TESIS - ciatej.repositorioinstitucional.mx Viviana... · Efecto de la temperatura y tiempo de...

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO

MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

EN LA ESPECIALIDAD DE

PROCESOS AGROINDUSTRIALES

PRESENTA

Q. LIZZIE VIVIANA BAAS DZUL

OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

POLIFENÓLICOS CON ACTIVIDAD

BIOLÓGICA A PARTIR DE HARINAS

ELABORADAS CON SUBPRODUCTOS DE

LIMON ITALIANO

ACADÉMICO DE

MÉRIDA, YUC. 26 DE FEBRERO 2014.

TÍTULO

I

TÍTULO

OBTENCIÓN DE EXTRACTOS POLIFENÓLICOS CON

ACTIVIDAD BIOLÓGICA A PARTIR DE HARINAS

ELABORADAS CON SUBPRODUCTOS DE LIMON

ITALIANO

Presenta: Q. Lizzie Viviana Baas Dzul

Tutor Académico: Dra. Neith Aracely Pacheco López

Tutor en planta: Dra. Ingrid Mayanín Rodríguez Buenfil

Asesor: Dr. Manuel Octavio Ramírez Sucre

RESUMEN

II

RESUMEN

Se estudió el método de extracción de compuestos polifenólicos que permitió la

conservación de la actividad biológica a partir de harinas elaboradas con subproductos de

limón italiano Citrus limón (L). Burns. Para ello, se realizaron secados de subproducto a

diferentes temperaturas y tiempos para la obtención de las harinas, a las cuales se les

determinó el porcentaje de humedad y la concentración de polifenoles totales, con

capacidad antimicrobiana y antioxidante. La temperaturas de 50⁰C a las 21 h presento una

concentración de polifenoles de 23.3 ± 4.1 mg EAG/g b.s con alta actividad biológica,

reportando una concentración mínima inhibitoria (CMI) contra S. typhimurium, S. aureus y

E. coli de 5.8±0.0, 11.7±0.0 y 17.5 ± 8,2 mg EAG/g b.s. respectivamente y un porcentaje de

inhibición del radical DPPH de 93.4±2.5 %. Estos valores determinaron que los

subproductos cítricos fueran secados a estas condiciones, aportando un rendimiento de 15.5

±0.8 g/ 100g de subproducto. Al evaluar la vida de anaquel de la harina de subproducto de

limón italiano, se observó que almacenarla a una temperatura de 25 ⁰C el tiempo de vida

útil seria de aproximadamente dos años y nueve meses y a 30 ⁰C un año y ocho meses. La

harina de subproducto de limón italiano que presento las mejores condiciones de secado,

fue empleada para la extracción de compuestos polifenólicos, esto mediante un diseño

experimental 34, los factores evaluados fueron: solventes (acetona, etanol y metanol),

concentración de solvente (50, 70 y 90%), tiempo (1, 2.5 y 4 h) y temperatura (15, 25 y 40

⁰C). Las variables de respuesta analizadas fueron: concentración de polifenoles y

flavonoides, actividad antioxidante y antimicrobiana. El mejor tratamiento para la

extracción de polifenoles fue favorables al emplear el solvente acetona a una concentración

de 70 % a una temperatura de 25 ⁰C hasta 40 ⁰C por un tiempo de una hora y el mismo

solvente con la misma concentración a una temperatura de 40 ⁰C por un tiempo de dos hora

y media favoreció la extracción de flavonoides. Al igual en este diseño experimental, se

obtuvo que el mejor método de extracción de compuestos polifenólicos con mayor

actividad inhibitoria del radical DPPH resultó ser utilizando el solvente acetona a una

concentración de 50 % hasta 70% a temperatura de 15ºC y tiempo de 1h. Para la CMI de E.

coli, S. typhimurium y S. aureus, se obtuvo que las mejores condiciones seria utilizando el

RESUMEN

II

solvente etanol a una concentración de 90 % a temperatura de 25⁰C hasta 40 ⁰C por un

tiempo de 4h. Al análisis por cromatografía en capa fina los extractos polifenólicos que

presentaron alta actividad biológica se pudo identificar la presencia del compuesto

neohesperidina como compuesto mayoritario y posible responsable de la actividad

biológica.

ÍNDICE DE CONTENIDO

III


TÍTULO .................................................................................................................................. 2

RESUMEN ............................................................................................................................. 3

ÍNDICE DE CONTENIDO .................................................................................................... 5

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ...................................................................................... 9

DEDICATORIAS ................................................................................................................. 14

AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... 15

1. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 1

2.-JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 3

3.-HIPÓTESIS ........................................................................................................................ 5

4.-OBJETIVOS ...................................................................................................................... 6

4.1.-Objetivo General ......................................................................................................... 6

4.2.- Objetivos Particulares ................................................................................................. 6

5.- FUNDAMENTACIÓN ..................................................................................................... 7

5.1. Frutos cítricos .............................................................................................................. 7

5.2 Limón (Citrus limon (L.) Burns) .................................................................................. 7

5.3. Estructura del limón ..................................................................................................... 9

5.4. Subproductos cítricos ................................................................................................. 10

5.5. Pretratamiento de subproductos cítricos. ................................................................... 11

5.6. Secado de alimentos ................................................................................................... 12

5.7. Polifenoles ................................................................................................................. 14

5.7.1. Clasificación de los compuestos polifenólicos.................................................... 15

5.7.2.Ácidos fenólicos ................................................................................................... 15

5.7.3. Estilbenos ............................................................................................................ 17

5.7.4. Lignanos .............................................................................................................. 18

5.7.5. Flavonoides ......................................................................................................... 19

5.7.6. Actividad antioxidante de polifenoles ................................................................. 25

5.7.7 Actividad antimicrobiana ..................................................................................... 27

5.7.8. Degradación no enzimática de polifenoles .......................................................... 29


III

5.7.9. Extracción de polifenoles .................................................................................... 31

5.8. Vida de anaquel ......................................................................................................... 36

5.9. Color .......................................................................................................................... 37

6.- MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 39

6.1. ETAPA I. Elaboración de harina de subproducto de limón italiano ......................... 39

6.1.1. Colecta del material biológico............................................................................. 39

6.1.2. Secado del material biológico para la obtención de harinas de subproducto de

limón italiano................................................................................................................. 40

6.1.3. Determinación de humedad ................................................................................. 40

6.1.4. Extracción y cuantificación de polifenólicos de limón italiano .......................... 41

6.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de extractos de polifenoles ........ 42

6.1.6. Determinación de la capacidad antioxidante de extractos polifenólicos de harina

de subproducto de limón italiano .................................................................................. 43

6.1.7. Color de la harina de subproducto de limón italiano .......................................... 43

6.1.8. Actividad del agua de harina de subproducto de limón italiano ......................... 44

6.1.9. pH de la harina de subproducto de limón italiano ............................................... 44

6.1.10. Acidez titulable total de harina de subproducto de limón italiano .................... 44

6.1.11. Análisis bromatológico de la harina de subproducto de limón italiano con las

mejores condiciones de secado ..................................................................................... 45

6.1.12. Determinación del tiempo de vida útil de harinas de subproducto de limón

italiano ........................................................................................................................... 45

6.2. ETAPA II. Evaluación de la extracción de compuestos polifenólicos en harinas de

subproducto de limón italiano ........................................................................................... 47

6.2.1. Evaluación de los solventes y sus concentraciones, temperaturas y tiempos de

extracción de harina de subproducto de limón italiano previamente seleccionada....... 47

6.2.2 Determinación del contenido total de flavonoides ............................................... 47

6.2.3. Cromatografía en capa fina (CCF) ...................................................................... 48

6.3. Análisis estadístico .................................................................................................... 49

7. RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................................. 50

7.1. Secado de subproductos de limón italiano ................................................................. 50

7.2. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la reducción del porcentaje de

humedad de subproductos de limón italiano empleando el diseño experimental 4 x 8. ... 50


III

7.2.1. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos

polifenólicos de los subproductos de limón italiano. .................................................... 55

7.2.2. Actividad antimicrobiana .................................................................................... 57

7.2.3. Actividad antioxidante ........................................................................................ 60

7.2.4. Color .................................................................................................................... 62

7.3. Evaluación del efecto de las temperaturas de 50°C y 110°C en la reducción de

humedad y concentración de polifenoles de subproductos de limón italiano. .................. 66

7.3.1 .Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos

polifenólicos de los subproductos de limón italiano. .................................................... 69

7.3.2. Actividad antimicrobiana .................................................................................... 71

7.3.3. Actividad antioxidante ........................................................................................ 73

7.4. Propiedades fisicoquímicas de harina de subproducto de limón italiano secadas a 50

y 110 ⁰C a diferentes tiempos. .......................................................................................... 76

7.5. Análisis bromatológico de harina secada a 50 ⁰C por 21 h. ...................................... 78

7.6. Balance de materia y rendimiento.............................................................................. 79

7.7. Vida de anaquel de la harina de subproducto secado a 50 ⁰C por 21 h ..................... 82

7.7.1 Variable de respuesta ........................................................................................... 87

7.7.2 Estimación del tiempo de anaquel de harina de subproducto de limón italiano .. 90

7.8. Evaluación del mejor sistema de extracción de compuestos polifenólicos en harina

de subproducto de limón italiano mediante un diseño factorial 34. .................................. 92

7.8.1. Concentración de polifenoles .............................................................................. 92

7.8.2. Concentración de flavonoides totales .................................................................. 96

7.8.3. Actividad antioxidante de extractos de la mejor harina elaborada de subproducto

de limón italiano. ........................................................................................................... 98

7.8.4. Actividad anticrobiana expresada como la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) de las bacterias E. coli, S. aureus, S. typhimurium, en los diferentes tratamientos

de extracción de polifenoles en harina de subproducto de limón italiano. ................. 101

7.8.5. Cromatografía en capa fina (CCF) .................................................................... 105

8. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 107

9. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 109

10. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 110

11. ANEXO I. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 4X8 .................................... 118

12. ANEXO II. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 2X8 ................................... 119


III

13. ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34 ...................................... 120

14. ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ................................................................... 123

15. ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO ...................................................... 134

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

IV


Índice de tabla

Tabla 1. Clasificación científica de los cítricos ...................................................................... 7

Tabla 2. Composición de frutos cítricos (cifra indican montos por 100g) ............................. 8

Tabla 3. Ácidos hidroxibenzóicos más importantes ............................................................. 16

Tabla 4. Ácidos cinámicos más importantes ........................................................................ 17

Tabla 5. Concentración (mg/kg) de compuestos polifenólicos de subproducto de limón .... 24

Tabla 6. Estudios realizados en la extracción de polifenoles de cítricos .............................. 35

Tabla 7. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado ................... 54

Tabla 8. Concentración de compuestos polifenólicos en extractos de harinas de

subproductos del Limón italiano .......................................................................................... 56

Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos de harina de subproducto de limón italiano

contra las bacterias 1) S. typhimurium, 2) S. aureus, 3) E. coli, a diferentes temperatura (T)

y tiempos (t) de secado ......................................................................................................... 59

Tabla 10. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado ................. 68

Tabla 11.Resultados de la concentración de polifenoles, concentración mínima inhibitoria y

actividad antimicrobiana (porcentaje de inhibición) de extractos de harina de subproducto

de limón italiano secados a 50 ⁰C y 110 ⁰C ......................................................................... 75

Tabla 12. Resultados de color, pH y porcentaje de acidez de harinas obtenidas a 50 ⁰C y

110 ⁰C ................................................................................................................................... 76

Tabla 13. Concentración proximal de harina de subproducto de limón italiano secada a 50

⁰C por 21 h ............................................................................................................................ 79

Tabla 14. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el

secado y el molido ................................................................................................................ 80

Tabla 15. Balance de materia de polifenoles extraídos de harina de limón italiano ............ 80

Tabla 16. Tiempo de vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano ............. 92

Tabla 17. Factor de retención de los compuestos polifenólicos ......................................... 106


IV

Índice de figuras

Figura 1. Sección transversal de un limón. ........................................................................... 10

Figura 2. Curve de secado para un sólido húmedo en aire caliente a temperatura y velocidad

constante (Brennan, J. 2008). ............................................................................................... 13

Figura 3. Clasificación de los compuestos polifenólicos ( D’ Archivio, M. y col., 2007) ... 15

Figura 4. Estructura química del ácido benzoico ................................................................. 16

Figura 5. Estructura química del ácido cinámico ................................................................. 17

Figura 6. Estructura química del a) Resveratrol y b) Piceido ............................................... 18

Figura 7. Estructura química de los lignanos ....................................................................... 19

Figura 8. Estructura química de las diferentes clases de flavonoide .................................... 20

Figura 9. Estructura de grupo funcional de flavonoides con alta capacidad antioxidante. a)

un grupo o-difenolico (estructura catecol), b) un 2-3 doble enlace conjugado con la función

4-oxo y c) grupo hidroxilo en la posición 3 y 5.................................................................... 26

Figura 10. Clasificación de métodos microbiológicos para la detección biológica ............. 28

Figura 11. a) Representación de hue h⁰, croma C* y la luminosidad L*. b) Espacios del

color L*, a*, b ....................................................................................................................... 38

Figura 12. Colecta y almacenamiento del material biológico .............................................. 39

Figura 13. Secado y prueba de humedad de subproductos de limón italiano ....................... 41

Figura 14. Vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano ............................. 46

Figura 15. Esquema de Cromatografía en capa fina de extractos polifenólicos de harina de

subproducto de limón italiano .............................................................................................. 49

Figura 16. Reducción del porcentaje de humedad de subproducto de limón italiano .......... 52

Figura 17. Grafica de Pareto para para el porcentaje de humedad del diseño 4x8 ............... 52

Figura 18. Curvas de secado de las harinas de subproducto de limón italiano .................... 53

Figura 19. Gráfico de medias de la velocidad de secado...................................................... 55

Figura 20. Gráfica de Pareto para a) concentración de polifenoles y b) grafica de

interacción de la concentración de polifenoles ..................................................................... 57

Figura 21. Porcentaje de inhibición de extractos de harina de subproducto de limón italiano

con respecto a las temperaturas a diferentes tiempos de secado .......................................... 61

Figura 22. Gráfica de Pareto para el porcentaje de inhibición del radical DPPH ................ 62


IV

Figura 23. Gráfica de parametros de color a) luminosidad (L*), b) cromaticidad (C*) y c)

de hue (h⁰) de las harinas de subproducto de limón italiano secadas a diferentes

temperaturas.......................................................................................................................... 64

Figura 24. Gráfica de Pareto para a) luminosidad (L*), b) Cromaticidad (C*) y c) hue (h⁰)

.............................................................................................................................................. 65

Figura 25. Reducción del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de limón

italiano .................................................................................................................................. 66

Figura 26. Gráfica de Pareto para el porcentaje de humedad de muestras de harina de

subproductos de limón italiano ............................................................................................. 67

Figura 27. Velocidad de secado de las harinas de subproducto de limón italiano ............... 67

Figura 28. Gráfico de medias de la velocidad de secado...................................................... 68

Figura 29. Concentración de polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano ....... 70

Figura 30. Grafica de Pareto a) concentración de polifenoles totales y b) interacción de

polifenoles totales ................................................................................................................. 71

Figura 31. Grafica de Parateo a) CMI de S.typhimurium, c) CMI de S. aureus y e) CMI de

E.coli y grafica de interacción para b) CMI de S.typhimurium, d) CMI de S. aureus y f)

CMI de E.coli ....................................................................................................................... 73

Figura 32. Gráfico de media para a) porcentaje de inhibición del radical DPPH y b) grafico

de interacción para el porcentaje de inhibición .................................................................... 74

Figura 33. Gráfica de media para a)luminosidad, b)cromaticidad,c) hue, d) pH y e)

porcentaje de acidez.............................................................................................................. 77

Figura 34. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el

secado ................................................................................................................................... 79

Figura 35. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el

secado y el molido ................................................................................................................ 81

Figura 36. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano,

secada a 35 ⁰C por 106 días. a) concentración de polifenoles y porcentaje de inhibición del

radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua (Aw), c) pH y porcentaje de

acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli ........................................................ 83

Figura 37. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano,

secada a 60⁰C por 53 días. a) concentración de polifenoles y porcentaje de inhibición del


IV

radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua (Aw), c) pH y porcentaje de

acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli. ....................................................... 85

Figura 38. Grafica de a) luminosidad, b) cromaticidad y c) hue de harina de subproducto de

limón secada a35 y 60 ⁰C ..................................................................................................... 86

Figura 39. Harina secada por un tiempo de 106 días a una temperatura de 35 ⁰C ............... 88

Figura 40. Harina secada por un tiempo de 53 días a una temperatura de 35 ⁰C ................. 89

Figura 41. Vectores en función del tiempo para las temperaturas de 35 y 60 ⁰C................. 90

Figura 42. Gráfico del ln k en función de 1/T ...................................................................... 90

Figura 43 . Gráfico del log vida útil en función de las temperaturas ................................... 91

Figura 44. Concentración de polifenoles totales con respecto al tiempo a diferentes

solventes y concentración de solvente, en muestras de harina de subproducto de limón

italiano. La figura a) presenta la concentración de polifenoles totales en extractos obtenidos

a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ........................................................................ 94

Figura 45. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto,

b) interacción concentración del solvente x tipo de solvente y grafica de media en la

concentración de polifenoles a diferente c) concentración de solvente, d) temperatura y e)

tiempo. .................................................................................................................................. 95

Figura 46. Concentración de flavonoides totales con respecto al tiempo a diferentes

solventes y concentración de solventes, en muestras de harina de subproducto de limón

italiano. La figura a) presenta la concentración de flavonoides totales en extractos obtenidos

a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ........................................................................ 97

Figura47. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto

y grafica de media para concentración de polifenoles a diferente b) temperatura, c)tiempo,

d)concentración de solvente y e) tipo de solvente ................................................................ 98

Figura 48. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenólicos de harina

de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo a diferentes solventes y

concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración de polifenoles totales en

extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ..................................... 100

Figura 49. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) diagrama de

pareto, b) grafica de interacción temperatura-concentración de solvente y grafica de media


IV

para el porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenolicos obtenidos a

diferente c) concentración, d) solvente y e) tiempo............................................................ 101

Figura 50. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con

respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta

la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s) de E.coli a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25

⁰C y c) 40 ⁰C. ..................................................................................................................... 102



la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s) de S.aureus a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25

⁰C y c) 40 ⁰C. ..................................................................................................................... 103



la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s) de S.typhimurium a temperatura de a) 15 ⁰C,

b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C. ............................................................................................................ 104

Figura 53. Cromatofolio de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón

italiano. Bajo luz ultravioleta (UV). 1 y 4) extracto con acetona, 2 y 5) extracto con etanol,

3 y 6) extracto control, 7) Neohesperidina, 8) Hesperidina, 9) Naringina y 10) Ácido

elágico ................................................................................................................................. 106

DEDICATORIAS

V

DEDICATORIAS

A Dios por regalarme esta vida y darme la oportunidad de poder culminar una

etapa más en mi vida profesional.

A mis padres por el amor, esfuerzo y paciencia que me han tenido a lo largo

de mi vida.

A Manuel, Oscar, Susana, Davidcito y Cesar por estar a mi lado en los

momentos de estrés y sobre todo por sus consejos y muestras de cariño.

Aquellas personas que creyeron en mí, y me brindaron su tiempo y apoyo

incondicional.

AGRADECIMIENTO

VI

AGRADECIMIENTO

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.

(CIATEJ) Unidad Sureste, por facilitarme las instalaciones y equipos para la realización de

esta tesis.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por la beca otorgada con

número de apoyo 290733

Al Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT-

Gobierno del Estado de Yucatán, por el apoyo a través del proyecto, “Aprovechamiento

integral de los subproductos de la industria citrícola del Estado de Yucatán para la

obtención de metabolitos de alto valor agregado”, con clave: Yuc-2011-C09-69165.

A la Dra. Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil por su paciencia, conocimientos transmitidos

y sabios consejos durante la realización de este trabajo.

A la Dra.Neith Aracely Pacheco López por su amistad, conocimientos invaluables que me

brindo para llevar a cabo esta investigación, y sobretodo su gran paciencia para esperar a

que este trabajo pudiera llegar a su fin.

A la Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras y el Dr. Manuel Octavio Ramírez Sucre,

por su contante apoyo y colaboración en la realización de la tesis.

A los miembros del jurado Dra. Teresa del Rosario Ayora Talavera, M. en C Tania

Gonzáles Flores y el Dr. Ulises García Cruz por las valiosas contribuciones que hicieron al

trabajo final y por el tiempo que dedicaron para revisarlo, aun a pesar de tantas actividades

que los ocupan

A los investigadores del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del

Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ) Unidad Sureste, por sus correcciones y recomendaciones

para este trabajo.

AGRADECIMIENTO

VI

A mis amigos y compañeros por su colaboración desinteresada.

A todas esas personas que de una u otra manera contribuyeron a la realización de este

trabajo.

ANTECEDENTES

1

1. ANTECEDENTES

En México la citricultura representa una actividad de gran importancia dentro de la

fruticultura nacional. Con una producción anual de 7.1millones de toneladas de fruta, y un

valor estimado de 8,050 millones de pesos, lo que sitúa a nuestro país en el quinto lugar en

producción de cítricos a nivel mundial. De esta producción la gran mayoría es de naranja y

limón, seguido de mandarina, tangerina, toronja, lima y limón real (SIAP 2014).

En la región sureste del país, Yucatán es el principal productor y proveedor de cítricos con

una alta demanda que se ve reflejada en el mercado interno, en la industria y la exportación.

El empleo de estos frutos cítricos en la industria procesadora genera diversos productos

como jugos embotellados y los aceites esenciales que son utilizados principalmente como

potenciadores del sabor de alimentos (refrescos, helados y golosinas), así como en la

fabricación de perfumes. Así mismo genera subproductos como cascara, semilla y bagazo

que no son aprovechados industrialmente y son desechados a los alrededores (SAGARPA

2014).

Estos productos y subproductos obtenidos de la industria citrícola son conocidos por su alto

contenido de moléculas bioactivas. En particular la cáscara y pulpa son una fuente de fibra

dietética ya que proporcionan una cantidad equilibrada de la fracción soluble en agua

(Russo, M. y col., 2014). Además contienen compuestos de interés industrial como los

polifenoles, flavonoides, limonoides, ácidos fenólicos, cumarinas, polimetoxiflavonas y

carotenoides, los cuales pueden presentar actividad biológica. Es por ello, que el

aprovechamiento de los subproductos generados a partir del procesamiento de cítricos es de

gran importancia comercial ya que las propiedades biológicas que pudieran presentar tales

como la capacidad antimicrobiana, antioxidante y antifúngica, los hacen excelentes

prospectos para ser usados como aditivos en la industria alimentaria para el desarrollo de

productos funcionales (Giovanna, C. y col., 2014) e incluso pueden ser empleados como

base para forraje o alimento para ganado (SAGARPA 2014).

ANTECEDENTES

2

Por lo anterior, el estudio del aprovechamiento de los subproductos generados de la

industria citrícola , para la obtención de harinas que permitan un mejor almacenamiento de

los mismos, así como la evaluación de métodos de extracción que permitan la recuperación

de polifenoles que conserven la mayor actividad biológica es de gran interés.

JUSTIFICACIÓN

3

2.-JUSTIFICACIÓN

En Yucatán, el principal centro de industrialización de cítricos es la Juguera de Akil, la cual

pertenece a la Unión de ejidos citricultores del sur del estado; los subproductos generados

en forma de cáscaras, bagazo y semillas son cercanos al 65 % del peso total del fruto

procesado y solo cerca del 10 % se comercializa a pequeños productores para la

elaboración de compostas y alimento para ganado, el resto se acumula a los alrededores de

la juguera generando severo daño ambiental. Con base a lo anterior, y considerando que en

el estado de Yucatán la citricultura forma parte fundamental de la economía, la producción

y el procesamiento industrial, se ha decidido estudiar los subproductos del limón italiano

(cascara, bagazo y semilla) sabiendo que este fruto ocupa el primero lugar en producción

con respecto a su clasificación como limón. Así mismo, los subproductos de limón italiano

son una fuente de fibra alterna a otros productos como los cereales, con el beneficio de

presentar un alto contenido de compuestos bioactivos tales como: polifenoles, carotenoides

y vitamina C, ausentes en otras fuentes de fibra y que presentan propiedades funcionales

como capacidad antimicrobiana y antioxidante que pueden tener efecto beneficioso sobre la

salud, por esto que el estudio de estos desechos es de gran interés.

Derivado de lo anterior, en este trabajo se busca transformar los subproductos de la

industria citrícola de limón italiano a una harina que presente humedad similar o inferior al

15 % tal como lo indica la CODEX para elaboración de harinas, con alto valor nutricional

que podría ser útil para la industria alimentaria o como base para la elaboración de alimento

para ganado, y que particularmente facilite la conservación del residuo y la extracción de

compuestos polifenólicos con actividad biológica.

Si bien existen diversos métodos de extracción de compuestos polifenólicos en los que se

incluyen la extracción con solventes, extracción por microondas y aplicación de fluidos

supercríticos entre otros, el empleo de estos métodos depende de las propiedades físicas y

estructurales de la molécula que se pretende separar, de las características de la matriz en la

que se encuentra, así como el costo, rendimiento y conservación de propiedades funcionales

durante la extracción. Por lo tanto en este trabajo se propone el estudio de la extracción de

los compuestos polifenólicos mediante extracción solido- liquido con solventes orgánicos,

JUSTIFICACIÓN

4

que por su bajo costo y fácil manejo permita la recuperación de extractos polifenólicos con

actividad antimicrobiana y antioxidante que puedan ser utilizados en la industria

alimentaria.

.

HIPÓTESIS

5

3.-HIPÓTESIS

El estudio de las condiciones de secado de los subproductos gastados del limón italiano

Citrus limón (L). Burns provenientes de la industria citrícola del estado de Yucatán

permitirá la obtención de harinas de subproductos que favorezcan la recuperación de

compuestos polifenólicos con actividad biológica. Así mismo el estudio de las condiciones

de extracción sólido-liquido de los compuestos polifenólicos presentes en las harinas,

permitirá la obtención de compuestos que conserven elevada actividad antimicrobiana y

antioxidante para poder ser aplicadas en la industria alimentaria.

OBJETIVOS

6

4.-OBJETIVOS

4.1.-Objetivo General

Determinar el método de extracción de compuestos polifenólicos que permita la mayor

conservación de la actividad biológica a partir de harinas elaboradas con subproductos de

limón italiano Citrus limón (L). Burns.

4.2.- Objetivos Particulares

Determinar las condiciones de secado, para la elaboración de harinas de

subproducto de limón italiano con base en el estudio del porcentaje de humedad,

concentración de polifenoles, actividad antimicrobiana y antioxidante.

Evaluar la vida de anaquel acelerado de las harinas de subproducto de limón

italiano.

Establecer las condiciones de extracción de polifenoles totales en función de la

actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos polifenólicos obtenidos.

Determinar el perfil preliminar de compuestos polifenólicos presentes en los

extractos de harina de subproducto de limón italiano con actividad antimicrobiana.

FUNDAMENTACIÓN

7

5.- FUNDAMENTACIÓN

5.1. Frutos cítricos

El fruto de los cítricos se encuentra dentro de la familia Rutceae dividida en el género:

Citrus, Fortunella y Poncirus, los dos últimos no tienen valor comercial, por lo que el

género Citrus es el que presenta mayor importancia económica. En la tabla 1 se muestra la

clasificación científica (Dugo, G. y col., 2010).

Tabla 1. Clasificación científica de los cítricos

Reino Familia Género

Plantae Rutaceae Citrus

(Dugo, G. y col., 2010).

Por otro parte, el contenido de nutrientes en cítricos es diverso y dispensables en la dieta

humana, es por ello que la tabla 2 se presentan otros componentes importantes como la

humedad, caloría, proteína, lípido, elementos minerales y contenido de vitaminas de cinco

cítricos diferentes (lima, mandarina, naranja dulce, toronja y limón) (Dugo, G. y col.,

2002).

5.2 Limón (Citrus limon (L.) Burns)

Botánicamente el limón es una baya de color verde o amarillo pálido con 5-10 semillas, se

emplea en la cocina para dar un sabor ácido a los alimentos y se produce principalmente

para el mercado, en jugo y como saborizante en bebidas. De manera general, los limones se

cultivan en climas más fríos, como el oeste de Estados Unidos, España, Italia y Argentina.

Sin embargo, también puede adaptarse a climas secos, como Egipto, Irán y la India ((Dugo

y col., 2002). A nivel mundial, México ocupa el primer lugar en producción de limón,

seguido por la Unión Europea, Estados Unidos y Turquía (USDA. 2014). En México, según

el servicio de información y estadísticas Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) de la

SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y

Alimentación), se reportan 4 tipos de limón: agrío o mexicano, persa, italiano y real en este

FUNDAMENTACIÓN

8

a IU

: unid

ad i

nte

rnac

ional

(D

ugo

y c

ol.

, 2

00

2)

Tab

la 2

. C

om

po

sici

ón d

e fr

uto

s cí

tric

os

(cif

ra i

nd

ican m

onto

s p

or

10

0g)

FUNDAMENTACIÓN

9

orden de importancia. A la fecha a nivel nacional, Yucatán ocupa el quinto lugar en

producción con 124 mil toneladas de limón, que equivalen en porcentaje de producción al

0.110 % de limón mexicano, 42.69 % de limón persa y 57.14 % de limón italiano (SIAP

2014).

Estudios realizados han reportado que el limón contienen compuestos químicos naturales,

como los polifenoles (principalmente flavonoides) con capacidad antioxidante y

antimicrobiana (González-Molina, E. y col., 2010), así como otros componentes (vitaminas,

minerales, fibra dietética, aceite esencial y carotenoides). Entre los flavonoides presentes en

el limón se encuentran las flavanonas y flavonas (O´Shea, N. y col., 2012), importantes

para la prevención de enfermedades tal como la obesidad, diabetes, enfermedad

cardiovascular y cáncer (González-Molina, E. y col., 2010).

5.3. Estructura del limón

La estructura del limón es similar a otros frutos cítricos y por lo tanto recibe un nombre

especial: “hesperidio”. Un hesperidio es un fruto carnoso de cubierta endurecida y

compuesto de un pericarpio, el cual comprende tres capas distintas: (ver figura 1):

Exocarpio o flavedo, es la capa más externa del pericarpio y forma la piel exterior

dura de la fruta, en ella se encuentran presentes las glándulas de aceite y pigmentos.

Compuesta principalmente de material celulósico, pero también contiene otros

componentes, tales como aceites esenciales, ceras de parafina, esteroides y

triterpenoides, ácidos grasos, pigmentos (carotenoides, clorofilas y flavonoides),

principios amargos (limoneno), y enzimas. Cuando el fruto cítrico está maduro, las

células del flavedo contienen carotenoides (principalmente xantofila), y en la etapa

de desarrollo, se encuentra la mayor cantidad de clorofila. La región interna del

flavedo es rica en organismos multicelulares con formas esféricas o piriformes, que

están llenos de aceites esenciales (Ahmed y col., 2012).

Mesocarpio o albedo, es la capa media del pericarpio, contiene celulosas,

carbohidratos solubles, pectina y protopectina, flavonoides, aminoácidos y

vitaminas (Ahmed y col., 2012).

