Tinción de Golgi

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Biomdica 2006;26:498-508TORRES-FERNNDEZ O.

RESEA HISTRICA

La tcnica de impregnacin argntica de Golgi.Conmemoracin del centenario del premio nobel de Medicina(1906) compartido por Camillo Golgi y Santiago Ramn y Cajal

Orlando Torres-Fernndez

Laboratorio de Microscopa, Instituto Nacional de Salud, Bogot D.C., Colombia.

La tcnica de Golgi es un sencillo procedimiento histolgico que revela la morfologa neuronalcompleta en tres dimensiones. Este mtodo se fundamenta en la formacin de depsitosopacos intracelulares de cromato argntico, producto de la reaccin entre el bicromato depotasio y el nitrato de plata (reaccin negra). Camillo Golgi, su descubridor, y Santiago Ramny Cajal, su principal exponente, recibieron el premio nobel de Medicina y Fisiologa en 1906por su contribucin al conocimiento de la estructura del sistema nervioso. Gran parte de suslogros se obtuvieron a travs de la aplicacin del mtodo de impregnacin argntica. Sin

embargo, Golgi y Cajal tenan interpretaciones diferentes sobre la estructura del tejido nervioso.Golgi era defensor de la teora reticular, la cual propona que el sistema nervioso estabaconformado por una red de clulas fusionadas a travs de los axones a manera de un sincitio.Por el contrario, la doctrina neuronal, defendida por Cajal, sostena que las neuronas eranclulas independientes. Tambin se debe a Golgi y su reazione nerael descubrimiento delorganelo celular conocido como aparato de Golgi. La microscopa electrnica confirm lospostulados de la doctrina neuronal, as como la existencia del complejo de Golgi, y contribuyal resurgimiento de la tcnica de impregnacin argntica. Aunque existen mtodos modernosde tincin intracelular que revelan imgenes excelentes de la morfologa neuronal, la tcnicade Golgi se mantiene vigente por ser un mtodo ms prctico y menos costoso para el estudiode la morfologa normal y patolgica de las neuronas.

Palabras clave: neuroanatoma, neuronas, tcnicas histolgicas, aparato de Golgi, historiade la medicina, premio nobel.

The Golgi silver impregnation method: commemorating the centennial of the Nobel Prize inMedicine (1906) shared by Camillo Golgi and Santiago Ramn y Cajal

The Golgi silver impregnation technique is a simple histological procedure that reveals completethree-dimensional neuron morphology. This method is based in the formation of opaqueintracellular deposits of silver chromate obtained by the reaction between potassium dichromateand silver nitrate (black reaction). Camillo Golgi, its discoverer, and Santiago Ramn y Cajal itsmain exponent, shared the Nobel Prize of Medicine and Physiology in 1906 for their contributionto the knowledge of the nervous system structure, Their successes were largely due to theapplication of the silver impregnation method. However, Golgi and Cajal had different views onthe structure of nervous tissue. According to the Reticular Theory, defended by Golgi, thenervous system was formed by a network of cells connected via axons within a syncytium. Incontrast, Cajal defended the Neuron Doctrine which maintained that the neurons were indepen-dent cells. In addition, Golgi had used a variant of his black reaction to discover the cellular

organelle that became known as the Golgi apparatus. Electron microscopy studies confirmedthe postulates of the Neuron Doctrine as well as the existence of the Golgi complex andcontributed to a resurgence of use of the Golgi stain. Although modern methods of intracellularstaining reveal excellent images of neuron morphology, the Golgi technique is an easier andless expensive method for the study of normal and pathological morphology of neurons.

Key words: neuroanatomy, neurons, histological techniques, Golgi apparatus, history ofmedicine, Nobel Prize.

