determinación de la actividad antimicrobiana de algunas especies de
Espeletias encontradas en el páramo de Guasca. Carrera Bacteriología. Facultad de Ciencias Básicas.
Pontificia Universidad Javerina. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C, pp. 14 – 18.
AVELLO, M.; SUWALSKY, M., 2006. Radicales libres, antioxidantes naturales y mecanismos de
protección*. Atenea 494, pp. 161-172.
BANDONI, A. 2000. Los Recursos Vegetales Aromáticos en Latinoamérica. Su aprovechamiento industrial
para la producción de aromas y sabores. Argentina: Editorial de la Universidad Nacional de la Plata. pp.
29-231
BEGUM, S. HASSAN, SI., ALI, SN., SIDDIQUI, BS. 2004. Chemical constituents from the leaves of
Psidium guajava. Nat. Prod Res, 18 (2), pp.135-40.
BEGUM, S., HASSAN, SI., SIDDIQUI, BS. 2002 c. Two new triterpenoids from the fresh leaves of Psidium
guajava. Planta Med, 68 (12), pp. 1149-52.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 25
BEGUM, S., HASSAN, SI., SIDDIQUI, BS., SHAHEEN, F., GHAYUR, MN., GILANI, AH. 2002 a.
Triterpenoids from the leaves of Psidium guajava. Phytochemistrym, 61 (4), pp. 399-403.
BEGUM, S., SIDDIQUI, BS., HASSAN, SI. 2002 b. Triterpenoids from Psidium guajava leaves. Nat Prod
Lett, 16 (3), pp. 173-7.
BETONI, JE., MANTOVANI, RP., BARBOSA, LN., DI STASI, LC., FERNANDES JUNIOR, A. 2006.
Synergism between plant extract and antimicrobial drugs used on Staphylococcus aureus diseases. Mem
Inst Oswaldo Cruz, 101 (4), pp. 387-90.
BOLETIN DE PLANTAS MEDICINALES Y AROMATICAS. 2002. Revalorización del uso de plantas
medicinales en América. 6.
BOVERIS, A.; OSHINO, N., 1972. The cellular production of hydrogen peroxide. Biochemistry, 128 (3), pp.
617-630,
BUBBERT, H., JENNET, H. 2002. Surface & thin films Analysis. Wiley-vch.New York.
CABRERA, T. C. S., D. S., 2000. Algunos aspectos sobre el estrés oxidativo, el estado antioxidante y la
terapia de suplementación. Rev Cubana Cardiol, 14 (1), pp.55-60.
CÁCERES, A., FLETES, L., AGUILAR, L., RAMÍREZ, O., FIGUEROA, L., TARACENA, AM., ET, AL. 1993.
Plants used in Guatemala for the treatment of gastrointestinal disorders 3. Conformation of activity against
enterobacteria of 16 plants. J Ethopharmacol, 38 (1), pp. 31-8.
CALCINES, D. 1993. Los aceites esenciales, ed. E.P .y. Educación. Santiago de las Vegas.
CARBALLO, M., CORTADA, M., GADANO, B. 2005. Riesgos y beneficios en el consumo de plantas
medicinales. Teoría, 14 (2), pp. 95-108.
CAVAR SANJA, MAKSIMOVI MILKA, 2012. Antioxidant activity of essential oil and aqueous extract of
Pelargonium graveolens L’Herq. Food Control 23, pp. 263-267.
CEDMED, 2007.Validación de métodos analíticos. No 41.
ELA, R.A., CASAIS, L., 2002. Técnicas de Separación en Química Analítica, ed. E. Síntesis.
CHAH, KF., EZE, CA., EMUELOSI, CE., ESIMONE, CO. 2006. Antibacterial and wound healing properties
of methanolic extracts of some Nigerian medicinal plants. J Ethnopharmacol, 104 (1-2), pp. 164-7.
CHENG, JT., YANG, RS. 1983. Hypoglycemic effect of guava juice in mice and human subjects. Am J Chin
Med, 11 (1-4), pp. 74-6.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 26
DA SILVA JOÃO DOMINGOS, LUZ ARNALDO IRAN R., DA MILTON HELIO L., ANDRADE ELOISA
HELENA A., ZOGHBI MARIA DAS GRAÇAS B.2 AND MAIA JOSÉ GUILHERME S., 2003. Essential oils
of the leaves and stems of four Psidium spp. Flavour and fragrance journal. 18, pp.240–243.
