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CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS
INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS
EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE
ALTA INTENSIDAD (PEF) EN LA INACTIVACIN DE CLULAS
VEGETATIVAS DE Bacillus cereus EN UNA BEBIDA MEZCLA DE
HUEVO LQUIDO Y LECHE.
ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO
TRABAJO DE GRADO
Presentando como requisito parcial
para optar al ttulo de
Microbiloga Industrial
ANTONIO MARTNEZ LPEZ, DIRECTOR.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogota, D.C
2 de febrero de 2009
-
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia.
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EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE
ALTA INTENSIDAD (PEF) EN LA INACTIVACIN DE CLULAS
VEGETATIVAS DE Bacillus cereus EN UNA BEBIDA MEZCLA DE
HUEVO
LQUIDO Y LECHE.
ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO
APROBADO
Antonio Martnez Lpez, PhD
Director
Mara Pina Prez, Ingeniera Agrnoma Marcela Franco, PhD
Coodirectora Asesora
Fernando Sampedro, PhD Aurora Marco,
PhD
Jurado Jurado
Dinoraz Velez, PhD Vicenta Deveza, PhD
Jurado Jurado
Mara Rodrigo, PhD Pablo Fernndez, PhD
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS
INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS
Jurado Responsable Convenio UPC-PUJ
-
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS
INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS
EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE
ALTA INTENSIDAD (PEF) EN LA INACTIVACIN DE CLULAS
VEGETATIVAS DE Bacillus cereus EN UNA BEBIDA MEZCLA DE
HUEVO LQUIDO Y LECHE.
ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO
APROBADO
Angela Umaa Muoz, MPhil Janeth Arias Palacios, M.sC-M. Ed
Decana Acadmica Director de Carrera
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DEDICATORIA
A mis padres y hermano.
-
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer especialmente al Doctor Antonio Martnez y la Doctora Mara
Dolores Rodrigo, por permitirme estar en su grupo de trabajo e investigacin;
ensearme este mundo mgico de la investigacin y guiarme cuando lo necesite.
Tambin quisiera agradecer al Doctor Pablo Fernndez por aceptarme para
emprender este viaje.
A Chelo, por ayudarme, por ser una excelente gua en el desarrollo de mi trabajo
final de carrera y por su paciencia.
A todos mis compaeros del IATA; a Carmen por estar siempre dispuesta a
ayudarme y su alegra, a Daniela por sus consejos, a Aurora por estar siempre
dispuesta a colaborarme, a Fernando por ser como mi hermano y a su familia
porque se han convertido en mi familia Espaola.
A mis compaeros de piso: Manu, por ser un gran amigo, a Pili y a Bego.
A la Doctora Marcela Franco por su apoyo y su gran amistad.
A mis profesores, y especialmente a la Doctora Janeth Arias, por ensearme a no
rendirme y a luchar por lo que quiero y por su gua.
A mis amigos, que aunque estando lejos siguen apoyndome y estando conmigo
cuando ms los he necesitado.
Por ltimo, a mi familia, sin ellos no hubiese podido emprender este viaje y no
habra sido posible la realizacin de este trabajo final de carrera.
2 de febrero de 2009
vi
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TABLA DE CONTENIDOS
Pgs 1. INTRODUCCIN 1
2. MARCO TERICO 2
2.1. NUEVAS TECNOLOGAS 4
2.1.1. Pulsos elctricos de alta intensidad (PEF) 4
2.1.1.1. Sistemas de tratamiento por PEF 5
2.1.1.2. Cmaras de tratamiento 6
2.1.1.3. Factores relacionados con la tecnologa de PEF 7
2.1.1.3.1. Factores del proceso 7
2.1.1.3.1.1. Intensidad de campo elctrico 8
2.1.1.3.1.2. Forma del pulso elctrico 8
2.1.13.2. Temperatura 10
2.1.1.3.3. Tiempo de tratamiento 11
2.1.1.3.4. Amplitud de pulso 11
2.1.1.4. Factores relacionados con las caractersticas fsico-
qumicas del producto 12
2.1.1.4.1. Conductividad, pH, antimicrobianos, fuerza inica y
tamao de partcula 12
2.1.1.5. Factores del microorganismo 14
2.1.1.5.1. Tipo de microorganismo 14
2.1.1.5.2. Tamao del inculo 14
2.1.1.5.3. Fase de crecimiento 15
2.1.1.6. Mecanismo de inactivacin microbiana por PEF 15
2.1.1.7. Mecanismo de inactivacin enzimtica por PEF 17
2.1.1.8. Ventajas y desventajas de la tecnologa de PEF 18
2.1.1.8.1. Ventajas de los PEF 18
2.1.1.8.2. Desventajas de los PEF 18
2.2. ANTIMICROBIANOS NATURALES 19
2.2.1. Cacao 20
2.2.2. Composicin de los antimicrobianos naturales 20
vii
-
2.2.3. Mecanismo de inactivacin microbiana y enzimtica por
antimicrobianos naturales 21
2.2.4. Efecto sinrgico de los antimicrobianos naturales y nuevas
tecnologas de conservacin alimentaria 23
2.2.5. Efecto de la adicin de antimicrobianos naturales en los
alimentos 23
2.2.6. Ventajas y desventajas de los antimicrobianos naturales 24
2.2.6.1. Ventajas de los antimicrobianos naturales 24
2.2.6.2. Desventajas de los antimicrobianos naturales 25
2.3. BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO 25
2.3.1. Huevo lquido 25
2.3.1.1. Microorganismos alteradores y patgenos del huevo lquido 30
2.3.2. Leche 30
2.3.2.1. Microorganismos alteradores y patgenos de la leche 32
2.4. Bacillus cereus 32
2.5. MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS 34
2.5.1. Modelo de Bigelow 34
2.5.2. Modelo de Weibull 36
2.5.3. Modelo de Baranyi 37
2.6. BONDAD DEL AJUSTE 39
2.7. CLCULO DE LA ENERGA SUMINISTRADA EN EL
PROCESO 39
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 40
3.1. FORMULACIN DEL PROBLEMA 40
3.2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIN 40
3.3. JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN 40
4. OBJETIVOS 42
4.1. OBJETIVO GENERAL 42
4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS 42
5. MATERIALES Y MTODOS 43
viii
-
5.1. PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA
MEZCLA DE HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO) Y
LECHE DESNATADA (UHT) 43
5.1.1. Materiales 43
5.1.2. Composicin de la bebida 43
5.1.3. Metodologa 43
5.2. PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA
MEZCLA DE HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO),
LECHE DESNATADA (UHT) Y POLVO DE CACAO
(CocoanOX 12%) 44
5.2.1. Materiales 44
5.2.2. Composicin de la bebida 44
5.2.3. Metodologa 45
5.3. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE LAS
BEBIDAS 45
5.3.1. pH 45
5.3.1.1. Materiales 45
5.3.1.2. Metodologa 46
5.3.2. Conductividad elctrica 46
5.3.2.1. Materiales 46
5.3.2.2. Metodologa 46
5.4. RECUPERACIN Y CRECIMIENTO DE Bacillus
cereus HASTA LA FASE ESTACIONARIA DE
CRECIMIENTO 47
5.4.1. Materiales 47
5.4.2. Metodologa 47
5.5. TRATAMIENTO POR PEF 49
5.5.1. Tratamiento de la bebida mezcla de huevo lquido
pasteurizado, leche desnatada uht y CocoanOX 12% por
PEF 49
5.5.1.1. Materiales 49
5.5.1.2. Descripcin del equipo de PEF (OSU-4D) 49
ix
-
5.5.1.3. Funcionamiento del sistema 50
5.5.1.4. Metodologa 51
5.5.1.4.1. Parmetros 51
5.5.1.4.2. Tratamientos de inactivacin por PEF 51
5.5.2. Consideraciones a tener en cuenta para el uso del equipo
de PEF 51
5.5.3. Etapas del tratamiento por PEF 52
5.6. RECUENTO DE Bacillus cereus 52
5.6.1. Materiales 52
5.6.2. Metodologa 53
6. RESULTADOS Y DISCUSIN 54
6.1. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE UNA
NUEVA BEBIDA MEZCLA DE LECHE DESNATADA,
HUEVO LQUIDO Y CocoanOX 12% 54
6.2. CURVAS DE CRECIMIENTO DE Bacillus cereus EN LAS
BEBIDAS DE ESTUDIO 57
6.3. CINTICAS DE INACTIVACIN POR PEF DE
Bacillus cereus EN LA BEBIDA MEZCLA DE LECHE
DESNATADA Y HUEVO LQUIDO, CON Y SIN
CocoanOX 12% 64
6.3.1. Efecto del tiempo de tratamiento e intensidad de campo
elctrico 65
6.3.2. Efecto sinrgico del CocoanOX 12% con los tratamientos
de PEF 68
6.3.3. Ajuste de los datos experimentales a modelos matemticos
predictivos 75
6.3.3.1. Modelo de Bigelow 77
6.3.3.2. Modelo de Weibull 78
6.3.3.3. Ecuacin modificada de Gompertz 80
6.3.3.4. Modelo Log-Logistic 81
6.4. ALMACENAMIENTO 86
7. CONCLUSIONES 94
x
-
8. RECOMENDACIONES 96
9. REFERENCIAS 98
TABLAS
5.1. Bebidas obtenidas y su composicin 45
5.2. Temperatura de tratamiento, campo elctrico y tiempo de
tratamiento por PEF a las bebidas 51
6.1. Diferentes formulaciones de la bebida, analizadas para el
tratamiento con PEF 55
6.2a. Variaciones del pH y la conductividad elctrica en funcin de la
temperatura de las bebidas analizadas 56
6.2b. Variacin del pH y la conductividad elctrica en funcin de la
temperatura de las bebidas analizadas 56
6.3. Condiciones para el tratamiento con PEF, intensidad de
campo elctrico (E) y tiempos de tratamiento para B1 y B3
en la inactivacin de B.cereus 65
6.4a. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la
inactivacin de B.cereus en las cuatro bebidas analizadas 76
6.4b. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la
inactivacin de B.cereus en las cuatro bebidas analizadas 77
6.5. Parmetros modelo de Bigelow para la inactivacin de
B.cereus en las cuatro bebidas analizadas 78
6.6. Parmetros cinticos del modelo de Weibull para la
inactivacin de B.cereus en las cuatro bebidas analizadas 80
6.7. Parmetros cinticos de la ecuacin modificada de
Gompertz para la inactivacin de B.cereus en las cuatro
bebidas analizadas 81
6.8. Parmetros cinticos del modelo Log-Logistic simplificado 86
xi
-
FIGURAS
2.1. Cmaras de tratamiento 7
2.2. Componentes de las cmaras de tratamiento tipo co-field 7
2.3. Onda de cada exponencial 9
2.4. Onda cuadrada 9
2.5. Onda cuadrada bipolar 10
2.6. Estructura de la membrana bacteriana expuesta a altas
temperaturas 11
2.7. Onda cuadrada bipolar. Amplitud del pulso (w) 12
2.8. Comparacin de tamaos celulares 14
2.9. Induccin de un potencial transmembrana en una clula
expuesta a PEF 16
2.10. Mecanismo de inactivacin celular por PEF 17
2.11. Brotes de enfermedades transmitidas por el huevo y sus
derivados. Espaa (1998-2001) 26
