Tesis - Poblacion Microbiana

7/25/2019 Tesis - Poblacion Microbiana

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Instituto Politcnico Nacional

CENTRO DE INVESTIGACIN EN CIENCIA

APLICADA Y TECNOLOGA AVANZADA

UNIDAD QUERTARO

POSGRADO EN TECNOLOGA AVANZADA

Estudio de la poblacin microbiana productora de gaspresente en yacimientos petroleros de Chicontepec,

Veracruz

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRA EN TECNOLOGA AVANZADA

PRESENTA

IBT Ginesa Elizet Arenas Isaac

Directora de Tesis:

Dra. Norma Gabriela Rojas Avelizapa

Santiago de Quertaro, Qro. Junio de 2012.


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El presente trabajo se realiz en el Laboratorio

Bioqumica del rea de Biotecnologa en el Centro

de Investigacin en Ciencia Aplicada y TecnologaAvanzada del Instituto Politcnico Nacional bajo la

direccin de la Dra. Norma Gabriela Rojas

Avelizapa.

La sustentante fue becaria CONACyT con registro 237762, becario PIFI durante el

periodo febrerojunio 2009 y agostodiciembre 2011.


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Dedicado

A mis padres quienes siempre me alentaron a seguir

adelante y para no abandonar mis sueos.

______________________________________________________

A Guillermo Castaeda por su paciencia, amor y apoyo

incondicional.

______________________________________________________


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Agradecimientos

A la Dra. Norma G. Rojas Avelizapa por guiar mis

pasos en el camino de la investigacin.

A Regina H. Gama por hacer ms ameno el ambiente

de trabajo y armonizar con risas los das difciles.

Al CICATA Quertaro por facilitar las instalaciones

para llevar a cabo el proyecto.

A CONACyT por el apoyo econmico.A PIFI por el apoyo econmico y cientfico.

Al Instituto Mexicano del Petrleo por proporcionar el

material para llevar a cabo la investigacin.


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i

ndice general

Resumen ............................................................................................................... vii

Abstract ................................................................................................................ viii

Introduccin........................................................................................................... 1

Marco terico......................................................................................................... 3

2.1

Yacimientos petroleros como hbitat de microorganismos extremfilos.... 4

2.2

Produccin de biosurfactantes y cidos..................................................... 5

2.3

Produccin de biopolmeros....................................................................... 5

2.4

Metabolismo de los microorganismos fermentativos.................................. 6

2.5

Metabolismo de los microorganismos metangenos.................................. 8

2.6

Enriquecimiento de medios de cultivo para incrementar poblaciones

nativas de pozos petroleros...................................................................... 112.7

Tecnologas de MEOR en el mundo......................................................... 15

2.8

Sitio de estudio......................................................................................... 16

Justificacin........................................................................................................ 19

Hiptesis.............................................................................................................. 21

Objetivos.............................................................................................................. 23

5.1

Generales................................................................................................. 23

5.2

Particulares............................................................................................... 23

Materiales y Mtodos.......................................................................................... 17

6.1

Anlisis bromatolgico (proximal) del polvo de cocoa y melaza de caa. 26

6.2

Caracterizacin microbiolgica de la muestra de aceite........................... 26

6.2.1 Preparacin de frascos con medio de cultivo base para

microorganismos anaerobios....................................................... 27

6.2.2 Procedimiento para el cultivo de bacterias sulfato reductoras

(BSR). .......................................................................................... 29

6.2.3

Procedimiento para el cultivo de bacterias fierro reductoras (BFR).

..................................................................................................... 30

6.2.4

Procedimiento para el cultivo de bacterias nitrato reductoras

(BNR.).......................................................................................... 31

6.2.5

Procedimiento para el cultivo de bacterias metanognicas (BM) . 32


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ii

6.3

Obtencin de microorganismos fermentadores partiendo de la muestra de

aceite. ....................................................................................................... 33

6.3.1

Preparacin del medio de cultivo con melaza (Medio M)............. 33

6.3.2

Evaluacin de la produccin de CO2 con el medio de cultivo con

polvo de cocoa (Medio C)............................................................ 34

6.4

Obtencin de microorganismos metangenos......................................... 37

6.4.1

Evaluacin de BES como inhibidor de metanognesis durante la

produccin de CO2....................................................................... 38

6.5

Evaluacin de la produccin de gas y crecimiento de los cultivos en los

tratamientos experimentales..................................................................... 39

6.5.1

Evaluacin de la produccin de CO2 y CH4.................................. 40

Resultados........................................................................................................... 44

7.1

Anlisis proximal al polvo de cocoa y melaza de caa............................. 45

7.2

Caracterizacin de los grupos microbianos presentes en muestras de

aceite........................................................................................................ 47

7.3

Cultivo de bacterias fermentadoras a partir de una muestra de aceite..... 49

7.3.1

Microbiologa de los microcosmos evaluados.............................. 54

7.4

Efecto de la concentracin de polvo de cocoa en la produccin de CO2por

el cultivo fermentativo............................................................................... 55

7.5

Obtencin de los consorcios metangenos.............................................. 58

7.5.1

Microbiologa de los cultivos evaluados....................................... 60

7.6

Evaluacin de BES como inhibidor de la metanognesis durante la

produccin de CO2................................................................................... 62

7.7

Anlisis estadstico de los tratamientos.................................................... 66

7.7.1

Concentraciones de las fuentes de carbono................................ 66

7.7.2

Efecto de la concentracin de BES sobre los cultivos

metangenos............................................................................... 68

Discusiones......................................................................................................... 718.1

Efecto de las fuentes de carbono sobre la produccin de CO2................ 72

8.2

Efecto de la adicin de BES a un cultivo productor de CH4y CO2........... 73

Conclusiones....................................................................................................... 76

Bibliografa........................................................................................................... 78


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iii

ANEXO 1. Mtodo de nmero ms probable (NMP) para la cuantificacin de

microorganismos anaerobios en una muestra de aceite. ...................................... viii

ANEXO 2. Preparacin de agua destilada anxica. ............................................... xi

ANEXO 3. Cuantificacin de nitritos para NMP de BNR. ...................................... xii

ANEXO 4. Valores tabulados de las mediciones de gases. ................................ xiii


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iv

ndice de Tablas

Tabla 1 Caractersticas de los principales grupos extremfilos encontrados en

yacimiento .............................................................................................. 4

Tabla 2 Composicin nutricional de la melaza de caa de azcar .................... 12

Tabla 3 Composicin nutricional del polvo de cocoa ......................................... 13Tabla 4 Pases que han realizado pruebas utilizando el metablitos microbianos

involucrados en tcnicas de MEOR...................................................... 15

Tabla 5 Formulacin del medio de cultivo base ................................................. 28

Tabla 6 Formulacin del medio de cultivo modificado para el cultivo de

microrganismos fermentadores ............................................................ 33

Tabla 7 Formulacin del medio de cultivo de microrganismos fermentadores

adicionado con polvo de cocoa ............................................................ 35

Tabla 8 Plan de experimentacin para la produccin de CO2 en cultivos

fermentativos usando diferentes concentraciones del medio de cocoa ....

............................................................................................................. 35

Tabla 9 Concentracin en mol (M) del 2-bromoetano sulfonato de sodio en los

tratamientos .......................................................................................... 39

Tabla 10 Condiciones de operacin del cromatgrafo de gases ......................... 42

Tabla 11 Anlisis proximal del polvo de cocoa y melaza de caa ....................... 45

Tabla 12 Composicin de la solucin con oligoelementos .................................. 47Tabla 13 Solucin de oligoelementos para medio de cultivo base ........................ xi

Tabla 14 Valores obtenidos de la medicin de CO2 producido por el grupo

fermentativo proveniente del aceite ...................................................... xiii

Tabla 15 Valores obtenidos de la medicin de CO2 producido por el grupo

fermentativo utilizando medio con cocoa y medio con melaza ............. xiii

Tabla 16 Valores obtenidos de la medicin de CH4en el grupo metangeno con

el inhibidor BES .................................................................................... xiv

Tabla 17 Valores obtenidos de la medicin de CO2en el grupo metanognico con

el inhibidor BES .................................................................................... xiv

Tabla 18 Valores obtenidos de la medicin de CO2en el grupo fermentativo con

inhibidor BES ......................................................................................... xv


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v

ndice de Grficas.

Grfica 1 Produccin de CO2 en el microcosmos que contiene el medio de

cultivo adicionado con melaza e inoculado con la muestra de aceite

......................................................................................................... 50

Grfica 2 Produccin de CO2de la primera resiembra sin aceite que presentcontaminacin. ................................................................................. 51

Grfica 3 Produccin de CO2 del cultivo fermentativo en el medio de cultivo

adicionado con melaza e inoculado con una muestra de aceite ...... 52

Grfica 4 Produccin acumulada de CO2 por el cultivo fermentativo en los

medios de cultivo sin la adicin de aceite ........................................ 53

Grfica 5 Produccin acumulada de CO2 de los cultivos fermentativos a

diferentes concentraciones de polvo de cocoa y melaza ................. 56Grfica 6 Produccin en mg/ml de CH4 y CO2del cultivo metangeno ........... 59

Grfica 7 Produccin en mg/ml de CH4por el cultivo metangeno ................. 63

Grfica 8 Produccin de CO2en mg/ml por el cultivo mixto metangeno ....... 64

Grfica 9 Produccin de CO2en mg/ml por el cultivo fermentativo ................. 65

Grfica 10 Interacciones entre las diferentes fuentes de carbono con respecto al

tiempo de incubacin ....................................................................... 67

Grfica 11 Produccin de CO2en los diferentes tratamientos comparados con la

media de todo el tratamiento ............................................................ 68

Grfica 12 Interaccin entre la produccin de CO2y CH4................................. 69

Grfica 13 Produccin de CO2en los diferentes tratamientos comparados con la

media de todo el tratamiento con un nivel de confianza 98.80%. .... 70

ndice de Figuras.