Endocarpio es la capa interior del pericarpio (o fruto), que rodea las semillas

directamente y es la parte comestible, dividido en 10-14 segmentos (carpelos)

FUNDAMENTACIÓN

10

separados por finos septos. Cada segmento está compuesto de hasta varios cientos

de unidades llamadas bolsas de zumo o vesículas que contienen el jugo de limón.

Las paredes de las vesículas están compuestas de celulosas, hemicelulosas, pectina,

protopectina, azúcares, flavonoides, y otros componentes menores, tales como

aminoácidos y vitamina C (Ahmed y col., 2012).

5.4. Subproductos cítricos

En la industria citrícola los productos resultantes de la transformación de los frutos (como

el limón italiano) son el jugo, aceite esencial y la cascara. Este último junto con el bagazo y

las semillas, son los residuos industriales y representan el 40-60 por ciento del peso de la

materia cruda (Dugo, G. y col., 2002). La utilización de este residuo es un requisito

fundamental de la industria de procesamiento de frutas, no sólo por razones económicas,

sino también para maximizar los recursos disponibles y producir diversos alimentos nuevos

(Lima, B. y col.2014), evidentemente reduciendo el impacto ambiental grave que esto

podría producir (Dugo, G. y col., 2002).

España es uno de los principales productores y exportadores de frutas cítricas y desde hace

algún tiempo la industria alimentaria ha mostrado un especial interés en la revalorización

de subproductos cítricos, utilizándolos principalmente para alimento animal, debido a su

alto contenido de fibra (Garau, M. y col., 2007). La cual puede ser empleada como buena

fuente de fibra dietética (FD) y el consumirla ayudaría a la prevención de enfermedades

como el estreñimiento, hemorroides e hipercolesterolemia (Lario, Y. y col., 2004).

Exocarpio (Flavedo)

Mesocarpio

(Albedo)

Centro de la columna o

medula

Endocarpio

Semilla

Septas

Figura 1. Sección transversal de un limón.

FUNDAMENTACIÓN

11

La fibra dietética no solo es deseable por sus propiedades nutricionales sino también por

sus propiedades funcionales y tecnológicas (Lario, Y. y col., 2004). O´She, N. y col.,

(2012) mencionan que los valores encontrados de fibra dietética en cascaras de limón fue

de 14 g / 100 g base seca (b.s), en comparación a 7.34 g/100 g b.s. de la fruta pelada en sí.

Del contenido total de la fibra dietética (obtenida de la cascara de limón), 4.93 g/ 100 g b.s

pertenecen a la fibra soluble y 9.04 g/ 100 g b.s pertenecen a la fibra insoluble.

Otros estudios han demostraron que los subproductos cítricos son buena fuente de

compuestos bioactivos; las cáscaras son ricas en metabolitos secundarios tales como aceite

esencial y compuestos fenólicos. Al igual, se ha informado que los residuos cítricos

contienen antioxidantes naturales tales como ácidos fenólicos y flavonoides. Sin embargo,

la composición química y la actividad antioxidante de la fruta entera y subproductos

cítricos pueden variar dependiendo del cultivo y estado de maduración (Moulehi, I. y col.

2012).

González-Molina, E. y col., (2010) mencionan que las semillas del limón contienen mayor

cantidad de eriocitrina, hesperidina y menos cantidad de naringina, mientras que las

cascaras contienen neoriocitrina, neohesperidina, naringina y menor cantidad de narirutina.

5.5. Pretratamiento de subproductos cítricos.

El pretratamiento es un paso importante que se requiere para la conservación de frutas o

para potencializar los subproductos cítricos, esto con la creación de un ingrediente o

producto microbiológicamente estable que permita minimizar la perdida de compuestos

bioactivos (polifenoles, ácidos fenólicos, flavonoides y carotenoides) o al igual que

contribuya a mejoran la salud humana. Algunos métodos de pretratamiento involucrados

para el desarrollo de estos ingredientes o productos son: molienda en húmedo (moler los

subproductos hasta un tamaño de partícula determinado), lavada (lavar los subproductos

para eliminar las sustancias no deseadas) (O´Shea, N. y col., 2012), escaldado (cocción de

los alimentos en agua o liquido hirviendo durante un periodo de tiempo de 10 y 30

segundos), tratamientos químicos (Kuljarachanan, T y col., 2009), y secado (al sol, horno o

liofilizado). Los pretratamientos por escaldado y tratamiento químicos inactivan las

enzimas responsables de la degradación de muchos compuestos activos (Kuljarachanan, T.

y col., 2009). Es por ello que el empleo de estos pretratamientos o la combinación de ellos

FUNDAMENTACIÓN

12

dependerá de los metabolitos y nutrientes disponibles en los subproducto y así poder

elaborar un ingrediente alimentario alto en nutrientes (O´Shea, N. y col., 2012).

5.6. Secado de alimentos

El secado es el método más antiguo de conservación de los alimentos que consiste en

eliminar la mayor parte del agua, lo que inhibe la proliferación de microorganismos y

dificulta la putrefacción. Al igual reduce el peso del alimento y facilita la concentración de

los compuestos presentes en ellos. La razón principal del secado es aumentar la vida útil del

alimento más allá que la del material en fresco, sin la necesidad de un almacenamiento en

refrigeración (Brennan, J. 2008).

Cuando el alimento o subproducto cítrico húmedo se coloca en el seno de una corriente de

aire caliente, el calor se transfiere a la superficie, principalmente por convección. El vapor

de agua formado se lleva desde la superficie de secado a la corriente de aire (Montes, E. y

col. 2008 y Brennan, J. 2008). En un sistema modelo es necesita un material húmedo que

consiste en un sólido inerte humidificado con agua pura, el cual es colocado en una

corriente de aire caliente, flujo paralelo a una de sus caras, donde la temperatura, humedad

y velocidad del aire se mantienen constantes. Se supone que el calor se transfiere al sólido

desde el aire por convección y que el secado tiene lugar solamente por una cara. Si la

velocidad de cambio del contenido en humedad se representa frente al tiempo, como en la

figura 2 puede apreciarse que la curva de secado consistirá en etapas o períodos (Pineda-

Castro, M. y col., 2009 y Brennan, J. 2008).

El la figura 2 se presenta un sistema modelo de secado, representado por A-B, periodo de

adaptación o equilibrio. En este periodo la superficie del sólido húmedo va hacia el

equilibrio con el aire. Por lo general este periodo es corto comparado con el tiempo total del

secado. El periodo B-C es conocido como periodo de velocidad constante, donde la

superficie del sólido está saturada con agua. Como el agua se evapora en la superficie, esta

se mueve desde el interior del solido hacia la superficie, manteniendo el estado de

saturación, en esta etapa la velocidad de secado permanece constante. Esto hace que la

temperatura de la superficie corresponda a la temperatura del bulbo húmedo del aire

(Pineda-Castro, M. y col., 2009 y Brennan, J. 2008). Conforme avanza el secado, el

movimiento del agua hacia la superficie no es lo suficiente para mantenerse en condiciones

FUNDAMENTACIÓN

13

de saturación por lo que el estado de equilibrio de la superficie no se mantiene y la

velocidad de secado empieza a disminuir. El punto C se conoce como el punto crítico. En

este punto, la temperatura de la superficie del sólido sube y se aproxima a la temperatura

del bulbo seco del aire conforme el secado se acerca al final. Para el periodo C-D llamado

velocidad de decrecimiento, la velocidad de secado es gobernada por factores externos que

afectan el movimiento de la humedad del interior del sólido y lo cual provoca la

disminución de la velocidad de secado (Brennan, J. 2008).

Para el estudio de la velocidad de secado se han estudiado numerosos modelos matemáticos

(Pineda-Castro, M. y col., 2009 y Brennan, J. 2008). Que no solo permiten predecir el

mejor proceso, sino que también ofrecen herramientas para predecir las condiciones de

almacenamiento y empaque; además, ayudan a establecer el contenido final de humedad de

los productos agrícolas y los requisitos del proceso de secado (Montes, E. y col. 2008).

Para tener un mejor manejo de los subproductos o alimentos secos es necesario reducir el

tamaño de partícula y esto se logra moliendo el material seco hasta obtener una harina (o

polvo seco) estable con porcentaje de humedad tal como lo indica la norma del CODEX

para harina de trigo (15 por ciento de humedad) y con actividad del agua (aw) de 0.3 y 0.5;

que corresponde a la humedad de la monocapa y permite su conservación a condiciones

ambientales (Schimidt, S. y col., 2013, Ríos, E. y col., 2007).

Garau, C. y col., (2007) estudiaron la cinética de secado de la cascara y el bagazo de la

naranja (Citrus aurantium v. Canoneta). Los cuales fueron secados en un horno

A

t-h

dW dt

K

g/

(Kg s

óli

do

sec

o)

(h) B C

D tc

Figura 2. Curve de secado para un sólido húmedo en aire caliente a temperatura y velocidad

constante (Brennan, J. 2008).

FUNDAMENTACIÓN

14

convencional a temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 ⁰C con una velocidad de secado

de 2 m/s. El secado de los subproductos se llevó a cabo hasta obtener una humedad

constante de 0.12 y 0.11 g H2O/ 100 g b.s. para las cascaras y bagazo respectivamente. En

este trabajo, se obtuvo como resultado que la temperatura de aire de secado tuvo una

importante influencia en la velocidad de secado. Observando que a mayor tiempos de

secado se obtiene bajas velocidad de secado mientras que a temperaturas más altas de

secado se necesita tiempos de secados cortos. Al igual se reportó que el bagazo presento

mayor tiempo de secado que la cáscara. Curiosamente, las muestras de bagazo mostraron

similares tasas de secado cuando el proceso de secado se realizó por arriba de 80 ºC. Por lo

tanto, la cinética de secado a la temperatura de 80 y 90 ºC fue prácticamente superponible,

lo que sugiere que a mayor temperatura de secado no aumento significativamente la

velocidad. Este fenómeno se conoce como efecto de cementación. Ya que impide la

liberación de agua y ralentiza la velocidad de secado, en consecuencia, el secado a mayor

temperatura no promueve ningún aumento adicional a la velocidad de secado.

5.7. Polifenoles

Los compuestos polifenólicos, representan uno de los grupos más numerosos y complejos

metabolitos secundarios de las plantas (Naveda, G. F. 2010 y Romero y col., 2003). Estos

compuestos están conformados por un anillo aromático rodeado de uno o más grupos

hidroxilos y estructuralmente varían desde una simple molécula fenólica a la de una

molécula polimérica compleja (Ignat y col., 2011). Entre sus propiedades podemos

encontrar que son potencialmente saludables en el organismo humano, principalmente

como antioxidante, antialergénico, antinflamatorio, anticancerígeno y como agente

antimicrobiano (Dagnilia, M. 2012). Desde el punto de vista químico la presencia de sus

anillos tipo benceno, se relacionan directamente con algunas características de los

alimentos como son el sabor, color, la palatabilidad y el valor nutricional (Padilla, F. y col.,

2008). La principal fuente de obtención de los compuestos polifenólicos son los alimentos

de origen vegetal como las frutas, verduras, determinadas bebidas (vino, té, zumo de fruta),

cereales y legumbres (Festy, D. 2007).

FUNDAMENTACIÓN

15

5.7.1. Clasificación de los compuestos polifenólicos

Existen varias clases y subclases de polifenoles que se definen en función del número de

anillos fenólicos que poseen y de los elementos estructurales que presentan estos anillos.

Entre los principales grupos se encuentran: flavonoides, ácidos fenólicos estilbenos y

lignanos ver figura 3 (Ignacio y col., 2011).

A continuación se describe cada clase de compuesto polifenolico:

5.7.2.Ácidos fenólicos

Los ácido fenólicos, constituyen alrededor de un tercio de los fenoles dietéticos, y se

encuentran presentes en las plantas en forma libre y unida. Los fenoles unidos pueden estar

vinculados con varios componentes de las plantas a través de éster, éter, o enlace acetal. La

clasificación de este grupo se divide en dos: ácido hidroxibenzóico y ácido

hidroxicinámicos los cuales serán descritos a continuación (Ignat y col., 2011).

a) Ácido hidroxibenzóico

El ácidos hidroxibenzóico tiene una estructura básica C6-C1, como el ácido gálico, p-

hidroxibenzoico, protocatecúlico, vaníllico y siríngico. Al igual es un compuesto de

estructura compleja como los taninos condensados e hidrolizables (Ahmed.y col., 2012).

POLIFENOLES

1.-Ácido fenólicos

2.-Flavonoides

3.-Estilbenos

4.-Lignanos

a) Hidroxibenzóico

b) Hidroxicinámico

a) Flavonas

b) Flavanonas

c) Isoflavonas

d) Flavonoles

e) Antocianinas

f) Flavanoles

Figura 3. Clasificación de los compuestos polifenólicos ( D’ Archivio, M. y col., 2007)

FUNDAMENTACIÓN

16

El contenido de este compuesto en la planta comestible por lo general es bajo salvo en

ciertas frutas rojas, la cebolla o el rábano negro. (Manach, C.y col., 2004). En la figura 4 se

muestra la estructura del ácido benzoico y en la tabla 3, se presentan los grupos que

contienen para la formación de estos compuestos.

Figura 4. Estructura química del ácido benzoico

Tabla 3. Ácidos hidroxibenzóicos más importantes

Nombre del ácido

benzoico

R2 R3 R4 R5

p-hidroxibenzoico H H OH H

protocatéquico H OH OH H

Vaníllico H OCH3 OH H

gálico OH OH OH OH

siríngico H OCH3 OH OCH3

Salicilico OH H H H

gentisico OH H H OH

(Robbins, R. 2003)

b) Ácido hidroxicinámico

El ácido hidroxicinámico es un grupo de compuesto presente en la pared celular del limón,

cuyo principal representante se encuentra el clorogénico, ácido ferúlico, p-cumárico,

cafeico y sinápico (Gonzales-molina, E. y col., 2010), de los cuales el ácido ferúlico y p-

cumárico son los de mayor abundancia en la naturaleza (Martínez M, A. 2005).

Químicamente su esqueleto está formado por un anillo aromático, un grupo alifático y un

ácido carboxílico en el extremo. Es nombrado como ácido hidroxicinámico por la

sustitución del grupo OH en el anillo aromático. Por lo general, este tipo de compuesto se

encuentra esterificado en la pared celular vegetal, por lo tanto, posee una baja solubilidad y

se destaca por ser buen agente antioxidante (Martínez M, A. 2005).

FUNDAMENTACIÓN

17

El grupo de los ácidos hidroxicinámicos se han asociado consistentemente para reducir el

riesgo de enfermedad cardiovascular, cáncer y otras enfermedades crónicas (Dalbem, L. y

col., 2012).

En la figura 5 se muestra la estructura del ácido cinámico y en la tabla 4 se presentan los

grupos que contienen para formar los ácidos hidroxicinámicos.

Figura 5. Estructura química del ácido cinámico

Tabla 4. Ácidos cinámicos más importantes

Nombre del ácido

cinámico

R2 R3 R4 R5

p-cumárico H H OH H

Cafeico H OH OH H

Ferúlico H OCH3 OH H

Sinápico H OCH3 OH OCH3

(Robbins, R. 2003)

5.7.3. Estilbenos

Los estilbenos están constituidos por dos anillos fenilos conectados por un puente de

metileno de dos carbonos (C6-C2-C6). La variación estructural dependerá de la

configuración del doble enlace carbono-carbono, el número de hidroxilos y a medida que el

grupo fenol es sustituido con azúcar, metoxilo, u otros grupos alcoxi (Ferré-Filmon, K. y

col., 2004). Su distribución en los alimentos vegetales no es muy amplia. Sin embargo entre

las principales fuentes dietéticas se encuentran la uva ( D’ Archivio, M. y col., 2007), zumo

de la uva y vino.

Los estilbenos son compuestos con propiedades biológicas, tal como la actividad

antioxidante y la actividad antimicrobiana (Arraki, K. y col., 2013). Entre los compuesto

que presenta mayor interés nutricional se encuentra el resveratrol (3, 5, 4’-

FUNDAMENTACIÓN

18

trihidroxiestilbeno) y el piceido glucósido (resveratrol-3-O-ß-D-glucósido) ambos

estilbenos se pueden encontrar en su forma cis y trans (De la rosa, L. y col., 2010) (figura

6). El resveratrol destaca por ser un compuesto con actividad antitumoral e inhibe

reacciones que incrementan el riesgo de enfermedades coronarias (Manach, C. y col.,

2004).

a) Resveratrol b) Piceido

Figura 6. Estructura química del a) Resveratrol y b) Piceido

5.7.4. Lignanos

Los lignanos nombrados por primera vez por Harworth en 1941, son metabolitos

secundarios encontrados en una gran variedad de plantas que incluyen semillas de lino,

calabaza, ajonjolí, centeno, y en algunas bayas (Collado, J. 2011).Por definición y en

sentido estricto son dímeros de unidades de fenilpropano (C6-C3) enlazadas por el átomo

central de sus cadenas laterales (unión C8-C8´) tal como se muestra en la figura 7 (Boluda,

C y col., 2005).

Los lignanos están siendo estudiados para su posible uso en la prevención del cáncer,

particularmente cáncer de seno. Al igual que otros fitoestrógenos (tales como isoflavonas

de soya), estos se aferran de los mismos puntos de las células donde se sujeta el estrógeno.

Si hay poco estrógeno en el cuerpo (después de la menopausia, por ejemplo), los lignanos

pueden actuar como estrógeno débil; pero cuando el estrógeno natural es abundante en el

cuerpo, los lignanos pueden en su lugar reducir los efectos del estrógeno al desplazarlos de

las células. Este desplazamiento de la hormona puede ayudar a prevenir tales tipos de

cáncer, como cáncer de seno, eso depende de que el estrógeno inicie y se desarrolle.

Además, al menos un estudio de laboratorio sugiere que los lignanos pueden ayudar a

prevenir el cáncer de formas que no están ligadas al estrógeno (Collado, J. 2011).

FUNDAMENTACIÓN

19

Figura 7. Estructura química de los lignanos

5.7.5. Flavonoides

Los flavonoides son compuestos naturales distribuidos en las hojas, semillas, cortezas,

flores y fruto de las plantas, hasta la fecha se han identificado más de 4.000 flavonoides.

Por lo general ayudan a proteger a las plantas contra la luz UV, parásitos fúngicos,

herbívoros, patógenos y daño celular oxidativo. Al igual, son responsables de las

características del color rojo y azul de las frutas, vinos y ciertas verduras (Medic-Ṧaric . M. y

col., 2004).

Estructuralmente los flavonoides están compuestos por quince carbonos arreglados en una

configuración C6-C3-C6. Principalmente la estructura consiste en dos anillos fenilo (A y B)

ligados a través de un anillo C de pirano heterocíclico (figura 8) (Daglia, M. 2012). Los

átomos de carbono individuales de los anillos A, B y C se numeran mediante un sistema

que utiliza números ordinarios para los anillos A y C, y números primos para el anillo B.

De los tres anillos, el A se biosintetiza a través de la ruta de los poliacetatos, y el anillo B

junto con la unidad C3 proceden de la ruta del ácido Shikímico. (Martinez -Flores, S. y col.,

2002).

En su mayoría los flavonoides cítricos se encuentran como glucósidos, pero también

pueden aparecer en forma libre (agliconas flavonoides). Además, se pueden presentar como

sulfatos, dímeros ó polímeros. Los glucósidos de los cítricos pueden encontrarse de dos

formas: como O-glucósidos con los carbohidratos ligados a través de átomos de oxígeno

(enlace hemiacetal), o como C-glucósidos con los carbohidratos ligados a través de enlaces

carbono-carbono. De todas estas formas naturales, los O-glucósidos son los de mayor

presencia (Martinez – Flores, S. y col., 2002). Los carbohidratos presentes en los cítricos

afectan el sabor. Por ejemplo en la toronja el neohesperidósido da el sabor intensamente

FUNDAMENTACIÓN

20

amargo, mientras que en el limón la presencia del rutinosido da el sabor insípido

(Gonzáles-Molina., 2010).

La clasificación de estos compuestos se hace en función del estado de oxidación del anillo

heterocíclico (anillo C) y de la posición del anillo B. Dentro de cada familia existen una

gran variedad de compuestos, que se diferencian entre sí por el número y la posición de los

grupos hidroxilos, y por los distintos grupos funcionales que pueden presentar (metilos,

azúcares, ácidos orgánicos).

Entre los principales subgrupos de compuestos flavonoides se encuentran: flavonas,

flavanonas (dihidroflavonas), isoflavonas, antocianidinas y flavanoles (figura 8) (Martinez

-Flores, S. y col., 2002).

d) Flavanoles

f) Flavonoles

e) Antocianinas

a) Flavonas

b) Flavanonas

c) Isoflavonas

Flavonoide

Figura 8. Estructura química de las diferentes clases de flavonoide

FUNDAMENTACIÓN

21

a) Flavonas

Poseen un grupo ceto en el carbono C4 y una insaturación entre los carbonos C2 y C3. Son

los flavonoides menos abundantes en los alimentos. Sin embargo, podemos encontrarlos

con gran abundancia en el perejil y apio (Ignat, I. y col., 2011). Miyake. Y. col., (1997)

aislaron dos compuestos de C-glucosilflavonas de frutas de limón: Diosmetina 6,8-di-C-

glucosido y Diosmetina 6-C-D-glucosido.

b) Flavanonas

Son análogos de las flavonas con el anillo C saturado y se glucosilan principalmente por la

unión de un disacárido en el carbono C7. Las flavanonas se encuentran presentes en su gran

mayoría en los cítricos. Estos compuestos son localizados en las partes sólidas de las frutas,

en particular en el albedo. Por ello, su concentración es hasta cinco veces mayor en la fruta

que en los zumos.

Las flavanonas presentes en cítricos se encuentran en forma de agliconas y glucosido.

Para las agliconas se encuentra: Naringenina y hesperetina, y como glucosidos:

neohesperidósido (naringenina y neohesperidina) (,Xu, G. y col., 2007) y rutinósido

(narirutina y hesperidina) (Tripoli, E. y col., 2007).

Ignat, I. y col., (2011) reportaron la presencia de eriodictiol en el limón. Compuesto con

mayor actividad antioxidante que todos los glucósidos de flavonoide presentes en el fruto

(Rio, J.A. y col., 2004).

c) Isoflavonas

Poseen un anillo bencénico lateral en posición C3. Su estructura es parecida a la de los

estrógenos. Las isoflavonas poseen grupos hidroxilos en los carbonos C7 y C4’, al igual

que sucede en la estructura molecular de la hormona estriol (uno de los tres estrógenos

mayoritarios junto al estradiol y la estrona). En realidad, las isoflavonas se pueden unir a

receptores de estrógenos, y por ello se clasifican como fitoestrógenos. Se pueden presentar

como agliconas, o a menudo conjugadas con glucosa, pero son termosensibles y pueden

hidrolizarse durante su procesamiento industrial y durante su conservación. Se presentan

casi exclusivamente en plantas leguminosas, siendo la soja y sus derivados la principal

fuente de isoflavonas (Quiñones, M. 2012). En los alimentos la Isoflavonas se presentan en

FUNDAMENTACIÓN

22

cuatro formas: aglicona, 7-O-glucosido, 6´´-O-acetyl-7-Oglucosido y 6´´-O-malonyl-7-O-

glucosido (De la Rosa, L y col., 2010).

d) Flavonoles

Se caracterizan por poseer un grupo ceto en el carbono C4 y una insaturación entre los

carbonos C2 y C3. Poseen además un grupo hidroxilo adicional en el carbono C3.

Representan el grupo más ubicuo de polifenoles presente en los alimentos. La quercetina es

el compuesto más representativo. Las principales fuentes de flavonoles son las verduras y

las frutas. El té y el vino son también alimentos ricos en flavonoles. La biosíntesis de

flavonoles es un proceso fotosintético. Por ello, estos compuestos se localizan

principalmente en el tejido externo y aéreo de la planta. La distribución y la concentración

de los flavonoles puede ser distinta incluso en frutas procedentes de la misma planta; esto

se debe a que la localización de los frutos condiciona la exposición al sol (Quiñones, M.

2012).

Rutina y miricitina son los flavanoles con mayor presencia en el jugo de limón, mientras

que la quercetina y kaempferol se encuentran tanto en cascaras y jugo (Gonzáles- Molina,

E. y col., 2010).

e) Antocianidinas

Químicamente las antocianinas son glicósidos de las antocianidinas, es decir, están

constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un

azúcar por medio de un enlace glucosídico. La estructura química básica de estas agliconas

es el ion flavilio, también llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos

aromáticos: un benzopirilio y un anillo fenólico; el flavilio normalmente funciona como un

catión ( Ioana, I. y col., 2011).

De todas las antocianidinas que actualmente se conocen (aproximadamente 20), las más

importantes son la pelargonidina, la delfinidina, la cianidina, la petunidina, la peonidina y

la malvidina, nombres que derivan de la fuente vegetal de donde se aislaron por primera

vez; la combinación de éstas con los diferentes azúcares genera aproximadamente 150

antocianinas. Los hidratos de carbono que comúnmente se encuentran son la glucosa y la

ramnosa, seguidos de la galactosa, la xilosa y la arabinosa y, ocasionalmente, la

FUNDAMENTACIÓN

23

gentiobiosa, la rutinosa y la sacarosa. Habitualmente unidos en las posiciones 3 y también

5, formando 3-O-glucósidos y 3,5-di-O-glucósidos. Son compuestos hidrosolubles, y

constituyen uno de los grupos más importantes de pigmentos vegetales. Se encuentran

principalmente como heterósidos con los tres anillos de su estructura conjugados. La

glucosilación ocurre principalmente en la posición 3 del anillo C ó en las posiciones 5 y 7

del anillo A. También es posible la glucosilación de las posiciones 3’, 4’ y 5’ del anillo B,

aunque esta glucosilación aparece con menos frecuencia (Collado, G. 2011).

Las antocianidinas están ampliamente distribuidas en la dieta humana. Se pueden encontrar

en ciertas variedades de cereales, en el vino tinto y en algunos vegetales, aunque aparecen

mayoritariamente en las frutas (De la Rosa, L., 2010).

f) Flavanoles

Poseen el anillo C saturado y un grupo hidroxilo en el carbono C3. Pueden aparecer como

monómeros o como polímeros con distintos grados de polimerización. A diferencia de otros

grupos de flavonoides, sus combinaciones de tipo heterosídico (entre el grupo reductor del

azúcar y un grupo tiol) son poco habituales. Los flavanoles más representativos en los

alimentos son de tipo flavan-3-ol (Daglia, M. 2012), y estos pueden aparecer como

monómeros (catequinas), como dímeros condensados entre sí y como oligómeros

(procianidinas), o bien pueden aparecer como polímeros (proantocianidinas o taninos

condensados). Epicatequina y catequina son los compuestos mayoritarios en frutas. Las

catequinas también se encuentran en el vino y en el chocolate (Wiswedel, I. y col., 2004),

que son las fuentes mayoritarias. En cambio, galocatequina, epigalocatequina y

epigalocatequina galato aparecen principalmente en el té. Es bastante complejo valorar el

contenido de proantocianidinas en los alimentos, debido a que poseen un amplio rango

estructural y pesos moleculares muy variables. Los datos mayoritarios disponibles, en

cuanto a la caracterización de estos compuestos, hacen referencia principalmente a dímeros

y trímeros de catequinas, que representan las formas mayoritarias (Quiñones, M y col.,

2012).

En la tabla 5 se presenta la concentración y estructura de compuestos polifenólicos en

subproducto (cascara, semilla y bagazo) de limón.

FUNDAMENTACIÓN

24

Tabla 5. Concentración (mg/kg) de compuestos polifenólicos de subproducto de limón

Compuesto Clase Estructura Cascara Semilla Pulpa

ácido p-

hidroxibenzoico

(ácido 4-

hidroxibenzoico)

Derivado

del ácido

benzoico

54 ±1.6

65±0.9

53±0.9

Ácido cafeico

3-(3,4-

dihidroxifenilo)-2-

ácido propenoico

Derivado

del ácido

cinnamico

31±0.9

98±6.2

25±0.7

Apigenina 6,8-di-C-

glucosido

(5,7,4´-

trihidroxiflavona-6,8-

di-C-β-glucosido)

Flavona-

C

glucosido

273±3.8

323±4.9

231±4.1

Diosmetina 6,8-di-C-

glucosido

(5,7,3´-trihidroxi-4´-

flavona metoxi 6,8-

C-β-glucosido)

Flavona-

C

glucosido

399±6.5

350±7.8

305±6.2

Eriocitrina

(5,7,3´,4´-

tetrahidroxiflavanona

-7-β-rutinosido)

Flavavona

β-

rutinosido

2,670±80.3

2,612±78.9

2,657±72.6

Hesperidina

(5,7,3′- Trihdroxi-4′-

methoxi flavona7- β-

rutinosido)

Flavanona

-O-

glucosido

2,198±56.4

1,443±11.9

2,912±47.3

FUNDAMENTACIÓN

25

Narirutina

(5,7,4′-

trihidroxiflavanona7-

β-rutinosido)

Flavanona

-O-

glucosido

85±2.9

152±1.6

124±2.8

Rutina

(3,5,7,3′,4′-

tetrahidroxiflavanone

3- β-rutinosido)

Flavonol

glicosido

52±1.6 61±4.3 44±2.9

(Russo, M y col., 2014)

5.7.6. Actividad antioxidante de polifenoles

Los compuestos polifenólicos actúan como antioxidantes, por ser capaces de prevenir la

oxidación. Esta propiedad del compuesto dependerá de la oxido-reducción del grupo

hidroxifenólico y la estructura química, sin embargo, en una fruta, la capacidad

antioxidante no está dada simplemente por la suma de las capacidades antioxidantes de

cada uno de sus componentes, sino también por la interacción entre ellos, lo que puede

producir efectos sinérgicos o antagónicos (Abeysinghe D. y col., 2007).

Los antioxidantes protegen el organismo de los radicales libres, moléculas que en su

estructura atómica presentan un electrón no apareado, altamente reactivo y que genera una

reacción REDOX. Son altamente inestables y generan reacciones en cadena. (Cano, A. y

col., 2004).

Algunos ejemplos de tipos de radicales libres son los siguientes:

a)Superóxido (O2.-)

b)Radical hidroxilo (HO.)

c)Radical alcoxilo (R-O2.)

d) Peróxido de hidrógeno (H2O2)

e)Hidroperoxilo (HO2.)

f)Peroxinitritos (ONOO-)

FUNDAMENTACIÓN

26

Estos radicales libres son moléculas altamente reactivas responsables por el daño a lípidos,

proteínas y ácidos nucleicos en la célula. Al igual los radicales libres pueden aumentar el

riesgo al desarrollo de cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades

degenerativas (Alothman, M. y col., 2009). Entre las enfermedades asociadas a los

radicales libres son: arterioesclerosis, diabetes melllitus, envejecimiento, cáncer,

enfermedades respiratorias, hepatopatías, artritis, enfermedades inflamatorias crónicas del

intestino, entre muchas otras más (Abeysinghe, D. y col., 2007).

La función de los antioxidantes es desactivar los radicales libres, minimizando el daño y

protegiendo el organismo de este tipo de enfermedades. En efecto, los grupos fenólicos de

los polifenoles sirven como una fuente fácilmente disponible de "H" tales átomos pueden

reaccionar con los radicales libres y así deslocalizarlos sobre la estructura de los polifenoles

(Tripoli, E. y col., 2007).