Biomdica 2006;26:498-508


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Biomdica 2006;26:498-508 LA TCNICA DE GOLGI Y EL PREMIO NOBEL DE MEDICINA 1906

Correspondencia:Orlando Torres-Fernndez, Laboratorio de Microscopa,Instituto Nacional de Salud, Avenida Calle 26 No. 51-60,Bogot D.C., [email protected]

Recibido: 17/08/06; aceptado: 17/10/06

Este artculo tiene como propsito hacer unreconocimiento al mtodo histolgico querevolucion la neurociencia a finales del siglo XIXy que en pleno siglo XXI contina vigente a pesar

de los avances tecnolgicos modernos. Existennumerosas publicaciones sobre los genios de laciencia que lo hicieron famoso (1-9); por eso estaresea, aunque obviamente debe referirse a ellos,se ha enfocado ms en acontecimientosrelacionados con el origen y desarrollo de latcnica misma. El mtodo de impregnacinargntica neuronal, o tcnica de Golgi, se dio aconocer en 1873 y surgi, aparentemente, comoresultado de un hallazgo fortuito del mdico yneurobilogo italiano Camillo Golgi (1843-1926).Posteriormente, los trabajos de otro mdiconeurobilogo, el espaol Santiago Ramn y Cajal

(1852-1934), revelaron la verdadera dimensin deese descubrimiento (1-4). Los dos investigadoresrecibieron el premio nobel de Fisiologa y Medicinaen 1906, en reconocimiento por su trabajo sobrela estructura del sistema nervioso (5), realizado,en gran parte, con la aplicacin de esta tcnica(1-5). Golgi y Cajal (figura 1) haban sidonominados al Nbel en los aos anteriores (6),pero Cajal, con algo de escepticismo, considerabaque la anatoma y la histologa no seran cienciasa tener en cuenta en la definicin de fisiologa omedicina segn los estatutos del premio nobel(7). Hoy se reconoce el aporte significativo de losestudios de Cajal y Golgi al conocimiento generaldel sistema nervioso, y no solamente de laneuroanatoma (8,9). Con su tcnica, Golgi logrpor primera vez la visualizacin de neuronasmarcadas que mostraban su estructura completa(cuerpo celular, dendritas y axn) en unapreparacin histolgica. Despus de sudescubrimiento, Golgi continu con los estudiosdel tejido nervioso utilizando su mtodo (3,4), perofue en manos de Cajal, casi dos dcadasdespus, que la tcnica de Golgi se convirti enla herramienta que cambi el curso de la historia

de la neurociencia. Cajal se sorprendi por tantosaos de indiferencia de la comunidad cientficaante tan importante descubrimiento (9).

Origen y desarrollo inicial de la tcnica deGolgi

La tcnica de impregnacin argntica o reazionenera(reaccin negra), como la llam Golgi (3,4),se fundamenta en la formacin de depsitosopacos intracelulares de cromato argntico,producidos por la reaccin entre el bicromato depotasio y el nitrato de plata. La impregnacin revelala morfologa neuronal completa en tresdimensiones. La imagen que se observa de unaneurona coloreada con el mtodo de Golgiequivale, en menor escala, a la que se obtiene deuna neurona reconstruida a partir de cortes

seriados en microscopa electrnica de transmisin(10). Tambin es similar a la que podra obtenersecon un microscopio electrnico de barrido. Por elcontrario, las tcnicas histolgicas convencionalesapenas permiten la observacin del perfil delcuerpo neuronal y algunos fragmentos dedendritas en un solo plano (figura 2). El estudioultraestructural ha demostrado que laimpregnacin ocurre dentro de la clula, a travsdel citoplasma, con excepcin de algunosorganelos (10).

En la poca en que Golgi descubri su mtodo, el

bicromato de potasio era utilizado como un fijadory endurecedor de cerebros completos. Tambineran ya conocidas las tinciones con nitrato deplata. Gustav Retzius (1842-1919), un reconocidoneuroanatomista sueco, haba desarrollado unatincin de plata para observar la piamadre (lamembrana ms interna de las meningesenceflicas y que Retzius llamaba pa ntima).Retzius escribi en un pie de pgina de suautobiografa el relato que le hizo un asistente deGolgi sobre el hallazgo de la reazione nera. Segneste, Golgi ensay la tincin de plata de Retziusen muestras de cerebros previamente colocadasen bicromato de potasio, con el propsito deestudiar la membrana enceflica, pero al observarel tejido cerebral adyacente descubri lasimgenes de las estructuras que l consider eranlas clulas del sistema nervioso (11,12). Esainterpretacin ha sido considerada una genialidad,


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pues los conocimientos que se tenan sobre laestructura neuronal eran escasos (13).