Figura 1 Sntesis de CO2, H2y acetato a partir de glucosa .............................. 7Figura 2 Rutas metablicas de la metanognesis ............................................ 9

Figura 3 Coenzima M (CoM) de la metanognesis. Estructura del 2-

bromoetano sulfonato de sodio (BES ............................................... 10

Figura 4 Ubicacin de la zona de estudio en el paleocanal de Chicontepec .. 17


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vi

Figura 5 Arreglo entre los frascos productores de gas y la solucin recolectora

con NaOH ........................................................................................ 41

Figura 6 Microcosmos que contienen medio de cultivo adicionado con melaza

de caa e inoculado con una muestra de aceite. ............................. 49

Figura 7 Cromatograma obtenido de la inyeccin de los gases del espacio

gaseoso de los microcosmos con el cultivo fermentativo ................. 52Figura 8 Fotografa que corresponde a la Tincin Gram del grupo de bacterias

fermentativas provenientes del cultivo inoculado con aceite ............ 54

Figura 9 Fotografa de los microcosmos con medio de cultivo y adicionados

con polvo de cocoa .......................................................................... 55

Figura 10 Fotografas de los microcosmos del cultivo metangeno ................. 58

Figura 11 Cromatograma que describe el perfil de los gases detectados en la

muestra del espacio gaseoso de los microcosmos de los cultivos

metangenos. .................................................................................. 59

Figura 12 Fotografas que muestran la Tincin Gram del grupo de bacterias

metangenas provenientes de la muestra proveniente del biorreactor

anaerobio. ........................................................................................ 61

Figura 13 Fotografa de los microcosmos del cultivo metangeno adicionados

con BES al inicio del tratamiento. ..................................................... 62

ndice de Ecuaciones.

Ecuacin 1 Frmula para cuantificar la produccin de CO2en mg ..................... 41

Ecuacin 2 Ecuacin de los gases ideales ......................................................... 42

Ecuacin 3 Produccin de CO2en moles/ml ...................................................... 43

Ecuacin 4 Produccin de CH4en moles/ml ....................................................... 43


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vii

Resumen

La recuperacin mejorada de hidrocarburos por va microbiana o MEOR por sus

siglas en ingls (Microbial Enhanced Oil Recovery) refiere al uso de

microorganismos tales como bacterias y/o arqueas, provenientes de pozos

petroleros y de suelos o bien sus subproductos para aumentar la recuperacin de

hidrocarburos hasta en un 40% en yacimientos parcialmente agotados o de muy

difcil acceso. El proyecto Aceite Terciario del Golfo de Chicontepec, es una de las

cuatro reservas probadas y posibles de crudo en Mxico; el cual tiene condiciones

poco favorables para llevar a cabo una extraccin convencional. El presente

trabajo busca evaluar y optimizar la produccin microbiana de gas (CO2) utilizando

medios de cultivos enriquecidos usando melaza y polvo de cocoa para el

crecimiento de bacterias fermentadoras provenientes del pozo petrolero Coyotes

332 de Chicontepec. La primera etapa del proyecto consisti en una

caracterizacin de los grupos microbianos del petrleo, bacterias sulfato

reductoras, bacterias nitrato reductoras, bacterias fierro reductoras, bacterias

fermentativas y bacterias metanognicas; para la cual slo se lograron aislar

bacterias fermentadoras productoras de CO2, en el primer cultivo se obtuvo 11.03

mg/ml de CO2 a los 80 das de incubacin y en la resiembra sin aceite 12.35

mg/ml de CO2a los 75 das de incubacin; la segunda etapa evalu la produccinde gases en los cultivos con melaza y cocoa, obteniendo en el medio con cocoa al

20% una mejor produccin con respecto al medio con melaza produciendo 23.09

mg/ml de CO2 a los 90 das de incubacin con respecto al de melaza que ha

producido 15.66 mg/ml en el mismo tiempo de incubacin; en la tercera etapa el

uso del inhibidor BES a una concentracin de 6mM para inhibir a los grupos

metangenos ha logrado incrementar la produccin de CO2de 8.97 a 12.74 mg/ml

y disminuir el CH4 de 1.91 a 0 a los 77 das de incubacin para ambos casos; con

este trabajo experimental se prob que el polvo de cocoa mejora la produccin de

CO2; el inhibidor BES detiene la produccin de CH4a concentraciones de 6 mM.


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viii

Abstract

Microbial enhanced oil recovery (MEOR) refers to the use of microorganisms such

as bacteria and/or archeas or their by-products to increase the recovery of

hydrocarbons up to 40% in partially depleted or difficult access reservoirs. The

Aceite Terciario del Golfo Project in Chicontepec is one of four proven and

potential crude oil reservoirs in Mexico. This oil reservoir is not in favorable

conditions to carry out a conventional extraction procedure. Appropriate

alternatives or solutions must be developed. The aim of this study was to evaluate

and optimize the microbial production of gas (CO2) using enriched microbial culture

by using molasses and cocoa powder for the growth of fermentative bacteria that

came from the oil well "Coyotes 332" Chicontepec. The first stage of the study

involved the characterization of the microbial groups present in oil samples, suchas sulfate-reducing bacteria, nitrate-reducing bacteria, iron-reducing bacteria,

fermentative bacteria and methanogenic bacteria. Only the fermentative group was

detected, which was able to produce 11.03 mg/ml of CO2 after 80 days of

incubation; the second stage evaluated the CO2production by cultures added with

molasses and cocoa powder, as it was demonstrated. Media added with cocoa at

20% produced 23.09 mg/ml of CO2at day 90. This production is higher than CO2

production obtained with molasses (15.66 mg/ml) at 10% under similar conditions.During the last and third stage of this study, it was demonstrated that the use of an

inhibitor (BES) at a concentration of 6 mM was able to completely inhibit

methanogens, increasing the CO2 production from 8.97 to 12.74 mg/ml and

decreasing CH4production from 1.91 to 0 at day 77 for both cases. According to

the results, it was demonstrated that cocoa powder enhances the production of

CO2by the fermentative group and the BES inhibitor stops the production of CH4at

concentrations of 6 mM as it was evaluated with the methanogen group used in the

present study.


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aptulo I

Introduccin


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Captulo I IBT Ginesa E. Arenas Isaac

Estudio de la poblacin microbiana productora de gas en yacimientos petroleros de Chicontepec, Ver. 1

Actualmente se conoce que los procesos microbianos tienen varias aplicaciones

en diferentes procesos industriales y los nuevos desarrollos en el rea de la

biotecnologa, han sido utilizados para mejorarlos y as, emplearlos con diversos

fines como son la reduccin y eliminacin de contaminantes, produccin de

metablitos de inters y para la obtencin de subproductos con alto valor

agregado.

Una de las aplicaciones de estos procesos y no muy reciente, es la recuperacin

de hidrocarburos residuales presentes en yacimientos petroleros, ya que cerca del

50% del petrleo del mundo se encuentra en reservas inactivas o parcialmente

agotadas y en la mayora de los casos, el aceite tiende a ser demasiado viscoso

para ser extrado de la manera convencional o por recuperacin primaria, lo queadems ha provocado un incremento considerable en su costo (OTA, 1984). Con

este fin en pases como China, India y Turqua, se implementaron mtodos

conocidos como de recuperacin artificial o secundaria, los cuales principalmente

utilizan una bomba que inyecta a presin gas o agua (water flooding) a travs de

los yacimientos para facilitar la extraccin del crudo; sin embargo, estos mtodos

no son capaces de obtener porcentajes, considerados como mnimos por

asociaciones petroleras, aproximadamente un 35 (Ferrer, 2001), adems de que

su implementacin, operacin y mantenimiento representan altos costos para la

industria petrolera.

La tecnologa de MEOR por sus siglas en ingls (Microbial Enhanced Oil

Recovery) es un trmino general que refiere al uso de bacterias/arquea y/o de sus

subproductos, para aumentar la recuperacin de hidrocarburos hasta en un 40%

en yacimientos parcialmente agotados o de muy difcil acceso (Behllgil &

Mehmetolu, 2002).

Los primeros microorganismos estudiados para la implementacin de la tecnologa

de MEOR solamente eran cultivados y estudiados bajo condiciones de

temperaturas de 20 a 45C, salinidad menor al 10% y presiones por debajo de los


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Captulo I IBT Ginesa E. Arenas Isaac


2 x 104kPa (Mueller & Nielsen, 1996) por lo que esta tcnica era vista como no

sustentable debido a la larga inversin de tiempo que requera su estudio e

implementacin. Sin embargo, con el desarrollo de nuevas tecnologas se ha

logrado avanzar en el desarrollo de tcnicas para el aislamiento y conocimiento de

microorganismos autctonos de yacimientos muy profundos, los cuales tienen

mecanismos para enfrentar condiciones de ausencia de oxgeno (anaerobiosis),

presin, salinidad y temperaturas elevadas; entre ellos se pueden nombrar a las

bacterias sulfato reductoras (BSR), bacterias nitrato reductoras (BNR), bacterias

hierro reductoras (BFR), bacterias fermentativas y bacterias metanognicas

(Mueller & Nielsen, 1996), con ello se estudia y evala su implementacin directa

o de sus subproductos en los procesos de MEOR (Almehaideb & Zekri, 2002).