2.12. Relacin de brotes de enfermedades transmitidas por
alimentos y alimentos implicados en Espaa (1994-2003) 29
2.13. Curva de supervivencia de esporas de B.stearothermophilus a
temperatura constante (115C) 35
2.14. Ejemplos de curvas de supervivencia no lineales 36
5.1. pH-metro y conductmetro 46
5.2. Grfico del equipo de pulsos elctricos 50
6.1. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B1 58
6.1A. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B2 58
6.2. Comparacin del crecimiento de B.cereus en B1 y B2 a 4C 59
6.3. Curva de crecimiento de B.cereus a 20C en B1 60
6.3A. Curva de crecimiento de B.cereus a 20C en B2 60
6.4. Comparacin del crecimiento de B.cereus en B1 y B2 a 20C 61
6.5. Curva de crecimiento de B.cereus a 37C en B1 62
6.5A. Curva de crecimiento de B.cereus a 37C en B2 62
6.6. Comparacin del crecimiento de B.cereus en B1 y B2 a 37C 63
6.7. Valores de mx de Gompertz para B.cereus a las tres diferentes
xii
-
temperaturas de crecimiento para B1 y B2 64
6.8. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B1 en las
diferentes condiciones de tratamiento con PEF 67
6.9. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B3 en las
diferentes condiciones de tratamiento con PEF 68
6.10. Curvas de inactivacin de B.cereus en B2 en las diferentes
condiciones de tratamiento con PEF 70
6.10A. Curvas de inactivacin de B.cereus en B4 en las
diferentes condiciones de tratamiento con PEF 70
6.11. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B1 y B2 72
6.11A. Inactivacin de B.cereus a 25kV/cm en las bebidas y B2 72
6.12. Inactivacin de B.cereus a 35kV/cm en las bebidas B1 y B2 73
6.12A. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B3 y B4 73
6.13. Inactivacin de B.cereus a 25kV/cm en las bebidas B3 y B4 74
6.13A. Inactivacin de B.cereus a 35kV/cm en las bebidas B3 y B4 74
6.14. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los
cuatro modelos analizados para B1 a 15kV/cm 83
6.15. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los cuatro
modelos analizados Para B2 a 15kV/cm 84
6.15A. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los
cuatro modelos analizados para B3 a 15kV/cm 84
6.16. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los
cuatro modelos analizados para B4 a 15kV/cm 85
6.17. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura
de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (15kV/cm)
en B3 88
6.18. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura
de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento con PEF (25kV/cm)
en B3 89
6.18A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura
de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (35kV/cm)
en B3 89
xiii
-
6.19. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura
de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (15kV/cm)
en B4 92
6.20. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura
de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (25kV/cm)
en B4 93
6.20A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura
de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (35kV/cm)
en B4 93
xiv
-
RESUMEN
Con el objetivo de conocer el efecto del polvo de cacao (CocoanOX 12%) y los
pulsos elctricos de alta intensidad (PEF) en el control e inactivacin de clulas
vegetativas de Bacillus cereus, en cuatro bebidas: leche semi-desnatada (B1),
leche semi-desnatada con CocoanOX 12% (B2), leche semi-desnatada y huevo
lquido (B3) y leche semi-desnatada, huevo lquido y CocoanOX 12% (B4), se
realizo el presente estudio.
La concentracin de CocoanOX 12% fue de 2.5% (p/v), ya que se conoce que es
la mnima concentracin de cacao que ejerce un efecto letal en clulas vegetativas
bacterianas. Posteriormente al tratamiento con PEF, las bebidas se almacenaron en
refrigeracin durante 15 das para as analizar el comportamiento de B.cereus
despus del tratamiento con PEF y el efecto del CocoanOX 12%. Los resultados
obtenidos fueron analizados mediante cuatro modelos matemticos predictivos;
modelo de Bigelow, Weibull, la ecuacin modificada de Gompertz y Log-logistic.
En B1 el mximo nivel de inactivacin fue de 3Log10 ciclos logartmicos de
reduccin para 35kV/cm, 300s a 15C; estos mismos resultados se obtuvieron
para B3. En las bebidas suplementadas con CocoanOX 12% el nivel de
inactivacin incremento hasta 3.30Log10 ciclos de reduccin. El modelo que
mejor se ajusto a los datos obtenidos experimentalmente para las cuatro bebidas,
fue el Log-logistic.
Durante el almacenamiento, el CocoanOX 12% ejerci un efecto bactericida en el
control de B.cereus, dando como resultado una reduccin de cuatro ciclos
logartmicos a los 15 das de almacenamiento a 5C en B2 y B4, con respecto a las
bebidas que no contenan el CocoanOX 12%. Estos resultados ponen de
manifiesto el efecto bacteriosttico del CocoanOX 12% as como el efecto
sinrgico de este producto y los PEF en el control de Bacillus cereus.
El presente estudio abre camino hacia la realizacin y propuesta de una nueva
bebida rica en nutrientes esenciales.
-
1. INTRODUCCIN
Gracias a los cambios en la dieta de los consumidores, debido a una mayor
concienciacin por proteger la salud y bienestar, as como tambin la falta de
tiempo, las industrias estn tratando de desarrollar alimentos procesados listos
para el consumo, ricos en nutrientes; con mnimos tratamientos de conservacin,
as como tambin alimentos orgnicos verdes los cuales carecen de
conservantes qumicos en los mismos.
Estos cambios en los hbitos de consumo, estn llevando a la industria agro-
alimentara a utilizar nuevas tecnologas de conservacin no trmicas. Dentro de
las ms prometedoras se encuentran la tecnologa de Altas Presiones Hidrostticas
(HHP) y ms recientemente se est trabajando a nivel de laboratorio y de planta
piloto en la posibilidad de aplicar el tratamiento por Pulsos Elctricos de Alta
Intensidad (PEAI). Ambas tecnologas se pueden aplicar solas o combinadas con
antimicrobianos naturales como sustitutos de conservantes qumicos, lo que se
denomina un tratamiento por barreras o efecto hudle. Al tratarse de tecnologas
no trmicas, permiten conservar, en mayor medida que los tratamientos trmicos,
la calidad (sabor, aroma, color y vitaminas) de determinados alimentos listos para
el consumo e inactivar microorganismos patgenos, alteradores y enzimas,
incrementando su vida til en refrigeracin y facilitando su comercializacin.
Dentro de este entorno tecnolgico y de nuevos productos, en el presente trabajo
se pretende desarrollar una nueva bebida mezcla de huevo lquido pasteurizado,
leche desnatada y antimicrobianos naturales la cual cumple con caractersticas
ideales para un pblico cada vez ms exigente.
Para conseguir la inocuidad del producto desarrollado frente a clulas vegetativas
de un microorganismo patgeno que est presente en las materias primas
utilizadas y para mantener en lo posible sus caractersticas nutricionales y
sensoriales, se evaluar la capacidad de dos tecnologas no trmicas (Altas
1
-
Presiones Hidrostticas y Pulsos Elctricos de Alta Intensidad) solas o
combinadas con diferentes antimicrobianos naturales.
2. MARCO TERICO
Tradicionalmente los alimentos han sido preservados usando calor (esterilizacin
comercial, pasteurizacin y escaldado), preservativos (antimicrobianos), o
cambios en las condiciones del medio para los microorganismos como en el pH
(fermentacin), actividad de agua (deshidratacin), la temperatura (refrigeracin
y/ congelacin) (Barbosa et al, 2001).
A pesar de la eficacia de las tecnologas tradicionales desde el punto de vista de
seguridad microbiolgica, estas tambin causan un deterioro nutricional, sensorial
y funcional en los alimentos procesados (Barbosa et al, 2001).
La creciente demanda de alimentos frescos, mnimamente procesados a la vez que
seguros y que conserven sus cualidades nutricionales y organolpticas por parte
de los consumidores ha llevado a un gran esfuerzo de investigacin en los ltimos
veinte aos con el fin de desarrollar nuevos mtodos de conservacin capaces de
inactivar microorganismos patgenos transmitidos por alimentos, as como
tambin conservar sus valores nutricionales y sensoriales (Maas et al, 2005;
Herrero et al, 2006; Barbosa et al, 2001; Devlieghere et al, 2004).
El desarrollo de nuevas tecnologas en la Industria Alimentara est permitiendo
alargar la vida til de muchos productos y satisfacer los gustos del consumidor.
Son productos que presentan un valor aadido y una alta calidad nutritiva y
sensorial, que generalmente se consumen crudos o con un tratamiento trmico
suave. Por este motivo, resulta imprescindible conocer el efecto de las distintas
tecnologas de conservacin en su calidad (Herrero et al, 2006).
Los mayores avances en este campo se han conseguido con el desarrollo de
sistemas fsicos, que afectan la viabilidad de los microorganismos, sin un
incremento sustancial de la temperatura del alimento (Barbosa et al, 2001;
Herrero et al, 2006).
2
-
Entre las tecnologas de esta naturaleza se encuentran las altas presiones
hidrostticas (HHP), ultrasonidos, irradiacin, pulsos elctricos de alta intensidad
(PEF), campos magnticos oscilantes y luz blanca de alta intensidad (Herrero et
al, 2006; Maas et al, 2005). El proceso de irradiacin ionizante (IR) envuelve la
aplicacin de ondas electromagnticas electrones a los alimentos. Las fuentes de
radiacin incluyen rayos gamma de cobalto-60, rayos X, la cantidad de irradiacin
absorbida por el alimento es medida en kGy (1Gy = 1J/kg). La aplicacin
comercial del tratamiento por irradiacin ionizante en alimentos empez en 1980,
pero su xito ha sido poco debido a las preocupaciones en cuanto al tratamiento
por parte de los consumidores. Hoy en da, la percepcin de la sociedad en cuanto
a la IR esta cambiando y se esta reexaminando esta tecnologa (Maas et al,
2005).