La eficiencia de los polifenoles como antioxidantes depende en gran parte de su afinidad

por los radicales y por tanto de su estructura química. Dentro de la estructura existen tres

grupos importantes para la evaluación de su capacidad antioxidante (figura 9):

a) Presencia de estructura O-dihidroxi en el anillo B; que confiere una mayor estabilidad a

la forma radical y participa en la deslocalización de los electrones.

b) El doble enlace en los carbonos 2,3, en conjunción con la función 4-oxo son los

responsables de una deslocalización del electrón en el anillo B.

c) Grupos 3- y 5-OH con función 4-oxo en los anillos A y C son necesarios para ejercer el

máximo potencial antioxidante (Tripoli, E. y col., 2007).

Siguiendo estos criterios, el flavonoide quercetina es el que mejor reúne los requisitos para

ejercer una efectiva función antioxidante (Martínez -Flórez. S. y col., 2002).

b)

c) a)

Figura 9. Estructura de grupo funcional de flavonoides con alta capacidad antioxidante. a) un grupo o-

difenolico (estructura catecol), b) un 2-3 doble enlace conjugado con la función 4-oxo y c) grupo hidroxilo

en la posición 3 y 5

FUNDAMENTACIÓN

27

Algunos compuestos polifenólicos con actividad antioxidante presentes en el limón se

encuentran: la hesperidina, Diosmina y eriocitrina (Del Río, J. y col., 2004). Siendo la

Eriocitrina el compuesto con mayor actividad antioxidante de todos los flavonoides

glucósidos presentes en la fruta.

5.7.7 Actividad antimicrobiana

Los compuestos polifenolicos actúan como agentes antimicrobianos es decir, matan o

inhiben el crecimiento de microorganismos, esto dependerá de la estructura y contenido del

grupo hidroxilo (Tripoli y col., 2007). Los que presentan actividad antimicrobiana podrían

causar la lisis celular de los microorganismos, por diferentes mecanismos de acción como:

el bloqueo de la síntesis de la pared celular o el transporte de sus precursores; afectando a la

membrana citoplásmica; bloqueando las fases de la síntesis protéica como la activación,

iniciación, fijación del complejo aminoácido-ARNt al ribosoma, incluso podrían afectar el

metabolismo de los ácidos nucleicos (Calvo, J. y col., 2009).

Rodríguez, E. (2011) menciona que los compuestos fenólicos sensibilizan la membrana

celular, y al saturarse los sitios de acción, la célula sufre un daño grave, provocando que se

colapse la membrana. Entre los compuestos con actividad antimicrobiana se encuentra el

ácidos cafeico, ferúlico y p-cumárico, por ejemplo, inhiben a los microorganismos E. coli,

S. aureus y B. cereus. Otros compuestos fenólicos que han demostrado tener actividad

antimicrobiana son los taninos y el ácido tánico. Este último por ejemplo inhibe los

microorganismos L.monocytogenes, E. coli, S. Enteritidis, S. aureus, A.hydrophila y S.

faecalis.

Tripoli, E. y col., (2007) mencionan que la hesperetina, y la aglicona de hesperetina tienen

actividad antimicrobiana contra S. typhimurium.

5.7.7.1. Metodologías para evaluar la actividad antimicrobiana

Existen diferentes métodos de laboratorio empleados para determinar In vitro la

susceptibilidad de bacterias ante agentes antimicrobianos, estos métodos no poseen la

misma sensibilidad ni se basan en los mismos principios, debido a que los resultados son

influenciados por el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de

solubilidad de cada compuesto evaluado (Stella, L. y col., 2009). Entre los métodos

FUNDAMENTACIÓN

28

empleados se encuentran tres grupos: métodos de difusión, métodos de dilución y

bioautografía (ver figura 10) (Choma, I. y col., 2011).

a) Método de difusión

Se basa fundamentalmente en incorporar en la superficie del agar inoculado previamente

con el microorganismo de prueba el compuesto de ensayo, para posteriormente observar la

inhibición de crecimiento o halo de inhibición. Este método se divide en tres técnicas:

disco, cilindro y pozo. La primera, consiste en incorporar una concentración conocida de

extracto polifenólico a un discos de papel, la cual es colocada sobre la superficie de una

caja de agar inoculado con el microorganismos de estudio. La caja es incubada a una

temperatura y tiempo adecuado hasta finalmente observa el halos de inhibición de

crecimiento. Para el método del cilindro, se emplea cilindro de acero inoxidable o

porcelana de tamaño uniforme (usualmente de 8 mm x 6mm x 10 mm) es colocado sobre la

superficie de la caja de agar inoculado y lleno del extracto de muestras o estándar. Después

de la incubación, los cilindros son retirados y la zona de inhibición es medida (Choma, I. y

col., 2011). En el ensayo de pozo, algunos agujeros con milímetros de diámetro son

cortados en la superficie del agar inoculado y son llenados con la muestra de estudio. La

solución del compuesto ensayado es difundida en medio del agar causando la inhibición del

Clasificación de

métodos

microbiológicos

para la detección

biológica

Método de difusión

Método de dilución

Bioautografía

Disco

Cilindro

Pozo

Contacto

Inmersión

Directo

Tubo de ensayo

Dilución en agar

Figura 10. Clasificación de métodos microbiológicos para la detección biológica

FUNDAMENTACIÓN

29

crecimiento de los microorganismos. Las placas de Petri se dejan a temperatura ambiente,

antes de la incubación. Entonces, las zonas de inhibición de crecimiento son medidas. La

concentración mínima inhibitoria (CIM) se determina visualmente, como la concentración

de compuesto de ensayo más baja, lo que provoca zonas reconocibles de inhibición del

crecimiento. Sin embargo, los métodos de difusión son menos adecuados para determinar el

valor de la CIM que los de dilución, ya que es imposible medir la cantidad del compuesto

de prueba utilizado en el medio de agar (Stella, L. y col., 2009).

b) Método de dilución

La principal ventaja de los métodos de dilución es la posibilidad de estimar la

concentración del compuesto de ensayo en el medio de agar o en la suspensión de caldo;

por esta razón, son comúnmente utilizadas para la determinación de los valores de

concentración mínima inhibitoria (CIM). En el procedimiento de dilución en agar, diversas

concentraciones del compuesto ensayado se mezclan con un agar nutriente. Las placas de

agar son inoculadas y luego incubadas. En el tubo de ensayo consiste en hacer diluciones

seriadas del extracto en ensayo en caldo de cultivo y un tubo como control de crecimiento

de microorganismos, los tubos se inoculan con una suspensión calibrada del

microorganismo y se incuban a temperatura y tiempo determinado, finalizado el período de

incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la existencia o no de

turbidez en esta prueba se pueden emplear microplacas de 96 pocillos (Jougenssen, J. y

col., 2009).

5.7.8. Degradación no enzimática de polifenoles

La reacción de degradación que involucran a los polifenoles en la transformación y

almacenamiento de alimentos incluyen procesos bioquímicos y químicos. Aunque el más

importante mecanismo bioquímico para la degradación de polifenoles es la oxidación

enzimática, otros factores tales como las reacciones químicas, fermentación, cocción,

manufactura o almacenamiento también puede catalizar transformaciones y la degradación

de compuestos polifenólicos (De la Rosa y col., 2010).

La reacción de pardeamiento, la cual es una de las más importantes que ocurre durante el

procesamiento y almacenamiento de los alimentos, representa un área de investigación

FUNDAMENTACIÓN

30

interesante para la estabilidad y tecnología de los alimentos, así como para la nutrición y

salud. La reacción de pardeamiento puede involucrar diferentes compuestos y proceder a

través de diferentes caminos químicos. El mayor grupo de reacciones importantes para el

pardeamiento es la enzima de oxidación de fenoles o llamada no enzimática de

pardeamiento. La última es favorecida por un tratamiento térmico e incluye un amplio

número de reacciones como la reacción de Maillard, caramelización, oxidación química de

fenoles y maderización (De la Rosa y col., 2010).

La reacción de Maillard, se refiere originalmente a la reacción de pardeamiento que se

produce entre el aminoácido y azúcar durante la cocción y procesamiento de alimentos. Sin

embargo en años recientes diferentes compuestos como los polifenoles han sido

relacionados con la reacción de Maillard. Esta reacción contribuye a propiedades

sensoriales, nutriciales y toxicológicas en diferentes alimentos. Aunque en sus primeras

etapas la reacción de Maillard conduce a la formación de los productos conocidos como

Amadori y Heyn´s, poca información está disponible en la estructura química de los cientos

de productos pardos que son formados por una serie de consecutivos y reacciones paralelas,

incluyendo oxidaciones, reducciones y condensación aldólica (De la Rosa y col., 2010).

La reacción de Maillard es también conocida por contribuir al envejecimiento natural y

normal de proteínas del tejido y otras biomoléculas tales como los polifenoles. Recientes

publicaciones han reportado que los polifenoles pueden reaccionar con un grupo amino

complicando la vía de las reacción de pardeamiento y modificando las propiedades

saludables de los polifenoles. En lo que respecta al efecto de la degradación química de

polifenoles por la reacción de Maillard en su actividad antioxidante. La oxidación química

de este compuesto es responsable de la perdida de la capacidad antioxidante. Sin embargo

observaciones recientes indican que polifenoles parcialmente oxidados puedan presentar

alta actividad antioxidante que los fenoles no oxidados. Por esta razón, investigaciones

futuras se requieren en este campo (De la Rosa y col., 2010).

Por otra parte, el empleo de calor durante la fabricación de diversos productos, puede

cambiar la composición enantiomérica de los polifenoles. Además la epimerización de

polifenoles podría ser causada por la condición aplicada durante los procedimientos de

extracción (De la Rosa y col., 2010).

FUNDAMENTACIÓN

31

5.7.9. Extracción de polifenoles

La extracción es un paso muy importante para el aislamiento, la identificación y uso de

compuestos polifenólicos. Esta dependerá de la naturaleza química y del grado de

polimerización de los propios compuestos, (Arranz, S.M. 2010) así como el efecto de la

extracción repetida, la concentración y polaridad de los diferentes solvente, temperatura de

extracción (Li, B. y col., 2006) y el tamaño de partícula de la muestra (Arranz, S.M. 2010).

Existen diferentes métodos de extracción para la obtención de compuestos bioactivos como

por ejemplo:

a) Extracción líquido- líquido

Es una operación de transferencia de masa en que una solución líquida que contiene

inicialmente uno o más solutos es mezclado con un líquido inmiscible (disolvente). El

disolvente exhibe afinidad preferente o selectividad hacia uno o más compuestos en la

alimentación y tiene diferente densidad.

Dos corrientes son el resultado de este contacto: el extracto, que es la solución rica que

contiene el soluto extraído que se desea, y el refinado, la solución de alimentación residual

que contiene poco soluto.

La extracción es una herramienta muy útil si se elige un disolvente de extracción adecuado

para la separación de compuestos fenólicos, la extracción líquido-líquido se utiliza con

frecuencia en líquidos de subproductos industriales, tales como los resultantes de la

industria de bebidas (Ignat, I. y col, 2011).

.

b) Extracción solido- líquido

La extracción sólido-líquido, o la lixiviación, se pueden definir como una masa fenómeno

de transporte en el que los sólidos contenidos en una matriz sólida migra en un disolvente

puesto en contacto con la matriz. La masa fenómenos de transporte se pueden mejorar

mediante cambios en la concentración de gradientes, los coeficientes de difusión o capa

límite (Ignat, I. y col, 2011).

Los disolventes más utilizados en los métodos de extracción con disolvente son el metanol

acidificado o etanol. De estos disolventes, la extracción con metanol es la más eficiente.

Estudios han reportado que emplear metanol para la extracción de pulpa de uva se obtuvo

FUNDAMENTACIÓN

32

un rendimiento del 20% más eficaz que el etanol y 73 % más eficaz que la extracción con

agua, sin embargo, en la industria alimentaria se prefiere etanol debido a la toxicidad de

metanol (Li, B. y col., 2006).

El empleo de extracción con solvente implica la co-extracción de compuestos no fenólicos,

tal como azucares, ácidos orgánicos y proteínas, que requieren procesos posteriores de

purificación (Ignat, I. y col, 2011).

Hasta ahora, no se recomienda un disolvente específico o apropiado de extracción para la

recuperación de contenido polifenolico total en muestra fresca, debido a las diversas

estructuras químicas de los polifenoles que van desde formas simples y polimerizadas

(lipófilo) que podrían afectar la solubilidad (Fariza, S.y col., 2011)

c) Fluidos supercrítico

El método de fluidos supercríticos (FSC) es rápido, automatizable, selectivo y evita el uso

de grandes cantidades de disolventes tóxicos. Además, la ausencia de la luz y el aire

durante la extracción reduce los procesos de degradación de los compuestos que pueden

ocurrir durante las técnicas tradicionales. La extracción con FSC se basa en el hecho de

que, cerca del punto crítico, el disolvente cambia sus propiedades rápidamente con

variaciones de presión. Los fluidos supercríticos están reemplazando cada vez más los

disolventes orgánicos tal como n- hexano, diclorometano, cloroformo, y otros que se

utilizan convencionalmente en la extracción industrial, purificación, y las operaciones de

recristalización a causa de regulador y presiones ambientales sobre hidrocarburos y

sustancias que agotan emisiones. La extracción con FSC se solvata por lo cual lo hace

similar a los disolventes orgánicos líquidos, pero con mayor difusividad y viscosidad más

baja (Ignat, I. y col, 2011).

El líquido esencial más utilizado en los FSC es el dióxido de carbono (CO2), debido a su

efecto benigno sobre el medio ambiente, baja toxicidad, inflamabilidad y compatibilidad

con los productos alimenticios procesados. Además, cuenta con condiciones críticas

modestas, puede separarse fácilmente a partir de solutos. Modernas tecnologías sofisticadas

permiten la regulación precisa de los cambios en la temperatura y la presión, y por tanto, la

manipulación de la propiedad de solvatación del FSC, ayudan a la extracción de productos

naturales.

FUNDAMENTACIÓN

33

Bocco y col., (1998), estudiaron el poder antioxidante (PAO) de la semilla y cáscara de

algunos cítricos de Francia, realizaron la extracción con metanol a reflujo durante 30

minutos. Las fases utilizadas para la identificación y cuantificación por HPLC fueron agua

y acetonitrilo. La actividad antioxidante la determinaron mediante la oxidación acelerada de

citronelal en clorobenceno. En la cáscara de limón reportaron un contenido fenólico de 1.65

g/100g b.s., de los cuales, 606 mg / 100g b.s fueron de naringina, sin embargo, no

encontraron hesperidina. En la cáscara de naranja agria reportaron un contenido fenólico de

2.23 g/100g b.s., de los cuales 1097 mg/100g b.s. fueron de naringina y 66 mg/100g b.s. de

hesperidina, y en la lima reportaron 19 mg/100g b.s. de naringina.

Li y col., (2006), determinaron el contenido fenólico de cáscaras de cítricos en Nueva

Zelanda. Realizaron extracciones con etanol, metanol y agua, observando que el agua es

menos efectiva que los otros dos disolventes, y no observaron diferencias significativas en

la extracción de fenoles utilizando metanol o etanol. Analizaron el efecto de utilizar la

cáscara fresca, o con un pretratamiento secando en un horno, reportaron un mayor

contenido fenólico en las cáscaras frescas, esto se debió a la influencia de la temperatura y

el tiempo del proceso de secado en la degradación de los polifenoles; además, el agua

contenida en las células de los frutos ayuda a la extracción de los fenoles y en ausencia de

agua, todos los componentes en las células se adhieren, lo que probablemente hace la

extracción más difícil, y por lo tanto la obtención de fenoles es menor. En la cáscara de

limón extraído con etanol al 80% reportaron 0.31 g/100g b.s. de fenólicos. Los resultados

que obtuvieron realizando una extracción con etanol al 72% fueron los siguientes: La

toronja presentó el mayor contenido fenólico (161.6 ± 17.36 mg/100g), seguida de la

mandarina (121.14 ± 11.89 mg 100g), el limón Yen Ben (118.95 ± 9.35 mg /100g), la

naranja dulce (73.59 ± 5.43 mg /100g), y el limón Meyer (59.77 ± 4.31 mg /100g). Los

datos están expresados en 100 g de cáscara fresca, con un contenido de humedad promedio

del 80%. Estos estudios reportaron que el contenido fenólico está directamente relacionado

con la actividad antioxidante, sin embargo, esto no siempre ocurre, pues los compuestos

fenólicos tienen diferente capacidad antioxidante unos de otros, porque si una fruta tiene un

alto contenido fenólico, pero estos compuestos poseen una baja actividad antioxidante,

entonces la capacidad antioxidante de esta fruta no será muy alta. El poder antioxidante lo

FUNDAMENTACIÓN

34

determinaron por el método de reducción de fierro (FRAP), la cáscara de toronja presentó

la mayor actividad antioxidante, seguida del limón Yen Ben, la mandarina, naranja y

finalmente el limón Meyer.

Xu y col., (2007) analizaron la cáscara de una variedad de toronja China, (C. pardisi

Changshanhuyou), para la cuantificación con la técnica de HPLC utilizaron como fase

móvil metanol/agua/ácido acético (37:59:4 v/v). Realizaron un pre tratamiento calentando

las cáscaras a diferentes temperaturas y tiempos, realizando la extracción con metanol 80%.

Calentando a 120ºC durante 90 minutos, reportaron un contenido fenólico de 4.7 g/100g

b.s., de los cuales 2782 mg/100g b.s. fueron de naringina y 149 mg/100g b.s. de

hesperidina. Estos estudios revelaron que la capacidad antioxidante aumentó con el tiempo

y temperatura de extracción, al igual que el contenido de fenoles totales.

Wang y col., (2008), analizaron cáscaras de algunos cítricos de Taiwan, realizando la

extracción con metanol a 85ºC durante 12 horas. Para la identificación por HPLC utilizaron

dos fases: ácido acético acuoso 2% (Fase A), y 0.5% ácido acético acuosoacetonitrilo (Fase

B). En la cáscara de mandarina reportaron un contenido fenólico de 4.92 g/100g b.s., con

54 mg/100g b.s. de naringina y 11.39 mg/100g b.s. de carotenoides. En la cáscara de

naranja dulce reportaron un contenido fenólico de 3.55 g/100g b.s., con 36mg/100g b.s. de

naringina y 10.81 mg/100g b.s. de carotenos. En la cáscara de limón reportaron un

contenido fenólico de 3.27 g/100g b.s. con 151 mg/100g b.s. de naringina y 1.49 mg/100g

b.s. de carotenos.

Kuljarachanan y col., (2009), en Tailandia, analizaron la cáscara de lima. Realizaron la

extracción con agua-acetona (1:1 v/v) durante 15 horas a 30ºC; reportaron un contenido

fenólico de 811±77.6 mg/100g b.s.

Chen, M. y col., (2011), analizaron cáscaras de cítricos por diversos métodos. Este estudio

investigó los efectos de las diferentes temperaturas de secado (50, 60, 70, 80, 90 y 100 ⁰C)

sobre los cambios en el flavonoide, ácidos fenólicos y actividad antioxidante de las cascaras

de los cítricos (Citrus sinensis (L.) Osbeck). Los fenoles totales y el contenido de

FUNDAMENTACIÓN

35

flavonoides de cascaras de naranja secadas se redujeron en menor temperatura de secado

(50 y 60 ° C) y a mayor temperatura de secado aumento (70, 80, 90 y 100 ° C). Las

cantidades de los compuestos fenólicos en el 100 ⁰C extracto de la muestra tratada fueron

significativamente mayores que las cantidades en las muestras calentadas a otra

temperaturas (P < 0,05). Los valores de CE50 de los extractos de cáscara de naranja del

DPPH efectos radicales barrido y ABTS+ efectos de barrido aumentaron con menor

temperatura de secado y la disminución de secado a más altas temperatura y los valores de

del extracto de la muestra tratada a 100 ⁰C fueron significativamente menores que las

muestras calentadas a otras temperaturas (P < 0,05). Sin embargo, las actividades de Fe2 +

quelantes de las muestras mostro una tendencia opuesta.

En la tabla 6 se presentan algunos disolventes empleados para la extracción de polifenoles

en cítricos.

Tabla 6. Estudios realizados en la extracción de polifenoles de cítricos

Cítrico Polifenoles

(g/100g B.S)

Temperatura

(⁰C)

Tiempo

(min)

Disolvente y

concentración

Autor

Limón 1.65 80 30 Metanol Bocco y col., 1998

Naranja agria 2.23

Limón 0.306 NR NR Etanol 80% Li y col., 2006

Toronja 0.161 Etanol 76%

Toronja 4.7 120 90 Metanol 80 % Xu y col, 2007

Mandarina 4.92 80 12h Metanol Wang y col., 2008

Naranja dulce 3.55

limón 3.27

Lima 0.811 30 15h Agua-acetona

(1:1 v/v)

Kuljarachanan y

col., 2009

Citrus sinensis

(L.) Osbeck

3.94-6.27 50-100 48h Metanol Chen M. y col.,

2011

Como se puede observar, las variables más empleadas indistintamente en la extracción de

polifenoles son la concentración y tipo de disolvente, la temperatura y el tiempo de

FUNDAMENTACIÓN

36

extracción y al realizar alguna modificación en estas variables, se extraen cantidades muy

diferentes de polifenoles. El metanol y etanol son los disolventes mayormente empleados,

sin embargo, el etanol será más aceptado para la extracción de los compuestos debido a que

el metanol es un compuesto tóxico.

5.8. Vida de anaquel

Los productos alimenticios, están permanentemente sujetos a cambios desfavorables que lo

hacen notorio en su aspecto físico o fisicoquímico. Esencialmente, estos cambios afectan la

vida de anaquel de un producto que depende de factores ambientales, como la humedad,

temperatura de exposición, proceso térmico al que se somete y la calidad de las materias

primas, entre otros. El efecto de estos factores se manifiesta en el cambio de las cualidades

del alimento que evitan su venta: cambios de sabor, color, textura o pérdida de nutrientes lo

que provoca que al final de la vida de anaquel de un producto se alcance cuando ya no

mantienen las cualidades requeridas para que el consumidor final lo utilice (García, B.C

2008).

Para determinar la vida útil de un alimento o producto, primero se debe identificar las

reacciones químicas o biológicas que influyen en la calidad y seguridad del mismo,

considerando la composición del alimento y el proceso a que es sometido para poder

proceder a establecer las reacciones más críticas en la calidad (García, B.C y col., 2008).

Por ello el tiempo de vida de anaquel se puede estimar mediante varios métodos: pueden

tomarse valores reportados en la literatura especializada de alimentos similares y bajo

condiciones similares al producto de nuestro interés; se pueden monitorear las quejas de los

consumidores para orientar los posibles valores de vida de anaquel; se pueden evaluar

atributos de calidad del alimento que varían durante la vida de anaquel o mediante pruebas

aceleradas (García, B.C y col., 2008). Las cuales son métodos acelerados de estimación de

la vida de anaquel de alimentos que se basan en la aplicación de los principios de la cinética

química sobre el efecto que las condiciones ambientales como temperatura, presión,

humedad, gases de la atmósfera y luz, tienen sobre la velocidad de la reacción. La

determinación rápida de la caducidad (Acelerated shelf life determination, ASLD) es

utilizada para disminuir el tiempo necesario para estimar la caducidad, de otro modo sería

excesivamente largo. Debido a la globalización del comercio alimentario y del aumento de

FUNDAMENTACIÓN

37

la competencia tanto nacional como internacional, ha aumentado la necesidad de establecer

rápidamente la caducidad de un producto. Esta situación se hace más urgente cuando la

caducidad de un producto se prevé que va a ser larga, de meses a varios años. Son bien

conocidos los efectos que causa aumentar la temperatura en muchas reacciones químicas,

junto con los cambios negativos que tiene durante el almacenamiento. Por tanto, la manera

más común de realizar la determinación rápida de la caducidad consiste en almacenar el

producto a temperaturas elevadas (Man, D. 2002). Por lo tanto los métodos que aceleran el

deterioro por efecto de ésta se basan en el cumplimento de la ley de Arrhenius; la ecuación

1 para calcular el efecto de la temperatura sobre la vida media es (Palazón, M.A. ei al.,

2009)

𝑡𝑠 = 𝑡0 ∗ 𝑒𝐸𝐴𝑅 ⌊

1

𝑇0−

1

𝑇𝑠⌋ Ec.1

Dónde: tS es el tiempo de vida de anaquel a la temperatura TS, t0 es el tiempo a la

temperatura T0, R es la constante de los gases ideales, y EA es la energía de activación para

la reacción de deterioro.

Cabe mencionar que las pruebas de laboratorio simulan las condiciones reales, pero existen

variables como las condiciones de transporte, cambios de presión, fluctuaciones de

temperatura, entre otras, que son difíciles de duplicar. Por lo tanto, los resultados obtenidos

estiman la vida de anaquel de los alimentos (García, B.C y col., 2008).

5.9. Color

El color se define como la sensación resultante de estimular la retina por las ondas

luminosas comprendidas en la región visible del espectro. Otros atributos relacionados con

el color son el tono y la saturación de un color, y la luminosidad. El tono es la propiedad de

color definida por el estado químico del pigmento. La saturación se refiere a la cantidad de

polifenoles presente, y la luminosidad es función del estado físico de la superficie de la

harina, y se define como el grado de luminosidad de un color con relación a un gris neutro

en una escala que se extiende del negro absoluto al blanco absoluto (Brazal, 1975; Warris y

col., 1990).

El sistema de representación del color más adecuado es el CIELAB (CIE, 1986), ya que se

presenta más uniforme en la zona de los rojos (Hernández, 1994). Este sistema emplea las

FUNDAMENTACIÓN

38

coordenadas tricromáticas L* (luminosidad), a* (índice rojo) y b* (índice de amarillo), de

manera que a partir de relaciones entre ellas se pueden obtener las coordenadas

colorimétricas, la intensidad de color o saturación y el tono. La coordenada L* es la más

relacionada con la valoración visual del consumidor. Depende de varios factores como el

pH, la capacidad de retención de agua y la humedad.

a) El CIE LCH espacio de color o modelo Color

Este modelo es fácil de comprender que el espacio de color Lab, con el que comparte varias

características. Es conocido más correctamente como L* C* h⁰. Esencialmente, es en la

forma de una esfera. Hay tres ejes, L* y C* y hº. El eje L* representa la luminosidad. Esta

es vertical; desde 0, que no tiene luminosidad (es decir, negro absoluto), en la parte inferior,

a través de 50 en el medio, a 100 que es la máxima ligereza (es decir, blanco absoluto) en la

parte superior .

El eje C * representa Chroma o "saturación". Esto va desde 0 en el centro del círculo, el

cual es completamente insaturado (es decir, un gris neutro, negro o blanco) a 100 o más en

el borde del círculo de muy alta Croma (saturación) o " pureza de color”.

Si realizamos un corte horizontal a través del centro, vemos un círculo de color. Alrededor

del borde del círculo que vemos todos los colores saturados posible, o Hue. Este eje circular

es conocido como H ° de Hue. Las unidades son en forma de grados ° (o ángulos), que van

desde 0 ° ( rojo) 90 º (amarillo), 180 º (verde ) , 270 º ( azul) y de nuevo a 0 ° .

En la figura 11 se presenta hue h⁰, croma C* y la luminosidad L* (espacios del color L*,

a*, b).

Figura 11. a) Representación de hue h⁰, croma C* y la luminosidad L*. b) Espacios del color L*, a*, b

MATERIALES Y MÉTODOS

39

6.- MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. ETAPA I. Elaboración de harina de subproducto de limón italiano

6.1.1. Colecta del material biológico

El material biológico, subproductos de limón italiano Citrus limón (L). Burns (cáscara,

bagazo y semilla) fue colectado en la Juguera de Akil, perteneciente a la Unión de Ejidos

Citricultores del Sur del Estado, localizado en el municipio de Akil Yucatán a una distancia

de 80 kilómetros en dirección sureste de la ciudad de Mérida.

Los subproductos de limón italiano con el que se realizó la primera etapa del trabajo, se

colectaron en el mes de septiembre del 2012, los residuos colectados fueron los obtenidos

después de extraerle al fruto cítrico los aceites esenciales por el método de prensado en frío

el cual consistió en aplicar presión a las cáscaras para romper las glándulas de aceite,

anterior a la obtención del jugo, realizado por parte de la Juguera. La muestra colectada, fue

dividida en lotes de 2 kilos, los cuales se depositaron en bolsas de plástico debidamente

etiquetadas y se transportaron al Laboratorio de Tecnología de Alimentos de la Unidad

Sureste del CIATEJ donde se almacenaron a una temperatura de -2 ⁰C (figura 12).

Figura 12. Colecta y almacenamiento del material biológico


40

6.1.2. Secado del material biológico para la obtención de harinas de subproducto de

limón italiano.

Para el secado de subproductos de limón italiano se emplearon las muestras almacenadas a

-2 ⁰C, para ello se plantearon dos diseños factoriales, en los que se evaluaron los factores

tiempo y temperatura teniendo como variable de respuesta el porcentaje de humedad,

contenido de polifenoles totales, actividad antioxidante y antimicrobiana. En el primer

diseño factorial 4x8 se emplearon para el factor tiempo, niveles de 12, 24, 36 y 48 h y para

el factor temperatura niveles de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y 110 ⁰C. Para esta prueba se

emplearon treinta y dos lotes de subproducto de limón italiano (anexo1), los cuales fueron

secados en un horno convencional de la marca Shellab. Las muestras secas fueron molidas

y tamizadas a un tamaño de partícula de 500 micras para la obtención de harina (figura

13).Las muestras obtenidos a los diferentes tiempos fueron analizados por triplicado para

determinar al porcentaje de humedad, así como las variables de respuesta correspondientes.

En el segundo diseño factorial 2 x 8, se emplearon los factores temperatura y tiempo, el

primero fue a niveles de 50 y 110 ⁰C y el tiempo fue evaluado a diferentes niveles para

cada temperatura, lo anterior con la finalidad de obtener intervalos más cortos. Para 50°C

los niveles de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 h y 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 h para la temperatura

de 110 ⁰C (anexo 2). El procedimiento para la obtención de las harinas fue similar a lo

establecido en el primer diseño factorial. Evaluando como variable de respuesta el

porcentaje de humedad, contenido de polifenoles totales, actividad antioxidante y

antimicrobiana.

Al igual que el primer diseño las mediciones correspondientes para cada tiempo y

temperatura se realizaron por triplicado.

6.1.3. Determinación de humedad

La humedad se determinó mediante termobalanza MB45mediante la utilización de, 2 g de

harina que fueron colocados en el platillo del equipo, las mediciones fueron realizadas de

acuerdo al principio termogravimétrico, es decir, la humedad fue determinada a partir de la

pérdida de peso de la muestra desecada por calentamiento de acuerdo a lo reportado como

programa de determinación de humedad en harinas del equipo (figura 13).