En los aos siguientes al descubrimiento de sumtodo original de impregnacin, Golgi introdujomodificaciones importantes. Una de ellas fue laadicin de tetrxido de osmio al bicromato depotasio (14), tcnica an conocida como elmtodo de Golgi rpido (10,13,15). Otra fue lautilizacin de cloruro de mercurio en lugar delnitrato de plata para obtener la impregnacin con

mercurio metlico. A esta segunda variante, en1891 Cox agreg el uso de cromato de potasiodespus del tratamiento inicial con bicromato depotasio y cloruro de mercurio. Este procedimientoes conocido como el mtodo de Golgi-Cox(11,13). Con su mtodo, Golgi llev a cabodiversos estudios sobre la estructura histolgicadel sistema nervioso, la mayora de los cualespublic en revistas cientficas italianas de pocacirculacin en otros pases europeos (3,4). Noobstante, por la informacin hallada en diferentesreferencias, es evidente que antes de Cajal latcnica era conocida por varios de los cientficosdestacados de la poca, tales como Klliker (1,2),Retzius (12), Ranvier y Simarro (16), este ltimo,un destacado siquiatra y neurlogo espaol (17).En una visita a Simarro en 1887, Cajal conoci latcnica de Golgi (2,9,16,17), se entusiasm conella y le introdujo modificaciones que mejoraron

Figura 1. Fotografas deCamillo Golgi (izquierda) ySantiago Ramn y Cajal(derecha). The NobelFoundation. Reproducidascon autorizacin de laFundacin Nobel. Cortesade Jonna Petterson, Gerentede Relaciones Pblicas,Fundacin Nobel.

enormemente la calidad de las imgenes de laspreparaciones neurohistolgicas. La principal deellas fue el proceder de doble impregnacin, esdecir, la repeticin de cada una de las etapas deinmersin del tejido en las soluciones utilizadas.Tambin influy que hubiera trabajado con cortesms gruesos para facilitar la observacintridimensional de todos los componentesneuronales. Otro motivo de su xito fue el haberutilizado material embrionario y de animales

jvenes, en lugar de comenzar directamente conlos adultos (generalmente de cerebros humanos),como se acostumbraba en ese tiempo. La menorcantidad de mielina existente en el cerebro deanimales jvenes facilita la impregnacin (1,2,9).

Cajal, Klliker y la doctrina neuronal

El prestigioso anatomista suizo Albert von Klliker(1817-1905) jug un papel determinante en ladivulgacin y aceptacin de los trabajos de Cajal(1,2,9). Klliker haba publicado las primerasdescripciones neurohistolgicas de la cortezacerebral con tcnicas rudimentarias, y dio elnombre de piramidales a las clulas corticalesprincipales (18). Estas neuronas estn entre lasque mejor responden a la tcnica de Golgi (figura2). El inters de Klliker por la neurohistologa lollev a visitar el laboratorio de Golgi en 1887 paraconocer su tcnica, pero luego no tuvo xito al


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intentar reproducirla (1,19,20). Klliker se encontrcon Cajal en un evento cientfico llevado a caboen Berln en 1889 y Cajal, conocedor de la famade su interlocutor, aprovech para mostrarle sus

preparaciones histolgicas elaboradas con elmtodo de Golgi. Klliker se interes en su trabajoy aprendi de l los secretos de la tcnica, lospuso en prctica y confirm los hallazgos delcientfico espaol. Esto llev a Klliker aabandonar su adhesin a la teora reticular acogidapor Golgi y otros cientficos de la poca y a aceptarlos postulados de la teora neuronal, propuestapor Waldeyer en 1891 (quin adems acu lapalabra neurona), y de la cual Cajal se convirtien principal defensor (2,9,19,20). Segn la teorareticular, las neuronas estaran fusionadas unascon otras a travs de sus axones, formando loque Golgi llam una red nerviosa difusa (3,21),es decir que los circuitos neuronales seransincitios en trminos de la biologa actual. Lateora neuronal (ms conocida como la doctrinaneuronal) estableci que las neuronas sonunidades independientes (19,20,22). Esta doctrina