El ultrasonido es definido como ondas de sonido con frecuencias por encima del
umbral de audicin humana (>16kHz). Aunque el ultrasonido fue inicialmente
descartado como un mtodo para la preservacin de alimentos debido a la
debilidad de su accin letal frente a los microorganismos, la aplicacin de una
presin hidrosttica externa de hasta 600MPa (Manosonicacin (MS)) incrementa
la letalidad del tratamiento. Adicionalmente, la combinacin de MS con
temperatura (Manotermosonicacin (MTS)) ha sido propuesta.
Las HHP envuelven la aplicacin de presiones desde 100 a 1000MPa. El primer
estudio del efecto letal de las HHP fue realizado a finales del siglo 19, pero solo
hasta aos recientes se ha empezado a aplicar comercialmente (Maas et al,
2005).
La tecnologa por PEF consiste en la aplicacin de pulsos elctricos (10-
50kV/cm) de corta duracin (1-100s) a un alimento puesto entre dos electrodos.
Numerosos estudios han comprobado la efectividad de los pulsos elctricos de
alta intensidad en la destruccin de microorganismos y enzimas de sistemas de
alimentos (Maas et al, 2005).
3
-
La optimizacin del empleo de estos mtodos de conservacin pasa por el diseo
de procesos combinados, en los que la asociacin o aplicacin simultnea de
varios procedimientos permita potenciar el efecto, de cada uno de ellos, en los
microorganismos patgenos y alteradores y reducir el impacto adverso en las
caractersticas de los alimentos tratados (Herrero et al, 2006).
2.1 NUEVAS TECNOLOGAS
Se ha comprobado que estas tecnologas alargan la vida de diversos productos
alimenticios y podrn en un corto o mediano plazo reemplazar parcialmente los
tratamientos trmicos convencionales existentes utilizados industrialmente para
pasteurizar y/o esterilizar los alimentos (Barbosa et al, 2001).
2.1.1 PULSOS ELECTICOS DE ALTA INTENSIDAD (PEF)
Los PEF se basan en la aplicacin de pulsos cortos de alto voltaje sobre el
alimento (tpicamente de 20 a 80kV/cm) con una duracin entre 1 y 10 ms (hasta
300s) y se ajusta teniendo en cuenta diversos factores del alimento y de la
microbiota contaminante; el alimento producto se pone entre dos electrodos
dentro de una cmara. Es un proceso no trmico, ya que los alimentos tratados se
mantienen a temperatura ambiente o por debajo de la misma por algunos
microsegundos, minimizando la energa prdida causada por el calentamiento.
Esta tecnologa es considerada superior al tratamiento calrico convencional
debido a que reduce grandemente los cambios que ocurren en las propiedades
sensoriales (sabor, color) y fsicas (textura, viscosidad) de los alimentos. Adems
de conservar los atributos sensoriales de los alimentos, los PEF no introducen
cambios qumicos significativos en los alimentos (Barbosa et al, 2001; Herrero et
al, 2006; Devlieghere et al, 2004).
Los resultados de estudios experimentales han demostrado la eficacia y validacin
de estos mtodos en la preservacin y extensin de la vida de productos
alimenticios como la leche, huevos lquidos, jugos de manzana, naranja y yogurt
4
-
entre otros. Los pulsos elctricos de alta intensidad y los pulsos de luz son las dos
tecnologas ms estudiadas y que parecen estar listas para su aplicacin industrial
como se ha demostrado en pruebas a nivel de laboratorio y de planta piloto
(Barbosa, 2000).
2.1.1.1 SISTEMAS DE TRATAMIENTO POR PEF
Los aspectos mas importantes de esta tecnologa son la generacin de pulsos
elctricos de alta intensidad, el diseo de cmaras para el tratamiento del alimento
de tal manera que ste reciba un tratamiento uniforme con un mnimo de
incremento de la temperatura y el buen diseo de electrodos para minimizar la
electrolisis.
Los diferentes componentes con los que cuenta el equipo de tratamiento por PEF
son los siguientes (Grahl et al, 1996):
Generador de alto voltaje Interruptor de alto voltaje Cmaras de tratamiento Transformador Sondas de temperatura, voltaje e intensidad de corriente Osciloscopio Sistema de refrigeracin
El osciloscopio se utiliza para comprobar el voltaje y la intensidad de corriente
aplicada durante el tratamiento. La energa es suministrada por una fuente de alto
voltaje y sta se almacena en uno o varios condensadores y se descarga a los
alimentos a tratar en forma de pulsos y as obtener un campo elctrico. La energa
contenida en los condensadores puede ser descargada casi instantneamente en
una millonsima de segundo. Esto se produce en una cmara de tratamiento donde
el alimento circula a travs de un conducto cilndrico pequeo. Cuando una seal
de activacin se genera, un interruptor de alta tensin se cierra y la carga
5
-
almacenada en el condensador pasa a travs de las cmaras de tratamiento que
contienen el alimento (Barbosa et al, 2001).
Un factor limitante a tener en cuenta en el tratamiento por PEF es el fenmeno de
la ruptura dielctrica. El fenmeno de la ruptura dielctrica consiste en un cambio
brusco de la conductividad elctrica en el interior de la cmara de tratamiento que
produce a su vez un aumento brusco de la intensidad de corriente provocando la
interrupcin del tratamiento. Este cambio brusco puede ser debido a una excesiva
intensidad del tratamiento, valor alto de conductividad elctrica del producto o a
la presencia de burbujas de aire. Durante el fenmeno se observa la formacin de
una chispa en el interior de la cmara de tratamiento, por lo que el fenmeno se
conoce tambin como arqueo o chispa.
2.1.1.2 CMARAS DE TRATAMIENTO
Las cmaras de tratamiento consisten en dos electrodos separados por un material
aislante resistente al alto voltaje en los cuales se aloja el alimento lquido a tratar.
Existen distintos tipos de cmaras segn el volumen almacenado, distribucin y
geometra. Dependiendo del tipo de estudio a realizar, podemos encontrar cmaras
estticas utilizadas para estudios preliminares de laboratorio y cmaras en
continuo utilizadas para estudios en planta piloto y escala industrial por ser ms
econmicas y eficientes. (Barbosa et al, 1999).
Los tipos de cmaras ms importantes son:
- Cmara co-field: Son cmaras continuas, donde la direccin del campo
elctrico generado es paralela al flujo del alimento.
- Cmara coaxial: Son cmaras continuas, constituidas por dos electrodos
cilndricos concntricos, donde el alimento fluye entre ellos recibiendo el
tratamiento.
- Cmara de placas paralelas: Son cmaras estticas, constituidas por dos
electrodos con una distancia menor que la superficie de los mismos.
6
-
CONTINAS ESTTICA
Co-field Coaxial Placas Paralelas
Figura 2.1. Cmaras de tratamiento. (Barbosa et al., 1998)
1. Figura 2.2. Componentes de las cmaras de tratamiento tipo co-field (IATA-
CSIC, 2008)
Las cmaras deben estar diseadas de tal modo que consigan distribuir
uniformemente la intensidad de campo elctrico y as conseguir una mayor
efectividad en el tratamiento, evitando las variaciones de campo que podran
aumentar las probabilidades de ruptura dielctrica (Barbosa et al, 1999).
2.1.1.3 FACTORES RELACIONADOS CON LA TECNOLOGIA DE PEF
2.1.1.3.1 FACTORES DEL PROCESO
7
-
2.1.1.3.1.1 INTENSIDAD DE CAMPO ELCTRICO
La intensidad de campo elctrico se produce en el interior de las cmaras y se
define como la diferencia de potencial aplicada a los dos electrodos por la
distancia entre ellos. Segn la ley de Gauss, el campo elctrico en geometra plana
se puede definir como:
dVE = Ecuacin 2.1
donde E es la intensidad de campo elctrico (kV/cm), V diferencia de potencial
(Voltios) y d es la distancia entre electrodos (cm) (Barbosa et al, 1999).
Es uno de los factores ms importantes en la inactivacin de microorganismos por
PEF, ya que para producir la ruptura de la membrana y posterior muerte del
microorganismo es necesario superar el denominado potencial crtico
transmembrana o intensidad de campo elctrico crtica (Ec) que suele situarse en
un valor de 5 kV/cm (Hlsheger et al., 1980; Qin et al., 1998).
2.1.1.3.1.2 FORMA DEL PULSO ELCTRICO
La forma del pulso interviene directamente en la inactivacin de microorganismos
por PEF. Existen diversos tipos de onda que forman el pulso, entre los cuales
podemos destacar:
Onda de cada exponencial: Este tipo de onda presenta un pico con corto tiempo en el mximo voltaje y una larga cola con un bajo campo
elctrico, hasta llegar a su valor inicial (0kV/cm); en donde el exceso de
calor generado en el alimento no produce un efecto letal en los
microorganismos (Barbosa et al, 1999; Barbosa et al, 2001) (Figura 2.3).
8
-
Figura 2.3. Onda de cada exponencial (Barbosa et al., 1999)
Onda cuadrada: Este tipo de onda se basa en alcanzar rpidamente el valor de voltaje aplicado, mantenindose durante cierto periodo de tiempo y
descendiendo rpidamente hasta su valor inicial. Existen diversos estudios
que han observado que la onda cuadrada es ms eficaz en la inactivacin
de microorganismos gracias a que mantienen el voltaje mximo dado por
un periodo de tiempo largo utilizando a su vez menos energa que la onda
de cada exponencial (Rodrigo et al., 2003;Barbosa et al, 2001 ) (Figura
2.4).
Figura 2.4. Onda cuadrada (Barbosa et al., 1999).