41

Figura 13. Secado y prueba de humedad de subproductos de limón italiano

6.1.4. Extracción y cuantificación de polifenólicos de limón italiano

La extracción de polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano se realizó de

acuerdo a la metodología reportada por Sánchez-Contreras y col., (2012). El contenido de

polifenoles totales se determinó por espectrofotometría siguiendo la metodología propuesta

por Vasco y col., (2008) con algunas modificaciones. 20 L de extracto, se mezclaron con

250 μL de Folin Ciocalteu a temperatura ambiente durante 3 min, posteriormente 1250 l

de una solución de carbonato de sodio (Na2CO3) (20 % en agua) fueron adicionados,

posteriormente se realizó una agitación de la mezcla para ser llevado a un volumen de 2 mL

con agua destilada. Adicionalmente la muestra se dejó en reposo durante 2 h a temperatura

ambiente en condiciones de oscuridad para su posterior análisis de absorbancia a 760 nm

mediante la utilización de un l espectrofotómetro ultravioleta-visible de la marca Perkin

Elmer Lambda 40. Para el análisis cuantitativo se construyó una curva de calibración con

ácido gálico a concentraciones de 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2 mg/ mL.

Lo anterior con el fin de expresar los resultados en términos de equivalentes de ácido gálico

(EAG)/ g de harina base seca. Cabe mencionar que todas las determinaciones se realizaron

por triplicado.


42

6.1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de extractos de polifenoles

6.1.5a. Microorganismos

Con los extractos obtenidos de las harinas de subproducto de limón italiano se evaluó la

actividad biológica sobre los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922,

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, los cuales

fueron adquirido del cepario del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y

Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ) Unidad Sureste. Las cepas fueron reactivadas en

caldo nutritivo y resembradas en placa para la evaluación de su viabilidad y pureza.

6.1.5b. Actividad antimicrobiana cualitativa de extractos polifenólicos

Para esta prueba se tomaron extractos polifenólicos que fueron estandarizados a

concentración de 27 mg/g base seca (b.s) y se colocaron individualmente en microplacas de

96 pozos. Posteriormente medio de cultivo Mueller-Hinton (M-H) fue adicionó al sistema

hasta obtener un volumen final de 150 μl. Finalmente se adicionó 50 μl de inóculo de cada

bacteria ajustado al tubo 0.5 de MacFarland que contenía alrededor de 106 UFC/ml como

concentración final de cada microorganismo. Las microplacas fueron incubadas a 37 ⁰C por

24 h, pasado el tiempo de incubación las muestras diluidas fueron sembradas en cajas de

agar M-H, e incubadas a las mismas condiciones. Para esta prueba solo se observó

cualitativamente el crecimiento microbiano mediante la presencia o ausencia del

microorganismo como indicativo de inhibición por el extracto.

6.1.5c. Concentración mínima inhibitoria (CMI)

La prueba de CMI contra las cepas S. typhimurium, E. coli, S. aureus, fue calculada solo

para los extractos de polifenoles de harinas con humedades del 15 por ciento o inferiores,

valor establecido por la norma del CODEX para harina de trigo (Codex Standard 152-1985)

y que fueron obtenidas del segundo diseño factorial 2 x 8. Para esta prueba se empleó la

metodología propuesta por Lagnika y col., (2011) con ligeras modificaciones. Para ello se

empleó una microplaca de 96 pozos donde se realizó microensayos de siete diluciones

seriadas, y se usó el indicador redox violeta p-yodonitrotetrazolio como indicador del

crecimiento. Los extractos polifenólicos fueron ajustados a concentraciones conocidas

iniciando con 25, 23.3, 11.7, 5.8, 2.9, 1.5, 0.75mg de polifenoles/g base seca Lo anterior se

realizó en pozos de 200 μL, obteniendo 100 μL de cada dilución a las concentraciones

finales previamente indicadas. Para obtener este volumen el extracto polifenólico fue


43

ajustado con solución salina (NaCl 0.9 N). Posteriormente se adicionaron 50 μL de

solución salina y 50 μL del inóculo de bacterias con concentración final de106 UFC/mL en

cada pozo. Se utilizó amikacina como antibiótico de referencia como control positivo y se

utilizó solución salina como control negativo. Las microplacas fueron incubada a 37 ⁰C por

24 h, después de este tiempo 30 μL de 0.2 mg / mL de solución de p-iodonitrotetrazolio fue

adicionado en cada pozo y posteriormente la microplaca fue incubada a 37 ⁰C. Después de

una hora de incubación se verificó la presencia de cambio de color rosado como indicador

de crecimiento, el valor de la primera concentración de polifenoles en donde no se presentó

cambio de coloración fue registrado como valor de CMI.

6.1.6. Determinación de la capacidad antioxidante de extractos polifenólicos de harina

de subproducto de limón italiano

La actividad antioxidante de los extractos polifenólicos fue evaluada mediante la

determinación del porcentaje de inhibición de la formación de radicales libres DPPH• (2,2-

difenil-1-picril-hidracilo) de acuerdo a la ecuación 2, siguiendo el método propuesto por

Chen, M. y col., (2011) con algunas modificaciones. A 2.9 mL de una solución de DPPH•

(0.1mM) se le adicionó un volumen de extracto de polifenoles con una concentración

conocida, posteriormente se llevó a un volumen final de 3 mL con la solución de DPPH•.

Finalmente a los 30 minutos de reacción, se realizaron las mediciones espectrofotométricas

correspondientes a una longitud de onda de 517 nm.

𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 (%) =⌊𝐴𝑎−(𝐴𝑏−𝐴𝑐)⌋

𝐴𝑎𝑥 100 Ec. 2

Dónde:

Aa: Absorbancia del blanco de la solución de DPPH•

Ab: Absorbancia de la mezcla que contiene DPPH• y la muestra

Ac: Absorbancia de la solución en blanco sin DPPH•

6.1.7. Color de la harina de subproducto de limón italiano

La determinación del cambio de color de las harinas secadas a diferentes temperaturas, se

realizó de acuerdo a la metodología de Kumar, J.A. y col., (2013), mediante la aplicación

de un colorímetro MiniScan Ez. El valor del color se expresó usando los parámetros


44

L*(luminosidad), a* (+ rojo, - verde), b*(+ amarillo, -azul), croma o saturación (C*) de

acuerdo a la ecuación 3 y hue (h⁰) de acuerdo a la ecuación 4.

C∗ = √𝑎∗2 + 𝑏∗2 Ec.3 h⁰=tan−1 b∗

a∗ Ec.4

6.1.8. Actividad del agua de harina de subproducto de limón italiano

La actividad de agua de las muestras obtenidas se realizó mediante la utilización de un

equipo higroPalm HP 23-Aw-A, 10 g de harina fueron utilizados para la medición la cual se

llevó a cabo por triplicado.

6.1.9. pH de la harina de subproducto de limón italiano

El pH fue calculado de acuerdo a la metodología propuesta por la AOAC 943.02, se pesó

1g de harina de subproducto de limón Italiano y se diluyó en 10 mL de agua,

posteriormente se agitó vigorosamente y con ayuda de un potenciómetro de la marca

OAKLON se determinó el pH el cual fue registrado por triplicado para cada una de las

muestras analizadas.

6.1.10. Acidez titulable total de harina de subproducto de limón italiano

Para esta prueba, se utilizó la metodología de la AOAC 935.57 Se pesó 1 g de harina de

subproducto de limón italiano y se disolvió en 20 mL de agua destilada, posteriormente la

mezcla fue filtrada al vacío. La muestra filtrada se colocó en un matraz Erlenmeyer de 25

mL y se tituló con una solución de NaOH 0.1M. Se empleó fenolftaleína como indicador.

El resultado se expresó como porcentaje de ácido cítrico de acuerdo a la ecuación 5.

𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 (𝑔 á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜

100𝑚𝐿) = [

(𝑉𝑚𝑥)(𝐶𝑚𝑥)(𝐹á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜)(100)

(𝐶𝑁𝑎𝑂𝐻 0.1𝑀)(𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑔)] Ec. 5

Donde

Vmx= Volumen de gasto de la solución de NaOH estandarizado

Cmx= Concentración de la solución de NaOH estandarizado

CNaOH 0.1M = Concentración ideal de la solución de NaOH 0.1 M


45

Fácido cítrico = Factor de conversión de equivalencia de 1 mL de NaOH 0.1M a ácido cítrico

anhidro (0.006404)

6.1.11. Análisis bromatológico de la harina de subproducto de limón italiano con las

mejores condiciones de secado.

Para la determinación de la humedad, proteínas (N x 6.25), cenizas, grasas (extracto

etéreo), carbohidratos totales, fibra cruda, vitamina C, calcio y potasio de la harina de

subproducto de limón italiano obtenida con las mejores condiciones de secado, se

emplearon las siguientes normas:

Métodos oficiales de análisis, Asociación de los químicos analíticos oficiales. 15ª

Edición, 1990. Volumen I.A.O.A.C. Método 986.25 Carbohidratos, determinación

para diferenciar el análisis inmediato.NMX-F-083-1986. Determinación de

humedad en productos alimenticios.NMX-F-608-NORMEX-2011 Determinación

de proteínas en alimentos – método de prueba.NMX-F-607-NORMEX-2002

Determinación de cenizas en alimentos – método de prueba.NMX-F-615-

NORMEX-2004 Determinación de extracto etéreo (método soxhlet) en alimentos-

Método de prueba.NMX-F-613-NORMEX-2003 Determinación de fibra cruda en

alimentos-Método de prueba oficial método de análisis, Asociación de los químicos

analíticos oficial, 18ª Edición. 1990. Volumen I.A.O.A.C. 967.21 Vitamina C. EPA

6010B Espectrometría de emisión atómica por plasma de acoplamiento inductivo-

empleando la norma; Nom-117-SSA1-1994 punto 7.3.1 Método para la

determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en

alimentos, agua potable y purificada por espectrofotometría de absorción atómica.

6.1.12. Determinación del tiempo de vida útil de harinas de subproducto de limón

italiano

La determinación del tiempo de vida útil de las harinas de subproducto de limón italiano se

realizó con la harina que presentó las mejores condiciones de secado obtenidas del diseño

factorial 2 x 8. Para el análisis se emplearon pruebas aceleradas descritas por Gamboa y

col., (2008) y López-Duarte y col., (2009) con algunas modificaciones. Los valores críticos

que se evaluaron fueron el porcentaje de humedad, la concentración de polifenoles totales,

actividad antimicrobiana y antioxidante, pH, acidez, color y actividad del agua (Aw), dando


46

mayor importancia al cambio de color debido a la naturaleza de la muestra que se considera

como poco perecedera. Para el análisis se prepararon muestras conteniendo 10 g de harina y

se almaceno en bolsas negras de polipropileno a dos temperaturas diferentes de incubación

35 y 60 ⁰C. Las muestras incubadas a la temperatura de 35 ⁰C, se le realizaron las pruebas

mencionadas anteriormente cada siete días por un periodo de tres meses y medio. Y las

muestras incubadas a 60 ⁰C cada tres días, durante un periodo aproximado de mes y medio.

Cabe mencionar que el porcentaje de humedad, la concentración de polifenoles totales,

actividad antimicrobiana y antioxidante, pH, acidez, color y actividad del agua (Aw) se

realizaron por duplicado y de acuerdo a las metodologías mencionadas en apartados

anteriores (figura 14).

Figura 14. Vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano

.


47

6.2. ETAPA II. Evaluación de la extracción de compuestos polifenólicos en harinas de

subproducto de limón italiano

6.2.1. Evaluación de los solventes y sus concentraciones, temperaturas y tiempos de

extracción de harina de subproducto de limón italiano previamente seleccionada.

Para determinar el mejor método de extracción de los compuestos polifenólicos totales en

harina de subproducto de limón italiano a las condiciones establecidas en la primera etapa (

secada a 50 ⁰C por 21h), así como el contenido de flavonoide totales, actividad

antimicrobiana y antioxidante, se planteó un diseño factorial 34 en el que se evaluaron 4

factores a tres niveles que se describen a continuación: solvente (etanol, acetona, metanol),

concentración de solvente (50, 70 y 90 %), temperatura (15, 25, 40 ⁰C) y tiempo (1, 2.5 y 4

horas), y como variables de respuesta: contenido de polifenoles totales, flavonoides totales,

actividad antioxidante y antimicrobiana. En el Anexo 3 se muestra el modelo empleado. De

igual forma se realizó una extracción control de acuerdo a la metodología reportada por

Sánchez-Contreras y col., (2012). Para el estudio, se pesó un gramo de harina de limón

italiano, y se introdujo en un matraz de 250 mL posteriormente se agregó el disolvente

(etanol, acetona, metanol) a las distintas concentraciones, en una proporción

harina/disolvente 1:10 (50% V/V de disolvente). Solo para los tratamientos realizados a la

temperatura de 15 ⁰C, los matraces fueron colocados a baño con hielo manteniendo

agitación y temperatura constante. Posteriormente los extractos se centrifugaron a 4500 rpm

durante 25 minutos a temperatura de 4 ⁰C. Finalmente los extractos obtenidos fueron

filtrados con papel Whatman # 1 y colocados en botellas de color ámbar a una temperatura

de 4 ⁰C hasta su posterior análisis. Cabe mencionar que los tratamientos se hicieron por

duplicado. La determinación del contenido de polifenoles, actividad antioxidante y

antimicrobiana se realizó de acuerdo a las metodologías mencionadas en los apartados

anteriores.

6.2.2 Determinación del contenido total de flavonoides

El contenido total de flavonoides se determinó usando la metodología descrita por Lira y

col., (2002) con algunas modificaciones. 100 μL de extracto polifenólico fueron colocados

en un vial de color ámbar y posteriormente se agregó el disolvente metanol (50% V/V), en

una proporción extracto/disolvente 1:10. De igual forma se adiciono 1 mL de AlCl3 al 2%

en metanol. Las muestras se mantuvieron en reposo por un tiempo de 30 minutos en el que


48

se llevó a cabo la reacción y se leyó la absorbancia a 420 nm. Para determinar el contenido

de flavonoides totales como equivalente de quercetina, se preparó una curva estándar de

quercetina (0.1, 0. 3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.3 y 1.6 mg/ mL). El análisis se realizó por duplicado

para cada muestra y se reportó el promedio de las dos lecturas como equivalentes de

quercetina (EQ)/ g de harina base seca.

6.2.3. Cromatografía en capa fina (CCF)

Esta prueba solo se realizó a los extractos polifenólicos que presentaron las mejores

condiciones de extracción en el diseño 34. Para ello se empleó la metodología de Valgas y

col., (2007) con algunas modificaciones. Se empleó un cromatofolio de cromatografía de

capa fina (CCF) de silica gel con un tamaño de 20 x 20 cm, ha dicho cromatofolio se le

trazo una línea de 1 cm en la parte superior y otra en la parte inferior con marcas de

referencia. Posteriormente, con ayuda de un capilar de vidrio se depositaron en el borde

inferior 3 μL de extracto polifenólico a una concentración de 5 mg/g b.s. Así mismo se

aplicaron 3μL de las muestras de referencias comerciales de neohesperidina, hesperidina,

naringina, ácido elagico y quercetina a concentraciones de 1mg/ mL y por ultimo una

muestra control (extracto obtenido por la metodología de Sánchez-Contreras y col., 2012).

Previo a la preparación de las placas cromatográficas la cámara fue saturada con los

vapores de la fase móvil (mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico y agua 11:2:7), para

favorecer la saturación, se introdujo en la cámara un papel filtro cuya parte inferior se

sumergió en la fase móvil. Se dejó una franja de la pared de la cámara al descubierto, para

poder dar seguimiento al proceso cromatográfico sin necesidad de destapar la cámara. Una

vez seco el cromatofolio de silica gel se depositó en la cámara saturada cuidando que la

fase móvil no tuviera contacto directo con las muestras depositadas en la cromatoplaca,

quedando su nivel por debajo de la línea de aplicación de la muestra.

La placa fue extraída de la cámara cuando el frente del disolvente se encontraba en el borde

superior trazado. Luego se dejó secar el solvente y posteriormente la cromatoplaca fue

revelada con tricloruro de aluminio (AlCl3) al 5%. Después de dejar reposar la placa para la

evaporación de la fase móvil, se observó bajo la lámpara UV-visible lo descrito

anteriormente se puede observar en la figura 15. Mediante fotodocumentación se indicaron


49

los valores de distancia recorrida de cada compuesto y se calculó los correspondientes

valores de Rf (factor de retención) (ecuación 5).

𝑅𝐹(𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖ó𝑛) =(𝐷𝑀)𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

(𝐷𝐹)𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 Ec. 5

Figura 15. Esquema de Cromatografía en capa fina de extractos polifenólicos de harina de subproducto de

limón italiano

6.3. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado y se registraron los valores

medios con desviaciones estándar. Los datos experimentales se analizaron mediante un

análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existe diferencia significativa entre los

factores. Se utilizó la prueba de rangos múltiples de Duncan para establecer las

comparaciones múltiples de los valores medios, valores medios fueron considerados en el

nivel de confianza del 95% (p< 0.05). Se empleó el programa estadístico SPSS

STATGRAPHICS Centurion XVI.I (versión 14) para realizar todos los cálculos

estadísticos.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

50

7. RESULTADOS Y DISCUSIONES

7.1. Secado de subproductos de limón italiano

Debido a que uno de los principales métodos de conservación de productos alimenticios es

el secado, en la primera etapa del presente trabajo se realizó el secado de los subproductos

de limón italiano con la finalidad de poder conservar la materia en almacenamiento por

periodos de tiempo más largos, reducir el volumen y facilitar la extracción de compuestos

de interés, sin embargo los procesos de secado con aire caliente presentan efectos en las

características de los compuestos de interés que estos pudieran contener, tal es el caso de

los polifenoles y en particular los flavonoides. De acuerdo a lo anterior en esta etapa del

trabajo experimental se evaluó el efecto de la temperatura y el tiempo de secado de

subproductos de limón italiano sobre la concentración de polifenoles totales presentes en

las harinas resultantes. Para ello se plantearon dos diseños experimentales. En el primero,

se estableció un diseño 4x8 en el cual se analizaron dos factores, siendo el primero el

tiempo estableciendo cuatro niveles de 12, 24, 36 y 48 h, el otro factor a evaluar fue la

temperatura a niveles de: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y 110⁰C. El segundo diseño

experimental evaluado fue un 2 x 8, empleando para el factor temperatura niveles de 50 y

110 ⁰C y para el factor tiempo ocho niveles que para la temperatura de 50 ⁰C fueron 3, 6, 9,

12, 15, 18, 21 y 24 h y para la temperatura de 110 ⁰C los niveles de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16

h. Para la elección de la mejor temperatura y tiempo de secado de los subproductos de

limón italiano se empleó como variable de respuesta la humedad de los subproductos la

cual debería ser inferior a lo establecido por la CODEX para harinas (15%), posteriormente

se tomó en cuenta la concentración de polifenoles, buscando obtener las condiciones

adecuadas para la mayor recuperación, sin embargo también se tomó en cuenta que los

extractos polifenólicos obtenidos presentaran actividad antimicrobiana y antioxidante. Los

resultados obtenidos a partir de los diseños evaluados se presentan a continuación.

7.2. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la reducción del porcentaje de

humedad de subproductos de limón italiano empleando el diseño experimental 4 x 8.

Los resultados de la evaluación del tiempo y la temperatura de secado en la reducción del

porcentaje de humedad del análisis experimental 4x8 se presentan en la figura 16, en esta

gráfica se puede apreciar la disminución del porcentaje de humedad para cada una de las


51

temperaturas de secado evaluadas de los subproductos de limón italiano con respecto al

tiempo a. Para el tiempo cero (muestra fresca) el porcentaje de humedad obtenido fue de

84.5 ± 0.9 % de humedad, durante las primeras 12 h de secado (figura 16) se observó la

máxima reducción del porcentaje de humedad para las temperaturas de 60 a 110°C,

alcanzando valores alrededor del 10%, los cuales se encuentran dentro de lo reportado por

la norma CODEX para harina. La temperatura de 50°C alcanzó el valor aceptado por la

norma a las 24h y la temperatura de 40°C hasta las 36h. Si bien las muestras secadas en el

intervalo de 60 a 110°C no presentaron una diferencia significativa en la reducción de

humedad después de las 12 h, las muestras secadas a 110 ⁰C presentarón el menor valor de

% de humedad a las 36 h siendo este de 1.7 ±0.1 % de humedad. Como se puede observar

en la figura 16, como era de suponerse al incrementar el tiempo de secado de los

subproductos de limón italiano se disminuye el porcentaje de humedad, de igual forma que

conforme se incrementa la temperatura de secado. Sin embargo la evaporación del agua

también favorece el incremento de la concentración de los solutos en la superficie.

El análisis de varianza indicó que los factores principales tiempo y temperatura a los

niveles evaluados, así como su interacción se observó un efecto significativo sobre el

porcentaje de humedad ya que el valor P fue menor al nivel de significancia (α= 0.05)

establecido tal y como se presenta en el diagrama de Pareto (figura 17), mostrando que la

temperatura presentó el mayor efecto sobre el porcentaje de humedad,

Los resultados obtenidos del porcentaje de humedad en este primer diseño experimental

indicaron que el cambio de humedad cada doce horas fue muy rápido (ver figura 16), a

temperaturas de 60 hasta 110 ⁰C la reducción de humedad fue muy drástica con respecto a

las temperaturas de 40 y 50 ⁰C. Por lo cual, se propuso para el segundo diseño factorías 2 x

8 intervalos menores de tiempo de muestreo tomando como máximo de 24 h debido a que

los subproductos de limón italiano a partir de este tiempo alcanzaron la humedad (15 %)

establecida por la CODEX para harina. Sin embargo, la evaluación de las velocidades de

pérdida de humedad, cuantificación de polifenoles y la evaluación de la actividad biológica

también fue determinada a todas las muestras obtenidas de este primer diseño experimental

con la finalidad de identificar las temperaturas a evaluar en el siguiente diseño.


52

Figura 16. Reducción del porcentaje de humedad de subproducto de limón italiano

7.2. a. Velocidad de secado de harinas de subproducto de limón italiano

Para la determinación de la velocidad de secado de los subproductos de limón italiano, fue

necesario graficar el porcentaje de perdida de H2O de los subproductos con respecto al

tiempo de secado tal como lo muestra la figura 18, con ayuda del programa OriginPro 8 en

función de la ecuación de SGompertz (Anexo) se calculó el valor de la velocidad de secado

(k) Para cada temperatura evaluada. Obteniendo como resultado los datos indicados en la

tabla 7.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Porc

enta

je d

e H

um

edad

(%

)

Tiempo (h)

40⁰C

50⁰C

60⁰C

70⁰C

80⁰C

90⁰C

100⁰C

110⁰C

Efectos estandarizados

0 1 2 3 4 5

AB

B:Temperatura

A:Tiempo

+-

Figura 17. Grafica de Pareto para para el porcentaje de humedad del diseño 4x8


53

En la figura 18 se ilustra la correlación de la perdida de H2O de subproducto de limón

italiano a diferentes temperaturas evaluadas, observando que las temperaturas de 60,70 80,

90, 100 y 110 ⁰C son superponibles, lo que indica que a mayor temperatura de secado no

hay un aumento en la velocidad, por el fenómeno denomina “acortezamiento” (“case

hardening”), este efecto impide la liberación de agua en el alimento debido a la formación

de una capa superficial dura e impenetrable que ralentiza la velocidad de secado (Garau, M.

y col., 2007). Diferentes autores han observado este fenómeno durante la deshidratación de

diferentes productos alimenticios (Cañizares, A. y col., 2007). En la tabla 7 se presentan

los resultados de la velocidad de secado (k), la mayor pérdida de H20 de los subproductos

durante el secado (a) y el coeficiente de correlación (r) que se obtuvo al emplear la

ecuación de SGompertz (Anexo 4).

Figura 18. Curvas de secado de las harinas de subproducto de limón italiano

Los resultados indicaron que la temperatura de 60 ⁰C presento mayor velocidad de secado

sin embargo la desviación estándar es muy grande y la menor a 40 ⁰C con un valor de

0.55±0.25 y 0.09 ±0.01 porcentaje de H2O / h. respectivamente. De igual forma, se reportó

que al ir aumentando la temperatura de secado la velocidad aumentaba hasta obtener una

velocidad contante, sin embargo se observó que a partir de la temperatura de 70 ⁰C la

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

dw

po

rcen

taje

de

H2O

Tiempo (h)

40⁰C

50⁰C

60⁰C

70⁰C

80⁰C

90⁰C

100⁰C

110⁰C


54

velocidad se mantuvo constante, debido a que a estas temperaturas la deshidratación de los

subproductos fueron muy similares en los tiempos evaluados. Este efecto puede ser

explicado con base a la disminución de la transferencia de calor de la pared al solido que se

está secando (Brennan, J. 2008) al haber ya alcanzado su máxima deshidratación a las 12h

o como se mencionó anteriormente al acortezamiento de los subproductos.

Tabla 7. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado

Temperatura

(⁰C)

Perdida máxima de H2O (a) Velocidad

(k)

Coeficiente de

correlación

(r)

40 94.56±2.0 0.09±0.01a 0.9895

50 90.33±0.18 0.21±0.00ab 0.99971

60 91.08±0.31 0.55±0.25c 0.99913

70 91.81±0.38 0.35±0.03abc 0.9987

80 91.21±0.12 0.46±0.03bc 0.99987

90 95.09±0.10 0.34±0.01abc 0.99991

100 94.32±0.21 0.39±0.02bc 0.99962

110 97.16±0.48 0.36±0.04abc 0.99821

Diferentes letras (a, b, c) de subíndice en la misma columna significan que hay diferencia significativa

(p≤0.05)

Se realizó un análisis de varianza para conocer si existe diferencia significativa entre las

velocidad de secado a las temperaturas evaluadas. La figura 19 presenta el gráfico de

medias de las velocidades de secado con respecto a las temperaturas, los resultados indican

que sólo presentaron diferencias significativas, la velocidad de secado de la temperatura de

secado de 40 y 50°C con respecto a 600 ⁰ C. En la tabla 7 también es posible apreciar que

la máxima pérdida de agua posible a alcanzar a las temperaturas evaluadas fue en un

intervalo de 90 a 95 % e indicando que sólo para la temperatura de 110°C fue superior a

95%.


55

Temperatura (C)Velo

cid

ad

de s

ecad

o (

dw

po

rcen

taje

de h

um

ed

ad

/dt)

40 50 60 70 80 90 100 110

-0.06

0.14

0.34

0.54

0.74

7.2.1. Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos

polifenólicos de los subproductos de limón italiano.

La tabla 8 presenta los valores de las concentraciones de polifenoles obtenidos a partir de

la extracción de las harinas de subproductos de limón italiano con respecto a los diferentes

tiempos de secado para cada una de las temperaturas evaluadas. La muestra fresca mostró

una concentración de polifenoles de 73.7±7.0 mg EAG/g b.s. De las temperaturas

evaluadas, la temperatura de 40 ⁰C presentó a las 12 horas la mayor concentración de

polifenoles totales 43.7 ±1.2 mg EAG/g b.s. y a 50 ⁰C a las 48h la menor concentración

28.9±10 mg EAG/g b.s. Los resultados obtenidos indicaron concentraciones de polifenoles

totales superiores a 28 mg EAG/g b.s. en todos los extractos analizados. Los resultados

obtenidos también indicaron que cuando los subproductos fueron secados a temperaturas

mayores de 40 ⁰C el contenido de compuestos polifenólicos fue significativamente (P<

0.05) inferior al obtenido en los subproductos en fresco. Li, B y col., (2006), mencionaron

que durante el proceso de secado tanto la temperatura como el tiempo largos de secado

podrían afectar algunos de los compuestos polifenólicos, reduciendo la presencia de los

mismos; adicionalmente sugieren que el agua presente en las células vegetales pudieran

tener un efecto benéfico en la extracción de polifenoles; por lo tanto, al tener una mayor

reducción de agua en los subproductos, todo los componentes tales como, membranas y

orgánulos presentes en las células se adhirieron por la ausencia de agua, haciendo la

extracción más difícil, como resultado, la recuperación global fue menor. Lo anterior

concuerda a lo obtenido en el presente trabajo ya que al ser secados los subproductos y

Figura 19. Gráfico de medias de la velocidad de secado


56

posteriormente utilizados para la extracción, la recuperación fue más baja, que en el

material fresco.

Chen M-L. y col., (2011), quienes estudiaron la concentración de compuestos polifenólicos

en cascara de naranja (C. sinensis (L.) Osbeck) secada a 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ⁰C,

reportaron que la concentración de polifenoles totales en los extractos incrementaba

conforme aumentaba la temperatura de secado. Reportando para la muestra en fresco

39.4±5.1 mg EAG/g b.s de compuestos polifenólicos y para la temperatura de 50 y 60 ⁰C

concentraciones significativamente inferiores al de la cáscara en fresco (P <0.05). Al igual

observaron que el contenido de compuestos fenólicos aumentaba gradualmente a medida

que las temperaturas de secado incrementaban. La concentración más alta de compuestos

fenólicos fue de 65.72 ± 3.42 mg EAG /g b.s. para las cáscaras secadas a 100 ⁰C. Este

contenido incrementó alrededor de dos veces en comparación con el de la cáscara fresca.

Los autores mencionan que la formación de sustancias fenólicas se produjo durante el

secado a 70 ⁰C y el incremento de estos compuestos fenólicos pudo deberse a la

disponibilidad de precursores de moléculas fenólicas o por la interconversión no enzimática

entre las moléculas fenólicas.

Tabla 8. Concentración de compuestos polifenólicos en extractos de harinas de subproductos del Limón

italiano

Concentración de polifenoles mg EAG /g (base seca)

Temperatura

⁰ C

12h 24h 36h 48h

40 43.7±1.2a 36.0±2.5

a 32.4±1.4

b 30.1±0.6

dc

50 38.0±3.7b 30.6 ±2.0

c 29.7±0.8

c 28.9±10

d

60 30.5±2.5d 32.1±1.5

bc 30.0±1.8

c 32.8±2.0

b

70 30.9 ±1.6dc

30.4±0.9c 32.1±0.2

bc 34.9±0.2

cb

80 31.8±2.3dc

33.0±1.1b 29.7±1.7

c 32.7±0.9

b

90 29.6±4.4d 32.1±1.7

bc 31.8±1.7

bc 29.5±0.9

d

100 35.0±1.3cb

37.6±1.2a 36.2±1.7

a 35.8±1.1

a

110 37.3±1.3b 37.0 ±1.3

a 32.9±2.9

b 33.7±2.1

ab

Cada valor es el promedio ± desviación estándar

EAG; equivalente de ácido gálico

Diferentes letras (a, b, c, d) de subíndice en la misma columna significan que hay diferencia significativa

(p≤0.05)


57

Con los resultados de la concentración de polifenoles totales, se realizó un análisis de

varianza (ANOVA) obteniendo como resultado que el tiempo y la interacción temperatura

y tiempo tuvieron un efecto significativo sobre la concentración de polifenoles, resultado

que se puede corroborar en el diagrama de Pareto (figura 20a) ya que el valor P es menor

al nivel de significancia (α= 0.05) establecido. Con el grafico de interacción (figura 20b) se

obtuvo que los extractos que presentaron mayor concentración de polifenoles fueron los de

harinas de subproducto de limón italiano secados a temperatura de 40 y 50⁰C a un tiempo

de 12 h (43.7±1.2 y 38.0±3.7mg EAG /g b.s.). Sin embargo las harinas secadas a estas

condiciones no presentaron la humedad establecida por la CODEX para harina por lo cual

estas condiciones no son recomendadas para secado de estos productos en cuanto a

concentraciones de polifenoles se refiere. Por otro lado, se obtuvo que los extractos de

harinas de subproductos secados a temperaturas de 100 y 110 ⁰C presentaron mayor

concentración de compuestos polifenólicos en comparación con las temperaturas de 50,

60,70, 80 y 90 ⁰ C, obteniendo valores aproximados de 35.9±2.9 a 37.6±1.2 mg EAG/ g b.s

y con una humedad inferior al 15 por ciento tal como lo establece la CODEX. Estas

temperaturas en función del contenido de polifenoles totales son las recomendadas.