Figura 2. Imgenes de neuronas piramidales de la corteza cerebral de ratn obtenidas mediante dos tcnicas histolgicasdiferentes. A. Neurona piramidal de la capa II que exhibe el soma y su arborizacin dendrtica en diferentes planos deprofundidad. Tcnica de Golgi-Colonnier. 20X. B. Perfil de una neurona piramidal de la capa V. A partir del soma (abajo enel centro), se desprende hacia arriba la dendrita apical. Tincin de hematoxilina y eosina (HE). 40X.

representa el principio organizacional y funcionaldel sistema nervioso en donde la neurona es launidad anatmica, fisiolgica, gentica ymetablica (9,19,20).

Despus de Klliker, casi todos los grandesneurocientf icos europeos aceptaron losdescubrimientos de Cajal y adhirieron a la nuevainterpretacin de la estructura del sistema nervioso(2,9,19,20). Por esa razn, caus sorpresa en elauditorio del Instituto Karolinska el discursopronunciado por Golgi al recibir el Premio Nbel(9,20), con el que defendi la teora reticular yatac la doctrina neuronal, a la que considerabauna propuesta terica ingeniosa sin suficientedemostracin experimental (21). En opinin deJones (20), la conferencia de Golgi haca msreferencia al pasado, trataba de defender unaposicin insostenible acudiendo a trabajosantiguos y se present con una actitud negativa.Por el contrario, la conferencia de Cajal tena elestilo de un seminario moderno en el que elponente resume brevemente sus trabajos


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objeto de controversia durante medio siglo, hastaque se comprob su existencia con el microscopioelectrnico (24,26). No es comn hallar referenciasque hagan honor con toda claridad a la tcnica de

Golgi como origen del descubrimiento de esteimportante organelo intracelular, excepto aquellasde autores italianos (3,4,26). Golgi utiliz sumtodo rpido (fijacin con bicromato de potasioal 3% y tetrxido de osmio al 1% antes deltratamiento con nitrato de plata al 0,75%), peroensay diferentes tiempos para detener la reaccinantes de que las neuronas alcanzaran laimpregnacin total. Tambin ensay laalcalinizacin de la solucin de osmio-bicromatocon fosfato de sodio al 10%. Las dos variantes lepermitan observar el organelo citoplasmticoantes de realizarse la impregnacin completa

(reazione nera) (14). Golgi llev a cabo estasobservaciones en clulas de Purkinje del cerebelode un bho (14) y en neuronas de gangliosespinales de varias especies de mamferosdomsticos (27). En el dibujo de un ganglio de unperro adulto, Golgi describi los diferentes gradosde impregnacin de las neuronas, en los que seobservan clulas sin completar la reaccin negraque exhiben el aparato reticular interno y clulastotalmente impregnadas (negras) (27).

La tcnica de Golgi en la era post-Cajal

Con la muerte de Cajal, y especialmente debido a

la guerra civil espaola, casi desaparece sufamosa escuela neurohistolgica. La mayora desus integrantes fueron perseguidos, desprovistosde sus cargos, encarcelados o emigraron a pasesde Amrica (28). Uno de los ltimos discpulosde Cajal, Rafael Lorente de N (1902 - 1990), seradic en Estados Unidos y continu por algunosaos con los estudios neurohistolgicos utilizandola tcnica de Golgi. El primer diagrama de losmicrocircuitos de la neocorteza fue unacontribucin famosa de Lorente de N basadaexclusivamente en la tcnica de Golgi (29,30).Muchos de los postulados de Lorente de N sobrela sinaptologa neocortical se confirmarondespus mediante la microscopa electrnica (30).Jones (18) le da poca trascendencia a los trabajosrealizados con la tcnica de Golgi entre 1940 y1970. No obstante, reconoce dos contribucionesimportantes durante ese periodo. Una de ellas es