Dependiendo de la polaridad de los pulsos de onda cuadrada estos pueden tener
caractersticas monopolares o bipolares. Los pulsos bipolares son aquellos que
aplican un pulso de onda positiva seguido de un pulso de onda negativa (Figura
2.5). La aplicacin de pulso bipolar produce cambios en la orientacin de las
molculas cargadas de las clulas provocando un estrs aadido en la membrana
celular, facilitando su ruptura (Ho et al., 1995). En el caso de los pulsos
9
-
monopolares (Figura 2.4) se mantienen las polaridades, por lo que parecen ser
menos efectivos, produciendo adems una mayor electrolisis y aumento de los
slidos adheridos a los electrodos (Barbosa et al, 1999).
Figura 2.5. Onda cuadrada bipolar (Barbosa et al., 1999).
2.1.1.3.2 TEMPERATURA
La temperatura es otro de los factores importantes en el tratamiento por PEF.
Durante el tratamiento por PEF se produce un aumento de la temperatura que
depender, principalmente, del campo elctrico aplicado y del tiempo de
tratamiento. Un aumento de la intensidad del tratamiento por PEF provocar un
mayor aumento de la temperatura. El incremento de la temperatura inicial del
tratamiento favorecer, en general, la inactivacin tanto de enzimas como de
microorganismos, producindose un efecto sinrgico (pulsos-temperatura) a
temperaturas comprendidas entre 35-60 C. Esto es debido a cambios en la
permeabilidad y fluidez de la membrana y conductividad elctrica del alimento,
aumentando as las probabilidades de ruptura de la membrana (Figura 2.6)
(Jayaram et al., 1992; Rodrigo et al., 2002, Sampedro et al., 2006; Barbosa et al,
2001).
Algunos autores han demostrado que un aumento moderado de la temperatura de
tratamiento disminuye tambin la cantidad de energa necesaria para lograr un
mismo grado de inactivacin microbiana, debido a los cambios en los
componentes de la membrana inducidos por la temperatura (Wouters et al, 1999;
Heinz et al., 2003; Barbosa et al, 2001).
10
-
Baja temperatura Alta temperatura
Figura 2.6. Estructura de la membrana bacteriana expuesta ha altas temperaturas
(Amiali, 2005)
2.1.1.3.3 TIEMPO DE TRATAMIENTO
El tiempo de tratamiento (t) es otro de los parmetros directamente relacionados
con la inactivacin de microorganismos por PEF y se define como:
wnt = Ecuacin 2.2
donde t es el tiempo de tratamiento (s), n es el nmero de pulsos aplicados y w
es la amplitud o duracin del pulso (s). En general, un incremento del tiempo de tratamiento produce un incremento de la temperatura y una mayor inactivacin
pero varios estudios han demostrado que se consigue una mayor inactivacin
microbiana aplicando tiempos de tratamiento cortos e intensidades de campo altas
(Sampedro et al., 2006). La aplicacin de tiempos de tratamientos largos y por
tanto de un aumento del gasto energtico no produce un aumento significativo de
la inactivacin (Raso et al., 2000, Aronsson et al., 2001).
2.1.1.3.4 AMPLITUD DE PULSO
La amplitud del pulso (w), se define como el tiempo o duracin de un pulso en
microsegundos y depende de la forma del mismo (Figura 2.7). En general, si se
aplica una amplitud de pulso excesiva y un tiempo largo de tratamiento se puede
producir un incremento excesivo de la temperatura y alterar la conductividad del
alimento, con la consiguiente reduccin en la efectividad del tratamiento por PEF.
Es fundamental combinar de forma adecuada esta variable para optimizar el
tratamiento, logrando una mayor inactivacin con un menor incremento de
temperatura. Diversos autores han tratado de optimizar la amplitud del pulso
11
-
basndose en la inactivacin microbiana conseguida. Se ha comprobado que un
valor cercano a los dos microsegundos logra una mayor reduccin microbiana. Un
aumento de la amplitud del pulso no logra en muchos casos un aumento de la
inactivacin.
Figura 2.7. Onda cuadrada bipolar. Amplitud de pulso (w).
2.1.1.4 FACTORES RELACIONADOS CON LAS CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS DEL PRODUCTO
Es necesario conocer las caractersticas fsico-qumicas de los productos
susceptibles de ser tratados por PEF ya que estas afectan directamente a la
efectividad del tratamiento. Las principales son: la conductividad elctrica, fuerza
inica, pH, actividad de agua (aw), presencia de burbujas, antimicrobianos y
tamao de partcula. ltimamente se ha comprobado que la composicin del
alimento es tambin un factor importante a tener en cuenta. La efectividad del
tratamiento con PEF se reduce cuanto ms compleja es la composicin de un
alimento (Sampedro et al., 2006; Barbosa et al, 1999).
2.1.1.4.1 CONDUCTIVIDAD, pH, ANTIMICROBIANOS, FUERZA
INICA Y TAMAO DE PARTICULA
La conductividad esta relacionada con la transferencia de energa, cuando hay una
baja conductividad esto conduce a una mayor eficacia en el tratamiento de PEF;
los alimentos que actan como buenos conductores presentan dificultades para ser
tratados con PEF debido a que se genera un pequeo pico del pulso elctrico en
las cmaras de tratamiento. Por lo tanto, es conveniente que la conductividad del
12
-
alimento sea baja para obtener un buen grado de inactivacin. Un incremento en
la conductividad incrementa la fuerza inica de los lquidos, por lo tanto un
incremento de la fuerza inica del alimento genera la disminucin en la taza de
inactivacin. La conductividad y la fuerza inica estn estrechamente
relacionadas. La presencia de iones en el alimento produce efectos variados en los
patrones de inactivacin. Iones como Ca2+, Na+, K+ y Mg2+ actan sobre la
membrana y alteran las funciones celulares de est; sin embrago, iones como
Ca2+ y Mg2+ ejercen un efecto protector al tratamiento con PEF (Barbosa et al,
1999).
Factores adicionales que intervienen en el tratamiento con PEF son el pH del
alimento producto y la presencia de antimicrobianos, estos pueden actuar
sinrgicamente con el tratamiento para la destruccin de microorganismos; el pH
del medio juega un papel importante en las cinticas de inactivacin en el
tratamiento con PEF. El efecto sinrgico entre el pH y los PEF es atribuido a una
posible disminucin del pH citoplasmtico por un incremento en la taza de
transferencia de protones a travs de la membrana cuando sta es electroporada.
La presencia de antimicrobianos en el alimento producto, como nisina
lisozima, reduce la viabilidad de microorganismos patgenos, lo que a su vez
aumenta la efectividad del tratamiento con PEF. Cada uno de estos factores genera
un estrs adicional a los microorganismos, y el resultado es un incremento en la
inactivacin total (Barbosa et al, 1999; Barbosa et al, 2001).
La presencia de partculas suspendidas y de burbujas en el alimento lquido
semislido representan un desafi extra al tratamiento con PEF; las partculas
suspendidas impiden una distribucin homognea del campo elctrico aplicado y
las burbujas de aire, causan una ruptura dielctrica, arcos elctricos chispas, as
como tambin cuasar daos en las cmaras electrodos. Diferentes estudios han
determinado que alimentos lquidos con partculas de mayor tamao son menos
susceptibles a ser tratados por PEF debido a que el fenmeno de ruptura
dielctrica o arqueo se produce de forma ms repetida (Barbosa et al, 1999).
13
-
2.1.1.5 FACTORES DEL MICROORGANISMO
El tipo de microorganismo (bacterias Gram positivas, Gram negativas, levaduras
esporas), caractersticas especficas, como el dimetro de los microorganismos, la
estructura de la membrana intervienen para escoger las condiciones de
tratamiento. As como tambin, la fase de crecimiento y la concentracin de
microorganismos (Barbosa et al, 1999).
2.1.1.5.1 TIPO DE MICROORGANISMO
La sensibilidad de los microorganismos al tratamiento con PEF vara con cada
tipo de microorganismo; las clulas vegetativas son ms sensibles que las esporas.
Sin embargo, dependiendo de las condiciones experimentales, se puede lograr una
inactivacin irreversible de esporas bacterianas despus del tratamiento con PEF
(Marquez et al 1997). El tamao de los microorganismos tambin influye en la
eficacia de la inactivacin microbiana producida por PEF (Figura 2.8). Las
grandes clulas de las levaduras son ms fciles de inactivar que las clulas
bacterianas. Las bacterias Gram positivas son ms resistentes al tratamiento con
PEF que las Gram negativas, y las clulas que se encuentran en fase logartmica
son ms sensibles que las que estn en la fase estacionaria (Barbosa et al, 2001;
Barbosa et al, 1999).
Figura 2.8. Comparacin de tamaos celulares (Qin et al., 1998)
2.1.1.5.2 TAMAO DEL INCULO
La eficiencia de la inactivacin con PEF se ve afectada por la concentracin
inicial de microorganismos en el alimento a tratar. Jeantet et al (1999), reportaron
14
-
que cuando el tamao del inculo es grande se reduce el efecto letal del
tratamiento por PEF (Amiali, 2005).Sin embrago, se comprob que el aumento de
poblacin de E. coli (103-108 UFC/mL) en leche ultrafiltrada, no afect a la
efectividad del tratamiento (Barbosa et al., 1999). En conclusin parece que la
influencia de este parmetro sobre la efectividad de los pulsos se ve afectado por
el tipo de microorganismo y las condiciones de tratamiento estudiadas (Torres,
2006).
2.1.1.5.3 FASE DE CRECIMIENTO
Las caractersticas de la clula y en especial su membrana son diferentes en cada
etapa de desarrollo del microorganismo. En la fase logartmica las clulas son ms
sensibles a un factor externo como los pulsos elctricos, que en la fase
estacionaria; ya que las clulas se encuentran en divisin y por tanto la
membrana celular es ms susceptible a los cambios externos (Barbosa et al, 2001;
Barbosa et al, 1999; Amiali, 2005). Gskov et al (1996), reporto que la
inactivacin con PEF en la fase logartmica es del 30% mayor que en la fase
estacionaria (Amiali, 2005). Por lo tanto, en estudios de inactivacin microbiana
por PEAI se debera recoger las clulas en fase estacionaria consiguiendo las
condiciones ms desfavorables (Torres, 2006)
2.1.1.6 MECANISMO DE INACTIVACIN MICROBIANA POR PEF
Durante la fase de desarrollo de una nueva tecnologa de conservacin de
alimentos es necesario conocer al mximo los mecanismos por los cuales se
inactivan los microorganismos. Varias teoras han sido propuestas para estudiar la
inactivacin de los microorganismos con PEF. Las ms estudiadas son la ruptura
dielctrica y la electroporacin (Torres, 2006).