7.2.2. Actividad antimicrobiana

Una vez obtenidos los extractos polifenólicos, se prosiguió con la determinación de la

actividad antimicrobiana. En la tabla 9 se muestra de manera cualitativa la presencia de

actividad antimicrobiana de los extractos de harinas de subproducto de limón italiano

secados a las diferentes temperaturas y tiempos. Para esta prueba el análisis fue cualitativo

Co

ncen

tració

n d

e p

olife

no

les

(mg

/g)

Temperatura (C)

28

32

36

40

44

40 50 60 70 80 90 100 110

Tiempo (h)

12

2436

48


0 1 2 3 4

A:Temperatura

AB

B:Tiempo

+

-

a) Gráfica de Pareto de la

concentración de polifenoles

b) Gráfica de interacción de la

concentración de polifenoles

Figura 20. Gráfica de Pareto para a) concentración de polifenoles y b) grafica de interacción de la concentración

de polifenoles


58

y se usó como referencia una escala de mayor a menor actividad, de acuerdo a los

resultados, tres cruces indicaron una mayor presencia de actividad antimicrobiana es decir

ausencia de unidades formadoras de colonias, dos cruces indicaron actividad

antimicrobiana media (2 a 12 Unidades Formadoras de Colonias “UFC”) y el signo menos

significo que no hubo actividad antimicrobiana (12 o más UFC), éste último valor obtenido

a partir del control. Para proceder con el análisis y fuera comparativo, los extractos se

ajustaron a una concentración de 28 mg EAG/g b.s de polifenoles (mínima concentración

de polifenoles obtenida a partir de los extractos de harina de subproducto). Los resultados

indicaron que todos los extractos polifenólicos obtenidos presentaron actividad

antimicrobiana contra S. aureus, sin embargo sólo los extractos de subproductos secados a

50 y 110 °C presentaron actividad contra E. coli y S. typhimurium (Ver tabla 9), esto pudo

deberse a la presencia de compuestos bioactivos en las muestras. Estudios realizados por

Yi, Z y col., (2008), reportaron que extractos de hesperedina, nobiletina y tangerina

presentados en Pericarpium Citri Reticulatae inhibieron el crecimiento de las cepas E. coli,

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Salmonella

typhi y Enterobacter cloacae. Para demostrar lo anterior los autores determinaron la

concentración mínima inhibitoria (CMI) de las seis cepas, obteniendo como resultado que

la hesperedina reporto una CMI de 200 μg /mL b.s. contra la cepa Staphylococcus aureus;

400 μg /mL b.s. contra las cepas Enterococcus faecalis y Staphylococcus epidermidis; y

800 μg /mL b.s contra las cepas E. coli y Salmonella typhi. Solo para las bacterias E. coli y

Staphylococcus aureus los extractos de nobiletina y tangerina presentaron una CMI de 1600

μg /mL b.s. Los autores a su vez indican que ha razón de la baja actividad antimicrobiana

de la tangeretina y nobiletina pudo ser debido a su estructura polimetoxilada, aunque esta

estructura puede ser ventajosa como antiproliferativos, antiinflamatorios y antimetastásico.

Mandalari, G. y col., (2007), quienes determinaron la actividad antimicrobiana de extractos

polifenólicos de cascara de bergamota (Citrus bergamia Risso), indicaron que los extractos

conteniendo neohesperedina, hesperetina, neoeriocitrina, naringina y naringenina

presentaron inhibición contra las bacterias Escherichia coli, Salmonella entérica,

Pseudomonas putida, bacillus subtilis, listeria innocua, lactococcus lactis, Staphylococcus

aureus y saccharomyces cerevisiae. Al igual, reportaron que el extracto de erioditiol

también presentó una alta inhibición para estos microorganismos. La actividad


59

antimicrobiana de acuerdo a los estudios previamente mencionados se asocia a la

interacción entre las diferentes agliconas o por el sinergismo entre los compuestos debido a

su reacción combinada con la membrana celular como un posible sitio de diana primaria,

pero con diferente modo de acción inhibitoria.

Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos de harina de subproducto de limón italiano contra las

bacterias 1) S. typhimurium, 2) S. aureus, 3) E. coli, a diferentes temperatura (T) y tiempos (t) de secado

+++: Mayor actividad antimicrobiana sin presencia de bacterias;

++: Media actividad antimicrobiana de 2 a 12 UFC.

-: Ausencia antimicrobiana de 12 o más UFC.

T

(⁰C)

t

(h)

Actividad antimicrobiana T

(⁰C)

t

(h)

Actividad

antimicrobiana

1 2 3 1 2 3

Ambiente 0 + +++ ++ Ambiente 0 + +++ ++

40 12 - +++ - 80 12 - +++ - 24 - +++ - 24 - +++ - 36 - +++ - 36 - +++ - 48 - +++ - 48 - +++ -

50 12 ++ +++ +++ 90 12 - ++ - 24 ++ +++ - 24 - +++ - 36 - +++ +++ 36 - +++ - 48 ++ +++ +++ 48 - +++ -

60 12 - +++ - 100 12 - +++ - 24 - ++ - 24 - ++ - 36 - +++ - 36 - +++ - 48 - +++ - 48 - +++ ++

70 12 - +++ - 110 12 ++ +++ ++ 24 - ++ - 24 ++ +++ ++ 36 - +++ - 36 ++ +++ - 48 - +++ - 48 ++ +++ ++


60

7.2.3. Actividad antioxidante

La actividad antioxidante se refiere al parámetro que determina qué tanto un compuesto

antioxidante evita que su sustrato se oxide. Normalmente se representa como porcentaje de

inhibición de un radical libre. Si el valor es cercano a cien por ciento, la actividad

antioxidante del compuesto es alta. Para evaluar el análisis de la actividad antioxidante de

extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano, fue necesario ajustar los

extractos a una concentración de 28 mg EAG/g b.s. con la finalidad de observar si la

temperatura y tiempo de secado de los subproductos de limón italiano afectaban el

porcentaje de inhibición del radical DPPH.

En la figura 21 se representa el porcentaje de inhibición del radical DPPH obtenidos de los

extractos polifenólicos de subproductos de limón italiano secados a las diferentes

temperaturas y tiempos. De los resultados se obtiene que el extracto de la muestra fresca

presentó un porcentaje de inhibición del 5.3±1.1 %, lo que nos indica que si bien la

concentración de polifenoles totales es elevada la actividad antioxidante es menor. El

mayor porcentaje de inhibición obtenido en el presente trabajo fue con los extractos

obtenidos a la temperatura de 50 ⁰C y36 h (78±2.1 % de inhibición del radical DPPH) y el

menor fue del obtenido 100 ⁰C a las 12h de secado (24.1±4.9 % de inhibición del radical

DPPH). Así mismo, Al igual se observó que los extractos de harina de subproductos

secados a altas temperaturas, redujeron el porcentaje de inhibición del radical DPPH.

El extracto polifenólico de la harina de subproducto que fue secado a la temperatura de 90

⁰C, presentó un incremento en el porcentaje de inhibición en comparación con la

temperatura de 70, 80, 100 y 110 ⁰C en todos los tiempos. Estos resultados indicaron que

los compuestos activos se ven afectados por el incremento de la temperatura durante el

secado de los subproductos del limón italiano más que por el tiempo.

De acuerdo a Chen, M., y col., (2011) quienes reportaron que el porcentaje de inhibición

del radicales DPPH aumenta conforme incrementaba la temperatura de secado encascaras

de naranja, Indicaron que para una concentración de 1.6 mg/mL de polifenoles, observaron

que el porcentaje de inhibición en los tratamientos de secado a 50, 60, 70,80, 90 y 100 ⁰C


61

Figura 21. Porcentaje de inhibición de extractos de harina de subproducto de limón italiano con respecto a las

temperaturas a diferentes tiempos de secado

fueron de 37.3, 38.3, 29.1, 46.2, 68.4, 70.2 y 80.1%, respectivamente. Lo anterior fue

atribuido a que compuestos fenólicos de bajo peso molecular podrían ser formados en las

cáscaras calentadas. Sin embargo, la temperatura de 70 ⁰C presentó un porcentaje de

inhibición menor que las temperaturas de 50 y 60 ⁰C. Este resultado pudo deberse a la

ausencia de grupos hidroxilo en el anillo B de los flavonoides lo que podría disminuir su

actividad secuestradora. Estos autores concluyen que la actividad antioxidantes del extracto

puede verse afectada por el calentamiento, modificando la estructura de los flavonoides y

presentando como consecuencia un efecto en la actividad antioxidante, similar a lo

obtenido en el presente trabajo.

Yi, Z. y col., (2007) reportaron que el porcentaje de inhibición del radical DPPH de los

extractos de hesperidina, nobiletina y tangeretina del fruto Pericarpium Citri Reticulatae

aumentaba conforme aumentaba la concentración de los compuestos. Para los extractos de

nobiletina y tangeretina el porcentaje de inhibición a las mismas concentraciones reportó

valores muy cercanos, debido a que las estructuras de estos compuestos son similares. Para

el extracto de hesperidina el porcentaje de inhibición fue mucho menor en comparación con

los otros dos, debido a la ausencia de grupo hidroxilo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

ra

dic

al

DP

PH

(%

)

Temperatura (⁰C)

12h

24h

36h

48h


62

El análisis de varianza del porcentaje de inhibición del radical DPPH indicó que tanto el

factor temperatura como el tiempo y la interacción de los mismos tienen un efecto

significativo en la respuesta lo cual es observado en la gráfica de Pareto (figura 22).Las

condiciones más adecuadas para obtener mayor porcentaje de inhibición del radical DPPH

seria utilizando extractos de harina de subproductos de limón italiano secadas a 50 ⁰C a un

tiempo de 36h. Lo cual indica que los compuestos fenólicos de bajo peso molecular con alta

actividad antioxidante podrían ser formados en los subproductos calentados, o quizá habría

presencia de la eriocitrina (compuesto con mayor actividad antioxidante de todos los

flavonoides glucósidos presentes en el limón).

7.2.4. Color

El color de las harinas es un atributo importante tanto para la harina como los productos

elaborados a base de ella. Es una práctica común, juzgar la calidad de estos alimentos en

función del color de los mismos. Esta propiedad física, sensorialmente es la más importante

asociada con el sentido de la vista (López, J. y col., 2010). Por lo cual, es importante

evaluar visualmente el alimento, por ser el primer juicio hecho por los consumidos en la

calidad de la apariencia física y color.

Durante la determinación del color se obtuvo como resultado que el tratamiento térmico

evaluado en los subproductos de limón italiano (transformado en harina) afectó la

coloración. Estos subproductos cítricos después de su proceso industrial aun contienen

residuos de azucares reductores tales como glucosa, sacarosa, fructosa y carbohidratos que

pueden experimentar una reacción de Maillard con la intervención de compuestos amino

durante el secado produciendo un color pardo. Al igual, la reacción enzimática podría


0 1 2 3 4 5 6

AB

B:Tiempo (h)

A:Temperatura (C)

+

-

Figura 22. Gráfica de Pareto para el porcentaje de inhibición del radical DPPH


63

cambiar la coloración de los subproductos deshidratados a color marrón o más oscuro

debido a la oxidación de fenoles (Chong, C. y col., 2013).

En la figura 23 se observa el comportamiento del parámetro de color: luminosidad (L*),

croma (C*) y hue (h⁰) de las harinas de subproducto de limón italiano obtenidas a

diferentes temperaturas y tiempos. La figura 23a describe una disminución en la

luminosidad de las harinas conforme aumenta la temperatura y tiempo de secado de los

subproductos. La muestra fresca presentó un valor de luminosidad de 65.9 ± 0.7. Por su

parte, la mayor luminosidad de harinas se presentó a las temperaturas de 40 a 60 ⁰C, con un

valor promedio de luminosidad de 71±0.1 y la menor luminosidad a temperaturas de 110

⁰C a las 48h con un valor promedio de 41.2±0.4. La reducción de la luminosidad a las

temperaturas de 70 hasta 110 ⁰C, pudo deberse al efecto de reacciones no enzimáticas como

la reacción de Maillard producida entre los azucares reductores y aminoácidos (Chong, C. y

col., 2013).

La figura 23b representa el comportamiento del parámetro croma (C*) de harinas de

subproducto de limón italiano. Reportando para la muestra en fresco una saturación de

30.7±0.9. El mayor valor de C* (33.2±0.2) fue en la harina secada a 50 ⁰C a las 12 hora y el

menor valor en la harina secada a 110 ⁰C a 36 h con un valor de C* de 24.4 ± 0.1. La

variaciones de los resultados de la cromaticidad representan lo llamativo o apagado de las

harinas analizadas. La figura 23c, representa la disminución constante del parámetro hue

en las diferentes muestras de harina obtenidas a diferentes temperaturas y tiempos. La

muestra en fresco reportó un ángulo de hue de 94.5 ±0.011⁰ lo que indica que se encuentra

en los colores amarillos. El mayor valor del ángulo hue (49±0.001⁰) se encontró a 40 ⁰C a

las 24h y una menor concentración de hue (61.45±0.002 ⁰) se encontró presente a las 110

⁰C a las 36h. Los valores de hue permiten interpretar el ángulo de la medición polar lo que

indica que a mayor temperatura y tiempo de secado, los subproductos de limón italiano

tienden a colores rojos intensos.


64

Los analisis de varianza realizados para los parámetros determinados de color se resumen

con los graficos de Pareto (figura 24). En la figura 24a, para la respuesta de luminosidad

de harinas de subproducto de limón italiano se observa que el factor de temperatura, tiempo

y la interacción temperatura y tiempo tienen un efecto significativo en la respuesta. La

temperatura es el principal factor que tiene influencia en la luminosidad. Para la respuesta

de cromaticidad (figura 24b), se observa que el factor temperatura y tiempo tienen un

efecto significativo en la respuesta, principalmente la temperatura y para la respuesta de

hue (figura 24 c) se obtuvo un efecto en la temperatura, tiempo y la interacción, siendo la

temperatura la que dé mayor influencia sobre la variable.

35

40

45

50

55

60

65

70

75

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Lu

min

osi

da

d L

*

Temperatura (⁰C)

12 h

24 h

36 h

48 h

22

24

26

28

30

32

34

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Cro

ma

C*

Temperatura (C)

12 h

24 h

36 h

48 h

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110

Hu

e h

*

Temperatura (⁰C)

12 h

24 h

36 h

48 h

a) b)

c)

Figura 23. Gráfica de parametros de color a) luminosidad (L*), b) cromaticidad (C*) y c) de hue (h⁰) de las harinas

de subproducto de limón italiano secadas a diferentes temperaturas


65

Despues de analizar los resultados obtenidos de todas las respuestas obtenidas en el primer

diseño factorial 4 x 8, se pudo observar que los extractos polifenólicos de harina de

subproductos secados a las temperaturas extremas evaluadas 40, 50, 100 y 110 ⁰C

obtuvieron concentraciones elevadas a menores tiempos, sin embargo a ese tiempo solo las

temperaturas altas obtuvieron la humedad requerida de acuerdo a la norma. En cuanto a la

actividad biológica la actividad oxidante se vio favorecida en los extractos obtenidos a

bajas temperaturas y tiempos cortos, mientras que para la actividad antimicrobiana no se

pudo identificar un comportamiento específico en función de los factores evaluados. De

acuerdo a lo anterior se decidió plantear otro diseño experimental basado en dos

temperaturas extremas las cuales presentaron mejores resultados a lo largo de los análisis

previos siendo estas las temperaturas de 50 y 110°C, así mismo se decidió reducir el tiempo

de muestreo con la finalidad de reducir el tiempo de secado y observar a detalle el

comportamiento de las muestras. En cuanto a la concentración de polifenoles y a la

actividad biológica de los extractos.


0 4 8 12 16 20

AB

B:Tiempo (h)

A:Temperatura (C)

+

-

a) Gráfica de Pareto de la luminosidad


0 2 4 6 8

AB

B:Tiempo

A:Temperatura

+

-

b) Gráfica de Pareto de la cromaticidad

c) Gráfica de Pareto de hue


0 5 10 15 20 25

AB

B:Tiempo (h)

A:Temperatura (C)

+

-

Figura 24. Gráfica de Pareto para a) luminosidad (L*), b) Cromaticidad (C*) y c) hue (h⁰)


66

7.3. Evaluación del efecto de las temperaturas de 50°C y 110°C en la reducción de

humedad y concentración de polifenoles de subproductos de limón italiano.

Como se mencionó anteriormente, los niveles del diseño factorial 2 x 8 fueron elegidos de

acuerdo a los resultados obtenidos en el primer diseño factorial 4 x 8, se evaluaron dos

temperaturas ubicadas en los extremos del primer diseño factorial con tiempos más corto de

secado para reducir el tiempo del mismo, así como evaluar si la concentración de

polifenoles influye en la actividad biológica.

Los niveles del tiempo a estudiar fueron 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 h para 50 ⁰C y 2, 4, 6, 8,

10, 12, 14 y16 h para 110 ⁰C

La figura 25 describe la reducción del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de

limón italiano con respecto al tiempo y la temperatura de secado evaluada. La muestra en

fresco presentó una humedad de 80.8 ±0.2 %. Para la temperatura de secado de 50 ⁰C la

menor humedad (7.8±0.5%) se alcanzó hasta las 18h. Para la temperatura de secado de 110

⁰C la menor humedad se obtuvo a las 8 h (2.5±0.3 %), así mismo los resultados de la

humedad de harinas de los subproductos indicaron que los tiempos 8, 10, 12, 14 y 16 h

para la temperatura de 110 ⁰C y los tiempos 18, 21 y 24 h para las temperaturas de secado

50 ⁰C, obtuvieron humedad del 15 % tal como establece la CODEX para harina.

Figura 25. Reducción del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de limón italiano

El análisis de varianza indicó que los factores principales tiempo y temperatura y su

interacción presentados en el diagrama de Pareto (figura 26a) tuvieron efecto significativo

sobre el porcentaje de humedad ya que el valor P fue menor al nivel de significancia (α=

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Porc

enta

je d

e hum

edad

(%

)

Tíempo (h)

50 ⁰C

110 ⁰C


67

0.05) establecido, mostrando que el tiempo mostró el mayor efecto sobre el porcentaje de

humedad.

7.3. a. Velocidad de secado de harinas de subproducto de limón italiano

Para determinar la velocidad de secado de los subproductos de limón italiano, fue necesario

graficar el porcentaje de reducción de H2O contenida en los subproductos con respecto al

tiempo de secado tal como lo muestra la figura 27, con ayuda del programa OriginPro 8 en

función de la ecuación de SGompertz (Anexo 4) se calculó el valor de la velocidad de

secado (k) para cada temperatura evaluada. Obteniendo como resultado los datos indicados

en la tabla 10.

Figura 27. Velocidad de secado de las harinas de subproducto de limón italiano

Por la estabilización en la pérdida de agua en los sistemas a las temperaturas evaluadas se

debió al fenómeno denominado “acortezamiento” (“case hardening”), este efecto impide la

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

dw

Po

rcen

taje

de

H2O

(%

)

Tiempo (h)

50 ⁰C

110 ⁰C


0 3 6 9 12 15

AB

A:Temperatura (C)

B:Tiempo (h)

+

-

Figura 26. Gráfica de Pareto para el porcentaje de humedad de muestras de harina de subproductos

de limón italiano


68

liberación de agua en el alimento debido a la formación de una capa superficial dura e

impenetrable que ralentiza la velocidad de secado (Garau, M. y col., 2007). Diferentes

autores han observado este fenómeno durante la deshidratación de diferentes productos

alimenticios (Cañizares, A. y col., 2007).

Los resultados de la velocidad de secado (k), la mayor pérdida de H2O de los subproductos

secados (a) y el coeficiente de correlación (r) que se obtuvo al emplear la ecuación de

SGompertz se observan en la tabla 10. A la temperatura de secado de 110 ⁰C se observó

mayor velocidad de pérdida de humedad en comparación con la temperatura de 50 ⁰C con

valores de 0.27±0.04 y 0.84 ±0.84 porcentaje de H2O / h respectivamente. De igual forma

se observa que al aumentar el tiempo de secado la perdida de humedad aumentaba hasta

obtener un valor constante, este efecto puede ser explicado con base a la disminución de la

transferencia de calor de la pared al solido que se está secando (Brennan, J. 2008) El

análisis de varianza indicó que si existe diferencia significativa entre las velocidades

obtenidas, (figura 28)

Tabla 10. Valores obtenidos de la ecuación de la recta en la cinética de secado

Temperatura

(⁰C)

Perdida

máxima de

H2O(a)

Velocidad

(k)

Coeficiente de error

50 125.14±10.81 0.27±0.04 0.9742

110 99.53±0.18 0.84±0.84 0.9625

Figura 28. Gráfico de medias de la velocidad de secado

Temperatura (C)

Velo

cid

ad

de s

ecad

o (

po

rcen

taje

de H

2O

50 110

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2


69

7.3.1 .Efecto de la temperatura y tiempo de secado en la concentración de compuestos

polifenólicos de los subproductos de limón italiano.

La figura 29 describe el comportamiento de la concentración de polifenoles totales

obtenidos de los extractos de harina de subproductos de limón italiano secados a las

temperaturas de 50 y 110 ⁰C a los diferentes tiempos evaluados. Cabe mencionar que los

tiempos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 h presentados en la gráfica, corresponden a 3, 6, 9, 12,15, 18,

21 y 24 h para la temperatura de 50 ⁰C y 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 h para la temperatura de

110 ⁰C. La codificación de los tiempos fue realizada con el fin de tener un mejor manejo en

los resultados.

La cantidad de compuestos polifenólicos en el extracto fresco fue de 55.6±3.1 mg EAG/g b.

s. La temperatura de 50 ⁰C a las 3 h presentó mayor concentración de polifenoles (55.4±6.7

mg EAG/g b. s.) y la menor a las 21h (23.3±4.1 mg/g b.s). Para la temperatura de secado de

110 ⁰C, la mayor concentración reportada de polifenoles fue a las 2h (57.0±8.5 mg/g b.s.) y

la menor a las 6h (31.7±0.7 mg EAG/g b.s). Los extractos de harinas de subproductos

cítricos que obtuvieron el 15 % de humedad a la temperatura de 50 y 110 ⁰C no presentaron

diferencia significativa en la concentración de polifenoles siendo mayores para la

temperatura de 110°C.

Los resultados obtenidos concuerdan con Chen M-L. y col., (2011), quienes estudiaron la

concentración de compuestos polifenólicos en cascara de naranja (C. sinensis (L.) Osbeck)

secada a 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ⁰C. Ellos reportaron que la concentración de polifenoles

totales en los extractos incrementaba conforme aumentaba la temperatura de secado.

Obtuvieron concentraciones de polifenoles de 37.89±0.65 mg/g b.s. para la temperatura de

50 ⁰C y 65.72 ± 3.42 mg/g b.s para la temperatura de100 ⁰C.

Sin embargo en este trabajo se observó que al ir aumentando el tiempo de secado para las

dos temperaturas la concentración de polifenoles reducía. Resultados que concuerdan con

Li, B y col., (2006), que mencionan que el proceso de secado (la temperatura o largos

tiempos de secado) podrían afectar a algunos compuestos polifenólicos; así mismo cabe

mencionar que el agua presente en las células vegetales pudo haber ayudado a la extracción

de polifenoles.


70

Figura 29. Concentración de polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano

Con los resultados de la concentración de polifenoles totales, se realizó un análisis de

varianza (ANOVA) obteniendo como resultado que el tiempo, temperatura y la interacción

temperatura y tiempo tuvieron un efecto significativo sobre la concentración de polifenoles,

resultado resumido en el diagrama de Pareto (figura 30a) ya que el valor P es menor al

nivel de significancia (α= 0.05) establecido. Con el grafico de interacción figura 30b se

obtuvo que los extractos que presentaron mayor concentración de polifenoles fueron los

extractos de harina de subproducto de limón italiano secados a 50 y 110⁰C a su menor

tiempo. Sin embargo los subproductos secados a estas condiciones no presentaron la

humedad establecida por la CODEX para harina por lo tanto, estas condiciones no son

recomendadas para este trabajo. Por otro lado, se obtuvo que los extractos de harinas de

subproductos secados a temperaturas de 110 ⁰C presentaron mayor concentración de

compuestos polifenólicos en comparación con las temperaturas de 50 ⁰ C y con una

humedad inferior al 15 por ciento tal como lo establece la CODEX.

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

1 2 3 4 5 6 7 8

Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

(mg

/g b

.s)

Tiempo (h)

50 ⁰C

110 ⁰C


71

7.3.2. Actividad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana para este diseño factorial 2x8, solo fue determinado en los

extractos de harinas de subproducto de limón italiano que presentaron porcentaje de

humedad del 15 % o menos en conformidad a lo establecido por la CODEX para harina. La

determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los extractos fue evaluada

contra los microorganismos S. typhimurium, S. aureus y E. coli. Para ello los extractos

fueron ajustados a 23.3 mg /g b.s. de polifenoles (mínima concentración de polifenoles en

extractos de harina de subproducto sin requerir concentrar la muestra).

En la tabla 11se presentan los resultados de CMI de los extractos polifenólicos de harina de

subproducto de limón italiano contra las bacterias S. typhimurium, S. aureus y E. coli. La

CMI contra la bacteria S. typhimurium fue de 5.8±0.0 mg EAG/g b.s para los extractos

obtenidos a las 21 y 24 h para la temperatura de 50 ⁰C y a las 12h para 110 ⁰C. La CMI

contra la bacteria S. aureus fue de 11.7 ±0 mg EAG/g b.s para los extractos obtenidos a los

tiempos 18, 21 y 24 h a la temperatura de 50 ⁰C. Y para extractos obtenidos a las 24h a la

temperatura de 110 ⁰C. Para la inhibición de la bacteria E. coli, la CMI fue de 11.7 ±0 mg

EAG /g b.s. a las 24 h a 50 ⁰C y al tiempo de14 y 16 h para la temperatura de secado de 110

⁰C. Al determinar la CMI con la técnica de dilución, se observó que los extractos de

polifenoles de harinas de subproducto de limón italiano mostraron actividad antimicrobiana

frente a las bacterias S. typhimurium, S. aureus, E. coli.

Yi, Z y col., (2008), obtuvieron una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 200 μg /mL


0 1 2 3 4 5

A:Temperatura (C)

AB

B:Tiempo (h)

+

-

Concentr

ació

n d

e p

olife

nole

s (m

g/g

) b.s

Temperatura (C)

Tiempo (h)

1

23

4

56

7

8

23

33

43

53

63

50 110

a) Gráfica de Pareto de la

concentración de polifenoles totales

b) Gráfica de interacción de la

concentración de polifenoles totales

Figura 30. Grafica de Pareto a) concentración de polifenoles totales y b) interacción de polifenoles totales


72

del microorganismo Staphylococcus aureus, al emplear extractos de hesperedina y 800 μg

/mL b.s contra las cepas E. coli y Salmonella typhi.

Mandalari, G. y col., (2007) quienes estudiaron la CMI de extractos polifenólicos de

cascara de bergamota (Citrus bergamia Risso).obtuvieron que los extractos de

neohesperedina, hesperetina, neoeriocitrina, naringina y naringenina presentaron CMI de

›1000 μg/mL para las bacterias Escherichia coli, Salmonella entérica, Pseudomonas

putida, bacillus subtilis, listeria innocua, lactococcus lactis, Staphylococcus aureus y

saccharomyces cerevisiae. Al igual, reportaron que el extracto de erioditiol presento la

mejor CMI con un promedio de 662 μg/ mL para estos microorganismos. Como se

mencionó anteriormente estos autores mencionan que la inhibición de los microorganismos

pudo deberse a la interacción entre las diferentes agliconas o por el sinergismo entre los

compuestos debido a su reacción combinada con la membrana celular como un posible sitio

de diana primaria, pero con diferente modo de acción inhibitoria. Así mismo, diversos

autores han reportado que la actividad antimicrobiana (Mandalari, G. y col., 2007) y

antioxidante (Alothman, A., 2009 y Chen, M., 2011) depende del compuesto presente en el

extracto y no de la alta concentración de polifenoles.

En los análisis estadísticos se observó por medio del gráfico de media que no existe

diferencia significativa entre los tratamientos realizados a la temperatura de 50 y 100 ⁰C

para la CMI de las bacteria S. typhimurium (figura 31 a), S. aureus (figura 31c) y E. coli

(figura 31e). Con el grafico de interacción se observó que la mejor CMI de polifenoles para

el microorganismo S. typhimurium (figura 31 b) fue de 5.8 mg/g b.s reportado a 50 ⁰C a

tiempos de 21 y 24 h. y para 110 ⁰C a las 12 h. Para el microorganismo S. aureus (figura

31 d) la gráfica de interacción indico que la CMI fue de 11.7 mg /g b.s para la temperatura

de 50 ⁰C a 21 y 24 h y para la temperatura 110 ⁰C fue al tiempo de 14 y 16 h. Por último la

mejor CMI de E. coli (figura 31 f) fue de 11.7 mg/g b.s a la temperatura de 50 ⁰C a un

tiempo de 24 h y para la temperatura de 110 ⁰C a 14 y 16 h.


73

7.3.3. Actividad antioxidante

Para evaluar la actividad antioxidante de los extractos polifenólicos de la harina de

subproducto de limón italiano, fue necesario ajustar los extractos a una concentración de

23.3 mg /g b.s. de polifenoles, con la finalidad de observar si la temperatura y tiempo de

secado de subproductos de limón italiano afectan el porcentaje de inhibición del radical

DPPH.

a) Gráfica de media de la CMI de

s.typhimurium

Temperatura (C)

CM

I de

S. ty

phim

uri

um

(m

g/g

) b.s

.

5

8

11

14

17

20

50 110

Tiempo (h)

1

23

Temperatura (C)

CM

I d

e S

. typ

him

uri

um

(m

g/g

) b

.s.

50 110

5.4

7.4

9.4

11.4

13.4

15.4

b) Gráfica de interacción de la CMI

de s.typhimurium

CM

I d

e S

.au

reu

s (m

g/g

) b

.s

50 110

Temperatura (C)

9.3

11.3

13.3

15.3

17.3

c) Gráfica de media de la CMI de

s. aureus

e) Gráfica de media de la CMI de

E. coli

Temperatura (C)

CM

I d

e E

.co

li (

mg

/g)

b.s

.

11

14

17

20

23

26

50 110

Tiempo (h)

1

23

f) Gráfica de interacción de la CMI

de E. coli

CM

I d

e S

.aure

us

(mg

/g)

b.s

Tiempo (h)

1

23

Temperatura (C)

11

13

15

17

19

50 110

d) Gráfica de interacción de la CMI

de s. aureus

CM

I d

e E

.co

li (

mg

/g)

b.s

.