anteriores y, acto seguido, presenta sus hallazgose interpretaciones ms recientes de acuerdo conlos ltimos avances tcnicos (20). En 1906 eratal la aceptacin de la doctrina neuronal que

algunos de los cientficos postulantes del premionobel de Medicina haban propuesto comocandidato slo a Cajal, por considerar que suaporte haba sido ms importante y por lainterpretacin equivocada de Golgi sobre laestructura del sistema nervioso (6).

Pese a lo anterior, e incluso despus de recibir elpremio Nbel, Cajal tuvo que continuar defendiendola doctrina neuronal frente a nuevos ataques porparte de los reticularistas. Para ello, l y variosde sus connotados discpulos desarrollaronnuevas tcnicas y conceptos sobre la estructura

del sistema nervioso. Los detalles y lasconclusiones sobre la experiencia acumulada consus trabajos en defensa de la doctrina neuronalfueron publicados por Cajal en una monografa en1933, pocos meses antes de su muerte (23). Dosdcadas despus, la microscopa electrnicaaport la prueba final inobjetable sobre ladiscontinuidad de las clulas del sistema nervioso(24). Aun as, algunos investigadores consideranque las ideas de Golgi sobre la teora reticularmerecen, por lo menos, ser reexaminadas (8,25).

Descubrimiento del aparato de Golgi

Si la microscopa electrnica le dio la razn aCajal y reafirm los postulados de la doctrinaneuronal, tambin contribuy a hacer justicia conuno de los grandes descubrimientos de Golgi, eldel organelo intracelular hoy conocido comoaparato de Golgi (24,26), y que l denominaparato reticular interno cuando dio a conocersu hallazgo en 1898. En dos artculosoriginalmente escritos en italiano y traducidos alingls hace apenas algunos aos (14,27), Golgidescribi detalles sobre su descubrimiento,producto de la aplicacin de su tcnica deimpregnacin neuronal. No obstante, en esa pocamuchos dudaban de si el aparato reticular internoera una estructura genuina o un artefacto producidopor los depsitos de impregnacin metlica en elcitoplasma neuronal. Aunque muy pronto seobserv el aparato de Golgi en otras clulasanimales y vegetales, su verdadera naturaleza fue


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el mtodo de Sholl para la cuantificacin de laarborizacin dendrtica, que se mantiene vigentedesde 1956 (18), y otra es la modificacin a latcnica llevada a cabo por Colonnier en 1964 (31),

quien introdujo el uso del glutaraldehdo medianteperfusin para la fijacin inicial y la adicin deglutaraldehdo a la solucin de induracin(bicromato de potasio). sta se considera unamodificacin del mtodo de Golgi-Kopsch (10).En 1896, Kopsch fue el primero en utilizar unamezcla de bicromato de potasio con formaldehdo.Esta combinacin se recomienda hoy para laimpregnacin de muestras almacenadas enformalina por largo tiempo, tal como ocurre conlos especmenes de coleccin de cerebroshumanos (13,32). Las tcnicas de Golgi-Kopschy Golgi-Colonnier han sido preferidas por muchos

investigadores debido a que facilitan el trabajo conmaterial preservado en aldehdos y mejora lacalidad de la morfologa celular, especialmentepara su estudio con microscopa electrnica(10,13,18).