DABBAH, R., EDWARDS, V.M., MOTAS, W.A. 1970. Antimicrobial Activity of Some Citrus Fruits Oils on
Selected Food-Borne Bacteria. Appl. Microbiology. 19(1), pp. 27 – 31.
DAVIES, P. 2004. Plantas aromáticas y medicinales En: Estudios en domesticación y cultivo de especies
medicinales y aromáticas nativas. Uruguay: FPTA-INIA, Serie 11, p. 19.
DÉCIGA, M., RIVERO-CRUZ, I., ARRIAGA-ALBA, M., CASTAÑEDA, G., ANGELES, G., NAVARRETE, A.,
MATA, R. 2007.Acute toxicity and mutagenic activity of mexican plans used in traditional medicine. Journal
of Ethnopharmacology, 110, pp. 334 - 342.
DELLACASA, A., DUSCHATZHY, C., BAILAC, P., CARRASCULL, A., PONZI, M. 1999. Propiedades
antimicrobianas del aceite esencial de Heterotheca latifolia Buck (Compositae). J. Essent. Oil Res, 11 pp.
262-263.
ECHEMENDIA, S, MORON, R. 2004. Tintura de hojas de guayaba L. en pacientes con diarrea aguda
simple. Rev cubana plant med. 9 (3).
ESTOMBA, D., LADIO, A. H. AND LOZADA, M. 2006. Las plantas silvestres comestibles en el noroeste
patagonico. J. Ethnopharm. 103, 109-119.
EUROPEAN PHARMACOPPEIA. 2005. France, Council of Europe. 2. ª edición.
FARAG, R. S., SHALABY, A.S., EL-BAROTY, G.A., IBRAHIM, N.A., ALI, M.A., HASSAN, E.M. 2004.
Chemical and biological evaluation of the essential oils of different Melaleuca species. Phytother Res.,, 18,
pp. 30-5.
FERNÁNDEZ, A., 1996. Ciclo de conferencia sobre validación de Métodos Analíticos. La Habana.
FERNÁNDEZ-CALIENES, A., MENDIOLA, J., SCULL, R., VERMEERSCH, M., COS, P., MAES. L. 2008. In
vitro anti-microbial activity of the Cuban medicinal plants Simarouba glauca DC, Melaleuca leucadendrom L
and Artemisia absinthium L. Mem Inst Oswaldo Cruz, 103, pp. 615-8.
FIGUEROA, M., RIVERO-CRUZ, I., RIVERO-CRUZ, B., BYEB, R., NAVARRETE, A., MATA, R. 2007
Constituents, biological activities and quality control parameters of the crude extract and essential oil from
Arracacia tolucensis var. multifida. Journal of Ethnopharm. 113, pp.125 - 131.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 27
FIRUZI, O.; ASADOLLAHI, M.; GHOLAMI, M.; JAVIDNIA, K., 2011. Composition and biological activities of
essential oils from four Heracleum species. Food Chemistry, 122, pp. 117–122.
FITOMED 1991. Plantas Medicinales. Edición Ciencias Médicas. Ciudad de La Habana: MINSAP.
FONT, I. Y QUER. 1983. Guía Práctica de las Plantas Medicinales y la Salud. BARCELONA, S. A. (Ed.)
FORMULARIO NACIONAL FITOFARMACOS Y APIFARMACOS. 2010. Ciudad de la Habana: Ed. Pueblo
y Educación, pp. 65-66.
GASTELL, P., LUIS, P.2000. 38. Metodos para medir el dano oxidativo. Rev Cubana Med Milit, 29(3),
pp.192-8.
GERSCHMAN R. 1954. Oxigen poisoning and X-Irradiation. A mechanism in common. Science; 119, pp.
623-6.
GONZALEZ, M. & RAMIREZ, D. 2007. Antecedentes y situación reguladora de la medicina herbaria en
Cuba. BLACPMA, 6(4), pp. 118-124.
GORDON, M. H., 2001. El desarrollo del enranciamiento oxidativo en los alimentos. In Antioxidantes de los
alimentos. Aplicaciones prácticas. , ACRIBIA, Ed. POKORNY, J.
GUIMARAES RAFAELA, BARROS LILLIAN, CARVALHO ANA MARIA, AND FERREIRA ISABEl., 2010.