50 110

Temperatura (C)

10

12

14

16

18

20

22

Figura 31. Grafica de Parateo a) CMI de S.typhimurium, c) CMI de S. aureus y e) CMI de E.coli y grafica

de interacción para b) CMI de S.typhimurium, d) CMI de S. aureus y f) CMI de E.coli


74

En la tabla 11, se presentan los resultados de la actividad antioxidante de los extractos de

harina de subproducto de limón italiano, expresada en porcentaje de inhibición (%) contra

el radical DPPH. El extracto polifenólicos que presentó mayor porcentaje de inhibición a 50

⁰C fue el obtenido a las 21 h (93.4±2.5 % de inhibición) y el que presentó menor actividad

fue el obtenido a las 18 h (66.6±1.7 % de inhibición). Los extractos polifenólicos obtenidos

a 110 ⁰C presentaron mayor porcentajes de inhibición de 50±5.2 % de inhibición a las 12h

y menor a las 16 h (35 ± 2.2 % de inhibición). Estos resultados nos indican que las

actividades más elevadas pudieron deberse a la presencia de diversos compuestos fenólicos

con actividad antioxidante, así mismo los bajos porcentaje de inhibición pudieron estar

influenciado por la ausencia de grupos hidroxilo en el anillo B de los flavonoides presentes

lo que podría disminuir su actividad secuestradora. Esto último puede estar relacionado a

cambios en la estructura de los flavonoides afectados por la actividad antioxidante del

extracto durante el tratamiento por calentamiento (Chen, M., y col., 2011).

Los resultados estadísticos indicaron (figura 32 a) que no existe diferencia significativa

entre las temperaturas de 50 y 110 ⁰C para el porcentaje de inhibición del radical DPPH.

Con el grafico de interacción (figura 32b) se observa que el mejor tratamiento fue a la

temperatura de 50 ⁰C a 21 h presentando el mayor porcentaje de inhibición del radical

DPPH (93.4±2.5 % de inhibición).

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

rad

ical

DP

PH

(%

)

50 110

Temperatura (C)

60

62

64

66

68

70

72

Temperatura (C)

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

rad

ical

DP

PH

(%

)

52

56

60

64

68

72

76

50 110

Tiempo (h)

1

23

a) grafico de media para el

porcentaje de inhibición

b) grafico de interacción para el

porcentaje de inhibición

Figura 32. Gráfico de media para a) porcentaje de inhibición del radical DPPH y b) grafico de interacción

para el porcentaje de inhibición


75

Dif

eren

tes

letr

as d

e su

bín

dic

e en

la

mis

ma

colu

mn

a p

ara

las

tem

per

atura

s d

e 5

0 y

10

0 ⁰

C (

a, b

, c,

d)

signif

ican q

ue

hay d

ifer

enci

a

sig

nif

icat

iva

(p≤

0.0

5).

ND

: p

rueb

a no

det

erm

inad

a

Ta

bla

11

.Res

ult

ado

s d

e la

co

nce

ntr

ació

n d

e p

oli

feno

les,

co

nce

ntr

ació

n m

ínim

a in

hib

ito

ria

y a

ctiv

idad

anti

mic

rob

iana

(po

rcen

taje

de

inhib

ició

n)

de

extr

acto

s d

e har

ina

de

sub

pro

duct

o d

e li

mó

n i

tali

ano

sec

ado

s a

50

⁰C

y 1

10

⁰C


76

7.4. Propiedades fisicoquímicas de harina de subproducto de limón italiano secadas a

50 y 110 ⁰C a diferentes tiempos.

La tabla 12, presenta los valores de las propiedades fisicoquímicas determinadas de las

harinas obtenidas del diseño factorial 2x8 que obtuvieron un porcentaje de humedad de

aproximadamente del 15 %. La luminosidad (figura 33a) de las harinas presentó diferencia

significativa a las temperaturas de secado evaluadas lo que indica que a mayor temperatura

y tiempo de secado las harinas pierden luminosidad. A la temperatura de 50 ⁰C las harinas

son más brillosas que las harinas obtenidas a 110 ⁰C. Para el parámetro hue que indica el

ángulo de medición polar, la temperatura de 50 ⁰C fue mayor que la temperatura de 110 ⁰C.

El pH de la harina se encontró en un rango de 3.43±0.02 a 3.52 ±0.02 para las dos

temperaturas. El porcentaje de acidez se presenta en un intervalo de 41.6 a 47.5 g ácido

cítrico / 100 mL.

Tabla 12. Resultados de color, pH y porcentaje de acidez de harinas obtenidas a 50 ⁰C y 110 ⁰C

Diferentes letras de subíndice en la misma columna para las temperaturas de 50 y 100 ⁰C (a, b, c) significan

que hay diferencia significativa (p≤0.05).

En la figura 33, se ejemplifica con las gráficas de medias la presencia de diferencia

significativa en las temperaturas evaluadas en relación base a la luminosidad de las harinas

(figura 33a) observando que la temperatura de 50 ⁰C tiene los mejores resultados y en la

cromaticidad (figura 33b) la temperatura de 50 ⁰C presentó el mayor valor. Para hue

(figura 33c) la temperatura de 50 ⁰C fue la que presentó los valores más altos. Donde no se

observó diferencia significativa fue en el porcentaje de acidez (figura 33e). En la figura

33d se observa que la temperatura de 110 ⁰C tiene mayor pH sin ser significativamente

diferente.

Temperatura

(⁰C)

Tiempo

(h)

Color pH % Acidez (g ácido

cítrico/ 100mL) L* C* h⁰

50 18 71.1±0.3c 31.5 ±0.2a 83.9±0.1a 3.52±0.02a 42.7±1.5b

21 72.7±0.2a 30.2±0.0b 84.3±0.1a 3.46±0.02b 41.6±0.0b

24 71.7±0.2b 31.5±0.2a 84.0±0.2a 3.43±0.02b 47.5±0.0a

110 12 50.8±0.1a 28.3±0.0a 69.1±0.0c 3.48±0.02b 43.8±0.0b

14 45.1±0.2b 28.0±0.0b 66.5±0.b 3.48±0.01b 43.8±0.0b

16 42.7±0.1c 27.7±0.1c 64.8±0.1a 3.51±0.0a 44.5±2.1b


77

Con base a los resultados presentado en el segundo diseño factorial 2x8, se determinó que

los subproductos de limón italiano secados a 50 ⁰C a 21 h (humedad del 7.8±0.5 %)

presentaron las mejores condición de secado, por su alta actividad biológica, reportando

una CMI de polifenoles contra las bacterias, S. typhimurium, S. aureus y E. coli de 5.8 ±0,

11.7±0, 17.5 ±8.2 mg EAG/g b.s respectivamente. Y un porcentaje de inhibición del radical

DPPH de 93.4 ±2.5 %.en comparación con la temperatura de secado de 110 ⁰C, que solo

presentó una alta concentración de polifenoles con baja actividad biológica.

Temperatura (C)

Lu

min

osi

dad

(L

*)

50 110

44

49

54

59

64

69

74

Temperatura (C)

Cro

mati

cid

ad

(*

C)

50 110

27

28

29

30

31

32

Hu

e (

h0

)

50 110

Temperatura (C)

66

70

74

78

82

86

pH

50 110

Temperatura (C)

3.46

3.47

3.48

3.49

3.5

Temperatura (C)

Po

rcen

taje

de a

cid

ez (

g d

e á

cid

o c

itri

co

/10

0 m

L)

50 110

43

43.3

43.6

43.9

44.2

44.5

44.8

a) Grafica de media para la luminosidad b) Grafica de media para la cromaticidad

c) Grafica de media para hue d) Grafica de media para pH

e) Grafica de media para el porcentaje de acidez

Figura 33. Gráfica de media para a)luminosidad, b)cromaticidad,c) hue, d) pH y e) porcentaje de acidez


78

7.5. Análisis bromatológico de harina secada a 50 ⁰C por 21 h.

Se realizó un análisis bromatológico para evaluar las principales características de la

composición de la harina de subproducto de limón italiano (secadas a 50 ⁰C a las 21 h.)

con la presencia de polifenoles y posterior a la extracción de los mismos. Este análisis fue

realizado en el laboratorio de metales del CIATEJ Guadalajara, donde se analizaron la

humedad, proteína, cenizas, grasa, carbohidratos totales, fibra cruda, vitamina C, calcio y

potasio. Estos análisis reportaron como resultado los valores indicados en la tabla 13. La

humedad de las harinas con polifenoles (7.20 %) fue menor que la harina sin polifenoles

(11.72 %). Este aumento se debió al proceso de extracción de polifenoles, lo que implico

que la harina interactuara con disolventes lo cual provoco un aumento en la humedad. El

contenido de proteína en la harina con polifenoles y sin polifenoles fue menor al contenido

de proteínas en harina de maíz (8.54 %) (García, S. 2004). Las cenizas, grasas y

carbohidratos totales presentaron valores similares en la harina con polifenoles y sin

polifenoles. En cuanto a la fibra cruda, se observó que la harina sin polifenoles presento

mayor valor en comparación con la harina con polifenoles. Estudios realizados por García,

S. (2004) indicaron que la harina de maíz, maseca y minsa, presentaron un contenido de

4.05, 2.10 y 2.28 % (García, S. 2004), lo anterior indica que la fibra de harina de limón

italiano es mucho mayor que los valores reportado por Garcia, S (2004). Se ha reportado

que la fibra cruda es una medición que cuantifica principalmente celulosa y algunos tipos

de hemicelulosas por lo que puede ser utilizada como un buen sustrato para la producción

de alcohol de segunda generación, o para la formulación de alimentos para ganado o hasta

de consumo humano.

El contenido de calcio y potasio fue de 8 705.0 y 6 706.0 mg/kg respectivamente en las

harinas de subproducto de limón italiano y en las harinas sin polifenoles fue mucho menor

(tabla 13). La pérdida de estos elementos se pudo deber durante la extracción de los

compuestos polifenólicos por la interacción de solventes y agua.


79

Tabla 13. Concentración proximal de harina de subproducto de limón italiano secada a 50 ⁰C por 21 h

Determinación Harina de subproducto de limón italiano

Con polifenoles (% en peso) Sin polifenoles(% en peso)

Humedad 7.20 11.72

Proteína 5.97 5.45

Cenizas 6.39 6.92

Grasas 1.29 1.75

Carbohidratos totales 79.15 74.16

Fibra cruda 15.55 16.15

Vitamina C 3.53 (mg/100g muestra) 5.39 (mg/100g muestra)

Calcio 8 705.0 mg/kg 6 706.0

potasio 6 706.0 mg/kg 4 177.0

7.6. Balance de materia y rendimiento

La tabla 14 presenta resumido el balance de materia y el rendimiento de subproductos de

limón italiano cuando son procesados a diferentes temperaturas. La humedad del

subproducto del limón italiano fue de 84.5±0.9 % y de la harina fue de 7.8 ±0.8 %. Valor

que se encuentra dentro de lo establecido por la CODEX para harina. El subproducto de

limón italiano (cascara, bagazo, semilla) secado a 50⁰ C por 21 h presentó un rendimiento

de 15.5±0.8 g / 100 g de subproducto. El balance general se especifica en la figura 34.

Secado

Materia prima

Entrada S (100g)

XH2O

0.845 (84.5g)

Xsólidos

0.149 (14.6g)

Xpolif

0.000056 (5.6mg)

Salida S1 (83.3g)

(Agua evaporada) X

H2O 0.9999 (76.8g)

Xpolif

0.0000459 (1.77mg)

Salida S2 o Entrada

M (15.5g) X

H2O 0.077 (1.2g)

Xsólidos

0.921 (14.3)

Xpolif

0.00016 (3.83mg)

Figura 34. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el secado


80

Tabla 14. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el secado y el molido

Análisis Subproducto Harina

Humedad (%) 84.5±0.9 7.8±0.5

YMATERIA SECA/SUBPRODUCTO

(g/100g BH)

Durante secado

- 15.5 + 0.8

YHARINA/SUBPRODUCTO

(g/100g BS)

Durante molido

- 89.58

En la tabla 15 se presenta resumido el balance de materia y el rendimiento de la

concentración de polifenoles. Para la cuantificación de compuestos polifenoles en

subproducto cítrico se tuvo un rendimiento de 5.56±0.31 mg EAG / 100 g b.s. y en las

harinas se obtuvo un rendimiento de 2.33±0.041 mg EAG/g b.s. Durante el proceso de

secado de los subproductos de limón italiano se perdió 3.2 g/ 100 g de materia b.s.

Obtenido al final del proceso una concentración de 2.3 g/ 100g b. s. El balance general se

especifica en la figura 35

Después del seca y el molido de los subproductos de limón italiano se obtuvo para la harina

un rendimiento de 45g/ 100 g b.s.

Tabla 15. Balance de materia de polifenoles extraídos de harina de limón italiano

Análisis Subproducto Harina

Polifenoles totales mg/100g BS 5.56 ± 0.31 2.33 ± 0.41

YPOLIF.

DE HARINA/POLIF.

EN SUBPRODUCTO

(g /100g BS) Después del secado y

molienda

- 45

YPOLIF. EN

HARINA/SUBPRODUCTO

(g /100g BS)

Después del secado y molienda

- 2.3


81

La cáscara de cítrico deshidratada, es un subproducto de la industria citrícola cuyo mercado

principal es la obtención de pectina. En la actualidad se buscan otras alternativas aplicables

a estos subproductos. Debido a su gran contenido de fibra y su costo relativamente bajo,

comparado con su alto valor nutricional, podría transformarse en un producto base para la

elaboración de alimentos nutracéuticos .De igual forma, estos subproductos de acción

benéfica para la salud, podría convertirse en harinas funcional de aplicación veterinaria

(Albarracin, P.M. et al., 2011).

Materia prima

Entrada S (100g)

XH2O

0.845 (84.5g)

Xsólidos

0.149 (14.6g)

Xpolif

0.000056 (5.6mg)

Salida S1 (83.3g)

(Agua evaporada) X

H2O 0.9999 (76.8g)

Xpolif

0.0000459 (1.77mg)

Salida S2 o Entrada

M (15.5g) X

H2O 0.077 (1.2g)

Xsólidos

0.921 (14.3)

Xpolif

0.00016 (3.83mg)

Salida M1(1.53 g)

(pérdida) X

H2O 0.077 (0.115g)

Xsólidos

0.923 (1.385)

Xpolif

0.00102 (1.53mg)

Molido

Secado

Harina

Salida M2 (13.9g) X

H2O 0.077 (1.1g)

Xsólidos

0.922 (12.8g)

Xpolif

0.0016 (2.3mg)

Figura 35. Balance de materia y rendimiento de subproducto de limón italiano durante el secado y el

molido


82

7.7. Vida de anaquel de la harina de subproducto secado a 50 ⁰C por 21 h

Para determinar el tiempo de vida de anaquel de la harina que tuvo las mejores condiciones

de secado (50 ⁰C por 21 h) de subproducto de limón italiano, fue necesario el empleó de

metodologías como las utilizadas en las pruebas aceleradas de la determinación de la vida

de anaquel, que consisten en aplicar calor a los alimentos, esto para disminuir el tiempo

necesario y poder estimar la vida de anaquel del producto, que de otro modo seria

excesivamente largo. Para este estudio se emplearon dos temperaturas 35 y 60 ⁰C. Los

parámetros críticos a evaluar en función de la temperatura y tiempo de almacenamiento

fueron la concentración de polifenoles, actividad antimicrobiana, antioxidante y las

propiedades fisicoquímicas (humedad, pH, acidez y color). Para conocer el porcentaje de

inhibición del radical DPPH y la CMI de los tres microorganismos, fue necesario ajustar los

extractos polifenolicos de harina de subproducto de limón italiano a una concentración de 5

mg/g b.s.

En la figura 36 se presentan los resultados de la concentración de polifenoles y su actividad

antioxidante, así como la CMI de S. typhimurium, S. aureus y E.coli, el porcentaje de

humedad y la actividad del agua de la harina que fue secada a 35 ⁰C por un periodo de 106

días. En la figura36a se observa para el día 78 de secado, la mayor concentración de

polifenoles (10.1±2.2 mg EAG/g base seca) al igual, mayor porcentaje de inhibición del

radical DPPH (70.5±3.4 %). En general, durante los 106 días de secado de la harina, la

concentración de polifenoles sufrió un descenso y posteriormente un ligero incremento que

no fue significativamente diferente. La reducción de la concentración pudo deberse al

efecto de la temperatura de secado (Garau, M. y col., 2007) y el aumento a la formación de

nuevos compuestos polifenólicos con bajo peso molecular (Chen, M. y col., 2011). Para el

porcentaje de inhibición del radical DPPH se observó que conforme pasaban los días de

almacenado de la harina, el porcentaje de inhibición del radical DPPH incrementaba. Lo

anterior podría ser indicativo de que los compuestos polifenolicos presentes tuvieron alta

actividad antioxidante y quizá se tuvo la presencia de compuestos como hesperidina,

diosmina y eriocitrina, compuestos con mayor actividad antioxidante presentes en el limón

(Del Río, J. y col., 2004).


83

La humedad de la harina almacenada a 35⁰C disminuyo conforme aumentaron los días de

almacenamiento (figura 36b), encontrándose el valor dentro de lo reportado por la CODEX

para harina. Con una actividad de agua (Aw) de 0.36 a 0.43. Valor que se encontró por

debajo de lo reportado por Schmidt, S. y col., (2006) en harina de trigo (Aw de 0.523).

La figura 36c indica un pH de 3.3 a 3.5 y un porcentaje de acidez de 21.4±1.2 a 29.9±5.4 g

ácido cítrico/ 100 mL. La figura 36d muestra que los extractos polifenólicos de harina de

subproducto de limón italiano presentaron una CMI de 0.9 mg/g b.s contra S. typhimurium,

1.3 mg/g b.s contra S. aureus y para E.coli 1.9 mg/g b.s.

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

0

2

4

6

8

10

12

14

0 8

15

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

92

99

106

b)

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

rad

ica

l D

PP

H

a)

Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

mg

EA

G/g

ba

se s

eca

)

Tiempo (Días)

a

b

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 8

15

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

92

99

106

b)

Aw

a)

Po

rcen

taje

de

hu

med

ad

(%

)

Tiempo (Días)

a

b

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 8

15

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

92

99

106 b

) P

orc

enta

je d

e a

cid

ez (

g d

e

áci

do

cít

rico

/ 1

00

mL

)

a)

pH

Tiempo (Días)

a

b

a) b)

c)

0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0

10.0

0 8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

Co

ncn

etra

ció

n d

e p

oli

fen

ole

s

pa

ra l

a i

nh

ibic

ín d

e

mic

roo

rga

nis

mo

s (m

g/g

b.s

)

Tiempo (Días)

S.Typhimurium S.aureus E. colid)

Figura 36. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano, secada a 35 ⁰C por 106 días. a)

concentración de polifenoles y porcentaje de inhibición del radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua

(Aw), c) pH y porcentaje de acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli


84

En la figura 37 se presentan los resultados de la concentración de polifenoles y su actividad

antioxidante, así como la CMI de S. typhimurium, S. aureus y E.coli, el porcentaje de

humedad y la actividad del agua de la harina que fue almacenada a 60 ⁰C por un tiempo de

53 días. En la figura37a se observa para el día 29, la mayor concentración de polifenoles

(11.0±0.3 mg EAG/g b.s.) y el menor valor al día 15, reportando 7.3±0.7 mg/g b.s. De igual

forma se observa que a partir del día 22 la concentración de polifenoles aumentó con

respecto a la muestra de harina con las mejores condiciones de secado (9.1±0.2 mg/g b.s).

En general, durante los 53 días de almacenado de la harina, la concentración de polifenoles

aumentó, esto pudo deberse quizá a la formación de nuevos compuestos polifenólicos con

bajo peso molecular (Chen, M. y col., 2011). Para el porcentaje de inhibición del radical

DPPH se observó que a partir del día 39 el porcentaje de inhibición del radical DPPH

incrementó más del doble del porcentaje de inhibición de la harina de subproducto obtenida

de las mejores condiciones de secado (28.8±0.3 %). Lo cual podría decirnos que los

compuestos polifenólicos presentes tuvieron alta actividad antioxidante y tal vez presencia

de los compuestos hesperidina, diosmina y eriocitrina, compuestos con mayor actividad

antioxidante presentes en el limón (Del Río, J. y col., 2004).

El porcentaje de humedad y la actividad de agua de la harina secada a 60⁰C disminuyó

conforme aumentaron los días de almacenamiento (figura 37b), encontrándose el valor

dentro de lo reportado por la CODEX para harina. Con una actividad de agua (Aw) de 0.08

a 0.3, valor que se encontró por debajo de lo reportado por Schmidt, S. y col., (2006) en

harina de trigo (Aw de 0.523). La figura 37c indicó un pH de 3.4 a 3.5 y un porcentaje de

acidez de 23.8 a 25.6 g ácido cítrico/ 100 mL.

En la figura 37d se reportó que los extractos polifenólicos de harina de subproducto de

limón italiano presentaron una CMI de 0.9 mg/g b.s contra los microorganismos S.

typhimurium y S. aureus y para E.coli 1.3 mg/g b.s.


85

En la figura 38 se muestran los valores de la luminosidad, croma y hue en función de los

días de almacenamiento de las harinas de subproducto de limón italiano en función del

tiempo 1 representando a la harina obtenida con las mejores condiciones de sacado del

subproducto de limón italiano y 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ,13, 14 y 15.que representa

los días 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99 y 106 para la temperatura de

secado a 35 ⁰C y 4, 8,11, 15,18,22, 25, 29, 32,36, 39, 43, 46, 50 y 53 para la temperatura de

secado a 110 ⁰C. En la figura 38a se observó que la harina con las mejores condiciones

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 4 8 11 15 18 22 25 29 32 36 39 43 46 50 53

b)

Aw

a)

Po

rcen

taje

de

hm

eda

d

(%)

Tiempo (Días)

a

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

2

4

6

8

10

12

0 4 8 11 15 18 22 25 29 32 36 39 43 46 50 53

b)

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

rad

ica

l D

PP

H

a)

Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

(mg

EA

G/g

ba

se s

eca

)

Tiempo (Días)

a

b

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 4 8 11 15 18 22 25 29 32 36 39 43 46 50 53

b)

Po

rcen

taje

de

aci

dez

(g

de

´´a

cid

o c

ítri

co/

10

0 m

l)

a)

pH

Tiempo (Días)

a

b

a) b)

c)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

0 10 20 30 40 50 60

Con

cen

traci

ón

de

poli

fen

ole

s

para

la i

nh

ibic

ión

de

mic

roorg

enis

mos

(mg

/g b

.s)

Tiempo (día)

S.Typhimurium S.aureus E.coli

d)

Figura 37. Resultado de vida de anaquel de la harina de subproducto de limón italiano, secada a 60⁰C por 53 días. a) concentración

de polifenoles y porcentaje de inhibición del radical DPPH ,b) porcentaje de humedad y actividad del agua (Aw), c) pH y porcentaje

de acidez, y d) CMI de S.typhimurium, S.aureus y E.coli.


86

presento una luminosidad de 73.6±0.1 y durante el secado a 35 ⁰C durante un tiempo de

almacenamiento de 106 días, perdió ligeramente la luminosidad en comparación con la

harina secada a 110 ⁰C. El valor de la cromaticidad (figura 38b) permaneció constante

durante el tiempo de almacenamiento de 35 ⁰C con un valor promedio de 30. Así mismo la

harina almacenada a 60 ⁰C aumentó su cromaticidad y volvió a disminuir al día 56 de

almacenamiento. Para el valor de hue (figura 38c), las harinas secadas a temperatura de 35

y 60 ⁰C permanecieron con valores constantes.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516

Cro

ma

tici

da

d (

*C

)

Tiempo (h)

35 ⁰C

60 ⁰C

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516

Hu

e (h

⁰)

Tiempo (h)

35 ⁰C

60 ⁰C

a) b)

c)

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Lu

min

isid

ad

(*

L)

Tiempo (h)

35 ⁰C

60 ⁰C

Figura 38. Grafica de a) luminosidad, b) cromaticidad y c) hue de harina de subproducto de limón secada a35 y 60 ⁰C


87

En los resultados de los análisis estadísticos se observó por medio del gráfico de medias

que la temperatura de almacenamiento de 60°C conservó la mayor concentración de

polifenoles así como la actividad antioxidante. Sin embargo para la concentración mínima

inhibitoria, la harina secada a 35 ⁰C presentó los mejores resultados. La luminosidad se

pierde a mayor velocidad cuando las muestras son almacenadas a 60 ⁰C.

La figura 39 y 40 ilustra el color que presento la harina al ser almacenada a temperaturas

de 35 y 60 ⁰C durante la prueba de vida de anaquel. .

7.7.1 Variable de respuesta

La variable de respuesta seleccionada como valor crítico para la determinación de la vida

útil de harina de subproducto de limón italiano fue el color, debido a que por fue la única

variable que presentó un cambio constante durante la prueba acelerada, lo cual afectó la

apariencia física de la harina. En la literatura existen reportes como el presentado por,

García, C. y col., (2011), quienes emplearon la degradación de color como indicador de

deterioro para la estimación de la vida útil de una pasta de tomate. Para ello, utilizaron la

escala L*, a*, b* del método de Hunter Lab para definir el color como valor control o

estándar de la pasta de tomate y posteriormente establecer un valor considerado como no

aceptable determinado mediante una prueba sensorial. Debido a que la medición de color se

puede representar como un punto ubicado en el espacio, es decir, con los ejes L, a y b

establecidos, los autores calcularon vectores correspondientes a los valores obtenidos a

partir de la medición del color, para lo que emplearon la ecuación 6

𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 = √𝐿2 + 𝑎2 + 𝑏2 Ec 6.

Con base a estos estudios, se decidió emplear el mismo procedimiento para estimar el

tiempo de vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano.


88

Figura 39. Harina secada por un tiempo de 106 días a una temperatura de 35 ⁰C

Control

8º día 15º día 22º día 29º día



92º día 99º día 106º día


89

Control




46º día 50º día 53º día

Figura 40. Harina secada por un tiempo de 53 días a una temperatura de 35 ⁰C


90

7.7.2 Estimación del tiempo de anaquel de harina de subproducto de limón italiano

En la figura 41 se presentan los resultados del cambio de color en función del tiempo para

cada temperatura evaluada. De igual forma, se observa que a medida que pasa el tiempo el

vector de color disminuye, es decir, el color amarillo de la harina se va oscureciendo.

Las regresiones lineales obtenidas de estos gráficos se presentan en la ecuación 7 y 8.

Donde la pendiente de cada una de ellas representa la constante de reacción o deterioro de

color. Este deterioro presenta una tendencia lineal con pendientes negativas expresadas

mediante la ecuación de la recta.

Vector = 78.665-0.0445t Ec 7.

Vector =77.346-0.3913t Ec 8.

Con las dos constantes obtenidas por mínimos cuadrados, y representadas por los valores

de la pendiente en las ecuaciones 7 y 8, para las dos temperaturas estudiadas se construyó

un gráfico del ln k en función de 1/T (Figura 42).

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

0 20 40 60 80 100 120

Va

lore

s H

un

ter

Tiempo (Días)

35 ⁰C

60 ⁰C

-4

-3

-2

-1

0

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

lnK

1/T

Figura 41. Vectores en función del tiempo para las temperaturas de 35 y 60 ⁰C

Figura 42. Gráfico del ln k en función de 1/T


91

La ecuación que se ajustó por mínimos cuadrados es la ecuación 9, y la energía de

activación que se obtuvo de esta ecuación es de 1518.30 J/ mol.

lnk=2.1053-182.61(1/T) Ec. 9

Por otro lado, se determinó que los valores L*=50.9±0.7, a*=11.5±0.2, b*=28.6±0.5, los

cuales representan un color obscuro de la harina de subproducto de limón italiano, son

valores que proporcionan un color no atractivo para el consumidor, siendo el vector

resultante de estos valores 59.5.

Al sustituir este resultado del vector en las ecuaciones 7 y 8 se estima que la harina

incubada a 35 ⁰C y 60 ⁰C tiene una vida útil de 431 días y 46 días respectivamente.

Posteriormente se graficó el logaritmo de la vida útil a las temperaturas estudiadas (figura

43).

Con la ecuación obtenida (ecuación 10) se puede estimar la vida útil de la harina de

subproducto de limón italiano para diferentes temperaturas de almacenamiento.

Log vida útil= 3.9993-0.039T Ec. 10

Y despejando la ecuación 10 se obtiene la ecuación 11:

Vida útil = 10(3.9993-0.039T)

Ec.11

Donde T está dada en ⁰C.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 20 40 60 80

Lo

g v

ida

uti

l

Temperatura (⁰C)

Figura 43 . Gráfico del log vida útil en función de las temperaturas


92

Con base a la ecuación 11 se estimó que a la temperatura de 25 ⁰C y 30 ⁰C el tiempo de

vida útil de harina de los subproductos de limón italiano son los valores que se indican en la

tabla 16:

Tabla 16. Tiempo de vida de anaquel de harina de subproducto de limón italiano

Temperatura

(⁰C)

Tiempo de

vida útil

25 2años y 9meses

30 1año y 8meses

7.8. Evaluación del mejor sistema de extracción de compuestos polifenólicos en harina

de subproducto de limón italiano mediante un diseño factorial 34.

Una vez establecidas las mejores condiciones de secado de subproductos de limón italiano

(50 ⁰C por 21 h) para la obtención de la harina cítrica, se prosiguió con la segunda etapa del

trabajo, la cual consistió en evaluar diferentes métodos de extracción para la obtención de

compuestos polifenólicos, lo anterior mediante un diseño factorial 34

(Anexo 3), los factores

evaluados fueron: solventes (etanol, acetona y metanol), concentración de solvente (50, 70

y 90 %), temperatura (15, 25 y 40 ⁰C) y tiempo de extracción (1, 2.5, 4 h). Las variables de

respuesta analizadas fueron: porcentaje de humedad, concentración de polifenoles y

flavonoides, actividad antimicrobiana y antioxidante, con la finalidad de obtener un método

de extracción con el mayor rendimiento posible que conservara la actividad biológica Para

evaluar el efecto del nuevo método evaluado, se utilizó como método de referencia de

extracción el descrito por Sánchez-Contreras y col., 2012, en el que mediante extracción

criogénica con metanol se obtuvo alrededor de 10.0 ± 3.1 mg EAG/g b.s de concentración

de polifenoles.

7.8.1. Concentración de polifenoles

En la figura 44 se presentan los resultados de los promedios de las concentración de los

polifenoles totales obtenidos a partir de los extractos de la harina de subproductos de limón

italiano, evaluados con el diseño factorial propuesto y expresados con respecto al tiempo de

extracción para cada uno de los solventes a las diferentes concentraciones propuestas. En la


93

figura 44a se presenta los resultados de la extracción realizada a la temperatura de 15 ⁰C.

La mayor concentración de polifenoles obtenida fue de 8.7± 0.1mg EAG/g b.s., con en el

extracto evaluado con etanol al 50 % durante 1h de extracción y la menor concentración fe

de 5.8±0.0 mg EAG/g b.s, la cual se encontró en el extracto obtenido con metanol al 50 %

por un tiempo de 2.5 h. La figura 44b presenta los resultados de la concentración de

polifenoles obtenidos de la extracción realizada a la temperatura de 25 ⁰C. La mayor

concentración de polifenoles (9.9±1.7 1mg EAG/g b.s) fue empleando acetona al 90 % por

1h y la menor (5.8±0.6 mg EAG/g b.s) se presentó en el extracto de metanol al 50 %

extraído por un tiempo de 4h. Para la temperatura de extracción de 40 ⁰C (figura 44 c), el

mayor contenido de polifenoles (8.6±0.9 mg EAG/g b.s) se presentó en el extracto de

acetona al 70 % por un tiempo de 2.5 h y la menor (6.1±0.1mg EAG/g b.) se reportó en el

extracto de metanol al 50 % extraído por 1 y 2.5 h. La mayor concentración de polifenoles

presentada en las tres temperaturas de extracción evaluadas, se encontró dentro de los

valores obtenidos por el estándar de referencia.