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aptulo II

Marco terico


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Captulo II IBT Ginesa E. Arenas Isaac


2.1 Yacimientos petroleros como hbitat de microorganismos

extremfilos.

Un yacimiento de petrleo est formado por fluidos tales como agua,

hidrocarburos, gases; y rocas de tipo sedimentario entre ellas arcillas y zeolitas.Los minerales de las rocas son suministro de nutrientes y constituyen un factor

importante que permite la propagacin de microorganismos, mientras que el aceite

y el agua contienen compuestos orgnicos e inorgnicos que son utilizados como

fuente de carbono y energa por microorganismos anaerobios diversos (Camper,

et al., 1993; Magot, et al., 2000).

Dadas las caractersticas anteriores, en un yacimiento se sostiene vida microbiana

que en su mayora corresponder a microorganismos termfilos, hipertermfilos,

halfilos, barfilos, quimioauttrofos y quimiohetertrofos anaerobios; en la Tabla

1 se muestra las caractersticas de los grupos extremfilos:

Tabla 1 Caractersticas de los principales grupos extremfilos encontrados enyacimiento.

Grupo microbiano Factor ambiental Caracterstica

Termfilo Temperatura 65C

Hipertermfilo Temperatura 80C

Barfilo Presin hidrosttica 500 psi

Alcalfilo pH 9

Halfilo Salinidad 2 %como NaCl

* (Madigan, et al., 2004) (Eckford & Fedorak, 2002)

Los productos metablicos generados por el conjunto de microorganismos

anaerobios encontrados en yacimientos van desde biopolmeros (Vargas, et al.,

1999), biosurfactantes y cidos orgnicos (Bryant, et al., 1993) hasta la produccin

de gases, principalmente CO2y H2los cuales son miscibles en el aceite (Behllgil

& Mehmetolu, 2002), siendo estos gases producidos por bacterias fermentativas.


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2.2 Produccin de biosurfactantes y cidos.

Existen microorganismos especficos que pueden producir biosurfactantes, estos

reducen la tensin interficial (IFT) entre el petrleo y el agua, adems de favorecerla formacin de emulsiones estables entre estos dos. Estas sustancias de igual

manera, incrementan la permeabilidad de los yacimientos debido al intercambio de

humedad que se lleva a cabo desde el centro del yacimiento, creando una

condicin ms hmeda, estudios anteriores en tecnologa del petrleo han

mostrado que Bacillus licheniformisy Clostridium sp., son capaces de lograr esta

condicin (Vargas, et al., 1999).

Algunos microorganismos son capaces de producir ciertos tipos de cidos, los

cuales causan la disolucin de las rocas y disminucin en la tensin interficial

entre el petrleo y los yacimientos salobres. La produccin in situde estos cidos

puede utilizarse en el tratamiento de varios problemas, tales como baja

permeabilidad del crudo atrapado debido a la baja permeabilidad de la roca.

2.3 Produccin de biopolmeros

Adems de clulas en crecimiento, las bacterias producen biopolmeros insolubles

en agua; si se agregan estas sustancias en zonas de alta permeabilidad se puede

mejorar la recuperacin de hidrocarburos (Muoz-Colunga, et al., 2009).

La acumulacin de estos biopolmeros en roca de alta permeabilidad (hasta 2000

md), da como resultado que el tamao de poro disminuya, forme canales que

favorezcan el flujo del agua a travs de la roca y de esta manera el agua llegue adonde se encuentra el crudo. En estudios anteriores se ha probado que la

inyeccin de Leuconostoc mesenteroides y el uso de una fuente de glucosa y

peptona reduce la porosidad de la roca (Belyaev, et al., 2004).


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2.4 Metabolismo de los microorganismos fermentativos.

La produccin de gases como H2, CO2, N2y CH4en un yacimiento, es llevada a

cabo por un conjunto de bacterias y archeas anaerbicas, que mediante un

metabolismo fermentativo son capaces de producir hidrgeno (H2), dixido decarbono (CO2), acetato y butirato, durante la fase inicial del proceso fermentativo

como se muestra en la Fig. 1 (Behllgil & Mehmetolu, 2002).

El CO2 es miscible en el petrleo logrando la disminucin de su viscosidad,

adems favorece el incremento de la presin en el yacimiento, mejorando la

movilizacin del petrleo en pozos parcialmente despresurizados (Stalcup, 2004),

buscar la produccin y/o incremento in situde este gas en pozos donde el petrleo

a recuperar tiende a ser altamente viscoso o pesado y para zonas que se

encuentran despresurizadas, es un elemento importante y juega un papel

significativo para la tecnologa MEOR (Belyaev, et al., 2004).


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Figura 1 Sntesis de CO2, H2 y acetato a partir de glucosa (Schrder, et al.,1994).

Glucosa

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

Fructosa-1,6-bifosfato

Gliceraldehdo-3-fosfatoDihidroxiacetona fosfato

2 NAD+

2 NADH

2 Fdox

2 Fdred

4 H+

2H2

ATP

ADP

ATP

ADP

2 x 1,3-Bisfosfoglicerato

2 ADP

2 ATP

2 x 3-Bisfosfoglicerato

2 x 2-Bisfosfoglicerato

2 x Fosfoenolpiruvato

2 ADP

2 ATP

2 x piruvato

2 Fdox

2 Fdred

4 H+

2 H2

2 CoA

2 CO2

2 x Acetil-CoA

2 x Acetil-fosfato

2 Acetato

2 ADP

2 ATP


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2.5 Metabolismo de los microorganismos metangenos.

Los microorganismos metangenos producen gas metano (CH4), este gas que

aunque se produce de manera in situ en el yacimiento, al combinarse una

corriente de este gas con petrleo, la reaccin tiene el potencial suficiente para

alterar su composicin qumica (Stalcup, 2004), entendindose ste cambio

cuando las fases del petrleo y del gas se encuentran separadas y no en una

emulsin equilibrada o estable como normalmente debera encontrarse;

provocando as, una migracin del petrleo a las profundidades del pozo,

fenmeno conocido como migracin fraccionaria (Silverman, 1965).

El CH4 producido en el pozo por bacterias metangenas quimiolitotrficas,provocan el decremento y cada de la produccin de CO2 y H2, puesto que el

metabolismo metangeno puede llegar a utilizar estos gases como fuente de

carbono o energa para iniciar su ciclo productivo como se muestra en laFigura 2,

ocasionando que la presencia de este metabolismo perjudique la produccin de

CO2.


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Figura 2 Rutas metablicas de la metanognesis: hidrogenotrficas (flechasnegras), acetoclsticos (flechas grises). La ruta hidrogenotrficapuede iniciar de formato o H2/CO2. La ruta acetoclstica obtieneelectrones de la oxidacin de CO producido por la divisin del acetato

(Almeida, et al., 2011).

Para lograr detener la metanognesis, se han estudiado varios compuestos que ya

han sido probados para disminuir la produccin de CH4; ionforos, cidos

orgnicos, cidos grasos y compuestos halogenados son algunos de ellos (Chae,

et al., 2010; Zinder, et al., 1984) sin embargo para los 3 primeros, se ha reportado


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una elevada tasa de inespecificidad sobre el metabolismo metangeno, afectando

a otros organismos estudiados en un cultivo mixto, adems de que el costo de

obtenerlos y usarlos es elevado (Liu, et al., 2011; Lee, et al., 2009).

A diferencia de los compuestos anteriores, los compuestos halogenados como el

cido bromoetanosulfnico o BES (2-bromoetanosulfonato de sodio,

BrCH2CH2SO3Na) se reporta como uno de los inhibidores ms eficaces debido a

sus efectos especficos sobre bacterias metanognicas; ste compuesto tiene un

efecto inhibidor sobre la reductasa metlica de la coenzima M del ltimo paso de la

metanognesis (Xu, et al., 2009) en la Fig. 3 se muestra las estructuras qumicas

de la enzima y el compuesto inhibidor:

Figura 3 a) Coenzima M (CoM) de la metanognesis. b) Estructura del 2-bromoetano sulfonato de sodio (BES). (Keltjens, 1984; Liu, et al.,

2011)

En un estudio utilizando este compuesto, se observ que el BES redujo la

produccin de CH4 hasta en un 76% en cultivos mixtos obtenidos del rumen de

vaca (Lee, et al., 2009) y hasta un 60% en cultivos de bacterias termfilas (Zinder,

et al., 1984). Dadas las condiciones del yacimiento objeto de estudio, se propone

favorecer e incrementar la produccin de CO2, dado que este gas acta de

manera eficaz en la disminucin de la viscosidad del crudo pesado con respecto al

CH4 (gas que tambin es producido de manera in situ) inhibiendo a la poblacin

metanognica.

b)a)


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2.6 Enriquecimiento de medios de cultivo para incrementar

poblaciones nativas de pozos petroleros.