Tambin es justo reconocer los aportes de otrosinvestigadores en la dcada de los aos 60; granparte de estos fueron consignados en lasmemorias de una reunin internacional realizadaen Puerto Rico en 1969 (11,15,33,34). All,Scheibel y Scheibel (15) consideraban que la cadaabrupta del nmero de publicaciones y practi-

cantes de la tcnica de Golgi durante tanto tiempofue una consecuencia directa del poder de latcnica misma. Segn estos autores, durante elprimer cuarto del siglo XX, la tcnica de Golgigener la acumulacin de una gran cantidad deinformacin sobre la estructura del sistemanervioso y los circuitos neuronales, pero no secontaba con los medios adecuados para explorartodas sus implicaciones funcionales. El mtodode Golgi impuls el desarroll de un mapa detalladodel sistema de vas antes de inventarse elautomvil para utilizarlas (15). Para la dcada delos aos 70 ya se contaba con mejores recursosen el campo de la neurociencia. La microscopaelectrnica, as como los avances enneurofisiologa, neuropatologa y en los estudiosdel comportamiento, haban dado lugar a nuevosenfoques tericos. La tcnica de Golgi recupersu importancia. En algunos casos fue necesario

redescubrir hallazgos como los de Cajal. Peroesta vez, adems de contar con mejorescondiciones de trabajo, los estudios se hacan demanera ms sistemtica que en el pasado y se

pas de la etapa descriptiva a la experimental(15,18). Este resurgimiento de la tcnica de Golgise puede comprobar al consultar el compendioCerebral Cortexvol 1, editado en 1984 por Petersy Jones (18), un clsico de lectura obligada paraneurohistlogos. En l se encuentran captulosextensos escritos por especialistas en cada unode los principales tipos neuronales de la cortezacerebral; gran parte de la informacin all registradase obtuvo con estudios realizados mediante latcnica de Golgi.

La tcnica de Golgi y los avances enmicroscopa

El perfeccionamiento de las tcnicas histolgicasha estado asociado con los avances en la micros-copa. Desde su aparicin, la tcnica de Golgi ha

jugado un papel importante debido a la necesidadde desarrollar microscopios que mostraran confidelidad la calidad de las imgenes tridimensionalesde las neuronas impregnadas y sus ramificacionesms finas (1,35). Las caractersticas del tejidonervioso y la necesidad de aprovechar mejor estatcnica neurohistolgica tambin contribuyeron alsurgimiento de la microscopa confocal (36,37).El primer microscopio confocal fue patentado por

Marvin Minsky (el padre de la llamada inteligenciaartificial) en 1957. Pero fue slo hasta 1988 quepublic una memoria de su invento en una revistacientfica (36), recin aparecidos los primerosmicroscopios confocales comerciales desarro-llados por otros autores. Minsky comenta que lainvencin de su microscopio confocal fuemotivada, principalmente, por su inters enmejorar la observacin de las preparaciones detejido nervioso realizadas con la tcnica de Golgi,para tratar de comprender la estructura cerebralcomo parte de sus estudios sobre redesneuronales artificiales (36). Si bien se han llevadoa cabo algunos trabajos en los que se ha aplicadola microscopa confocal al estudio de las neuronasimpregnadas por la tcnica de Golgi para sureconstruccin tridimensional (37-41), estatecnologa ha sido poco explotada an para estepropsito.


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Distinto ha sido lo ocurrido con la microscopaelectrnica, la cual contribuy a revivir el interspor la tcnica de Golgi. Su alto poder de resolucindemostr la validez de la teora neuronal y

confirm la existencia real de estructuras talescomo las espinas dendrticas y los contactossinpticos, previamente descritos con laimpregnacin argntica (42). Al poder visualizarla forma, el tamao y la estructura interna de loselementos pre y postsinpticos, se hizo posibleidentificar las dos neuronas participantes en unasinapsis en particular. Pero la microscopaelectrnica por s misma no permite reconocer,en forma inequvoca, que una dendrita o axnpertenecen a un determinado tipo de neurona. Porlo tanto, fue necesario combinarla con un mtodoque describiera la morfologa neuronal completa:

la tcnica de Golgi (4,10,42). Lograr estandarizarun buen procedimiento para combinar el mtodode Golgi con la microscopa electrnica no fuetarea fcil. Los depsitos gruesos de cromatoargntico que se depositan dentro de las neuronasinterfieren con la observacin ultraestructural.Durante las dcadas del 60 y del 70 se trabajpara obtener un mtodo que permitiera unaadecuada correlacin entre la morfologa neuronaly su estructura fina. Era necesario hallar unprotocolo para desimpregnar (extraer los depsitosde cromato de plata) las clulas sin perder sumarcacin y que preservara intacta laultraestructura de todos los componentesneuronales y sus conexiones sinpticas.