Studies on Chemical Constituents and Bioactivity of Rosa micrantha: An Alternative Antioxidants Source for
Food, Pharmaceutical, or Cosmetic Applications. J. Agric. Food Chem. 58, pp. 6277–6284.
HAJHASHEMI, V. y ABBASI, N. 2008. Hypolipidemic activity of Anethum graveolens in rats. Phytother Res.
22, pp. 372-5.
HALLIWELL B, GUTTERIOGE JMC, 1989. Free radical in biology and medicine. Oxford: Clarendon; 1:142.
HIERMANN, A., BUFAR, F. 1994. Influence of some traditional medicinal plants of Senegal on
prostaglandin biosynthesis. J Ethnopharmacol, 42, , pp. 111-6.
HOLETZ, FB., PESSINI, GL., SANCHES, NR., CORTEZ, DA., NAKAMURA, CV., Filho, BP. 2002.
Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Mem
Inst Oswaldo Cruz, 97 (7), pp. 1027-31.
HOSSAIN M AMZAD, DAWOOD SHAH MUHAMMAD, GNANARAJ CHARLES, IQBAL MUHAMMAD 2011.
In vitro total phenolics, flavonoids contents and antioxidant activity of essential oil, various organic extracts
from the leaves of tropical medicinal plant Tetrastigma from Sabah. Asian Pacific Journal of Tropical
Medicine, pp. 717-721.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 28
HU, H.S., HU, H.B., ZHENG, X.D. 2009. Study on chemical constituents and antimicrobial activity of the
essential oil from Acanthopanax brachypus. Zhong Yao Cai. 32, pp. 67-70.
HUANG, D., PRIOR, R. 2005.The chemestry behind antioxidant capacity assays. Journal of agricultural
and food chemestry, 53, pp. 1841 – 1856.
ICH. 2005. Harmonised Tripartite Guideline. “International Conference on Harmonization of Technical Re
uirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Validation of analytical procedures and
Methodology, ICH-Q2 A y B, Geneva.
IDSTEIN, H., BAUER, C., SCHREIER, P. 1985. Volatile acids in tropical fruits: cherimoya (Annona
cherimolia, Mill.), guava (psidium guajava, L.), mango (Mangifera indica, L., var. Alphonso), papaya (Carica
papaya L.). Z. Lebensm Unters Forsch, 180 (5), pp. 394-7.
JAYASINGHE, C., GOTOH, N., AOKI, T. Y WADA, 2003. S.ohenolic composition and antioxidant activity of
sweet basil. J. Agric. Food Chem 54, pp. 4442 – 4449,
JIMÉNEZ-ESCRIG, A., RINCÓN, M., PULIDO, R., SAURA-CALIXTO, F. 2001. Guava Fruit (Psidium
guajava L.) as a New Source of Antioxidant Dietary Fiber. J. Agric. Food Chem, 49, pp. 5489-5493.
JORDAN, MJ., MARGARIA, CA., SHAW, PE., GOODNER, KL. 2003. Volatile components and aroma
active compounds in aqueous essence and fresh pink guava fruit puree (Psidium guajava L.) by GC-MS
and multidimensional GC/GC-O. J Agric Food Chem, 51 (5), pp. 1421-6.
KOSAR, M., DEMIRC, I.B., DEMRCI, F. y HÜSNÜ, CAN. BASER. K. 2008. Effect of Maturation on the
Composition and Biological Activity of the Essential Oil of a Commercially Important Satureja Species from
Turkey: Satureja cuneifolia Ten. (Lamiaceae). J. Agric. Food Chem. 20, pp. 1021-1027.
LAWRENCE, B.M. 1995. “Wncommon Essential Oliz as Sources of Common Natural Aroma Chemicalis”.
Perfum Fav, 10, pp.45-48.
LEE, C. K. 1998. A New Norlupene from the Leaves of Melaleuca leucadendron. J Nat Prod. , 61 (3), pp.
375-6.
LEE, C. K., CHANG, M.H. 1999. Four new triterpenes from the heartwood of Melaleuca leucadendrom. J
Nat Prod., 62, pp. 1003-5.
LI, J., CHEN, F., LUO, J. 1999. [GC-MS analysis of essential oil from the leaves of Psidium guajava].