La mayora de los procesos de MEOR involucran la inyeccin de microorganismos

dentro del yacimiento para que estos produzcan los metablitos segn el inters y

necesidades en el yacimiento, sin embargo cabe sealar las desventajas que

conlleva, estas van desde problemas de corrosin por la produccin de sulfuro de

hidrogeno hasta el taponamiento de la roca por el tamao de las clulas (Brown,

2010), adems existe el riesgo de que al ingresar microorganismos exgenos a un

nuevo ambiente, esto genere el desplazamiento de la microbiota nativa cambiando

drsticamente el ambiente.

Puesto que los microorganismos candidatos a inyectarse dentro de un pozo han

sido cultivados en condiciones ptimas de laboratorio (temperatura < 40C, pH 5-

8, concentracin de sales < 10%) no se garantiza su sobrevivencia en un

ambiente de yacimiento, ambiente en el que encontramos temperaturas entre los

60-150 C, concentracin salina superior al 30 % y presiones atmosfricas por

encima de los 2 x 104 kPa, adems de presentar condiciones anaerbicas y

fuentes nutricionales de difcil asimilacin (McInerney, et al., 1999).

En estudios de laboratorio simulando las condiciones de un yacimiento

(condiciones PVT), se demostr que la inyeccin de nutrientes in situestimula el

incremento en las poblaciones microbianas nativas, logrando que en zonas con

excesiva permeabilidad, sta se redujera hasta lograr el paso efectivo del aceite

entre los poros de la roca (McInerney, et al., 1999) y al mismo tiempo tambin se

estimula la produccin gases principalmente de CO2, H2 y CH4 por

microorganismos fermentadores (Belyaev, et al., 2004).

Buscando estimular el crecimiento de las poblaciones microbianas nativas, se ha

probado la inyeccin de medios de cultivo enriquecidos con fuentes de carbono de

fcil asimilacin para los microorganismos, tales como melaza de caa,


29/109



favoreciendo el metabolismo fermentativo, sulfato reduccin y metangeno; la

fermentacin de la melaza produce CO2 y cidos grasos (Belyaev, et al., 2004;

Zhang, et al., 1999), las bacterias anaerobias facultativas producen 2 moles de H2

y 2 de CO2, las anaerobias estrictas producen 4 de H2por mol de glucosa:

C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2 CO2+ 2 H2

Utilizando melaza de caa se producen 1.58 moles de CO2/mol de sustrato (Nath

& Das, 2004), la melaza es el sustrato ms utilizado como fuente de carbono dado

a que es considerado materia de desecho y tiene un bajo costo.

Las melazas se obtienen como un subproducto final en la elaboracin del azcarde caa, es una mezcla compleja que contiene azcares fermentables (sacarosa,

glucosa, fructosa y rafinosa), azcares invertidos, sales y otros compuestos

solubles (Fajardo-Castillo & Sarmiento-Forero, 2007), en la Tabla 2 se muestra la

composicin de la melaza de caa de azcar obtenida de un proceso estndar:

Tabla 2 Composicin nutricional de la melaza de caa de azcar.

Componente ConstituyenteContenido

(% en 100g)

Componentes mayores

Materia seca 78 %

Protenas 3 %

Sacarosa 6063 %

Azcares reductores 35 %

Sustancias disueltas 48 %

Agua 16 %

Grasa 0.40 %

Cenizas 9 %

Minerales

Calcio 0.74 %

Magnesio 0.35 %

Fsforo 0.08 %


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Potasio 3.67

Aminocidos

Glicina 0.10 %

Leucina 0.01 %

Lisina 0.01 %

Treonina 0.06 %

Valina 0.02 %

Colina 600 ppm

Niacina 48.86 ppm

Vitaminas

c. Pantotnico 42.90 ppm

Piridocina 44 ppm

Riboflavina 4.40 ppm

Tiamina 0.88 ppm(Swan & Karalazos, 1990)

Sin embargo, adems de las melazas, existen otras fuentes de carbono de fcil

aprovechamiento como el polvo de cocoa, que aunque no es considerado un

material de deshecho, tiene un aporte energtico importante (Gabis, et al., 1999),

el polvo de cocoa, es un producto obtenido por transformacin mecnica de los

granos de cocoa (Theobroma cacao), una vez que se obtuvo la manteca, contiene

del 936 % de grasa, menos del 8 % de humedad y su pH vara entre 5.5 6.2

(cocoa cida) o 7.08.0 (cocoa alcalina) en la Tabla 3 se muestra la composicin

del polvo de cocoa (Camu, et al., 2007).

Tabla 3 Composicin nutricional del polvo de cocoa.

Componente ConstituyenteContenido

(g/100g)

Componentes mayores

Grasa 3 g

Carbohidratos 63.36 g

Azcares 44.89 g

Protena 16.10 g

Minerales Sodio 1.12 g


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Calcio 0.576 g

Hierro 0.004 g

Zinc 0.003 g

Fsforo 0.893 g

Potasio 2.7 g

Yodo 0.003 g

Magnesio 0.208 g

Vitaminas

Niacina 0.0018 g

Vitamina B1 0.27 mg

Vitamina B12 1.62 g

Vitamina B2 1.40 mg

Vitamina B3 1.08 mgVitamina B5 3.83 mg

Vitamina B6 0.32 mg

Vitamina B9 15 g

Vitamina C 1.80 mg

Vitamina E 0.43 mg

Vitamina K 9.10 g

(Camu, et al., 2007)

En Nieto y Chegwin (2010), se compar el uso el polvo de cocoa como fuente de

carbono y melaza de caa para el cultivo de hongos, obteniendo 20% mayor

crecimiendo para el cultivo con cocoa respecto al medio con melaza y Osorio et.

al. (2008) obtuvo un 11.5 % en el crecimiento de Mucor mieheiutilizando medios

de cultivos con polvo de cocoa con respecto a la melaza de caa.

Por lo anterior el polvo de cocoa es una fuente de carbono que aunque no es un

material propiamente de deshecho provee nutrientes asimilables para el

crecimiento de hongos y bacterias con un mayor rendimiento con respecto a la

melaza de caa (Osorio, et al., 2008).


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2.7 Tecnologas de MEOR en el mundo.

En pases como Estados Unidos, Australia, China, Rumania y Rusia se han

evaluado y probado una amplia variedad de tcnicas MEOR, mismas que van de

la inyeccin de microorganismos seleccionados o de la inyeccin de medios de

cultivo con fuentes de carbono complejas como melaza de caa, las cuales

incrementan la produccin de los metablitos de inters anteriormente

mencionados (Muoz-Colunga, et al., 2009). En la mayora de los casos se ha

reportado una recuperacin del hidrocarburo de un 13 a un 30% (Vargas, et al.,

1999). En la Tabla 4 se muestran los porcentajes de recuperacin de crudo por

algunos pases que han aplicado los metablitos microbianos en MEOR (Bao, et

al., 2009):

Tabla 4 Pases que han realizado pruebas utilizando el metablitosmicrobianos involucrados en tcnicas de MEOR.

(Bao, et al., 2009; Behllgil & Mehmetolu, 2002; Bryant, et al., 1993; Vargas, et al., 1999).

Investigaciones previas han encontrado que el proceso de MEOR es aplicable en

un 40 a 50% de los yacimientos petroleros de Amrica puesto que las condiciones

para poderlo llevar a cabo en un yacimiento pueden ser restrictivas dado el tipo de

roca, la temperatura del pozo, profundidad y caractersticas del crudo (Zhang, et

al., 1999).

Actividad de inters Ciudades/Pas Recuperacin (%)

Produccin de CO2y solventes. Ankara, Turqua 19.4

Produccin de tensoactivos y cidos. Oklahoma, E. U. A. 20

Produccin de biopolmeros. Santander,

Colombia

28

Inyeccin de nutrientes selectivos. Shengli, China 11.4


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Hoy en da se puede decir que estas tcnicas MEOR pueden incrementar la

produccin de hidrocarburos hasta en un 25% y disminuir los costos de

recuperacin y operacin de extraccin secundaria de una manera muy

perceptible (Muoz-Colunga, et al., 2009).

2.8 Sitio de estudio

En la regin denominada Paleocanal de Chicontepec se encuentra el 38.2% de las

reservas totales del pas y el 86% de la regin norte, el yacimiento se conoce

desde 1926 y se sabe que el crudo est atrapado dentro de pequeos

compartimentos de roca fragmentada por lo que resulta muy difcil extraerlo de la

manera primaria; slo se ha explotado una mnima parte de la enorme reserva,posee una superficie aproximada de 3815 km2, su profundidad vara entre 800 y

2400 m y el intervalo de temperatura se encuentra entre 65 y 75C (PEMEX,

2011).

Chicontepec est dividido en 29 campos y es altamente laminado compuesto por

finas intercalaciones de areniscas y arcillas. Su valor de porosidad media se

encuentra alrededor del 11% con un amplio rango de permeabilidades que oscilan

entre 0.1 md hasta 15 md, con un promedio de 0.4 md. Como parte de este

yacimiento se encuentra el pozo denominado Coyotes 332 el cual fue designado

para este estudio, en la Fig. 4 se muestra la ubicacin geogrfica del sitio de

estudio.