Con los resultados presentados se realizó un análisis de varianza multifactorial que indicó

que el tiempo, solvente, concentración del solvente y la interacción solvente-concentración,

presentaron un efecto significativo en la concentración de polifenoles totales. Estos

resultados se comprueban con el diagrama de Pareto (figura 45a). En la figura 45b, se

observa la interacción solvente-concentración, reportando que la mayor concentración de

polifenoles (7.9 mg EAG /g b.s) se podría obtener usando el solvente acetona a una

concentración de 70 % y 90 %. Dichas concentraciones fueron analizadas mediante la

gráfica de media (figura 45c), la cual a su vez reportó que no existe diferencia significativa

entre las dos concentraciones.


94

Debido a que la acetona a las concentraciones de 70% y 90 % presentaron mayor

concentración de polifenoles se prosiguió a evaluar por medio del grafico de medias, a que

temperatura y tiempo de extracción se favorece la mayor extracción de polifenoles. Por lo

tanto en la figura 45d se obtuvo que la temperatura de 25 ⁰C y 40 ⁰C a un tiempo de 1 h

(figura 45e) presentaron las mejores condiciones de extracción de compuestos polifenoles.

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1 2.5 4Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

(mg

EA

G/g

b.

s)

Tiempo (h)

Etanol 50% Etanol 70% Etanol 90%

Acetona 50% Acetona 70% Acetona 90%

Metanol 50% Metanol 70% Metanol 90%

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1 2.5 4

Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

(m

g E

AG

/g b

. s)

Tiempo (h)

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1 2.5 4

Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

(m

g E

AG

/g b

. s)

Tiempo (h) a) b)

c)

Figura 44. Concentración de polifenoles totales con respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de

solvente, en muestras de harina de subproducto de limón italiano. La figura a) presenta la concentración de

polifenoles totales en extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.


95

El solvente acetona al 70 %, que presentó las mejore condiciones para la mayor extracción

de polifenoles concuerda con lo reportado por Sulaiman S. y col., (2011), quienes

evaluaron los solventes acetona, etanol y metanol al 70 %, he indicaron que la acetona fue

el mejor solvente para la extracción de compuestos fenólicos. Reportaron concentraciones

de 0.4±0.1 a 138.2±2.1 mg EAG /g b.s. De la misa manera, observaron que la diferencia en

las polaridades de los solventes podría influir en la solubilidad de los componentes

químicos para cada muestra y por consiguiente en su rendimiento de extracción. Por otro

lado mencionan que para obtener extractos polifenólicos a partir de vegetales con mejor

rendimiento es necesario tomar en cuenta el solvente y la polaridad de la extracción de los

disolventes, así como el tiempo y temperatura de extracción, al igual que las características

físicas de las muestras. Hasta la fecha, no se encontró en la literatura un disolvente


0 1 2 3 4 5

A:Temperatura (C)

AD

BC

B:Solvente

C:Concentración (%)

D:Tiempo (h) +

-

Concentración de los solventes(%)

Conce

ntr

ació

n d

e polife

nole

s to

tale

s (m

g/g

b.s

)

Solvente

Etanol

AcetonaMetanol

6.3

6.6

6.9

7.2

7.5

7.8

8.1

50 70 90

Co

ncen

tració

n d

e p

oli

fen

ole

s to

tale

s (m

g/g

) b

.s

15 25 40

Temperatura (C)

7.1

7.5

7.9

8.3

8.7

Concentración de solvente (%)

Co

ncen

tració

n d

e p

oli

fen

ole

s to

tale

s (m

g/g

) b

.s

70 90

7.5

7.7

7.9

8.1

8.3

Co

ncen

tracio

n d

e p

oli

fen

ole

s to

tale

s (m

g/g

) b

.s

1 2.5 4

Tiempo (h)

7.1

7.4

7.7

8

8.3

8.6

8.9

a) Gráfica de Pareto b) Gráfica de interacción

c) Gráfica de media d) Gráfica de media

e) Gráfica de media

Figura 45. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto, b) interacción

concentración del solvente x tipo de solvente y grafica de media en la concentración de polifenoles a diferente

c) concentración de solvente, d) temperatura y e) tiempo.


96

específico o apropiado de extracción para la recuperación del mayor contenido polifenólico

total en muestras de subproductos cítricos, debido a las diversas estructuras químicas que se

pudieran encontrar que van desde formas simples y polimerizadas de los polifenoles.

Alothman. A y col (2009), quienes estudiaron la extracción de compuestos polifenólicos en

frutas tropicales (piña, platano y guayaba), empleando tres sistemas de solvente (metanol,

etanol y acetona) a tres diferentes concentraciones (50%, 70 y 90%), obtuvieron que el

solvente etanol así como la acetona en sus tres concentraciones presentaron mayor

concentración de polifenoles en comparación con el metanol.

7.8.2. Concentración de flavonoides totales

En la figura 46 se presentan los resultados de los promedios de la concentración de

flavonoides totales, los cuales fueron obtenidos a partir de los extractos de la harina de

subproducto de limón italiano con respecto al tiempo de extracción para cada solvente a las

diferentes concentraciones evaluadas. Cabe mencionar que para la prueba se empleó un

extracto de referencia (Sánchez-Contreras y col., 2012) para comparar la eficacia de los

ensayos obtenidos del diseño 34, con un valor promedio de 3.81 mg EQ /g b.s de

concentración de flavonoides. En la figura 46a se presentan los valores promedios de la

concentración de flavonoides que va de 3.80 a 3.83 mg EQ /g b.s de extractos obtenidos a

temperatura de 15 ⁰C. En la figura 46b se observan promedios de 3.81 a 3.83mg EQ/g b.s

obtenidos de la extracción a temperatura de 25 ⁰C y por último en la figura 46c se reportan

las concentraciones de los extractos de flavonoides obtenidos a la temperatura de 40 ⁰C,

con un valor promedio de 3.81 a 3.84 mg EQ/g b.s. Los valores de concentración de

flavonoides totales obtenidos en el diseño factorial se encuentran dentro del valor de

referencia establecido, lo cual implica que las condiciones tales como: solvente,

concentración de solvente, tiempo y temperatura experimentada, favorecen la extracción de

flavonoides totales.

Con los resultados presentados, se realizó un análisis de varianza multifactorial que indicó

que la temperatura, tiempo, solvente y la concentración del solvente, presentaron un efecto

significativo en la concentración de flavonoides totales. Estos resultados se comprueban

con el diagrama de Pareto (figura 47a). Por otro lado, en la gráfica de media se observa

que la temperatura de 40 ⁰C (figura 47 b) a los tiempos de 2.5 y 4h (figura 47c), con el


97

solvente acetona (figura 47d) a concentración de 70 y 90 % (figura 47e) presentaron una

mayor concentración de flavonoides.

3.763.773.783.793.803.813.823.833.843.853.863.87

1 2.5 4

Co

nce

ntr

aci

ón

de

fla

vo

no

ides

tota

les

(EQ

mg

/g)

b.s

Tiempo (h)

a)

3.77

3.78

3.79

3.80

3.81

3.82

3.83

3.84

3.85

3.86

3.87

1 2.5 4Co

nce

ntr

aci

ón

de

fla

vo

no

ides

tota

les

(EQ

mg

/g)

b.s

.

Tiempo (h) b)

3.78

3.79

3.80

3.81

3.82

3.83

3.84

3.85

3.86

3.87

1 2.5 4Co

nce

ntr

aci

ón

de

fla

vo

no

ides

tota

les

(EQ

mg

/g)

b.s

.

Tiempo (h)




c)

Figura 46. Concentración de flavonoides totales con respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de

solventes, en muestras de harina de subproducto de limón italiano. La figura a) presenta la concentración de

flavonoides totales en extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.


98

7.8.3. Actividad antioxidante de extractos de la mejor harina elaborada de

subproducto de limón italiano.

En la figura 48 se presentan los resultados de los promedios del porcentaje de inhibición

del radical DPPH de los extractos de la mejor harina de subproducto de limón italiano

obtenida. La inhibición fue expresada con respecto al tiempo de extracción para cada

solvente a las diferentes concentraciones evaluadas. Para este análisis se empleó un extracto

de referencia (Sánchez-Contreras y col., 2012) que reportó 28.8 ± 0.3 % de inhibición del

radical DPPH. En la figura 48a se presentan los resultados del porcentaje de inhibición del

radical DPPH de los extractos obtenidos a la temperatura de 15 ⁰C. El mayor porcentaje de

inhibición (73.2±14.4 %) fue en el extracto de etanol al 70 % durante 2.5h de extracción y

el menor (31.9 ±4.2 %.) se encontró en el extracto de acetona al 50 % por un tiempo de 4 h.

La figura 48b presenta el porcentaje de inhibición del radical DPPH de los extractos


0 3 6 9 12 15

AB

C:Tiempo (h)

A:Solvente

B:Concentración (%)

D:Temperatura (C)+

-

Co

ncen

tració

n d

e f

lav

on

oid

es

tota

les

(mg

/g)

b.s

.

Temperatura (C)

15 25 40

3.8

3.805

3.81

3.815

3.82

3.825

3.83

Co

ncen

tració

n d

e f

lav

on

oid

es

tota

les

(mg

/g)

b.s

1 2.5 4

Tiempo (h)

3816

3818

3820

3822

3824

(X 0.001)

Co

ncen

tració

n d

e f

lav

on

oid

es

tota

les

(mg

/g)

b.s

50 70 90

Concentración de los solventes

3.815

3.817

3.819

3.821

3.823

3.825C

on

cen

tració

n d

e f

lav

on

oid

es

tota

les

(mg

/g)

b.s

Etanol Acetona Metanol

Solvente

3.81

3.813

3.816

3.819

3.822

3.825

a) Diagrama de Pareto b) Diagrama de media

c) Diagrama de media d) Diagrama de media

e) Diagrama de media

Figura47. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) gráfica de pareto y grafica de

media para concentración de polifenoles a diferente b) temperatura, c)tiempo, d)concentración de solvente

y e) tipo de solvente


99

obtenidos a la temperatura de 25 ⁰C. El mayor porcentaje de inhibición del radical DPPH

(64.5±10.5 %) fue obtenido al emplear acetona al 50 % por 4h y la menor (24.4 ±2.6 %) se

presentó en el extracto de metanol al 90% extraído por un tiempo de 2.5 h. Para la

temperatura de extracción de 40 ⁰C (figura 48 c), el mayor porcentaje de inhibición del

radical DPPH (53.1±0.4 %) se presentó en el extracto de acetona al 90 % por un tiempo de

2.5 h y la menor (29.1±0.8 %) se reportó en el extracto de metanol al 50 % extraído por un

tiempo de 4 h. Con base a los resultados obtenidos, se pudo observar que el porcentaje de

inhibición del radical DPPH de los extractos polifenólicos obtenidos a las diferentes

temperaturas superó el valor de referencia. Lo que implica que los factores solvente,

concentración de solvente, tiempo y temperatura de extracción favorecen el incremento de

inhibición del radical DPPH.

Con los resultados presentados, se realizó un análisis de varianza multifactorial que indicó

que la temperatura, solvente y la interacción temperatura-concentración del solvente,

presentaron un efecto significativo en el porcentaje de inhibición del radical DPPH en

extractos polifenólicos, los cuales son comprobados con el diagrama de Pareto (figura

49a).

En la gráfica de interacción (figura 49b) se observa que el porcentaje de inhibición del

radical DPPH a temperatura de 15 ⁰C, y a concentración de 50 % y 70 % no presentó

diferencia significativa (figura 49c). Por lo tanto, se continuó a evaluar los solventes. En la

gráfica de medias (figura 49d) se observa que no hubo diferencia significativa entre ellos.

Para obtener mayor porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenólicos es

necesario emplear un tiempo de 1h (figura 49e).

Xu, G. y col., (2007), quienes analizaron la cáscara de una variedad de cítrico huyou, (C.

pardisi Changshanhuyou), realizaron un pre tratamiento que consistió en calentar las

cáscaras a diferentes temperaturas y tiempos, realizando la extracción con metanol al 80%.

Los autores observaron que la capacidad antioxidante del extracto de huyou aumentó con el

tiempo de calentamiento y la temperatura. Por ejemplo, después de calentar a 120 ⁰C

durante 90 min, los compuestos polifenólicos totales aumentaron de 37.33 a 47.20 mg

EAG/ g b.s. y la capacidad antioxidante total (CAT) aumentó de 43.66 a 58.21 ECAT mg /

g b.empleando el método de ABTS (azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico), y

19.66 a 33.14 ECAT mg / g b.s. por el ensayo FRAP (poder antioxidante reductor del


100

hierro). Estos estudios revelaron que la capacidad antioxidante aumentó con el tiempo y

temperatura de extracción, al igual que el contenido de polifenoles totales lo cual no fue

similar a lo obtenido en este trabajo.

0102030405060708090

100

1 2.5 4

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

ra

dic

al

DP

PH

(%

)

Tíempo (h) a)

0

20

40

60

80

100

1 2.5 4

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

ra

dic

al

DP

PH

(%

)

Tiempo (h) b)

0102030405060708090

100

1 2.5 4

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

rad

ica

l D

PP

H (

%)

Tíempo (h)




c)

Figura 48. Porcentaje de inhibición del radical DPPH de extractos polifenólicos de harina de subproducto de

limón italiano con respecto al tiempo a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la

concentración de polifenoles totales en extractos obtenidos a temperatura de 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.


101

7.8.4. Actividad anticrobiana expresada como la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) de las bacterias E. coli, S. aureus, S. typhimurium, en los diferentes

tratamientos de extracción de polifenoles en harina de subproducto de limón italiano.

Para determinar la CMI de las bacterias E.coli, S.aureus y S.typhimurium, fue necesario

ajustar los extractos polifenólicos a una concentración de polifenoles de 5 mg EAG/ g b.s,

en cuanto a los resultados obtenidos contra la bacteria E. coli, se puede apreciar en la

figura 50 CMI se encontró en un intervalo de 2.5 a 5mg EAG/g b.s., Si bien no fue posible

identificar una tendencia en el comportamiento de las muestras, se puede observar que a

a) Diagrama de Pareto b) Gráfica de interacción

c) Gráfica de media d) Gráfica de media

e) Gráfica de media

Efectos estandarizados0 1 2 3 4 5

B:Concentración (%)

D:Tiempo (h)

AD

C:Solvente

AB

A:Temperatura (C) +

-

Figura 49. Analisis estadistico del diseño experimental 34, resumido en a) diagrama de pareto, b)

grafica de interacción temperatura-concentración de solvente y grafica de media para el porcentaje de

inhibición del radical DPPH de extractos polifenolicos obtenidos a diferente c) concentración, d)

solvente y e) tiempo.


102

temperaturas de 15 y 40°C se observaron mayores concentraciones inhibitorias promedio

independientemente del tiempo y el solvente, por consiguiente la temperatura de 25°C

presentó extractos polifenólicos que requirieron menor concentración para inhibir a la

bacteria haciéndolos de esta forma más eficientes.

7.8.4.1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de las bacterias E. coli

En cuanto a la CMI obtenida para S. aureus, como se puede observar en la figura 51, la

temperatura de 40°C mostró que se requieren concentraciones de alrededor de 2.5 mg de

EAG/g b.s. independientemente del tiempo y tipo de solvente empleado para la extracción,

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

1 2.5 4

CM

I d

e E

. co

li (

mg

EA

G/g

)

b.s

Tiempo (h) a)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

1 2.5 4CM

I d

e E

. co

li (

mg

EA

G/g

)

b.s

Tiempo (h) b)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

1 2.5 4

CM

I d

e E

.co

li (

mg

EA

G/g

) b

.s

Tiempo (h)




c)

Figura 50. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo a

diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración mínima inhibitoria (mg/g

b.s) de E.coli a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.


103

así mismo los resultados obtenidos para las muestras extraídas a 15 y 25° presentaron

valores muy similares entre sí que se encontraban en los intervalos de 2.5 y 5 mg/g B.S.

7.8.4.2. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la bacteria S. aureus

En cuanto a los resultados de la CMI obtenidos contra la bacteria S. typhimurium se

observó (figura 52) que al igual que para la bacteria S. aureus las muestras obtenidas a

40°C presentaron los valores más pequeños encontrándose alrededor de 2.5 mg EGA/g b.s.

los tratamientos obtenidos a las temperaturas más bajas fueron muy similares

encontrándose en el intervalo de 2.5 y 5mg de EGA/g b.s.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

1 2.5 4CM

I S

. a

ure

us

(mg

/g)

b.s

Tiempo (h)

a)

0

1

2

3

4

5

6

1 2.5 4

CM

I S

.au

reu

s (m

g/g

) b

.s.

Tiempo (h)

b)

0

1

2

3

4

5

6

1 2.5 4CM

I d

e S

. a

ure

us

(mg

/g)

b.s

.

Tiempo (h)




c)

Figura 51. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo

a diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración mínima inhibitoria

(mg/g b.s) de S.aureus a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.


104

7.8.4.3. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la bacteria S. typhimurium

Con la finalidad de buscar identificar los compuestos presentes en los extractos que

presentaron las mejores características en cuanto actividad antimicrobiana se realizaron

placas de cromatografía para identificar algunos de los compuestos presentes en las

muestras y que pudieran ser responsables del efecto biológico al simplemente presentarse

en la muestra o por la mayor cantidad del mismo en el extracto.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2.5 4

CM

I S

. ty

ph

imu

riu

m (

mg

/g)

b.s

.

Tiempo (h) a)

0123456789

10

1 2.5 4

CM

I S

. ty

ph

imu

riu

m (

mg

/g)

b.s

.

Tiempo (h) b)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2.5 4

CM

I d

e S

. ty

ph

imu

riu

m (

mg

/g)

b.s

.

Tiempo (h)




c)

Figura 52. CMI de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano con respecto al tiempo a

diferentes solventes y concentración de solventes. La figura a) presenta la concentración mínima inhibitoria (mg/g b.s)

de S.typhimurium a temperatura de a) 15 ⁰C, b) 25 ⁰C y c) 40 ⁰C.


105

7.8.5. Cromatografía en capa fina (CCF)

Una forma de conocer la presencia de metabolitos secundarios es hacer una cromatografía

en capa fina del extracto polifenólico, para lo cual se utilizó como fase móvil acetato de

etilo: ácido fórmico: agua (11:2:7) y se reveló con tricloruro de aluminio (AlCl3) al 5%.

Los extracto polifenólico estudiados fueron acetona al 70 % a una temperatura de 40 ⁰C por

un tiempo de 1 h, extracto de etanol al 90 % a temperatura de 40 ⁰C por un tiempo de 4h y

por último un extracto control (Sánchez-Contreras y col., 2012). Con ayuda de los

estándares de Neohesperidina, Hesperidina, Naringina y Ácido elágico se pudo comprobar

la presencia de alguno de estos en los extractos.

En el cromatofolio de la figura 53 que pertenece a los extractos polifenolicos de harina de

subproducto de limón italiano se pueden observar mediante la incidencia de luz UV la

presencia de bandas fluorescentes con un valor de Rf v de 0.344, la cual corresponde a la

neohesperidina de acuerdo a las muestras de estándares analizados, lo que implica la

presencia de este compuesto en los extractos polifenoles (tabla 17). Al igual se observa la

presencia de otras bandas que pudieran ser compuestos polifenolicos que no fue posible

identificar con los estándares evaluados. El compuesto encontrado en extractos de harina de

subproducto de limón italiano coincide con lo reportado por autores como Del Rio, J. y

col., (200, quienes reportaron que en los frutos cítricos existe la presencia de flavonoides

tales como; naringina, hesperidina, neohesperidina, rutina, naringenina, hesperidina,

nairutin, y tangeretina los cuales presentan actividad biológica que en su mayoría se

expresa como actividad antioxidante sin embargo en algunos casos se ha asociado a la

actividad antimicrobiana.

El compuesto con mayor presencia indicado por el grosor de banda correspondió a la

neohesperidina en todos los casos a los mejores métodos de extracción.


106

Figura 53. Cromatofolio de extractos polifenólicos de harina de subproducto de limón italiano.

Bajo luz ultravioleta (UV). 1 y 4) extracto con acetona, 2 y 5) extracto con etanol, 3 y 6) extracto

control, 7) Neohesperidina, 8) Hesperidina, 9) Naringina y 10) Ácido elágico

Tabla 17. Factor de retención de los compuestos polifenólicos

Muestra RfA Rf

B

1.-Ext. con acetona 0.08 0.344

2.-Ext. con etanol 0.08 0.344

3.-Control 0.08 0.344

4.- Ext. con acetona 0.08 0.344

5.-Ext. con etanol 0.08 0.344

6.-Control 0.08 0.344

7.-Neohesperidina --- 0.344

8.-Hesperidina --- 0.372

9.-Naringina --- 0.04

10.-Ácido elágico --- ---

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CONCLUSIONES

107

8. CONCLUSIONES

El subproducto de limón italiano (muestra fresca) presentó 73.7 ± 6.98mg EAG/g b.s. de

polifenoles, valor que se encuentra dentro de lo reportado en la literatura. El factor

temperatura y tiempo de secado así como su interacción presentaron efectos significativos

en el contenido de polifenoles, obteniendo valores más elevados al aumentar la temperatura

(36 -39 mg EAG/ g b.s).

Los extractos polifenólicos presentaron actividad contra S. aureus en todos los tiempos y

temperaturas evaluadas. Y los extractos obtenidos del secados de subproductos a bajas

temperaturas (40 – 60ºC), presentaron mayor inhibición del radical DPPH.

Elevadas temperaturas de secado en las harinas de subproducto de limón italiano afectaron

la luminosidad, cromo y hue de las muestras evaluadas, efecto producido por reacciones de

pardeamiento.

Las mejores condiciones de secado para la obtención de harinas de subproducto de limón

italiano fueron a la temperatura de 50ºC a tiempos de 21 h con un contenido de polifenoles

de 23.3 ±4.1 mg EAG/ g b.s con actividad antimicrobiana y antioxidante.

El contenido de polifenoles con actividad biológica no presentó ningún cambio durante el

tiempo de vida evaluado. Por lo tanto se determinó que el color de la harina de subproducto

de limón italiano como factor de calidad es crítico para establecer el tiempo de vida.

La energía de activación obtenida mediante la ecuación de Arrhenius es de 1518.30 J/ mol y

la vida útil estimada de la harina obtenida de subproductos de limón italiano a 35 ⁰C y 60

⁰C es de 431días y 46 días respectivamente. Con los tiempos y las temperaturas estudiadas

se obtuvo una ecuación general para estimar la vida útil de la harina de subproducto de

limón italiano para diferentes temperaturas de almacenamiento; esta ecuación esta descrita

por: vida útil= 10(3.9993-0.039T).

CONCLUSIONES

108

La cual permite predecir el comportamiento del producto a diferentes condiciones de

temperatura que pueden encontrarse en las diferentes regiones del país.

En el diseño experimental 34 los extractos de polifenoles totales presentaron

concentraciones de 5.8 ± 0.6 hasta 9.9 ± 1.7 mg EAG/g b.s., valor que se encuentra dentro

de lo reportado en la literatura. Por otro lado el análisis de varianza multifactorial establece

que las mejores condiciones de extracción de polifenoles totales fueron favorables al

emplear el solvente acetona a una concentración de 70 % a una temperatura de 25 ⁰C hasta

40 ⁰C por un tiempo de una hora y el mismo solvente con la misma concentración a una

temperatura de 40 ⁰C por un tiempo de dos hora y media favorece la extracción de

flavonoides en harinas de subproducto de limón italiano secadas a 50 ⁰C por 21 h. Al igual

en este diseño experimental, se obtuvo que el mejor método de extracción de compuestos

polifenólicos con mayor actividad inhibitoria del radical DPPH resultó ser utilizando el

solvente acetona a una concentración de 50 % hasta 70% a temperatura de 15ºC y tiempo

de 1h. Para la CMI de E. coli, S. typhimurium y S. aureus, se obtuvo que las mejores

condiciones resulto ser el solvente etanol a una concentración de 90 % a temperatura de

25⁰C hasta 40 ⁰C por un tiempo de 4h.

La concentración mínima inhibitoria para los microorganismos S. aureus, S. typhimurium y

E.coli fue de 5 mg EAG/ g de harina b.s.

El análisis por cromatografía en capa fina de los extractos polifenólicos condujo a la

identificación parcial del compuesto neohesperidina como compuesto mayoritario y posible

responsable de la actividad biológica.

RECOMENDACIONES

109

9. RECOMENDACIONES

La harina elaborada a base del secado de subproducto de limón italiano almacenada a las

condiciones adecuadas podría incrementar su vida de anaquel por lo que se sugiere

almacenarla en recipientes herméticos favoreciendo el incremento de la vida de anaquel, así

mismo debido a las características nutrimentales de la misma es recomendado evaluarla en

formulaciones de alimento para ganado y sustitución en productos alimenticios para uso

humano por su alto contenido de fibra.

Se recomienda identificar mediante técnicas cromatográficas como cromatografía de

líquidos los compuestos polifenólicos mayoritarios presente en los extractos de harina de

subproducto de limón italiano que presentaron la mayor actividad biológica, con la

finalidad de establecer la correlación directa con la actividad biológica y así generar

alternativas para la obtención de agentes antimicrobianos o antioxidantes obtenidos a partir

de subproductos de limón

Los polifenoles al ser compuesto aromáticos, es decir contienen el núcleo del benceno, son

sensibles a la luz y por consiguiente fácilmente degradables Por ello es necesario tener el

mayor cuidado durante la extracción y el almacenamiento de los extractos obtenidos para

poder mantener su actividad biológica, así como evaluar métodos de almacenamiento para

su uso en alimentos o área farmaceútica.

BIBLIOGRAFÍA

110

10. BIBLIOGRAFÍA

Abeysinghe, D., Li, X., Sun, C., Zhang, W., Zhou, C., and Chen, K. (2007). Bioactive

compounds and antioxidant capacities in different edible tissues of citrus fruit of four

species, Food Chemistry, 104, 1338-1344.

Ahmed, J., Lobo, M., Ferhan, O. (2012). Tropical and Subtropical Fruits Postharvest

Physiology, Processing and Packaging. Malaysia: Wiley-Blackwell, pp. 377-379.

Alothman, M., Bhat, R., Karim, A. (2009). Antioxidant capacity and phenolic content of

selected tropical fruits from Malaysia, extracted with different solvents. Food chemistry.

115: 785-788.

A.O. A.C. 2000. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemist,

EUA.

Arraki, K., Richard, T., Badoc, A., Pédrot, E., Bisson, J., Waffo-Téguo, P., Mahjoub, A.,

Mérillon, J., Decendit, A. (2013). Isolation, Characterization and Quantification of

Stilbenes from Some Carex Species. Record of natural products. 7(4): 281-291.

Arranz, S.M. compuestos polifenólicos (extraíbles y no extraíbles) en alimentos de la dieta

española: metodología para su determinación e identificación. Memoria para optar al grado

de doctor. Facultad de farmacia departamento de bromatología II, Madrid 2010.

Benavente-García, O., Castillo, J., Marin, F., Ortuño, A., Del Río, J. (1997). Uses and

properties of Citrus flavonoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 45 (12):

4505-4515.

Bhitarkanika, Orissa, India. Asian Pacific Journal of tropical Biomedicine. 50-56.

Boluda, C., Duque, B., Aragón, Z. (2005). Lignanos (I): estructura y funciones en las

plantas. Revista de Fitoterapia. 5 (1): 55-68.

Brennan, J. (2008). Manual de procesado de los alimentos. España: Editorial Acribia, S.A.

pp.87

BIBLIOGRAFÍA

111

Burlow, S. (1990). Toxicological aspects of antioxidants used as food additives. In:

Hudson, B.J.F. (Ed.) Food Antioxidants. Elsevier, Amsterdam. pp. 253-268.

Calvo. J. y Martínez-Martínez, L. (2009). Mecanismos de acción de los antimicrobianos.

Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.27 (1): 44-52.

Cano, A., Arnao, M.B. 2004. Actividad antioxidante hidrofílica y lipofílica y contenido en

vitamina C en zumos de naranja comerciales: relación con sus características

organolépticas. Ciencia y Tecnología Alimentaria, Vol. 4, No. 3, 185-189.

Chen, M., Yang,D., Liu, S.(2011). Effects of drying temperature on the flavonoid, phenolic

acid and antioxidative capacities of the methanol extract of citrus fruit (Citrus sinensis (L.)

Osbeck) peels. International Journal of Food Science and Technology. 46: 1179-1185.

Choma, I. y Grzelak. (2011). Bioautography detection in thin-layer chromatography.

Journal of Chromatography A. 1218: 2684-2691

Collado, J. (2011). Identificación de los polifenoles en zumo de frutas rojas. Máster en

ingeniería ambiental y de procesos químicos y biotecnológicos. Universidad Politécnica de

Cartagena.

Daglia, M. (2012) Polyphenols as antimicrobial agents. Current Opinion in Biotechnology,

23:174-181.

Dalmen, L., Costa, M., Junger, A. (2012). Anticancer Properties of Hydroxycinnamic

Acids. Cancer and Clinical Oncology. 2: 109-121.

D’Archivio M., Filesi, C., Di Benedetto, R., Gargiulo, R., Giovannini, C., Masella, R.

(2007). Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Ist Super Sanita.43 (4): 348-

361.

Del Río, J., Fuster, M., Gómez, P., Porras, I., García-Lidón, A., Ortuño. A. (2004). Citrus

limon: a source of flavonoids of pharmaceutical interest. Food Chemistry. 84: 457-461.

BIBLIOGRAFÍA

112

Dugo, G. y Di Giocomo, A. (2002) Citrus The Genus Citrus. New York: Taylor & Francis,

pp. 30-40

Escobar, B., M. Extracción de compuestos fenólicos de las cáscaras de cítricos producidos

en México. 2010. Tesis de maestra. México.

Fariza, S., Bakar, S., Leong, O., Supriatno, S., Meng, S. (2011). Effect of solvents in

extracting polyphenols and antioxidants of selected raw vegetables. Journal of food

composition and Analysis. 24:506-515

Ferré- Filmon, K., Delaude, L., Demonceau, A., Noels, A. (2004). Catalytic methods for

the synthesis of stilbenes with an emphasis on their phytoalexins. Coordination Chemistry

Review. 248: 2323-2336.

Festy, D. (2007). Antioxidantes Guía práctica ¿Qué son?¿qué funciones realizan?¿qué

beneficios aportan?. Robin Book. España

Gamboa, L., González, M., Hurtado, E. (2008). Tiempo de vida útil de panquecas

elaboradas a base de harina de trigo (Triticum aestivum L.) y zanahoria (Daucus carota).

Universidad del Oriente, Venezuela. 20. 177-182.

Garau, C., Simal, S., Rosselló, C., Femenia, A. (2007). Effect of air-drying temperature on

physic-chenical properties of dietary fibre and antioxidant capacity of orange (Citrus

aurantium v. Canoneta) by-products. Food Chemistry. 104: 1014-1024.