La electroporacin es la teora ms aceptada, sta describe el fenmeno que ocurre
en la membrana celular cuando se aplica una intensidad de campo elctrico que da
lugar a una diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana (potencial
15
-
transmembrana) resulta del hecho de que la membrana tiene una constante
dielctrica mucho ms baja que la mayora de los alimentos, por lo tanto, la
aplicacin de los pulsos elctricos induce a la acumulacin de cargas negativas y
positivas dentro de la clula (Figura 2.9), este campo elctrico aplicado
desestabiliza temporalmente la capa lpidica y las protenas de la membrana
celular; el plasma de las membranas celulares se hace permeable a pequeas
molculas y la permeabilidad causa hinchazn y una eventual ruptura de la
membrana celular. Cuando esta diferencia de potencial alcanza un valor crtico de
1 voltio la repulsin entre las cargas lleva a cabo el movimiento de las molculas,
que vara en funcin del tipo de microorganismo, el dimetro del mismo, y sus
condiciones de crecimiento, para Eschericia coli corresponde a un campo
elctrico externo de aproximadamente 10kV/cm, y se origina la formacin de
poros irreversibles en la membrana celular (electroporacin) y en consecuencia la
prdida de su integridad, incremento de la permeabilidad y finalmente destruccin
de la clula afectada (Barbosa et al, 2001; Herrero et al, 2006).
Figura 2.9. Induccin de un potencial transmembrana en una clula expuesta a
PEF (Grahl, 1996)
La ruptura elctrica es la teora en la cual la membrana puede ser considerada
como un capacitador lleno con circuito elctrico. El potencial elctrico normal en
ambos lados de la membrana es de aproximadamente 10mV. La exposicin de la
membrana a un campo elctrico conduce al desarrollo en sta de un potencial
diferencial promovido por la separacin de cargas elctricas a travs de la
membrana celular. El aumento del potencial elctrico de la membrana conlleva a
una reduccin del espesor de la membrana celular. La ruptura de la membrana
16
-
celular ocurre si el voltaje de ruptura crtico Vc (~1V) es alcanzado por un
incremento adicional del campo elctrico externo. Se asume que la ruptura es
causada por la formacin de poros transmembrnicos, lo cual conduce a una
descarga inmediata de la membrana y a la descomposicin de esta (Barbosa,
2000)
Hamilton y Sale (1967), concluyeron que los pulsos elctricos posiblemente
causan una perdida irreversible en la funcin de la membrana como barrera semi-
permeable entre las clulas y su entorno (Figura 2.10) (Barbosa et al, 2001).
Figura 2.10. Mecanismo de inactivacin celular por PEF (Mercado, 1997)
2.1.1.7 MECANISMO DE INACTIVACIN ENZIMATICA POR PEF
Diversos estudios han observado el mecanismo de inactivacin de enzimas por
PEF; estos pueden causar la desnaturalizacin de las enzimas, afectar las
interacciones hidrofobicas, puentes de hidrogeno, interacciones de van der Waal,
fuerzas electrostticas (Barbosa et al, 1999).
Adems, los PEF influyen en el estado conformacional de las protenas. Las
cargas de los grupos y sus estructuras son altamente susceptibles a cambios
externos, en este caso a la aplicacin de los PEF. Asociaciones y disociaciones de
grupos ionizables, movimientos de las cargas de las cadenas, cambios en la
alineacin de las hlices, y la forma de una protena pueden ser inducidos por el
tratamiento con PEF (Barbosa et al, 1999).
17
-
Gracias a que los PEF afectan la estructura proteica y enzimtica, estos se pueden
utilizar para prevenir reacciones no favorables en los alimentos como: reacciones
de oxidacin, cambio del sabor y cambio del color de los alimentos (Barbosa et al,
1999)
2.1.1.8 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TECNOLOGA DE PEF
2.1.1.8.1 VENTAJAS DE LOS PEF
9 Los PEF son efectivos en la inactivacin de microorganismos patgenos y alteradores en los alimentos.
9 El proceso de tratamiento con PEF extiende la vida til de zumos de fruta, productos lcteos, huevo lquido, y cremas de vegetales.
9 Mantiene las caractersticas organolpticas, sensoriales (olor, sabor y aroma) y nutritivas (vitaminas, minerales), de los alimentos productos
tratados.
9 Los PEF, son una alternativa a la pasteurizacin y esterilizacin sin calor de alimentos lquidos en la industria agroalimentaria.
9 Los PEF actan sinrgicamente con otras tecnologas ya existentes como el tratamiento por calor, o nuevas tecnologas como la adicin de
antimicrobianos naturales y HHP para as obtener una mayor inactivacin
microbiolgica con menores tiempos de exposicin y tratamientos
moderados.
2.1.1.8.2 DESVENTAJAS DE LOS PEF
8 Tecnologa limitada a alimentos productos lquidos, sin partculas en suspensin.
18
-
8 Es aplicable nicamente a alimentos productos que tengan una baja conductividad, ya que productos con alta conductividad reducen la eficacia
del tratamiento, favoreciendo la ruptura dielctrica.
8 Si la composicin del alimento es compleja limita su potencial de inhibicin.
8 Solo logra inhibir las esporas bacterianas si se mezcla con otro tratamiento de inactivacin.
8 El gasto energtico es mayor que en el tratamiento trmico convencional con lo que se incrementar el coste de produccin y venta.
2.2 ANTIMICROBIANOS NATURALES
El creciente inters en la sustitucin de conservantes alimentarios qumicos y
productos con bajo impacto al medio ambiente, ha fomentado la investigacin
sobre la seleccin de materiales vegetales con el fin de identificar nuevos
compuestos, antimicrobianos as como tambin antioxidantes. Los productos
naturales y los compuestos derivados de los mismos, tienen aplicaciones en el
control de microorganismos patgenos. Por lo tanto, existen buenas perspectivas
para nuevos mtodos de procesamiento y control de alimentos (Valero et al, 2003;
Burt, 2004).
Los compuestos fenlicos de los antimicrobianos naturales, son los responsables
de su actividad antibacteriana. Existen pruebas que revelan que los componentes
traza juegan una parte fundamental en cuanto a la actividad antibacterial de los
extractos de plantas posiblemente mediante un efecto sinrgico con otros
componentes presentes (Burt, 2004).
Los antimicrobianos naturales actan sinrgicamente con un gran nmero de
mtodos de preservacin: pH bajo, baja actividad de agua del alimento, presencia
19
-
de agentes quelantes, calor leve, presiones moderadas, pulsos elctricos aunque
no todos se han investigado en productos alimenticios (Burt, 2004).
Posiblemente el rea de aplicacin ms interesante de los antimicrobianos
naturales como antibacterianos es en la reduccin e inhibicin del crecimiento de
microorganismos patgenos como E.coli Salmonella, B.cereus y L.monocytogenes
(Burt, 2004).
El uso de los antimicrobianos naturales por parte de los consumidores se espera
que incremente en el futuro gracias al aumento de los consumidores verdes los
cuales estimulan el uso y desarrollo de productos derivados de plantas, as como
tambin la medicina es cada vez ms receptiva al uso de antimicrobianos y otros
frmacos derivados de las plantas (Burt, 2004; Cowan, 1999).
2.2.1 CACAO
Cacao (Theobroma cacao) tiene varios usos en la industria, siendo el mayor de
estos la produccin de chocolate, y con menor impacto el uso como aromatizante.
Los componentes con accin antibacteriana ms importantes del cacao son las
antocianinas y flavonoides, estos ltimos han demostrado tener propiedades
antioxidantes (Busta et al, 1968). Los flavonoides aportan varios beneficios a la
salud como, baja tasa de mortalidad cardiovascular, papel protector contra
enfermedades coronarias, eliminacin de radicales libres derivados del oxigeno y
de nitrgeno, quelacin de metales de transicin (hierro, cobre), estudios in Vitro
han demostrado que tambin poseen propiedades antiinflamatorias, antialrgicas,
antivirales, anticancergenas (Keen et al, 2005; Nijveldt, 2001). El CocoanOX
12% (CCX) es cacao en polvo; es un compuesto de alta biodisponibilidad y
garantiza contener al menos 12% de polifenoles en su composicin.
2.2.2 COMPOSICIN DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES
20
-
Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias
aromticas, la mayora de las cuales son fenoles sus derivados. La mayora son
metabolitos secundarios, en muchos casos estos sirven como mecanismo de
defensa vegetal contra la depredacin por microorganismos, insectos y
herbvoros; algunos de ellos como terpenoides (dan el olor a la planta), quinonas y
taninos (pigmentacin de las plantas). Muchos de los compuestos son
responsables del sabor de la planta, y algunas de estas son utilizadas por el
hombre para dar sabor y aroma. Algunos de los compuestos ms simples constan
de un sustituto del anillo fenlico (Cowan, 1999).
Los componentes mayoritarios de algunos antimicrobianos naturales son: aldehdo
cinnamic y eugenol en canela (Valero et al, 2003), antocianinas y otros
componentes en el cacao (Busta et al, 1968), el ans consta de 85% de anothole
como ingrediente activo, as como tambin de eugenol, metilchavicol,
anisaldehyde y estragol (Ciftic et al, 2005), la vainilla tiene como componente
ms abundante a la vainillina, as como tambin sustancias voltiles que son las
responsables de su aroma, phydroxybenzoic, cido p-hidroxibenzladehido, cido
vainillic, alcohol p-hydroxybenzyl y alcohol vanillyl (Mao et al, 2002).
2.2.3 MECANISMO DE INACTIVACIN MICROBIANA Y ENZIMATICA POR ANTIMICROBIANOS NATURALES
Los antimicrobianos naturales estn compuestos por diferentes grupos qumicos,
lo ms probable es que sus propiedades antibacterianas no se deban a un solo
mecanismo sino a la mezcla de varios de los mismos los cuales tienen diferentes
sitios de actuacin en la clula bacteriana. Se conoce que los antimicrobianos
naturales poseen fenoles y estos la presencia de grupos hidroxilo; estos
componentes a su vez poseen fuertes propiedades antibacteriales contra
microorganismos patgenos. La posicin del grupo hidroxilo en los anillos
fenlicos no afecta su actividad antibacterial. Algunos autores han encontrado que
los fenoles con estado de oxidacin ms alto aumentan su poder antibacterial
(Cowan; 1999; Burt, 2004).