Zhong Yao Cai, 22 (2), pp. 78-80.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 29
LIANG, Q. QIAN, H., YAO, W. 2005. Identification of flavonoids and their glycosides by high-performance
liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry and with diode array ultraviolet
detection. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng), 11 (1), pp. 93-101.
LIZCANO, A., VERGARA, J. 2008. Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos
y/o aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes
rhopaloides y Passiflora maticata frente a microrganismos patógenos y fitopató. Facultad de Ciencias.
Carrera de microbiología industrial.Pontificia Universidad Javeriana: Bogotá D.C. pp. 62 – 63.
LOIZZO, M., TUNDIS, R., MENICHINI, F., SAAB, A., STATTI, G. 2007. Cytotoxic activity of essential oils
from labiatae and lauraceae families against in vitro human tumor models. Anticancer Res. 27, pp. 3293-9.
LOZOYA, X., MECKES, M., ABOU-ZAID, M., TORTORIELLO, J., NOZZOLILLO, C., ARNASON,JT. 1994.
Quercetin glycosides in Psidium guajava L. leaves and determination of a spasmolytic principle. Arch Med
Res, 25 (1), pp. 11-5.
LOZOYA, X., REYES-MORALES, H., CHAVEZ-SOTO, MA., MARTINEZ-GARCIA, MDEL C., SOTO-
GONZALEZ, Y., DOUBOVA, SV. 2002. Intestinal anti-spasmodic effect of a phytodrug of Psidium guajava
folia in the treatment of acute diarrheic disease. J Ethnopharmacol, 83 (1-2), pp. 19-24.
MACDONALD-WICKS, K., 2006. Methodology for the determination of biological antioxidant capacity in
vitro.Journal of the Science of Food and Agriculture, 86(13), pp. 2046-2056.
MAESTRI, D. M.; NEPOTE, V.; LAMARQUE, A. L.; ZYGADLO, J. A., 2006. Natural products as
antioxidants. Phytochemistry: Advances in Research, pp.105-135.
MARTÍNEZ, J., SULBARÁN DE FERRER, B., OJEDA DE RODRÍGUEZ, G., FERRER, A., NAVA, R.2003.
Actividad antibacteriana del aceite esencial de mandarina. Rev. Fac. Agron. 20, pp. 502 - 512.
MARTINEZ, M., LOPEZ, M., BETANCOURT, J. 2001. Estudio toxicológico preclínico de la Psidium
guajava L. (guayaba). Rev cubana plant med, (2), pp. 56-61.
MASUDA, T., INABA, Y., MAEKAWA, T., TAKEDA, Y., YAMAGUCHI, H., NAKAMOTO, K., KUNINAGA, H.,
NISHIZATO, S., NONAKA, A. 2003. Simple detection method of powerful antiradical compounds in the raw
extract of plants and its application for the identification of antiradical plant constituents. J Agric Food Chem
, 51 (7), pp. 1831-8.
MERCADANTE, AZ., STECK, A., PFANDER, H. 1999. Carotenoids from guava (Psidium guajava L.):
isolation and structure elucidation. J Agric Food Chem 47 (1), pp. 145-51.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 30
MESSAOUD, C.; CHOGRANI, H.; BOUSSAI, M., 2011. Chemical composition and antioxidant activities of
essential oils and methanol extracts of three wild Lavandula L. species. Natural Product Research.
MITSCHER, L.A., DRAKE, S., GOLLAPUDI, S.R., OKWUTE, S.K. 1987. Amodern look at folkloric use of
antiinfective agents. Journal of Natural products. 50, pp. 1025 - 1040.
MORALES DE GODOY, V. 1996. Extracción y Caracterización del aceite esencial de Lima Thaití Citrus
aurantiifolia (Chritms) Swingle. Trabajo especial de Grado. LUZ. Facultad Experimental de Ciencias,
Maracaibo, Venezuela. pp. 18-19.
MORALES, MA. LOZOYA, X. 1994. Calcium-antagonist effects of quercetin on aortic smooth muscle.
Planta Med, 60 (4), pp. 313-7.
MOREIRA, C. D.; CHASE, C. D.; GMITTER, F. G. J.; GROSSER, J. W., 2000. Inheritance of organelle
genomes in citrus somatic cybrids. Molecular Breeding, 6, pp.401-405.
MÜLLER, G. 1981. Microbiología de los Alimentos Vegetales. Editorial Acribia S.A. Zaragoza. España.
pp.152-153.