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Figura 4 Ubicacin de la zona de estudio en el paleocanal de Chicontepec.(PEMEX, 2005).

El pozo Coyotes, se encuentra localizado en el rea norte de Chicontepec, este se

encuentra localizado cerca de la ciudad de Poza Rica en la provincia Norte de

Veracruz, Mxico, las formaciones en este campo son muy compactas y con baja

permeabilidad (Gutirrez, et al., 2009).


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aptulo III


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Captulo III IBT Ginesa E. Arenas Isaac


Justificacin

La creciente necesidad de buscar alternativas para el incremento de la produccin

del sector petrolero mexicano, ha motivado la bsqueda de alternativas de alto

rendimiento y econmicamente sustentables, las tcnicas empleadas en aos

posteriores proponen porcentajes de recuperacin de petrleo de un 5% adicional,

al porcentaje de extraccin obtenido de manera convencional.

Dadas las caractersticas geolgicas del paleocanal de Chicontepec, se considera

que la produccin in situ de CO2 por microorganismos provenientes de este

ambiente, es la tcnica ms conveniente para la recuperacin de aceite, el estudio

de medios de cultivo enriquecidos con fuentes de carbono alternativas, ofrece

nuevas posibilidades y para evitar que la produccin de CO2 disminuya por laproduccin microbiana de CH4, se propone el uso de un inhibidor que acte de

manera especfica para estos organismos.


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aptulo IV


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Captulo IV IBT Ginesa E. Arenas Isaac


Hiptesis

Si se emplean microorganismos nativos de pozos petroleros cultivados en medios

de cultivo enriquecidos con fuentes de carbono alternativas e inhibidores

especficos de la metanognesis, se lograr incrementar la produccin de CO2 y

disminuir la produccin de CH4.


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aptulo V


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Captulo V IBT Ginesa E. Arenas Isaac


Objetivos

5.1 Generales.

Evaluar e incrementar la produccin de dixido de carbono (CO2) por bacterias

fermentadoras provenientes del pozo petrolero Coyotes 332 de Chicontepec.

5.2 Particulares.

Caracterizar el metabolismo de los consorcios microbianos provenientes de

muestras del pozo petrolero Coyotes 332.

Obtener bacterias fermentadoras utilizando fuentes de carbono complejas

(melaza de caa y polvo de cocoa).

Evaluar el efecto de la concentracin y tipo de fuente de carbono sobre la

produccin de dixido de carbono (CO2) por el cultivo fermentativo

utilizando cromatografa de gases.

Evaluar el efecto de inhibicin del 2-bromoetanosulfonato de sodio (BES)

sobre la ruta metanognica de un cultivo mixto en la produccin de metano

(CH4) y dixido de carbono (CO2).


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aptulo VI

Materiales y Mtodos


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Captulo VI IBT Ginesa E. Arenas Isaac


Para llevar a cabo la fase experimental se realizaron cultivos de microorganismos

utilizando como inculo el aceite extrado del pozo petrolero Coyotes 332 en

botellas serolgicas de 125 ml selladas hermticamente con sello de goma y aro

metlico, la condicin de anaerobiosis se logr mediante reduccin de los medios

de cultivo y desplazamiento de O2usando N2de alta pureza e incubando a 70 C.

La metodologa para llevar a cabo este estudio se llev a cabo en las siguientes

etapas:

Etapa 1 Anlisis proximal a las fuentes de carbono.

Caracterizacin microbiolgica de la muestra de aceite.

Etapa 2 Obtencin de microorganismos fermentadores a partir de la muestra

de aceite.

Evaluacin de la produccin de CO2 en el medio de cultivo con

melaza (Medio M) y medio de cultivo con cocoa (Medio C).

Etapa 3 Obtencin de microorganismos metangenos.

Evaluacin del efecto de BES como inhibidor de la metanognesis

durante la produccin de CO2.


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ETAPA I

6.1 Anlisis bromatolgico (proximal) del polvo de cocoa y melaza

de caa.

Para evaluar las caractersticas bromatolgicas de las fuentes de carbono

empleadas para los tratamientos se realizaron los siguientes anlisis:

1. % Humedad.

2. % Grasa.

3. pH en solucin.

4. Protena total.

5. Metales (minerales).

Esto se realiz con el fin de comparar las caractersticas reportadas en la

literatura, con respecto a las reales que se manejaron para los experimentos. Las

determinaciones de humedad, grasa, pH y protena total se realizaron conforme a

la tcnica reportada por Lerena, et al., (1998), la determinacin de minerales

(metales) se realiz por espectroscopa de emisin atmica acoplado a un inductor

de plasma (ICP).

6.2 Caracterizacin microbiolgica de la muestra de aceite.

Se caracterizaron los microorganismos por tipo de consorcios cultivables a partir

de la muestra de aceite anteriormente mencionada mediante tcnicas reportadas

en Arce y col. (2006) para el cultivo de microorganismos anaerobios segn su

metabolismo entre los que se han reportado bacterias sulfato reductoras, bacterias

nitrato reductoras, bacterias fierro reductoras y bacterias metanognicas.

Para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en las muestras lquidas

existen diversos mtodos, la estimacin por el mtodo del Nmero ms Probable

(NMP) es ms adecuado para el conteo de bacterias anaerobias, puesto que

permite mantener un ambiente anaerobio dentro de los frascos, sin necesitar de


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sistemas anaerobios ms complejos como cmaras anaerobias (Arce, et al.,

2006).

El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y

actualmente sigue siendo ampliamente utilizado (Hurley & Roscoe, 1983). En un

principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos

en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin

puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y

anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados (Wrenn &

Venosa, 1996; Vester & Ingvorsen, 1998; Kuai, et al., 2001) el desarrollo y detalle

de la tcnica se encuentra en el Anexo 1.

6.2.1 Preparacin de frascos con medio de cultivo base para

microorganismos anaerobios.

Se prepararon los medios de cultivo base para anaerobios basndonos en la

aplicacin de dos principios fundamentales:

1) Exclusin total de trazas de oxgeno en la preparacin y almacenamiento

de los medios de cultivo.

2) Mantenimiento de condiciones reductoras estrictas.

Los medios de cultivo especficos para cada grupo de bacterias anaerobias estn

constituidos por un medio de cultivo mineral en condiciones anxicas, al cual slo

hay que adicionar los aceptores de electrones correspondientes para cada tipo de

microorganismo que se quiere cultivar.

Medio de cultivo base.

En un matraz Erlenmeyer se disolvi en 1L de agua destilada los reactivos listados

en laTabla 5.Una vez disueltos todos los compuestos se obtuvo una solucin con


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tonalidad rosa debido a la resarzurina, el cual es un indicador de que hay oxgeno

presente en el medio.

Tabla 5 Formulacin del medio de cultivo base.

FrmulaCantidad

g/l agua anxica

NH4Cl 1.0 g

KH2PO4 0.3 g

H2PO4 0.3 g

MgCl2 6H2O 0.2 g

NaCl 2.0 g

CaCl2 2H2O 0.1 gKCl 0.1 g

Extracto de levadura 1.0 g

Triptona o peptona 1.0 g

Solucin de

oligoelementos

10 ml

Cistena-HCl 0.5 g

Resarzurina 0.1 % 1 ml

* El procedimiento para la preparacin de la solucin de oligoelementos y del agua anxica seencuentran en el Anexo 2.

Una vez preparada la solucin con los elementos anteriores se ajust el pH a 8

agregando KOH 1N, se adicionaron 35 ml de medio de cultivo base a cada frasco,

se taparon con el septo de plstico y aro metlico en una atmosfera de nitrgeno.

Al finalizar se esterilizaron los frascos con medio de cultivo en autoclave durante

20 minutos a una temperatura de 121C a 15 lb/in2, la fuente de carbono vara

dependiendo del microorganismo a cultivar y se especfica en las secciones

siguientes.


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6.2.2 Procedimiento para el cultivo de bacterias sulfato

reductoras (BSR).

Este mtodo se basa en el cultivo de bacterias sulfato reductoras presentes en la

muestra, en un medio de cultivo mineral utilizando acetato de sodio (C2H3O2Na)

como fuente de carbono y sulfato de sodio como aceptor de electrones. La

formacin de un precipitado negro de sulfuro de fierro resultado de la reaccin de

sulfuro de hidrgeno producido por la reduccin biolgica de sulfatos, con el

cloruro de fierro presente en el medio de cultivo es el indicador positivo de

crecimiento y posteriormente cuantificados por la tcnica del NMP como se

desarrolla en el Anexo 1.

Soluciones y reactivos:

1. Acetato de sodio (C2H3O2Na) 0.15 g/ml.

2. Sulfato de sodio (Na2SO4) 1M.

3. Cloruro ferroso (FeCl2.4H2O) 1.8 mg/ml.

A) Adicin de sustratos y aceptores de electrones.

Se agregaron 35 ml medio de cultivo base, 0.7 ml de la solucin estril de acetato

de sodio, 0.7 ml de solucin de sulfato de sodio y 0.7 ml de cloruro frrico a un

frasco serolgico con septo de goma de 125 ml.

B) Condiciones de cultivo.

Los frascos fueron inoculados con 4 ml de petrleo y se incubaron a una

temperatura controlada de 70C durante 30 das.

C) Anlisis de resultados, indicativo de sulfato reduccin.