García, B.C. Molina C.M. Estimación de la vida útil de una mayonesa mediante pruebas

aceleradas. Ingeniería 18. 1.2: 57-64. 2008. San José, Costa Rica.

González-Molina, E., Domínguez-Perles, R., Moreno, D., García-Viguera, C. (2010).

Natural bioactive compounds of Citrus limon for food and health. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51: 327-345.

Geankoplis, C. (1998). Procesos de transporte y operaciones unitarias, 3ª ed., editorial

CECSA.

BIBLIOGRAFÍA

113

Ignat, I., Volf, I., Popa, V. (2011). A critical review of methods for characterization of

polyphenolic compounds in fruits and vegetables. Food Chemistry. 126: 1821-1835.

Jorgensen, J. y Ferraro. M. (2009). Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of

General Principles and Contemporary Practices. Medical Microbiology. 49:1749-1755.

Kuljarachanan, T., Devahastin, S., Chiewchan, N. (2009). Evolution of antioxidant

compounds in lime residues during drying. Food Chemistry. 113: 944-949.

Kumar, J.A. Abu-Ghannam, N. (2013). Degradation kinetic modelling of color, texture,

polyphenols and antioxidant capacity of York cabbage after microwave. Food Research

international. 53: 125-133.

Lagnika, L., Anago, E., Atindehou, M., Adjahoutonon, B., Dramane, K., Sanni, A. (2011).

Antimicrobial activity of Crataeva religiosa Forst against bacteria isolated from

Thryonomys swinderianus Temminck. African Journal of Biotechnology.10: 10034-10039.

Lario, Y., Sendra, E., García-Pérez, J., Fuentes, C., Sayas-Barberá, E., Fernández-López, J.,

Pérez-Alvarez, J. (2004). Preparation of high dietary fiber power from lemon juice by-

products. . Innovative Food Science and Emerging Technologies. 5:113-117.

Li, B., Smith y B., Hossain, M., (2006). Extraction of phenolics from citrus peels I. solvent

extraction method. Separation and purification technology. 48.182-188

Lima, B., Lima, F., Tavares, B., Costa, A., Pierucci, A. (2014). Determination of the

centesimal composition and characterization of flours from fruit seeds. Food Chemestry.

151: 293-299.

Lira, L., Link, V., González, G. Ros, P. (2003). Total Flavonoid Determination for Quality

Control of Aqueous Extractives from Phyllanthus niruri L. Lat. Am.J.Pharm. 22: 203-7

López-Duarte, A. y Vidal-Quintanar, R. (2009). Oxidación of linoleic acid as a marker for

shelf life of corn flour. Food Chemistry. 114: 478-483.

Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., y Jimenez, L. (2004). Polyphenols: food

sources and bioavailability. The American Journal of Clinical Nutrition. 79: 727- 747.

BIBLIOGRAFÍA

114

Martínez-Flórez, S., González-Gallego, J., Culebras, J., Tuñón, M. (2002). Los

flavonoides:propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. 6: 271-278.

Martínez M., A. (2005). Flavonoides. Tesis doctoral en la facultad de química

farmacéutica, en la Universidad de Antioquia.

Matthaus, B. (2002). Antioxidant activity of extracts obtained from residues of different

oilseeds. Journal of Agricultural Food Chemistry. 50: 2350-2354.

Medic-Ṧaric, M., Jasprica, I., Smolcic-Bubalo., Mornar, A. ( 2004). Optimization of

Chromatographic Conditions in Thin Layer Chromatography of Flavonoids and Phenolic

Acids. Croatica Chemica Acta. 77: 361-366.

Middleton Jr., E. and Kandaswami, C. (1994). Potential Health-Promoting Properties of

Citrus Flavonoids. Food Technology, 48, (11): 115-119.

Miyake. Y., Yamamoto, K. Morimitsu, Y., Osawa, T. (1997). Isolation of C-

glucosyflavone from lemon peel and antioxidative activity of flavonoid compounds in

lemon fruit. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 45:4619-4623.

Montes, E., Torres, R., Andrade, R., Pérez, O., Marimon, J., Meza, I. (2008). Modelado de

la cinetica de secado de ñame (dioscórea rotundata) en capa delgada. Revista ingeniería e

investigación. 28: 45-52.

Moulehi, I., Bourgou, S., Ourghemmi, I., Saidani, M. (2012). Variety and ripening impact

on phenolic composition and antioxidant activity of mandarin (Citrus reticulate Blanco)

and bitter orange (Citrus aurantium L.) seeds extracts. Industrial Crops and products.

39:74-80.

Naveda, G., F. (2010). Establecimiento de un proceso de obtención de extracto de runa

(Ruta graveolens), con alto contenido de polifenoles. Tesis de doctorado. Madrid.

Norma de CODEX para la harina de trigo CODEX STAN 152-1985

BIBLIOGRAFÍA

115

O´Shea, N., Arendt, E., Gallagher, E. (2012). Dietary fibre and phytochemical

characteristics of fruit and vegetable by-products and their recent applications as novel

ingredients in food products. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 16:1-

10.

Padilla, F., Rincón, A., Bou-Rached, L. (2008). Contenido de polifenoles y actividad

antioxidante de varias semillas y nueces. Archivo Latinoamericanos de nutrición Organo

Oficial de la sociedad Latinoamericana de nutrición. 58:303-308

Patra, J., Gouda, S., Sahoo, S., Thatoi, H. (2012). Chromatography separation, 1H NMR

analysis and bioautography screening of methanol extract of Excoecaria agallocha L. from

Bhirtarkanika, Orissa, India. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. S50-S56.

Pereira, R., Mancini-Filho. (1994). Antioxidant activity of citrus seeds. Cien.

Tecnol.Aliment.14: 160-167.

Pineda-Castro, M., Chacón-Villalobos, A., Cordero-Gamboa, G. (2009). Efecto de las

condiciones de secado sobre la cinética de deshidratación de las hojuelas de morera. (Morus

alba).Agronomía mesoamericana. 20 (2): 275-283.

Quintal, M. y Calderón, J. (2009). La capacidad antioxidante total. Bases y aplicaciones.

REB.3: 89-101.

Quiñones, M. (2012). Los polifenoles, compuestos de origen natural con efectos saludables

sobre el sistema cardiovascular. Nutrición hospitalaria. 27: 78-89.

Rodrígez, E.(2011). Uso de agentes antimicrobianos naturales en la conservación de frutas

y hortalizas. Revista de Sociedad, Cultura y Desarrollo Sustentable Ra Ximhai. 7:153-170.

Romero, A., Doval, M., Sturl, M., Judis, M. (2003). Propiedades antioxidantes de

compuestos polifenólicos presentes en extractos hidroalcohólicos de soja fermentada.

Universal nacional de nordeste comunicaciones científicas y tecnológicas

Roobbins, R. (2003). Phenolic Acids in Foods: An Overview of Analytical Methodology.

Journal of agricultural and food chemistry. 51: 2866-2887.

BIBLIOGRAFÍA

116

Russo, M., Bonaccorsi, I., Torre, G., Sarò, M., Dugo, P., Mondello, L. (2014).

Underrestimated sources of flavonoids, limonoids and dietary fibre: Availability in lemon´s

by-products. Journal of Functional Food. 9: 18-16.

Sanchez Contreras A. y Rodriguez Buenfil I. Depósito de pantente Mx/a/2012/014554.

Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y alimentación (SAGARPA)

http://www.sagarpa.gob.mx/Paginas/default.aspx Consultado Agosto 2014.

Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP). http://www.siap.gob.mx/

Consultado agosto 2012.

Stellar, L. Marin, D. (2009). Metodologías para evaluar in vitro la actividad antibacteriana

de compuestos de origen vegetal. 42: 263-268.

Tomás- Barberán, F. A. (2003). Los polifenoles de los alimentos y la salud. Alim. Nutri.

Salud. 10: 41-53.

Tripoli, E., La Guardia, M., Giammanco, S., Di Majo, D. Giammanco, M. (2007). Citrus

flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties: A review.

Food chemistry. 104: 466-479.

United States Department of Agriculture (USDA)

http://www.usda.gov/wps/portal/usda/usdahome Consultado agosto 2014.

Valgas, C. Souza, M. Smania, A. (2007). Screening methods to determine antibacterial

activity of natural products. Braz.J. Microbiol.38 (2):369-380.

Vasco, C. J. Ruales, A. Kamal. (2008). Total phenolic compounds and antioxidant

capacities of major fruits from Ecuador. Food Chemistry. 111: 816-823.

Vinson JA, Hao Y, Su X & Zubik L.(1998). Phenolic antioxidant quantity and quality in

foods: vegetables. J Agric Food Chem, 46, 3630-3634.

Wang, Y., Chuang, Y., Hsu, H., (2008). The flavonoid, carotenoid and pectin content in

peles of citrus cultivated in Taiwan. Food Chemistry. 106:277-284.

http://www.sagarpa.gob.mx/Paginas/default.aspx

http://www.siap.gob.mx/

http://www.usda.gov/wps/portal/usda/usdahome

BIBLIOGRAFÍA

117

Wiswedel, I., Hirsch, D., Kropf, S., Gruening, M., Pfister, E., Schewe, T. Sies, H. (2004).

Flavanol-rich cocoa drink lowers plasma F2-isoprostane concentrations in humans. Free

Radical Biology & Medicine. 37: 411-421.

Xu, G., Ye, X., Chen, J., Liu, D. (2007). Effect of heat treatment on the phenolic

compounds and antioxidant capacity of citrus peel extract. Journal of Agricultural and food

chemistry. 55: 330-335.

ANEXO I. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 4X8

118

11. ANEXO I. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 4X8

Num. De

tratamientos

Tiempo

(h) Temperatura (⁰C) Variable de

respuesta

1 12 40

Porcentaje de

humedad,

concentración de

polifenoles y

flavonoides

totales, actividad

antioxidante y

antimicrobiana

2 24 40

3 36 40

4 48 40

5 12 50

6 24 50

7 36 50

8 48 50

9 12 60

10 24 60

11 36 60

12 48 60

13 12 70

14 24 70

15 36 70

16 48 70

17 12 80

18 24 80

19 36 80

20 48 80

21 12 90

22 24 90

23 36 90

24 48 90

25 12 100

26 24 100

27 36 100

28 48 100

29 12 110

30 24 110

31 36 110

32 48 110

ANEXO II. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 2X8

119

12. ANEXO II. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 2X8

Num. De

tratamientos

Tiempo

(h) Temperatura (⁰C) Variable de

respuesta

1 12 40

Porcentaje de

humedad,

concentración de

polifenoles y

flavonoides

totales, actividad

antioxidante y

antimicrobiana

2 24 40

3 36 40

4 48 40

5 12 50

6 24 50

7 36 50

8 48 50

9 12 60

10 24 60

11 36 60

12 48 60

13 12 70

14 24 70

15 36 70

16 48 70

ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34

120

13. ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34

Num. De

Muestra

Disolvente Pureza (%) Tiempo (h) Temperatura

(⁰C)

Variable de

respuesta

1 1.0 50.0 1.0 15.0

Porcentaje de

humedad,

concentración de

polifenoles y

flavonoides totales,

actividad antioxidante

y antimicrobiana

2 2.0 50.0 1.0 15.0

3 3.0 50.0 1.0 15.0

4 1.0 70.0 1.0 15.0

5 2.0 70.0 1.0 15.0

6 3.0 70.0 1.0 15.0

7 1.0 90.0 1.0 15.0

8 2.0 90.0 1.0 15.0

9 3.0 90.0 1.0 15.0

10 1.0 50.0 2.5 15.0

11 2.0 50.0 2.5 15.0

12 3.0 50.0 2.5 15.0

13 1.0 70.0 2.5 15.0

14 2.0 70.0 2.5 15.0

15 3.0 70.0 2.5 15.0

16 1.0 90.0 2.5 15.0

17 2.0 90.0 2.5 15.0

18 3.0 90.0 2.5 15.0

19 1.0 50.0 4.0 15.0

20 2.0 50.0 4.0 15.0

21 3.0 50.0 4.0 15.0

22 1.0 70.0 4.0 15.0

23 2.0 70.0 4.0 15.0

24 3.0 70.0 4.0 15.0

25 1.0 90.0 4.0 15.0

26 2.0 90.0 4.0 15.0

27 3.0 90.0 4.0 15.0

28 1.0 50.0 1.0 25

29 2.0 50.0 1.0 25

30 3.0 50.0 1.0 25

31 1.0 70.0 1.0 25

32 2.0 70.0 1.0 25

33 3.0 70.0 1.0 25

34 1.0 90.0 1.0 25

35 2.0 90.0 1.0 25

36 3.0 90.0 1.0 25

37 1.0 50.0 2.5 25

38 2.0 50.0 2.5 25

39 3.0 50.0 2.5 25

40 1.0 70.0 2.5 25

41 2.0 70.0 2.5 25

42 3.0 70.0 2.5 25

43 1.0 90.0 2.5 25

44 2.0 90.0 2.5 25

45 3.0 90.0 2.5 25

46 1.0 50.0 4.0 25

47 2.0 50.0 4.0 25

ANEXO III. MATRIZ DEL DISEÑO EXPERIMENTAL34

121

Num. De

Muestra

Disolvente Pureza (%) Tiempo (h) Temperatura

(⁰C)

Porcentaje de

humedad,

concentración de

polifenoles y

flavonoides totales,

actividad antioxidante

y antimicrobiana

48 3.0 50.0 4.0 25

49 1.0 70.0 4.0 25

50 2.0 70.0 4.0 25

51 3.0 70.0 4.0 25

52 1.0 90.0 4.0 25

53 2.0 90.0 4.0 25

54 3.0 90.0 4.0 25

55 1.0 50.0 1.0 40.0

56 2.0 50.0 1.0 40.0

57 3.0 50.0 1.0 40.0

58 1.0 70.0 1.0 40.0

59 2.0 70.0 1.0 40.0

60 3.0 70.0 1.0 40.0

61 1.0 90.0 1.0 40.0

62 2.0 90.0 1.0 40.0

63 3.0 90.0 1.0 40.0

64 1.0 50.0 2.5 40.0

65 2.0 50.0 2.5 40.0

66 3.0 50.0 2.5 40.0

67 1.0 70.0 2.5 40.0

68 2.0 70.0 2.5 40.0

69 3.0 70.0 2.5 40.0

70 1.0 90.0 2.5 40.0

71 2.0 90.0 2.5 40.0

72 3.0 90.0 2.5 40.0

73 1.0 50.0 4.0 40.0

74 2.0 50.0 4.0 40.0

75 3.0 50.0 4.0 40.0

76 1.0 70.0 4.0 40.0

77 2.0 70.0 4.0 40.0

78 3.0 70.0 4.0 40.0

79 1.0 90.0 4.0 40.0

80 2.0 90.0 4.0 40.0

81 3.0 90.0 4.0 40.0

Disolvente: 1) etanol, 2) acetona, 3) metanol

ANEXO IV. VELOCIDAD DE SECADO

122

14. ANEXO IV. VELOCIDAD DE SECADO

Para calcular la velocidad de secado se utilizó el programa OriginPro 8. Para ello, se

graficó el porcentaje de H2O con respecto al tiempo para obtener la curva de calibración y

en función de la ecuación de SGompertz (ecuación 12) se calculó la velocidad de secado.

0 10 20 30 40 50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Vel

oci

dad

de

seca

do d

w p

orc

enta

je d

e H

2O

/ dt

Tiempo (h)

Equation y = a*exp(-exp(-k*(x-xc)))

Adj. R-Squa 0.9895

Value Standard Err

B a 94.0564 1.99716

B xc 7.27915 0.54544

B k 0.08871 0.00655

𝑌 = 𝑎𝑒−𝑒(−𝑘(𝑥−𝑥𝑐)) Ec. 12

Donde

𝑎 = 𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝐻2𝑂

𝑘 = 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑐𝑎𝑑𝑜

𝐾𝑐 = 𝑝𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝐻2𝑂 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑌 = 𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒 𝑑𝑒𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

123

14. ANEXO V. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

Secado de los subproductos de limón italiano de harina de subproductos de limón

italiano

Humedad

Análisis de varianza del porcentaje de humedad (%) de harinas de subproducto de limón Italiano del

diseño 4x8

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón-F Valor-P

A:Tiempo 1050.83 1 1050.83 20.68 0.0000

B:Temperatura 831.614 1 831.614 16.37 0.0001

AB 375.667 1 375.667 7.39 0.0078

Total error 4572.22 90 50.8024

Total (corr.) 7778.88 95

Concentración de polifenoles

Análisis de varianza para la concentración de polifenoles (mgEAG/g) b. s. de harinas de subproducto

de limón Italiano del diseño 4x8


A:Temperatura 23.8013 1 23.8013 2.22 0.1400

B:Tiempo 114.601 1 114.601 10.67 0.0015

AB 98.1242 1 98.1242 9.14 0.0033

Total error 966.488 90 10.7388

Total (corr.) 1203.11 95

Porcentaje de inhibición del radical DPPH •

Análisis de varianza para el porcentaje de inhibición del radical DPPH• (%) b. s. en extractos de harina

de subproducto de limón Italiano del diseño 4x8


A:Temperatura 4926.25 1 4926.25 33.39 0.0000

B:Tiempo 3051.22 1 3051.22 20.68 0.0000

AB 1493.34 1 1493.34 10.12 0.0020

Total error 13276.5 90 147.517

Total (corr.) 23212.8 95

Actividad antimicrobiana

Análisis de varianza de la actividad antimicrobiana de extractos polifenólicos de harinas de

subproducto de limón Italiano contra la bacteria S. typhimurium del diseño 4x8


A:Temperatura 1.00446 1 1.00446 12.71 0.0006

B:Tiempo 0.01875 1 0.01875 0.24 0.6273

AB 0.0223214 1 0.0223214 0.28 0.5964

Total error 7.11071 90 0.0790079 Total (corr.) 8.15625 95


124


subproducto de limón Italiano contra la bacteria S.aureus del diseño 4x8


A:Temperatura 1.00446 1 1.00446 2.04 0.1570

B:Tiempo 3.16875 1 3.16875 6.42 0.0130

AB 0.650893 1 0.650893 1.32 0.2537

Total error 44.3946 90 0.493274

Total (corr.) 49.4063 95


subproducto de limón Italiano contra la bacteria E. coli del diseño 4x8


A:Temperatura 0.262401 1 0.262401 0.29 0.5945

B:Tiempo 0.352083 1 0.352083 0.38 0.5376

AB 0.0524802 1 0.0524802 0.06 0.8117

Total error 82.7393 90 0.919325

Total (corr.) 83.4896 95

Color

Análisis de varianza para la luminosidad (*L) de harinas de subproducto de limón italiano del diseño

4x8


A:Temperatura 8013.28 1 8013.28 366.70 0.0000

B:Tiempo 260.633 1 260.633 11.93 0.0008

AB 197.708 1 197.708 9.05 0.0034

Total error 1966.72 90 21.8524

Total (corr.) 10439.1 95

Análisis de varianza para la cromaticidad (*C) de harinas de subproducto de limón Italiano del diseño

4x8


A:Temperatura 117.933 1 117.933 36.71 0.0000

B:Tiempo 14.8403 1 14.8403 4.62 0.0343

AB 4.58581 1 4.58581 1.43 0.2353

Total error 289.104 90 3.21227

Total (corr.) 426.466 95

Análisis de varianza para hue (h⁰) de harinas de subproducto de limón Italiano del diseño 4x8


A:Temperatura 4888.81 1 4888.81 585.80 0.0000

B:Tiempo 170.17 1 170.17 20.39 0.0000

AB 74.2973 1 74.2973 8.90 0.0037

Total error 751.091 90 8.34546

Total (corr.) 5884.41 95


125

Diseño experimental 2x8

Humedad

Análisis de varianza del porcentaje de humedad (%) de harinas de subproducto de limón Italiano del

diseño 2x8


A:Temperatura 5656.76 1 5656.76 47.15 0.0000

B:Tiempo 22167.0 1 22167.0 184.76 0.0000

AB 767.835 1 767.835 6.40 0.0153

Total error 5039.13 42 119.979

Total (corr.) 33633.0 47

Concentración de polifenoles

Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g) b.s. de harinas de

subproducto de limón Italiano del diseño 2x8


A:Temperatura 361.846 1 361.846 7.14 0.0107

B:Tiempo 1209.25 1 1209.25 23.88 0.0000

AB 379.911 1 379.911 7.50 0.0090

Total error 2127.21 42 50.6479

Total (corr.) 4108.84 47


Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos de harinas de

subproducto de limón Italiano contra la bacteria S.typhimurium


A:Temperatura 45.63 1 45.63 4.07 0.0902

B:Tiempo 22.4267 2 11.2133 1.00 0.4219

AB 160.88 2 80.44 7.17 0.0256

Total (corr) 296.217 11


subproducto de limón Italiano contra la bacteria S.aureus


A:Temperatura 11.2133 1 11.2133 1.00 0.3559

B:Tiempo 22.4267 2 11.2133 1.00 0.4219

AB 22.4267 2 11.2133 1.00 0.4219

Total (corr) 123.347 11


126


subproducto de limón Italiano contra la bacteria E. coli


A:Temperatura 44.8533 1 44.8533 2.00 0.2070

B:Tiempo 156.987 2 78.4933 3.50 0.0983

AB 22.4267 2 11.2133 0.50 0.6297

Total (corr) 358.827 11

Porcentaje de inhibición

Análisis de varianza del porcentaje de inhibición del radical DPPH


A:Temperatura 39.605 1 39.605 0.91 0.3598

B:Tiempo 558.391 2 279.195 6.39 0.0129

AB 203.059 2 101.53 2.32 0.1403

Total (corr) 1325.32 17

Color

Análisis de varianza para la luminosidad (*L) de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 2956.81 1 2956.81 325.26 0.0000

B:Tiempo 0.09 2 0.045 0.00 0.9951

Interacción

AB 0.0233333 2 0.0116667 0.00 0.9987

Total (corr) 3066.0 17

Análisis de varianza para la cromaticidad (*C) de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 42.6272 1 42.6272 114.35 0.0000

B:Tiempo 0.0677778 2 0.0338889 0.09 0.9137

Interacción

AB 0.00777778 2 0.00388889 0.01 0.9896

TOTAL (corr) 47.1761 17

Análisis de varianza para hue (h⁰) de harinas de subproducto de limón Italiano del diseño 4x8


A:Temperatura 1348.54 1 1348.54 121368.20 0.0000

B:Tiempo 12.4433 2 6.22167 559.95 0.0000

AB 14.3478 2 7.17389 645.65 0.0000

Total (corr) 1375.46 17


127

pH

Análisis de varianza para el pH de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 0.00108889 1 0.00108889 4.56 0.0541

B:Tiempo 0.0036 2 0.0018 7.53 0.0076

AB 0.0120444 2 0.00602222 25.21 0.0001


Acidez

Análisis de varianza para la acidez harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 0.0408333 1 0.0408333 0.04 0.8538

B:Tiempo 25.4117 2 12.7058 11.51 0.0088

AB 14.7117 2 7.35583 6.66 0.0299

Total (corr) 46.7892 11

Vida de anaquel de harinas de subproducto de limón italiano

Concentración de polifenoles totales

Análisis de varianza de la concentración de polifenoles (mg EAG/g b.s) en extractos de harinas de

subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 20.0566 1 20.0566 28.25 0.0000

B:Tiempo 35.6242 14 2.54459 3.58 0.0016

AB 24.4946 14 1.74962 2.46 0.0187

Total (corr) 101.476 59


Análisis de varianza de la concentración mínima inhibitoria de extractos polifenólicos contra la

bacteria S.aureus.


A:Temperatura 15.6315 1 15.6315 82.79 0.0000

B:Tiempo 56.4193 14 4.02995 21.34 0.0000

AB 15.3255 14 1.09468 5.80 0.0000

Total (corr) 93.0404 59


128


bacteria E. coli


A:Temperatura 0.9375 1 0.9375 2.00 0.1676

B:Tiempo 80.0521 14 5.71801 12.20 0.0000

AB 27.9687 14 1.99777 4.26 0.0004

Total (corr) 123.021 59


bacteria S. typhimurium


A:Temperatura 8.4375 1 8.4375 46.29 0.0000

B:Tiempo 104.779 14 7.48419 41.06 0.0000

AB 18.7109 14 1.3365 7.33 0.0000

Total (corr) 137.396 59

Porcentaje de inhibición

Análisis de varianza del porcentaje de inhibición del radical DPPH


A:Temperatura 77.2935 1 77.2935 4.67 0.0387

B:Tiempo 10069.2 14 719.228 43.49 0.0000

AB 955.359 14 68.2399 4.13 0.0006

Total (corr) 11598.0 59

Humedad

Análisis de varianza del porcentaje de humedad de harinas de subproducto de limón italiano


A:Temperatura 240.329 1 240.329 820.91 0.0000

B:Tiempo 56.6874 14 4.0491 13.83 0.0000

AB 17.7311 14 1.26651 4.33 0.0000

Total (corr) 332.313 89

Actividad del agua

Análisis de varianza de la actividad del agua de harinas de subproducto de limón italiano


A:Temperatura 1.39876 1 1.39876 9190.28 0.0000

B:Tiempo 0.201767 14 0.0144119 94.69 0.0000

AB 0.117783 14 0.0084131 55.28 0.0000

Total (corr) 1.72744 89


129

Color

Análisis de varianza para la luminosidad ( *L)de harinas de harinas de subproducto de limón italiano


A:Temperatura 3442.88 1 3442.88 13626.29 0.0000

B:Tiempo 1350.73 14 96.4806 381.85 0.0000

AB 506.456 14 36.1754 143.18 0.0000

Total (corr) 5315.22 89

Análisis de varianza para la cromaticidad (*C) de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 101.548 1 101.548 1740.83 0.0000

B:Tiempo 27.3227 14 1.95162 33.46 0.0000

AB 59.5849 14 4.25606 72.96 0.0000

Total (corr) 191.956 89

Análisis de varianza para la hue de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 2021.33 1 2021.33 19024.24 0.0000

B:Tiempo 517.407 14 36.9576 347.84 0.0000

AB 118.173 14 8.4409 79.44 0.0000

Total (corr) 2663.28 89

Acidez

Análisis de varianza para la acidez de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 11.7042 1 11.7042 0.54 0.4675

B:Tiempo 137.172 14 9.79802 0.45 0.9404

AB 87.5283 14 6.25202 0.29 0.9914


PH

Análisis de varianza del pH de harinas de harinas de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 0.0138017 1 0.0138017 150.56 0.0000

B:Tiempo 0.112843 14 0.00806024 87.93 0.0000

AB 0.0504233 14 0.00360167 39.29 0.0000

Total (corr) 0.179818 59


130

Diseño factorial 34

Concentración de polifenoles totales

Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g b. s ) en extractos de harina

de subproducto de limón Italiano


A:Temperatura 0.8748 1 0.8748 1.12 0.2912

B:solvente 3.71482 1 3.71482 4.76 0.0306

C:Concentración 12.1874 1 12.1874 15.63 0.0001

D:Tiempo 16.5518 1 16.5518 21.22 0.0000

AD 2.67961 1 2.67961 3.44 0.0657

BC 3.5689 1 3.5689 4.58 0.0340

Total error 120.105 154 0.779902

Total (corr.) 161.005 161

Análisis de varianza de la concentración de polifenoles totales (mg EAG/g b.s) en extractos de harina de

subproducto de limón italiano para la temperatura


Entre los grupos 2.63109 2 1.31554 1.32 0.2804

Dentro de los grupos 32.8432 33 0.995249

Total (Corr.) 35.4743 35


subproducto de limón italiano para la concentración de solvente


Entre los grupos 0.000025 1 0.000025 0.00 0.9961


Total (Corr.) 35.4743 35


subproducto de limón italiano para el tiempo


Entre los grupos 6.13654 2 3.06827 3.45 0.0435


Total (Corr.) 35.4743 35


131

Flavonoides totales

Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mg EQ/g b.s) de extractos de harina de

subproducto de limón italiano


A:Solvente 0.000323787 1 0.000323787 7.51 0.0069

B:Concentración 0.000507 1 0.000507 11.75 0.0008

C:Tiempo 0.000200083 1 0.000200083 4.64 0.0328

D:Temperatura 0.00773515 1 0.00773515 179.29 0.0000

AB 0.000133389 1 0.000133389 3.09 0.0807

Total error 0.00668714 155 0.0000431428

Total (corr.) 0.0156251 161

Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mg EQ/g b.s) de extractos de harina de

subproducto de limón italiano para la temperatura


Entre los grupos 0.00776853 2 0.00388427 78.61 0.0000


Total (Corr.) 0.0156251 161

Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mg EQ/gb.s) de extractos de harina de

subproducto de limón italiano para el tiempo


Entre los grupos 0.00020579 2 0.000102895 1.06 0.3485


Total (corr.) 0.0156251 161

Análisis de varianza de la concentración de flavonoides totales (mgEQ/g b.s) de extractos de harina de

subproducto de limón italiano para el solvente


Entre los grupos 0.00130209 2 0.000651043 7.23 0.0010


Total (corr.) 0.0156251 161


132

Actividad antioxidante

Análisis de varianza multifactorial del diseño factorial 34

para la actividad antioxidante expresada en

porcentaje de inhibición del radical DPPH



para la CMI de compuestos polifenólicos

contra E.coli



contra S. aureus


A:Temperatura 1822.87 1 1822.87 20.23 0.0000

B:Concentración 20.107 1 20.107 0.22 0.6373

C:Solvente 417.327 1 417.327 4.63 0.0329

D:Tiempo 288.12 1 288.12 3.20 0.0757

AB 991.609 1 991.609 11.00 0.0011

AD 339.301 1 339.301 3.77 0.0541

Total error 13876.5 154 90.1073


A:Solvente 0.231481 1 0.231481 0.17 0.6776

B:Concentración 1.44676 1 1.44676 1.08 0.2994

C:Tiempo 2.83565 1 2.83565 2.12 0.1469

D:Temperatura 0.231481 1 0.231481 0.17 0.6776

AB 4.25347 1 4.25347 3.19 0.0762

BD 7.03125 1 7.03125 5.27 0.0231

Total error 206.848 155 1.3345


A:Solvente 5.78704 1 5.78704 5.15 0.0246

B:Concentración 4.6875 1 4.6875 4.18 0.0427 C:Tiempo 0.925926 1 0.925926 0.82 0.3652

D:Temperatura 42.1875 1 42.1875 37.58 0.0000 AB 2.17014 1 2.17014 1.93 0.1664

Total error 175.145 156 1.12272 Total (corr.) 230.903 161


133



contra S . typhimurium


A:Solvente 8.33333 1 8.33333 7.06 0.0087

B:Concentración 0.0578704 1 0.0578704 0.05 0.8251 C:Tiempo 2.83565 1 2.83565 2.40 0.1232

D:Temperatura 36.169 1 36.169 30.64 0.0000 Total error 185.32 157 1.18038

Total (corr.) 232.716 161

A:Solvente 8.33333 1 8.33333 7.06 0.0087

ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO

134

15. ANEXO VI. PRESENTACIÓN EN CONGRESO


135


136


137


138


139


140

TESIS - ciatej.repositorioinstitucional.mx Viviana... · Efecto de la temperatura y tiempo de...

Documents

Transcript of TESIS - ciatej.repositorioinstitucional.mx Viviana... · Efecto de la temperatura y tiempo de...