21
-
El modo de accin de los antimicrobianos naturales es similar al de otros
compuestos fenlicos; los sitios de accin de estos en la clula bacteriana son:
degradacin de la pared celular dao en la membrana citoplasmtica,
permeabilizacin de la membrana celular, dao en las protenas de membrana,
perdida del contenido intercelular al exterior, coagulacin del citoplasma y
perdida de la fuerza motriz de protones. Todos estos mecanismos de inactivacin
no actan independientemente; algunos afectan a la clula bacteriana como
consecuencia del dao anteriormente producido por otro mecanismo de
inhibicin. La estructura qumica de cada antimicrobiano natural afecta en su
modo de accin y actividad antibacteriana (Burt, 2004).
Los diferentes componentes de los antimicrobianos naturales tambin parecen
tener accin sobre las protenas presentes en el citoplasma, las enzimas envueltas
en la regulacin de la energa y en la sntesis de compuestos estructurales;
afectando tambin la unin de las protenas, logrando tambin la inhibicin de
enzimas por la oxidacin de compuestos, posiblemente a travs de la reaccin con
los grupos sulfhdrilo por medio de interacciones no especificas con las
protenas. Enzimas como la ATPasa se localiza en el citoplasma de la membrana
celular y en el borde de las molculas lipidias, por lo cual se ve inhibida por la
accin de los antimicrobianos naturales (Cowan; 1999; Burt, 2004).
La actividad antibacterial de los antimicrobianos naturales vara de acuerdo con el
tipo de microorganismo y se ve influenciada por la temperatura de
almacenamiento del alimento. Las bacterias Gram positivas son generalmente ms
sensibles a los antimicrobianos naturales que las Gram negativas. Se ha reportado
que altas concentraciones de antimicrobianos naturales prolongan
considerablemente la fase exponencial de los microorganismos como B.cereus
logran su inhibicin. Se ha encontrado que el aceite de canela, es efectivo en la
inhibicin de B.cereus (Valero et al, 2003; Burt, 2004).
Dependiendo del tipo de material vegetal utilizado, en trminos de su naturaleza
(especias, extracto aceite esencial), el origen (pas de origen, altitud a la que
22
-
crece, temporada de cosecha), el proceso de produccin, grado de pureza y su
conservacin, ayudan a determinar la presencia y concentracin de sustancias
antimicrobianas en el producto final (Valero et al, 2003).
2.2.4 EFECTO SINERGICO DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES Y NUEVAS TECNOLOGAS DE CONSERVACIN
ALIMENTARIA
El uso de antimicrobianos naturales con otra tcnica de conservacin de alimentos
da grandes beneficios de cada tcnica reduciendo el tiempo y la cantidad de cada
uno. Por esta razn, la aplicacin de temperaturas moderadas, tratamiento con
HHP y PEF y/ la preservacin de los productos alimenticios en fri juegan un
papel importante en la inhibicin de microorganismos (Valero et al, 2003).
Desde que se conoce que las HHP causan dao en la membrana celular, se sugiere
que esta tecnologa y la adicin de antimicrobianos naturales tienen el mismo
rgano blanco en las clulas bacterias, obtenindose as un efecto sinrgico. El
timol y el carvacol muestran un efecto sinrgico con el tratamiento de altas
presiones. Obtenindose reducciones de L.monocytogenes con 300MPa y
3mmol/L de timol carvacol (Burt, 2004).
La presencia de cacao y calor en el medio aumentan su efecto de inactivacin
(sinergismo), pero la presencia de calor no es esencial para el efecto letal del
cacao (Busta et al, 1968).
El efecto sinrgico puede ser explotado para maximizar la actividad antibacterial
de los antimicrobianos naturales y minimizar de esta manera su concentracin
(Burt, 2004).
2.2.5 EFECTO DE LA ADICIN DE ANTIMICROBIANOS NATURALES EN LOS ALIMENTOS
23
-
Generalmente se asume que altas concentraciones de lpidos y/ protenas en los
alimentos protegen a las bacterias de la accin antibacterial de los antimicrobianos
naturales, contrariamente una concentracin alta de agua y/ sal facilita la accin
antibacteriana. La estructura fsica del alimento puede limitar la accin
antibacterial de los antimicrobianos naturales. Se ha comprobado que se requieren
concentraciones mayores de los antimicrobianos naturales cuando se adicionan a
los alimentos, para generar el mismo efecto antimicrobiano que en ensayos in
vitro. Por ejemplo, para lograr el efecto antimicrobiano en leche semi desnatada se
requiere el doble de concentracin que en ensayos in vitro. Este efecto puede ser
debido a que los alimentos poseen ms nutrientes que el medio de cultivo y por tal
razn permite que las clulas bacterianas daadas reparen su dao en menos
tiempo; pero no nicamente actan las propiedades intrnsecas (contenido de
grasas, protenas, concentracin de agua, antioxidantes, preservativos, pH, sal y
otros aditivos) del alimento en la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos
naturales, las caractersticas extrnsecas (temperatura, empaque y las
caractersticas del microorganismo) son determinantes (Burt, 2004).
Generalmente, la susceptibilidad de las bacterias al efecto antibacteriano de los
antimicrobianos naturales se incrementa con un pH bajo del alimento, temperatura
de almacenamiento y la concentracin de oxigeno presente (Burt, 2004).
Los efectos organolpticos se pueden limitar, seleccionando el tipo de
antimicrobiano natural de acuerdo con el tipo de alimento, para as no cambiar el
aroma sabor original del mismo (Burt, 2004).
2.2.6 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES
2.2.6.1 VENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES
9 La adicin de antimicrobianos naturales prolonga la fase exponencial de muchos microorganismos patgenos y alteradores.
24
-
9 Los antimicrobianos naturales pueden realzar el aroma de los alimentos.
9 El tratamiento con antimicrobianos naturales acta sinrgicamente con otras tecnologas ya existentes como el tratamiento por calor, o nuevas
tecnologas como PEF y HHP, para obtener una mayor inactivacin
microbiolgica con menores concentraciones y tiempos de tratamiento.
2.2.6.2 DESVENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES
8 Su modo de accin aun no esta completamente claro.
8 Si la composicin del alimento es compleja se limitara su poder antimicrobiano.
8 En algunos casos, se aumenta la concentracin de antimicrobianos naturales en los alimentos para lograr la misma inhibicin que en ensayos
in vitro.
2.3 BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO
2.3.1 HUEVO LQUIDO
El huevo es un alimento de gran valor nutritivo que de forma natural se encuentra
protegido de la contaminacin exterior gracias a su cscara (Instituto Estudios del
Huevo, 2004). A pesar de ello en ocasiones se ve involucrado en las
toxiinfecciones alimentaras las cuales presentan una incidencia preocupante en
cuanto a su repercusin global sobre la salud pblica. Los datos epidemiolgicos
relativos a los brotes de toxiinfecciones alimentaras registrados durante los
ltimos aos ponen de relieve una elevada frecuencia de los originados por la
ingestin de alimentos de consumo inmediato que contienen huevo (Instituto
Estudios del Huevo, 2004).
25
-
Segn el informe elaborado por el Centro Nacional de Epidemiologa entre los
aos 1998 al 2001, el 38.5% de los brotes alimentarios se relacionan con el
consumo de huevo y sus derivados, de los cuales el 85.5% se asociaron con la
salmonelosis. El principal factor que contribuye a estos brotes es la inadecuada
temperatura de conservacin de los alimentos, entre otros factores se destacan, el
consumo de alimentos crudos y la preparacin con antelacin. El hogar con una
frecuencia superior al 59% es el lugar donde ocurren la mayora de los brotes
(Figura 2.11) (Instituto Estudios del Huevo, 2004)
Figura 2.11. Brotes de enfermedades transmitidas por el huevo y sus
derivados. Espaa (1998-2001) (Instituto Estudios del Huevo, 2004)
El huevo cuenta con barreras fsicas y qumicas que lo protegen de la
contaminacin por microorganismos:
26
-
La cutcula es la capa compuesta de queratina que recubre la cscara de acta a modo de tapn sellante de sus poros. Es una excelente barrera frente a la
prdida de humedad del huevo y frente a la entrada de microorganismos.
(Instituto Estudios del Huevo, 2004)
La cscara est compuesta por sales de carbonato clcico, fosfato clcico y protenas. Sus miles de poros permiten el intercambio gaseoso con el exterior.
(Instituto Estudios del Huevo, 2004)
El albumen o clara formada por protenas capaces de impedir la multiplicacin de los microorganismos invasores mediante diferentes mecanismos de accin,
adems su viscosidad dificulta el movimiento de las bacterias. La clara
contiene, ovoalbmina (55% de la protena de la clara), lecitina, lisozima, la
cual es un conservante natural por su actividad antimicrobiana; es importante
resaltar que el efecto antimicrobiano de la lisozima y de la ovoalbmina
desaparece cuando la clara se mezcla con la yema del huevo(Instituto Estudios
del Huevo, 2004)
Un gran nmero de industrias utilizan el huevo para elaborar sus productos en el
sector de alimentacin humana. El huevo aporta adems de su valor nutritivo, una
amplia gama de propiedades funcionales que son necesarias para los procesos de
fabricacin de muchos alimentos (Lee et al, 1999; Instituto Estudios del Huevo,
2004).La produccin y comercializacin de productos derivados del huevo ha
progresado de forma importante en los ltimos aos. Las razones de este
desarrollo son variadas, por un lado, la evolucin de la industria alimentaria, para
responder al creciente consumo de platos precocinados, que cada vez demanda
materias primas ms fciles de manipular y adecuadas a su proceso productivo,
evitando las complicaciones de manejar las cscaras y el huevo crudo. Por otra
parte, este desarrollo tambin se ha debido a la prohibicin del uso de huevo
fresco en la restauracin colectiva, para cualquier alimento cocinado a una
temperatura inferior a 75C (Instituto Estudios del Huevo, 2004).
Para la industria alimentaria los ovoproductos ofrecen algunas ventajas frente al
huevo en cscara:
27
-
Mayor versatilidad Fcil empleo y dosificacin Eliminacin de los residuos que supondran las cscaras Mayor seguridad bacteriolgica Manipulacin ms sencilla: fcil almacenamiento, ahorro de tiempo y
de mano de obra
Facilita la distribucin y el comercio internacional
El ovoproducto que ms se utiliza en la hostelera, restauracin colectiva y en la
industria alimentaria es el huevo lquido pasteurizado. Aproximadamente el 85%
de la produccin de huevos en Espaa se dirige al consumo humano directo como
huevo fresco, y el 15% restante est destinado a la industria de fabricacin de
ovoproductos, sobre todo industrias alimentarias (Instituto Estudios del Huevo,
2004).