Una vez terminado el tiempo de incubacin se determin el nmero de frascos

positivos observando la formacin de un precipitado negro en el medio de cultivo y

posteriormente se cuantifico el crecimiento por la tcnica de NMP.


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6.2.3 Procedimiento para el cultivo de bacterias fierro reductoras

(BFR).

La cuantificacin se basa en el crecimiento especfico de las bacterias reductoras

de hierro presentes en un medio de cultivo anaerobio utilizando acetato de sodio

(C2H3O2Na) como fuente de carbono y Fe3+ como aceptor de electrones. El

cambio de color del medio de cultivo, de amarillo a transparente es indicador

positivo del crecimiento; el color amarillo del medio se debe a la presencia de

citrato de hierro y el cambio a transparente indica la reduccin de Fe 3+a Fe2+.



2. Citrato de fierro (FeC6H5O7) 0.1 g/ml.


Se agregaron 35 ml de medio de cultivo base, 0.7 ml de las soluciones estriles de

citrato de fierro y 0.7 ml acetato de sodio a un frasco con septo de goma de 125

ml.




C) Anlisis de resultados, indicativo de fierro reduccin.

Al trmino del tiempo de incubacin se contaron los frascos positivos por el

cambio de color del medio de cultivo de amarillo a incoloro y se calcul el nmero

de bacterias por la tcnica de NMP.


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6.2.4 Procedimiento para el cultivo de bacterias nitrato

reductoras (BNR).

La cuantificacin se basa en el crecimiento especfico de bacterias nitrato

reductoras presentes en un medio de cultivo anaerobio por la reduccin de

nitratos, empleando acetato como fuente de carbono. El nmero de bacterias se

determin por el mtodo NMP analizando la aparicin de nitritos por la adicin de

los reactivos de Griess Llosvay y polvo de zinc.


1. Acetato de sodio (C2H3O2Na)

0.15 g/ml.2. Nitrato de potasio (KNO3) 50

g/L.

3. cido actico (CH3-COOH) 5N.

4. cido sulfanlico (C6H7NO3S)

8g/L.5. Solucin cida de alfa-

naftilamina (C10H9N) 5g/L.


Se agregaron 35 ml de medio de cultivo base, 0.7 ml de la solucin estndar

estril de nitrato de potasio y 0.7 ml de solucin de acetato de sodio bajo

condiciones estriles y anxicas.



temperatura de 70C durante 30 das.

C) Anlisis de resultados, indicativo de nitrato reduccin.

Al trmino del tiempo de incubacin se realiz la determinacin de nitritos en cada

tubo como se indica en el Anexo 3 y finalmente se contaron los frascos con

reaccin positiva y se calcul el nmero de bacterias por NMP.


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6.2.5 Procedimiento para el cultivo de bacterias metanognicas

(BM).

La cuantificacin se basa en el crecimiento especfico de bacterias metanognicas

en un medio de cultivo base empleando acetato sodio como fuente de carbono. El

indicador positivo del crecimiento es la produccin de metano, el cual es medido

por cromatografa de gases utilizando un detector de conductividad trmica (DCT).

Soluciones y reactivos


A) Adicin de sustratos y aceptores de electrones.Se agregaron 35 ml de medio de cultivo base, 0.7 ml de solucin estril de acetato

de sodio a un frasco con septo de goma de 125 ml.




C) Anlisis de resultados, indicativo de metanognesis.

Al finalizar la incubacin se determin la produccin de metano en los frascos de

cultivo, el gas producido se midi en un cromatgrafo de gases (GOW-MAC)

utilizando un detector de conductividad trmica (TCD). Los sistemas con formacin

de gas son considerados positivos y fueron tomados para determinar el nmero de

bacterias por NMP.


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ETAPA II

6.3 Obtencin de microorganismos fermentadores partiendo de la

muestra de aceite.

Para favorecer el crecimiento de los consorcios fermentadores se prepar un

medio de cultivo tomando como referencia el medio de cultivo base como se

reporta en Arce O., (2006) el cual fue modificado agregando melaza de caa como

fuente de carbono (Hernandez, 2010).

6.3.1 Preparacin del medio de cultivo con melaza (Medio M).

Utilizando la metodologa que se reporta en la seccin 6.1.1 se prepar el medio

de cultivo con melaza de caa al 10% al que denominamos Medio M sustituyendoalgunos elementos de la Tabla 5 de la seccin 6.1.1 por los que se muestran en la

Tabla 6:

Tabla 6 Formulacin del medio de cultivo modificado para el cultivo demicroorganismos fermentadores.

Frmula Cantidad

NH4Cl 0.250 g

KH2PO4 0.140 g

MgCl2 6H2O 1 g

NaCl 30 g

CaCl2 2H2O 0.140 g

KCl 0.335 g



Cistena-HCl 0.5 gResarzurina 0.1 % 1 ml

Melaza al 10 % 10 ml / c 50 ml

NaHCO3 8.5 % 3 ml / c 50 ml

Na2S 2% 1 ml / c 50 ml


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* Las cantidades se disolvieron en 1 L de agua anxica; la melaza, el bicarbonato y el sulfurode sodio se aadieron de manera individual a los frascos en la relacin sealada en la tabla.

Una vez preparado el medio, se agregaron 35 ml de este, en frascos de 125 ml

utilizando un flujo continuo de N2 para mantener las condiciones anxicas, se

sellaron los frascos con el septo de goma y el aro metlico para su esterilizaron en

autoclave durante 20 minutos, a una temperatura de 121C a 15 lb/pulg2 de

presin.

Como inculo se aadi 5 ml de petrleo en los frascos, los cuales posteriormente

se incubaron a una temperatura de 70C, el crecimiento se determin de manera

directa monitoreando la produccin de gas cada 168 h (7 das) tomando 2 ml de la

atmosfera gaseosa de los ambientes e inyectndolos en un cromatgrafo de

gases.

6.3.2 Evaluacin de la produccin de CO2con el medio de cultivo

con polvo de cocoa (Medio C).

Una vez que se obtuvo el grupo de bacterias fermentativas y que iniciaron la

produccin de CO2 utilizando el medio M con melaza, se evalu la adicin depolvo de cocoa como fuente de carbono alternativa.

Se prepar medio de cultivo base con la composicin que se indica en la Tabla 7 y

posteriormente se prepararon 4 series experimentales, tres de ellas corresponden

a medio de cultivo ms polvo de coca al 10, 15 y 20 % (Medio C) y la cuarta con

melaza al 10 % (Medio M) para llevar a cabo la evaluacin de la produccin de

gas en los tratamientos.


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Tabla 7 Formulacin del medio de cultivo de microorganismos fermentadoresadicionado con polvo de cocoa.

Frmula Cantidad

NH4Cl 0.250 g

KH2PO4 0.140 g

MgCl2 6H2O 1 g

NaCl 30 g

CaCl2 2H2O 0.140 g

KCl 0.335 g



Cistena-HCl 0.5 gResarzurina 0.1 % 1 ml

NaHCO3 3 ml/50 ml

Na2S 1 m/50 ml

Polvo de cocoa 10,15 y

20%

10 ml/50 ml

Melaza de caa 10% 10 ml/50 ml

A cada frasco de 125 ml se agregaron 35 ml segn tratamiento correspondiente

obteniendo al final una matriz experimental que se muestra en la Tabla 8:

Tabla 8 Plan de experimentacin para la produccin de CO2 en cultivosfermentativos usando diferentes concentraciones del medio de cocoa.

Tratamiento Medio de cultivo Inculo

1 Medio C 10%R1 Resiembra



4 Medio M 10%R1 Resiembra

5 Medio C 10%R0 No

6 Medio C15%R0 No


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7 Medio C 20%R0 No

8 Medio M 10%R0 No

*La resiembra para los cultivos R1 se tomaron de los cultivos frescos provenientes delaceite; los medios de cultivos rotulados como R0 no fueron inoculados ya que estos setomaron como controles de la produccin de CO

2.

Se utiliz un flujo continuo de N2 para propiciar las condiciones anxicas,

posteriormente se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a una

temperatura de 121C a 15 lb/pulg2de presin.

Terminada la esterilizacin se tomaron 3 ml del cultivo fresco de fermentadoras

como inculo para los tratamientos, estos se incubaron a 70C y la produccin de

gas fue monitoreada cada 168 h (7 das).


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ETAPA III

6.4 Obtencin de microorganismos metangenos.

El cultivo microbiano metangeno se obtuvo de un digestor anaerobio que trabaja

a 35 C y contiene biota mixta utilizada en la degradacin de residuos vegetales

en el cual coexisten bacterias metangenas y fermentativas, el cual esta

constituido principalmente por 3 grupos: Firmicutes(89.5%),Actinobacteria (6.9%),

Bacteroidetes (2.3%). Este cultivo fue proporcionado por el Departamento de

Bioprocesos de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa (UPIBI)

(Garca-Pea, et al., 2011).

Se trabaj con este cultivo ya que la muestra de aceite (petrleo) que fue

proporcionada para los experimentos no se obtuvo crecimiento para este grupo.

Para obtener un cultivo fresco de la muestra de metangenos, se prepar un

medio de cultivo tomando como referencia el medio de cultivo base como se

reporta en Arce, et al., (2006) y Lee, et al., (2009) en la seccin 6.2.5 de este

documento.