NAVARRO, C. 2000. Uso racional de las plantas medicinales. Pharmaceutical Care España, 2, pp. 9-19.
NAWAWI, N. N., HATTORI, M., KUROKAWA, M., SHIRAKI, K. 1999. Inhibitory effects of Indonesian
medicinal plants on the infection of herpes simplex virus type 1. . Phytother Res., 13, pp. 37-41.
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). 2003. Performance Standards for
Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. Approved Standard M2-A8. National Committee for Clinical
Laboratory Standards Wayne. Pa.12 (4), p. 12.
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). 2009. Performance Standards for
Antimicrobial Susceptibility Testing; Nineteenth. Informational Supplement.M100-S19 .29(3), pp.37 -42.
NUNDKUMAR, N., OJEWOLE, JA. 2002. Studies on the antiplasmodial properties of some South African
medicinal plants used as antimalarial remedies in Zulu folk medicine. Methods Find Exp Clin Pharmacol,
24 (7), pp. 397-401.
NURMI, K.; OSSIPOV, V.; HAUKIOJA, E.; PIHLAJA, K., 1996. Variation of total phenolic content and
individual low-molecular-weight phenolics in foliage of mountain birch trees (Betula pubescens ssp.
tortuosa). Journal of Chemistry and Ecology. 22, pp. 2023-2040.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 31
OGUNBINU, A.O., FLAMINI, G., CIONI, P.L., ADEBAYO, M.A., OGUNWANDE I.A. 2009. Constituents of
Cajanus cajan (L.) Millsp., Moringa oleifera L., Heliotropium indicum L. and Bidens pilosa L. from Nigeria.
Nat Prod Commun. 4, pp. 573-8.
OLADIPUPO, L. A., ADEBOLA, O.O. 2009. Chemical composition of the essential oils of the flowers,
leaves and stems of two senecio polyanthemoides Sch. Bip. samples from South Africa. Molecules. 6, pp.
2077-86.
ORTEGA, A. M.; IZQUIERDO, A. C.; GÓMEZ, J. J. H.; OLIVARES-CORICHI, I. M.; TORRES, V. M. M.;
MÉNDEZ, J. D. J. V., 2003. Peroxidación lipídica y antioxidantes en la preservación de semen. una
revisión. INCI, 28 (12).
PINO, J.A., BELLO, A., URQUIOLA, A., AGÜERO, J. 2003. Leaf Oil of Eugenia Axillaris (Sw.) Willd. from
Cuba. Journal of Essential Oil Research 15 (1), pp. 15-16.
PINO, JA., MARBOT, R., VAZQUEZ, C. 2002. Characterization of volatiles in Costa Rican guava Psidium
friedrichsthalianum (Berg) Niedenzu fruit. J Agric Food Chem, 50 (21), pp. 6023-6.
PONCE-MACOTELA, M., NAVARRO-ALEGRIA, I., MARTINEZ-GORDILLO, MN., ALVAREZ-CHACON, R.
1994. In vitro effect against Giardia of 14 plant extracts. Rev Invest Clin, 46 (5), pp. 343-7.
Portal educativo de ciencias naturales y aplicadas.[www
]http://natureduca.com/anat.nutric.vitaminas.php. Consultada 20 de abril 2013.
PRABU, GR., GNANAMANI, A., SADULLA, S. 2006. Guaijaverin -- a plant flavonoid as potential antiplaque
agent against Streptococcus mutans. J Appl Microbiol, 101 (2), pp. 487-95.
QADAN, F., THEWAINI, AJ., ALI, DA., AFIFI, R., ELKHAWAD, A., MATALKA, KZ. 2005. The antimicrobial
activities of Psidium guajava and Juglans regia leaf extracts to acne-developing organisms. Am J Chin
Med, 33 (2), pp. 197-204.
QIAN, H., NIHORIMBERE, V. 2004. Antioxidant power of phytochemicals from Psidium guajava leaf. J
Zhejiang Univ Sci, 5 (6), pp.676-83.
RABE, T., VAN, STADEN, J. 1997. Antibacterial activity of South African plants used for medicinal
purposes. J Ethnopharmacol, 56 (1), pp. 81-7.