El huevo lquido se pasteuriza a 60C por 3 minutos para obtener un producto
estable y libre de microorganismos. La pasteurizacin por calor es efectiva frente
a casi todos los microorganismos pero no frente a microorganismos termfilos
esporulados; adems esta tiene efectos negativos frente a la calidad y cantidad del
alimento tratado, en este caso huevo lquido. La pasteurizacin del huevo lquido
genera un descenso en la viscosidad (Miranda, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al,
1999). Someter el huevo lquido a altas temperaturas (60-68C) reduce la
capacidad espumante del huevo. Varios mtodo alternativos a la pasteurizacin
por calor se estn estudiando como el uso de pulsos elctricos de alta intensidad
(PEF), el cual inactiva a los microorganismos patgenos y alteradores, as como
tambin el uso de ultrasonido, uso de agentes antimicrobianos y las HHP, estas
ltimas dan un tratamiento homogneo a todo el alimento en su envase
inactivando a los microorganismos sin generar cambios fsicos del alimento
(Miranda et al, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al, 1999). El huevo lquido acta
como un importante factor para determinar el proceso de tratamiento debido a su
fcil desnaturalizacin de protenas y puede enmascarar a los microorganismos, de
esta manera hacer ms difcil su inactivacin (Lee et al, 2001).
28
-
La vida til del huevo lquido esta determinada por los microorganismos
alteradores que contiene: Micrococcus, Staphylococcus, Arthrobacter, Bacillus,
Pseudomonas spp y coliformes. En el huevo lquido pueden crecer
microorganismos patgenos como: Salmonellae spp y Listeria monocytogenes, as
como tambin algunos gneros resistentes a la pasteurizacin como: Alcaligenes,
Bacillus, Proteus, Escherichia, Pseudomonas y cocos Gram positivos (Miranda et
al, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al, 1999). La presencia de coliformes en el huevo
lquido es un indicador de malas condiciones del proceso de produccin del
mismo y tambin indica una alta probabilidad de la presencia de Salmonella
(Nieto, 2003).
Las caractersticas intrnsecas del alimento son determinantes en el desarrollo de
las contaminaciones por la proliferacin de bacterias. Los alimentos de alto
contenido proteico, como la carne, el pescado, los huevos, la leche y derivados,
son alimentos considerados de alto riesgo (Figura 2.12).
Figura 2.12. Relacin de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos y
alimentos implicados en Espaa (1994-2003)
29
-
Es interesante sealar, en relacin con la evolucin del consumo de huevos en los
pases desarrollados, el auge de la alimentacin fcil como resultado de
determinadas tendencias sociales. Como resultado de ello, los ovoproductos estn
sustituyendo cada vez ms a los huevos con cscara, tanto en los hogares como en
la restauracin colectiva (Instituto Estudios del Huevo, 2004).
2.3.1.1 MICROORGANISMOS ALTERADORES Y PATGENOS DEL HUEVO LQUIDO
La flora del huevo lquido est constituida por muchos tipos de bacterias Gram
positivas y Gram negativas que provienen principalmente de cscaras
contaminadas con heces y otros materiales, de la existencia en el lote en cuestin
de huevos contaminados del estado de limpieza, de la maquinaria y utensilios
empleados as como de las conducciones, bombas, filtros, recipientes, batidoras o
tanques de almacenamiento (Instituto Estudios del Huevo, 2004).
La simple presencia de un huevo deteriorado puede contaminar la instalacin de
rotura y aadir millones de bacterias al huevo lquido. La utilizacin para la
elaboracin de huevo lquido de huevos con la cscara rota incrementa el grado de
contaminacin por Salmonellas, otros microorganismos patgenos y
microorganismos causantes de alteracin (Instituto Estudios del Huevo, 2004;
Amiali, 2005).
Janssen y Mulder (1971), hallaron que el huevo lquido elaborado a partir de
huevos rechazados de incubacin, contena una gran variedad de microorganismos
pertenecientes a la familia Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae,
Micrococcaceae y Pseudomonadaceae (Instituto Estudios del Huevo, 2004;
Amiali, 2005).
2.3.2 LECHE
La leche es un lquido de composicin y estructura compleja con un pH cercano a
la neutralidad. La materia grasa se encuentra en emulsin, las protenas
constituyen una suspensin, mientras que los restantes componentes (lactosa,
30
-
otras sustancias nitrogenadas, minerales, entre otros) estn disueltos (Taverna et
al, 2001).
La leche es un excelente medio de cultivo para muchos microorganismos, cuyo
desarrollo ocasiona una prdida de calidad pudiendo incluso llegar a niveles que
la inutilicen para su consumo transformacin. El objetivo principal de la
pasteurizacin de la leche es la eliminacin de microorganismos patgenos que
sta pudiese contener, un propsito secundario es la destruccin de otros
microorganismos alteradores para salvaguardar la calidad del producto (Buffa,
2003).
El tratamiento de pasteurizacin que se utiliza con mayor frecuencia en la
industria consiste en un calentamiento de la leche a 72C durante 15s, denominada
por sus siglas en ingls HTST (High temperatura short time) (Buffa, 2003).
La leche contiene ms de sesenta enzimas endgenas, algunas de las cuales tienen
importantes aplicaciones tecnolgicas relacionadas con el flavor, la textura y la
estabilidad de los productos lcteos (Buffa, 2003). La mayora de la grasa de la
leche (98%) est constituida por triglicridos. La fraccin nitrogenada de la leche
est compuesta por dos grandes grupos: las protenas y el nitrgeno no proteico.
La lactosa es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa. Los minerales
representan una pequea fraccin de los slidos de la leche. Su concentracin es
de alrededor 0,7% de la materia seca de la leche (Taverna et al, 2001).
La leche contiene una gran cantidad de componentes en muy pequeas
concentraciones (gases disueltos, enzimas, entre otros) muchos de los cuales
tienen relevancia nutricional, en los procesos de transformacin y/o de
degradacin de propiedades qumicas y organolpticas de la leche y productos.
La leche es una fuente importante de vitaminas para el hombre. Las hidrosolubles
(vitaminas del grupo B y C) estn presentes en la fase acuosa. La concentracin es
poco variable ya que provienen de la biosntesis de las bacterias del rumen. En
31
-
cuanto a las liposolubles (A,E y D) estn asociadas a la materia grasa y varan,
entre otros aspectos, segn el tipo de alimentacin (Taverna et al, 2001).
2.3.2.1 MICROORGANISMOS ALTERADORES Y PATGENOS DE LA
LECHE
En el proceso de pasteurizacin de la leche los microorganismos patgenos, los
coliformes y la mayora de los psicrfilos son destruidos, no as un gran grupo de
mesfilos termorresistentes, conocidos todos ellos como termodricos. Los ms
frecuentes en la leche pertenecen a especies del gnero Micrococcus sp, algunos
enterococcos, aerobios formadores de esporas (Bacillus subtilis y Bacillus
cereus) y algunos lactobacilos (Lactobacillus casei, entre otros). Es importante
resaltar que la pasteurizacin no elimina totalmente la microbiota endgena de la
leche y est puede desarrollarse posteriormente (Buffa, 2003).
Bacillus cereus es uno de los microorganismos ms importantes encontrado en la
leche pasteurizada y los productos derivados de la leche (Pirttijrvi et al, 1998).
2.4 Bacillus cereus
Los datos epidemiolgicos muestran como Clostridium botulinum, Clostridium
perfringens, Staphilococcus aureus, Salmonella spp, Bacillus cereus y
Escherichia coli entre otros, se convierten en la causa de la gran mayora de las
infecciones e intoxicaciones que se producen por la ingesta de alimentos.
Las especies de Bacillus se encuentran comnmente deteriorando una amplia
gama de productos, dentro de los cuales se encuentran la leche y sus derivados,
productos crnicos, productos de panadera, purs de vegetales, productos de
pasta, pur de papas, ovoproductos, hiervas y especias (Abdou, 2007).
Bacillus cereus, pertenece a la familia Bacillacea, la cual contiene una diversidad
de bacterias formadoras de esporas, incluyendo desde aerobios estrictos hasta
anaerobios obligados, cocos y bacilos, tanto psicrfilos como termfilos. Es un
microorganismo Gram positivo mvil en los cultivos jvenes y a medida que
32
-
envejece puede verse como Gram variable o Gram negativo. Las esporas pueden
estar dentro de la pared bacteriana o pueden deformar la pared, estas son aerobias,
son altamente resistentes al tratamiento con temperatura. La termoresistencia de
los microorganismos esporoformadores y las propiedades sicotroficas de las
especies de Bacillus son factores determinantes para los procesos de produccin y
para determinan el tiempo de vida til de los alimentos, el cual acortan (Abdou,
2007).
Su temperatura de crecimiento mnima esta entre 15 a 20C y la mxima es entre
40 a 45C con un ptimo de 37C.
Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en suelos de todo
tipo, y puede ser encontrado en el polvo y en el aire, por lo tanto tiene
considerable oportunidad para estar presente en o sobre los alimentos. En la
industria alimentara, la contaminacin producida por Bacillus se genera
principalmente desde el suelo, y los procesos en los que interviene el agua
(Abdou, 2007). Las esporas fcilmente sobreviven la distribucin en polvos y
aerosoles siendo vehiculizadas desde estos lugares a otros hbitats. Los alimentos
secos como condimentos, leche en polvo y harinas pueden estar contaminados con
esporas.
Este microorganismo produce dos enterotoxinas durante su crecimiento
exponencial:
1. Toxina diarreica. El sndrome diarreico por el contrario, est producido por la
ingestin de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulacin
del organismo in vivo y de la produccin de una enterotoxina preformada y
termolbil (Pirttijrvi et al, 1998; Granum et al, 1997).
2. Toxina Emtica. El sndrome emtico est producido por una toxina
preformada y termoestable. Se asocia frecuentemente con arroz frito (Pirttijrvi et
al, 1998; Granum et al, 1997).