Se agregaron 35 ml de medio de cultivo base a cada frasco de 125 ml utilizando

un flujo continuo de N2 para mantener las condiciones anxicas del sistema;

posteriormente se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a una

temperatura de 121C a 15 lb/pulg2de presin.

Una vez esterilizados los frascos como inculo se tom el 10% de la muestra con

respecto al volumen total de medio de cultivo en los frascos, una vez inoculados

fueron incubados a 35C y se monitoreo la produccin de gases (CO2 y CH4)

como indicativo de crecimiento la medicin se realiz cada 168 h (7 das).


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6.4.1 Evaluacin de BES como inhibidor de metanognesis

durante la produccin de CO2.

Para comprobar la hiptesis de que inhibiendo el crecimiento de los

microorganismos metangenos se lograr mantener la produccin de CO2en los

cultivos en tratamientos se prob el 2-bromoetano sulfonato de sodio

recomendado para la inhibicin especfica de la ruta metanognica de bacterias

termfilas (Zinder, et al., 1984; Xu, et al., 2010) mencionada al inicio del

documento.

Una vez obtenido un cultivo fresco de metangenos, se prepar una serie

experimental para evaluar el efecto de la adicin del 2-bromoetano sulfonato desodio (BES) estos sistemas se prepararon bajo las mismas condiciones que se

mencionaron anteriormente, se prepar adems un control bajo las mismas

condiciones sin la adicin del BES. La evaluacin del tratamiento se realiz

midiendo la produccin del CH4 y CO2 producidos por el cultivo cada 168 h

(7das), tomando 2 ml de la atmosfera gaseosa de los frascos e inyectando a un

cromatgrafo de gases.

La concentracin recomendada para una inhibicin eficiente de la ruta

metanognica que utiliza CO2 in vivo es de 0.05 M (Xu, et al., 2009; Zinder, et al.,

1984), con el fin de encontrar una concentracin apropiada para esta aplicacin de

manera ex situ, en este trabajo se probaron tres concentraciones 0.04 M, 0.05 M

y 0.06 M a fin de evaluar el efecto que este inhibidor puede tener para esta

aplicacin.

Preparacin de solucin madre de 2-bromoetano sulfonato de sodio 0.5 M.

1. Agregar 50 ml de agua destilada anxica al matraz Erlenmeyer.

2. Pesar 5.275 g de BES y adicionarlos al matraz.

3. Agregar el agitador magntico y colocar el matraz en la placa en agitacin

hasta que el reactivo se disuelva en el agua.


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De la solucin madre se tomaron las alcuotas en ml como se indican en la Tabla 9

para lograr la concentracin final en el medio de cultivo la cual depender del

volumen total de medio de cultivo e inoculo en los frascos.

Tabla 9 Concentracin en mol (M) del 2-bromoetano sulfonato de sodio en lostratamientos.

Cantidad (ml) Concentracin molar final

(30 ml de volumen total)

2.580 ml 0.04 M

3.333 ml 0.05 M

4.137 ml 0.06 M

* Cantidades en ml que se agreg a los frascos con medio de cultivo y concentracionesfinales en el medio.

Como controles se prepararon sistemas inoculados a los cuales no se les adicion

inhibidor y adems se realiz un tratamiento el cual consisti en aadir el BES en

las mismas concentraciones antes mencionadas a los cultivos productores de CO 2

(bacterias fermentadoras obtenidas en la seccin 6.3) con el fin de evaluar el

efecto que pudiera tener el compuesto inhibidor sobre el grupo fermentativo.

En este ltimo tratamiento, las condiciones de cultivo fueron las mismas a la

seccin 6.3.1, diferencindose en la adicin de las soluciones del BES como se

indic en la Tabla 9, se incubaron a 70C y se monitore la produccin de CO2

cada 168 h (7 das).

6.5 Evaluacin de la produccin de gas y crecimiento de los

cultivos en los tratamientos experimentales.

Una vez preparados los experimentos anteriormente mencionados, se evalu la

produccin de gases en los tratamientos principalmente CO2 y CH4, parmetros

que permite evaluar las fases del crecimiento de los microorganismos.


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Para estas mediciones los tratamientos fueron monitoreados cada 168 h (7 das)

para obtener concentraciones de gas acumulado y representativo de las muestras

iniciando en tiempo 0 h con el primer da de incubacin.

6.5.1 Evaluacin de la produccin de CO2 y CH4.

Cuando se habla de evaluar procesos biolgicos (degradacin de algn

compuesto) por parte de microorganismos un parmetro importante a monitorear

es la produccin de gases, segn sea el microorganismo con el que trabajemos

podemos evaluar CO2, CH4y H2, parmetros efectivos y confiables para evaluar la

actividad microbiana (Oh, et al., 2000).

Para la medicin de estos existen varios mtodos tanto indirectos como directos

(ej. Titulacin, Cromatografa). La cromatografa es un mtodo fisicoqumico de

separacin donde la muestras de desplaza por una fase mvil que puede ser

gaseosa encargada de mover la muestra a travs de una columna donde

permanece estacionario y el cual es medido por un detector que toma una seal y

la manda a un software para su posterior anlisis, la cromatografa ofrece un

mtodo rpido, fcil y preciso para la medicin directa de gases (Skoog, et al.,

2001), sin embargo cuando no se cuenta con uno es fcil recurrir a los mtodosindirectos para su cuantificacin como la titulacin cido-base, como la utilizada en

la respirometra de Bartha, donde un agente alcalino como el hidrxido de sodio

(NaOH), cloruro de bario (BaCl2) retienen el CO2 en forma de carbonato para

posteriormente ser cuantificado por titulacin con cido clorhdrico (HCl) y

fenolftalena como indicador (Kijchavengkul, et al., 2006) .

Las primeras mediciones de CO2 para los cultivos fermentativos se realizaron

utilizando respirmetros tipo Bartha modificados por Luna y Sanchez-Yaez,

(1991), los cuales estuvieron estructurados de un matraz Erlenmeyer de 125 ml, el

cual tenia tena provisto un tapn de goma No. 4 de dnde se le adapt una

manguera cuyos extremos contaba con agujas de 16 x 1.1/4 pulgadas de acero

inoxidable para penetrar los tapones de los frascos y de esta manera evitar que al


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abrir el sistema se perdiera la atmosfera anaerbica y el CO2producido en la Fig.

5 se muestra el montaje final del sistema.

Figura 5 a) Arreglo entre los frascos productores de gas y la solucinrecolectora con NaOH. b) Adicin del BaCl y fenolftalena. c)Titulacin con HCl.

El matraz Erlenmeyer contena una solucin de NaOH al 0.5 N, una vez

recolectado el CO2 de los frascos se agreg la solucin de BaCl2 al 1%, las

cantidades de NaOH y de BaCl2deben ser equitativas, si el matraz contiene 25 ml

de NaOH se deber agregar la misma cantidad de BaCl2; para la titulacin se

agregaron de 3-4 gotas de fenolftalena y se titul con HCl al 0.5 N (Luna &

Snchez-Yaez, 1991).

El CO2producido en mg se calcul con la siguiente frmula:

[( )( ) ( )( )

Ecuacin 1 Frmula para cuantificar la produccin de CO2 en mg. (Luna &Snchez-Yaez, 1991)

Dnde:

ml NaOH= Cantidad en mililitros de la solucin de NaOH en el matraz.

N NaOH= Normalidad de la solucin de NaOH.

ml HCl= Cantidad en mililitros gastados durante la valoracin de HCl.

N HCl= Normalidad de la solucin de HCl.

22= Constante de disociacin del CO2en NaOH.

a)

b) c)


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El seguimiento de la produccin se realiz consecuentemente utilizando un

cromatgrafo de gases GOW-MAC No. 580 equipado con un detector de TCD y la

columna CTR 1. Este mtodo es aplicable para medir el O2, N2 CO2 y CH4 en

sistemas cerrados.

El mtodo de anlisis se realiz conforme a la Tabla 10, estas condiciones son

generales para el uso del detector de conductividad trmica.

Tabla 10 Condiciones de operacin del cromatgrafo de gases.

De la atmsfera (headspace) de los frascos se tom una muestra de 2 ml con una

jeringa tipo semforo para headspace y se inyect al cromatgrafo dnde los

gases de la muestra son acarreados con gas helio (He), y detectados con el

detector de conductividad trmica.

Para la cuantificacin se tomaron las reas de los picos obtenidos en el

cromatograma y posteriormente se calcularon las concentraciones de CO2y CH4

correspondientes presente en los sistemas, utilizando la ecuacin de los gases

ideales:

Ecuacin 2 Ecuacin de los gases ideales. (Arce, et al., 2006)

Condicin

Columna CTR 1 Temperatura ambiente (25 C)

Inyector 40 C

Detector 100 C

Gas acarreador (He) Flujo 30 ml/min

Corriente 125 mAmp


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El resultado en mol CO2/ml del sistema, se calcul de la siguiente forma:

Ecuacin 3 Produccin de CO2en moles/ml. (Arce, et al., 2006)

Dnde:

%CO2= rea del pico de CO2en porcentaje.

P= presin atmosfrica (atm).

V= volumen de la atmsfera de los sistemas a medir (L).

R= constante de los gases (0.082205 L * atm / mol * K).

T= temperatura del sistema ( K).

ml = mililitros de la muestra.