RAHIMI-NASRABADI MEHDI, AHMADI FARHAD AND BATOOLI HOSSEIN, 2011. Chemical composition
of essential oil and in vitro antioxidant activities of the essential oil and methanol extracts of Eucalyptus
loxophleba. Natural Product Research, pp.1–6.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 32
ROIG, J. T. 1991. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. 2da ed. 2da reimp. Ciudad de
La Habana: Editorial Científico-Técnica, p. 301.
ROIG, JT. 1974. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. La Habana: Ciencia y Técnica,
pp. 315-8.
SAFARALIE, A., FATEMI, S., SEFIDKON, F. 2008. Essential oil composition of Valeriana officinalis L. roots
cultivated in Iran. Comparative analysis between supercritical CO2 extraction and hydrodistillation. J
Chromatogr A. 8, pp.159-64.
SCHERER, R., TEIXEIRA, H. 2009. Antioxidant activity index (AAI) by the 2, 2-diphenyl-1- picrylhydrazyl
method. Food Chemistry, 112, pp. 654 – 658.
SCHMIDT JENNIFER M., NOLETTO JOSEPH A., VOGLER BERNHARD AND SETZER WILLIAM N.2006.
- Abaco Bush Medicine: Chemical Composition of the Essential Oils of Four Aromatic Medicinal Plants from
Abaco Island, Bahamas. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, Vol. 12(3). 43-64.
SENEVIRATHNE, M., KIN, S.H., SIRIWARDHANA, N., HA, J.H., LEL, K.W., JEON, Y. 2006. Antioxidant
potential of ecklonia cava on reactive oxygen species, scavenging, metal chelating, reducing power and
lipid peroxidation inhibition. Food Sci. Technol. 12(1), pp. 27–38.
SERRANO CARMO, MATOS OLIVIA, TEIXEIRA BARBARA, RAMOS CRISTINA, NENG NUNO,
NOGUEIRA JOSE, NUNES MARIA LEONOR AND MARQUES ANTONIO. 2011. Antioxidant and
antimicrobial activity of Satureja montana L. extracts. J Sci Food Agric 91, pp. 1554–1560.
SETZER WILLIAM N.2006. - Abaco Bush Medicine: Chemical Composition of the Essential Oils of Four
Aromatic Medicinal Plants from Abaco Island, Bahamas. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, Vol.
12(3), pp. 43-64.
SHI, H.; NOGUCHI, N.; NIKI, E.,2001. Introducción a los antioxidantes naturales.
SHIMADA, K.; FUJIKAWA, K.; YAHARA, K.; NAKAMURA, T. 1992. Antioxidative properties of xanthan on
auto oxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 40, pp.
945-948.
SINGH, G., KAPOOR, I.P., SINGH, P., DE HELUANI, C.S., DE LAMPASONA, M.P., CATALAN, C.A. 2008.
Chemistry, antioxidant and antimicrobial investigations on essential oil and oleoresins of Zingiber officinale.
Food Chem Toxicol. 46 (10), pp. 3295-302
SKOOG, D.A., LEARY, G., JAMES, J. 2000. Análisis Instrumental, ed. M. Graw-Hill.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 33
SMITH, P.A., STEWART, J., FYFE, L. 1998. Antimicrobial properties of plant essential oils and essences
against five important food-borne pathogens. Letters in Applied. Microbiology. 26 (2), pp. 118 – 122.
SUBEHAN, N., USIA, T., IWATA, H., KADOTA, S., TEZUKA, Y. 2006. Mechanism-based inhibition of
CYP3A4 and CYP2D6 by Indonesian medicinal plants. J Ethnopharmacol. , 105, pp. 449-55.
SUNTORNSUK, L., GRITSANAPUN, W., NILKAMHANK, S., PAOCHOM, A. 2002. Quantitation of vitamin
C content in herbal juice using direct titration. J Pharm Biomed Anal, 28 (5), pp. 849-55.
SWEENEY, M., HUNTER, S., KLOTZ, S.D., GENNARO, R.N., WHITE, R.S., 1994. Immunodetection and
comparison of melaleuca, bottlebrush, and bahia pollens. Int Arch Allergy Immunol, 105 (3), , p. 10.
THAIPONG, K., BOONPRAKOB, U., CISNEROS-ZEVALLOS, L., BYRNE, DH. 2005. Hydrophilic and
lipophilic antioxidant activities of guava fruits. Southeast Asian J Trop. Med Public Health, 4, pp. 254-7.