33
-
Los sntomas de la toxiinfeccin tienen dos formas de presentacin con presencia
de diarrea, dolores abdominales y vmitos. Su periodo de incubacin vara de 4 a
16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado (Granum et al, 1997).
2.5 MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS
Habitualmente, para el estudio de la resistencia microbiana a distintos agentes
letales se utilizan las denominadas curvas de supervivencia en las que se
representa el logaritmo decimal del nmero de supervivientes frente al tiempo de
tratamiento. Estas grficas se suelen describir mediante distintos modelos
matemticos a partir de los cuales se obtienen diferentes parmetros que permiten
cuantificar y predecir la resistencia bacteriana.
La obtencin de modelos y parmetros cinticos son bsicos para el desarrollo de
nuevos procesos de conservacin de alimentos. Su aplicacin directa en la
industria se aprovecha para optimizar procesos y mejorar la seguridad
microbiolgica de los alimentos, as como para implementar planes de anlisis de
peligros y puntos de control crticos (APPCC).
2.5.1 MODELO DE BIGELOW
Los modelos cinticos clsicos asumen una relacin de primer orden entre la
poblacin microbiana y la intensidad de tratamiento. El modelo desarrollado por
Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo, 1973) (Ecuacin 2.4) se ha usado
principalmente para explicar las curvas de supervivencia debidas al tratamiento
trmico:
Log S = Dt Ecuacin 2.4
donde S es la fraccin de supervivientes calculada como la fraccin entre el
nmero de microorganismos vivos tras un tratamiento especifico y el numero
34
-
inicial de microorganismos; D es el tiempo de reduccin decimal definido como
el tiempo requerido para reducir un ciclo logartmico la concentracin de
microorganismos (s) (Figura 2.13); y t es el tiempo de tratamiento (s). El valor de
D o tiempo de reduccin decimal se calcula a partir de la pendiente de la recta.
Figura 2.13. Curva de supervivencia de esporas de B. stearothermophilus a
temperatura constante (115 C).
En el caso del tratamiento por PEF existe la evidencia de la aparicin de varios
tipos de desviacin del modelo tradicional (Figura 2.14), con la aparicin de
hombros y colas en las curvas de supervivencia. Por lo tanto se debera evaluar la
validez del modelo de Bigelow para interpretar datos cinticos de inactivacin por
PEF.
35
-
Figura 2.14. Ejemplos de curvas de supervivencia no lineales.
2.5.2 MODELO DE WEIBULL
La distribucin de Weibull se ha aplicado en la industria mecnica para inquirir el
tiempo de fallo de un determinado componente. Este modelo consiste en una
distribucin de frecuencias que considera al microorganismo como una poblacin,
donde cada individuo tiene una resistencia al tratamiento, por lo tanto las curvas
de inactivacin representan la distribucin de la resistencia del conjunto de la
poblacin al tratamiento. Bajo esta perspectiva es ms fcil explicar que no exista
una relacin lineal entre el tiempo de tratamiento y la muerte del microorganismo.
Aparte de su sencillez, puede interpretar curvas con hombros y colas, y lneas
rectas. Esta distribucin ha servido para describir curvas de inactivacin por calor
y por PEF (Rodrigo et al., 2003, Sampedro et al., 2006) (Ecuacin 2.5).
( )
=
n
attS exp Ecuacin 2.5
36
-
donde S es la fraccin de supervivientes, t es el tiempo de tratamiento expresado
en s, a es el parmetro de escala expresado en s relacionado con la intensidad del tratamiento y n es el parmetro de forma, cuyo valor depende de la forma de la
curva de supervivencia. Cuando el valor de n1, las
curvas de supervivencia presentan hombros indicando que durante las primeras
condiciones del tratamiento las clulas son resistentes al tratamiento y conforme
aumentamos la intensidad del tratamiento se produce un aumento de la
inactivacin. En el caso que el valor de n=1 la probabilidad que el
microorganismo muera no depende del tiempo de tratamiento, en otras palabras,
cada clula es igual de sensible al tratamiento sin importar lo que dure el mismo.
Otro de los parmetros utilizados en el modelo de Weibull es el tiempo crtico
)(tcw que se puede definir como el tiempo donde se produce la mayor muerte del
microorganismo tras el tratamiento y se puede expresar con la siguiente ecuacin:
)1(* 1+= batcw Ecuacin 2.6 donde a y b son los parmetros de la ecuacin 1.4 y es la funcin gamma.
2.5.3 MODELO DE BARANYI
El modelo de Baranyi fue desarrollado originalmente para curvas de crecimiento
microbiano (Baranyi et al., 1993; Baranyi et al., 1994), sin embargo Xiong et al.,
1999 adaptaron el modelo a las curvas de supervivencia, obteniendo la siguiente
ecuacin:
))1(log(log ))((0
max tBtkBB eqqN
N += Ecuacin 2.7
siendo
37
-
)3
1arctan33
2arctan3)(ln21(
3)( 22
2
++++=
rrt
trtrtrrtB Ecuacin 2.8
Este modelo se adapta bien a curvas de supervivencia sigmoidales, donde qB
puede ser usado como indicador de la existencia de colas en las curvas de
supervivencia. El parmetro k
B
max es el ndice de muerte mximo y puede ser
considerado como una constante en la fase lineal de la curva de supervivencia.
B(t) es una funcin que explica la fase lag (hombro) de la curva y viene definida
por el parmetro r.
Este modelo tambin se adapta a curvas de supervivencia no sigmoidales. En caso
de la no existencia de colas en las curvas (qB=0), la Ecuacin 1.8 se transformara
en:
B
min0
)()log(D
tBtNN = Ecuacin 2.9
donde Dmin=2.303/kmax., siendo Dmin el tiempo de reduccin decimal. Como kmax
se puede considerar como una aproximacin del ndice de muerte para la fase
lineal de la curva, Dmin se define como el tiempo mnimo requerido para disminuir
un ciclo logartmico la poblacin de microorganismos a una temperatura de
referencia. En caso de no presentar la curva fase lag, entonces el modelo se puede
simplificar a un modelo cintico lineal de primer orden:
Dt
NN =)log(
0
Ecuacin 2.10
donde D es el tiempo de reduccin decimal.
38
-
2.6 BONDAD DEL AJUSTE
Los modelos se validan por medio de tres replicas usando el parmetro Accuracy
factor (Af). Este parmetro nos da una idea del ajuste del modelo a la curva de
supervivencia del microorganismo y se define como:
nobservadopredichoLog
Af = )/(10 Ecuacin 2.11 donde n es el nmero de valores observados, los valores predicho y observado
hacen referencia a la fraccin de supervivientes. Los valores de Af cercanos a 1
nos indican un mejor ajuste del modelo a los valores experimentales.
El Mean Square Error (MSE) se calcul utilizando la siguiente ecuacin:
pnobservadopredicho
MSE = 2)( Ecuacin 2.12
donde n es el nmero de valores observados, los valores predicho y observado
hacen referencia a la fraccin de supervivientes y p es el numero de parmetros
estimados por el modelo. Los valores de MSE cercanos a 0 nos indican un mejor
ajuste del modelo a los valores experimentales.
2.7 CLCULO DE LA ENERGA SUMINISTRADA EN EL PROCESO
Es necesario estudiar la energa consumida en cada uno de los tratamientos, para
determinar el efecto directo sobre microorganismos y enzimas en cada uno de los
casos mediante la siguiente ecuacin:
2)/( EmlJQ = t Ecuacin 2.13
donde E es la intensidad de campo elctrico (kV/cm), es la conductividad
elctrica del producto para cada una de las temperaturas de proceso (mS/cm) y t es
el tiempo de tratamiento (s).
39
-
3 FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
Debido al alto contenido de nutrientes en la nueva bebida, el desarrollo de
microorganismos patgenos es alto generando as un problema evidente de
salud pblica. Por esta razn es de suma importancia conocer el nivel de
inactivacin y el control durante el almacenamiento de un microorganismo
patgeno, presente en las dos materias primas con las que se realiza la nueva
bebida, como consecuencia del uso combinado de tecnologas emergentes, como
lo son los PEF y los antimicrobianos naturales para su control.
3.2 PREGUNTAS DE INVESTIGACIN
Evaluacin de la capacidad de los procesos no trmicos solos o combinados con
antimicrobianos naturales, para conseguir la inocuidad alimentaria de una bebida a
base de leche y huevo lquido.
Las preguntas a responder seran:
1) Cunto microorganismo se puede inactivar en las condiciones que permita
el alimento.
2) Cul es la cintica de inactivacin del microorganismo
3) Si existe un efecto sinrgico entre las tecnologas no trmicas y el
antimicrobiano natural
4) Cul sera la vida til de dicho alimento
3.3 JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN
Tradicionalmente los alimentos han sido preservados por calor, estos mtodos son
efectivos en la inactivacin de microorganismos patgenos y alteradores, pero
producen un gran impacto sobre las caractersticas nutricionales y organolpticas
de los alimentos tratados; lo que ha generado una inquietud en la industria
40
-
agroalimentaria que la ha llevado a explorar nuevas tecnologas de conservacin
no trmicas que permitan armonizar inocuidad alimentaria y calidad nutricional
de los alimentos elaborados.
Los Pulsos Elctricos de Alta Intensidad (PEF) solos o combinados con
antimicrobianos naturales, son tecnologas de conservacin no trmicas que
podran aunar ambos requisitos, inocuidad y calidad nutricional.
En el mercado, existen distintos tipos de bebidas que pretenden proporcionar al
consumidor unos niveles de nutrientes adecuados mientras que mantienen la
inocuidad. Las bebidas de este tipo suelen ser combinaciones de leche con zumo,
huevo con zumo, partiendo de productos tratados por calor. En estos casos las
tecnologas no trmicas que se proponen podran jugar un papel importante puesto
que al ser no trmicas daran valor aadido al producto final ya que permitiran
una mayor retencin de los nutrientes que se encuentran en las materias primas
frescas. Un buen candidato para este tipo de estudios seria la mezcla de leche y
huevo, junto con algn tipo de antimicrobiano natural que permita el control de
los microorganismos patgenos que sobrevivan a los tratamientos proporcionados
mediante ambas tecnologas emergentes.
Los resultados del estudio, son de un elevado nivel cientfico-tecnolgico, ya que
adems de proponer una bebida con un elevado valor nutritivo, partiendo de
materias primas de primera necesidad, se obtendrn datos del potencial de estas
tecnologas emergentes para conseguir la esta