Para la cuantificacin de CH4 se utiliz la misma frmula, en este caso la

sustitucin fue del porcentaje de rea del pico de CH4. El resultado en mol CH4/ml

del sistema, se calcul de la siguiente forma:

Ecuacin 4 Produccin de CH4en moles/ml. (Arce, et al., 2006)

Dnde:

%CH4= rea del pico de CH4en porcentaje.

P= presin atmosfrica (atm).

V= volumen de la atmsfera de los sistemas a medir (L).

R= constante de los gases (0.082205 L * atm / mol * K).

T= temperatura del sistema ( K).

ml= mililitros de la muestra.


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aptulo VII

Resultados


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Captulo VII IBT Ginesa E. Arenas Isaac


Etapa I

7.1 Anlisis proximal al polvo de cocoa y melaza de caa.

Con el fin de conocer y evaluar las caractersticas de las materias primas

utilizadas en el presente estudio, se realizaron los anlisis de pH, contenido de

grasas, protena total, algunos metales y humedad a estos materiales. Dicha

informacin se considera valiosa ya que la composicin de un medio de cultivo es

determinante en el metabolismo de los microorganismos a estudiar. En la Tabla 11

se presentan los resultados obtenidos de este anlisis.

Tabla 11 Anlisis proximal del polvo de cocoa y melaza de caa.

Melaza decaa

Polvo deCocoa

Humedad (%) 7.57 1.25

Grasa (%) 0.77 14.63

Protena (%) 3 16.01

pH 5.64 5.91

Metales (ppm) Se 0.003 0.01

Ca 3.20 13.21

P 11.61 0.75

Sr 0.03 0.006

Sb 0.06 0.05

Sn 0.03 0.03

B 0.02 -

Na 0.26 1.7

Al 0.52 0.23

Cr 0.009 -

Cu 0.06 -

Fe 0.45 0.66

K 37.38 91.62

Mg 10.09 5.66


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Ni 0.03 -

Zn 0.08 -

(-) No detectado.

El porcentaje de grasa de la melaza es menor (0.77 %) con respecto al del polvode cocoa (14.63 %) sin embargo, en ambos casos el contenido de grasa es ms

alto al que reporta Camu, et al., (2007) y Swan y Karalazos, (1990) en el caso de

la cocoa este datos es importante ya que este contenido de grasa puede

compensar la baja concentracion de azucares; las grasas, adems de los

azcares proveen una fuente de carbono y energa para los microorganismos. Por

otro lado, el contenido de humedad favorece la actividad de agua, la cual a su vez

facilita el crecimiento de los microorganismos; la protena provee la cantidad de

nitrgeno que los microorganismos necesitan para su metabolismo, el nitrgeno es

la molcula principal para la sntesis de algunas enzimas y protenas que las

clulas necesitan para su crecimiento; altas concentraciones de protena

garantizan este crecimiento.

El pH medido en solucin para ambas fuentes de carbono es cido, por lo que al

aadirlas al medio de cultivo ocasion una disminucin del pH del medio,

situacin que requiri realizar un ajuste con KOH 1 N buscando mantenerlo entre

8 y 8.5, el cual se considera el pH ptimo para el crecimiento de microorganismos

(Arce, et al., 2006; Bao, et al,, 2009; Belyaev, et al., 2004).

El anlisis de metales muestra que existe un mayor contenido de estos en la

melaza con respecto al polvo de cocoa, siendo este contenido mayor al que se

reporta en la literatura (Nieto y Chegwin A., 2010); en el polvo de cocoa tambin

se encontr una mayor cantidad a la reportada por Camu et al, (2007); hecho quees favorable para la cocoa, ya que es importante que los minerales esenciales

como potasio (K), Calcio (Ca), Hierro (Fe) se encuentren presentes, pues son

determinantes para el crecimiento de los microorganismos, su presencia en un

medio de cultivo favorece muchos procesos bioqumicos de la clulas; estos

minerales en su forma inica actan como catalizadores de la hidrlisis de


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diversos compuestos orgnicos. Normalmente las soluciones de oligoelementos

(minerales) se preparan utilizando la formulacin que se presenta en la Tabla 12,

estos elementos proveen al medio de cultivo los minerales que las clulas

requieren para su funcionamiento.

Tabla 12 Composicin de la solucin con oligoelementos.

Compuesto Cantidad g/L

MgCl2 6H2O 2.5 g

MnCl2 4H2O 0.6 g

NaCl 1.0 g

FeCl2 4H2O 0.1 g

CoCl2 6H2O 0.1 g

AlCl3 0.01g

H3BO3 0.01g

Na2MoO4

2H2O

0.01 g

CuCl2 2H2O 0.01g

CaCl2 2H2O 0.1 g

ZnCl2 0.1 g(Arce, y otros, 2006)

7.2 Caracterizacin de los grupos microbianos presentes en

muestras de aceite.

En botellas serolgicas de 125 ml se prepararon los medios de cultivo selectivos

para cada grupo microbiano (bacterias sulfato reductoras BSR, fierro reductoras

BFR, nitrato reductoras BNR, fermentativas y metanognicas) segn se report en

la seccin 6.1, as como su cuantificacin utilizando la metodologa de nmero

ms probable (NMP). El ambiente de anaerobiosis se logr mediante la reduccin

del medio de cultivo usando N2, los sistemas fueron incubados a 70C durante 30

das.


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A partir de la muestra de aceite solo pudo recuperarse el grupo de bacterias

fermentativas cuyo crecimiento fue evaluado mediante la produccin de CO2.

Algunas de las razones por las cuales nicamente el grupo fermentativo pudo

obtenerse se pueden relacionar al largo periodo de almacenamiento de la muestra

previo a su anlisis, pues la muestra fue colectada durante el mes de Octubre de

2010; adems de que el grupo restante de microorganismos (BSR, BNR, BHR,

Metanogenas) tienen un metabolismo muy estricto. El grupo fermentativo

recuperado a partir de la muestra de aceite fue utilizado para la realizacin del

presente estudio.


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Etapa II

7.3 Cultivo de bacterias fermentadoras a partir de una muestra de

aceite.

Siguiendo la metodologa reportada en la seccin 6.3 se evalu el crecimiento de

los consorcios fermentadores en 16 frascos serolgicos de 125 ml, midiendo la

produccin de CO2 y utilizando un medio de cultivo a base de sales minerales,

como fuente de carbono se utiliz melaza de caa al 10%, tomando como inculo

una muestra de aceite de 5 ml. En paralelo se prepar un sistema control que

consisti en medio de cultivo sin aceite con el fin de descartar una potencial

contaminacin y evidenciar que, en ausencia de aceite/inoculo, no tiene lugar la

produccin de gas.

En la Fig. 6 se muestra una fotografa de los microcosmos empleados durante la

experimentacin. La primera medicin de gas se llev a cabo utilizando un

respirmetro tipo Bartha modificado (ver seccin 6.5.1).

Figura 6 Fotografa de los microcosmos que contienen medio de cultivo

adicionado con melaza de caa e inoculado con una muestra deaceite.

En los sistemas inoculados con 5 ml de aceite y con melaza de caa como fuente

de carbono; se logr obtener al grupo de bacterias fermentadoras cuya produccin

de CO2se muestra en la Grfica 1; donde se puede observar que la produccin de


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CO2 tiene lugar en el tratamiento que fue inoculado con la muestra de aceite, el

sistema control que no fue inoculado o adicionado con la muestra de aceite no

present produccin de CO2. Con base en lo anterior se descarta la contaminacin

del medio de cultivo y la produccin abitica de este gas.

Grfica 1 Produccin de CO2 en el microcosmos que contiene el medio de

cultivo adicionado con melaza e inoculado con la muestra de aceite.Control, cultivo sin inoculo; Incubacin a 70 C por 91 das.

En la Grafica 1 se observa tambin que durante los primeros 14 das, la

produccin de CO2fue lenta, lo anterior puede deberse a que los microorganismos

se estaban adaptando al nuevo medio alcanzando una produccin de 1.98 mg/ml

de CO2, se observa tambin que la produccin de CO2 increment en forma

importante a partir del da 21 hasta los 70 das, con una produccin mxima de

11.41 mg/ml; a partir del da 71 y hasta los 91 das, la produccin CO2alcanz unafase estable de produccin.

Durante esta etapa de la experimentacin, se realiz una resiembra de los cultivos

en crecimiento sin utilizar aceite, en su lugar se tom como inculo una alcuota de

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98

C

O2mg/ml

Das

CO2

Control


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los medios de cultivo con edad de 20-25 das. Como se observa en la Grfica 2,

este lote experimental present problemas de contaminacin, esto es, los cultivos

control, los cuales no fueron inoculados y contenan nicamente medio de cultivo

estril presentaron crecimiento y produccin de gas.

En la Grfica 2 se observa la produccin de CO2por el sistema control, alertando

sobre el problema de contaminacin por lo tanto al da 40 se detuvo la

experimentacin en este lote.

Grfica 2 Produccin de CO2 de la primera resiembra sin aceite que presentcontaminacin. Control, cultivo sin inculo; incubacin 70C por 42das.

Debido a la perdida de los cultivos, nuevamente se volvi a sembrar la muestra de

aceite utilizando el medio de cultivo descrito anteriormente. Los sistemas se

incubaron a 7

Tesis - Poblacion Microbiana

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