TONA, L., KAMBU, K., MESIA, K., CIMANGA, K., APERS, S., DE BRUYNE, T., PIETERS, L., TOTTE, J.,
VLIETINCK, AJ. 1999. Biological screening of traditional preparations from some medicinal plants used as
antidiarrhoeal in Kinshasa, Congo. Phytomedicine, 6 (1), pp. 59-66.
TONA, L., KAMBU, K., NGIMBI, N., CIMANGA, K., VLIETINCK, AJ. 1998.
Antiamoebic and phytochemical screening of some Congolese medicinal plants. J Ethnopharmacol, 61 (1),
pp. 57-65.
TONA, L., KAMBU, K., NGIMBI, N., MESIA, K., PENGE. O., LUSAKIBANZA, M., CIMANGA, K., DE
BRUYNE, T., APERS, S., TOTTE, J., PIETERS, L., VLIETINCK, AJ. 2000. Antiamoebic and spasmolytic
activities of extracts from some antidiarrhoeal traditional preparations used in Kinshasa, Congo.
Phytomedicine, 7 (1), pp. 31-8.
TORRES, C. M. 2007. Investigación en procesos de transformación de sustancias de interés presentes en
hojas, tubérculos, semillas y frutos de especies andinas para generar productos agroindustriales que
puedan ser destinados a nivel industrial, medicinal o alimenticio. Segundo Informe Técnico Taller del
Jardín Botánico José Celestino. Colombia.
TSURUGA, C., EBIZUKA, Y., SANKAWA, U. 1991. Biologically active constituents of Melaleuca
leucadendron: inhibitors of induced histamine release from rat mast cells. Chem Pharm Bull,, 32, pp. 3276-
8.
Bibliografía
Lic. Yadira Morales Fernández
“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 34
UMAMAHESWARI, M., CHATTERJEE, T.K., 2008. In vitro antioxidant activities of the fractions of Coccinia
grandis L. leaf extract. African Journal of Traditional. Complementary and Alternative Medicine 5 (1), pp.
61–73.
VANACLOXTA, VB., ARTECHE, A. Y GUENECHEA, JL. 2003. Fitoterapia, Vademecum de prescripción
de Plantas medicinales. 4tª edición. España: Masson.
VIEIRA, RH., RODRIGUES, DP., GONCALVES, FA., MENEZES, FG., ARAGAO, JS., SOUSA, OV. 2001.
Microbicidal effect of medicinal plant extracts (Psidium guajava Linn. and Carica papaya Linn.) upon
bacteria isolated from fish muscle and known to induce diarrhea in children. Rev Inst Med Trop Sao Paulo,
43 (3), pp.145-8.
VUKOVIC, N., MILOSEVIC, T., SUKDOLAK, S., SOLUJIC, S. 2007. Antimicrobial Activities of Essential Oil
and Methanol Extract of Teucrium montanum. Evid Based Complement Alternat Med, pp. 17 - 20.
YAMASHIRO, S., NOGUCHI, K., MATSUZAKI, T., MIYAGI, K., NAKASONE, J., SAKANASHI, M.,
SAKANASHI, M., KUKITA, I., ANIYA, Y., SAKANASHI, M. 2003. Cardioprotective effects of extracts from
Psidium guajava L and Limonium wrightii, Okinawan medicinal plants, against ischemia-reperfusion injury
in perfused rat hearts. Pharmacology, 67 (3), pp. 128-35.
YANISHLIEVA-MASLAROVA, N. V.; HEINONEN, I. M., 2001. Origen de los antioxidantes naturales:
verduras, frutas, hierbas, especias y tés. In Antioxidantes de los alimentos. Aplicaciones prácticas,
ACRIBIA, Ed. POKORNY, J.
YOUSEFZADI, M., SONBOLI, A., KARIMIC, F., EBRAHIMI, S., ASGHARI, B., ZEINALIA, A. 2007.
Antimicrobial activity of some Salvia species essential oils from Iran. Z Naturforsch. 62, pp. 514-8.
ZAIKA, LL. 1988. Spices and herbs: their antibacterial activity and its determination. J Food Saf, 23, pp. 97-
118.
ZHANG, WJ., CHEN, BT., WANG, CY., ZHU, QH., MO, ZX. 2003. Mechanism of quercetin as an
antidiarrheal agent]. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 23 (10), pp. 1029-31.