Stell (43,44) y Blackstad (45) fueron los primerosen combinar el mtodo de Golgi con lamicroscopa electrnica. Posteriormente,Blackstad realiz algunos avances importantes(34,46), pero la innovacin ms notable la alcanz,en 1977, un grupo encabezado por el investigadorespaol Alfonso Fairn en la Universidad deBoston, en el laboratorio de Alan Peters, uncientfico experto en el estudio ultraestructural delsistema nervioso (24). Fairn y colaboradoresestandarizaron un mtodo combinado de Golgi ymicroscopa electrnica (Golgi-ME) basado en elvirado al oro (gold-toned) de las preparacionesantes de la desimpregnacin (10,47,48). Con estemtodo, y algunas modificaciones posterioresrealizadas por el mismo autor (10,49-51), se logr

eliminar los depsitos de cromato de plata yreemplazarlos por un precipitado de partculas deoro, muy finas, que proporciona una excelentepreservacin de los detalles ultraestructurales y

de la marcacin intracelular. De esta manera,incluso las prolongaciones celulares impregnadasms finas se pudieron reconocer secuencialmenteen microscopa ptica y electrnica. En resumen,el mtodo de Golgi-ME permiti demostrar laconexin directa entre dos neuronas, previamenteidentificadas con microscopa ptica, y sirvi degua para la identificacin de tipos neuronales anivel ultraestructural. Esto produjo un gran impactoen el estudio de los circuitos sinpticos (10,42,48).El profesor Fairn public recientemente un relatodetallado sobre los sucesos relacionados con losorgenes y desarrollo posterior de los mtodos de

Golgi-ME (48). La combinacin Golgi-ME tambinabri el camino a la aplicacin de tcnicashistoqumicas e inmunocitoqumicas paracorrelacionar la morfologa y la ultraestructuraneuronales con propiedades bioqumicas de lasclulas nerviosas. Para ello fue necesario adaptarla tcnica de Golgi a cortes de tejido (42,52-55),pues el procedimiento normal de impregnacin sehace sobre bloques o rodajas de cerebro de variosmilmetros de espesor, que despus se cortan yse montan para su observacin (10,13). El mtodode Golgi en cortes, seguido de virado al oro, sepuede combinar, adems, con otros mtodos,

tales como el trazado retrgrado de vas ytcnicas electrofisiolgicas (10,42,52,54,56,57).

Vigencia de la tcnica de Golgi

Despus de 133 aos del descubrimiento de latcnica de Golgi, y a pesar del avance tecnolgicode la neurociencia, este mtodo contina siendoel procedimiento de mayor utilidad prctica pararevelar la morfologa neuronal completa (4,58-60).Por otra parte, el mtodo de Golgi, por ser sencilloy de bajo costo, est al alcance de laboratoriosmodestos (como aquellos en los que Golgi y Cajallo practicaron) (1,3). Fairn lo resume as: latcnica de Golgi es sencilla en su ejecucin ygenerosa en la informacin que proporciona (10).Los mtodos ms modernos de marcacinneuronal, que emplean la inyeccin intracelularde diferentes tipos de colorantes, revelan conmayor detalle la complejidad morfolgica neuronal,


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especialmente de los axones, pero por ser mssofisticados y dispendiosos slo pueden utilizarsecon un reducido nmero de neuronas (24,59).Adems, precisan de laboratorios mejor equipados

y profesionales bien entrenados para ejecutarlos.Peters et al. (24) hacen la siguiente reflexin sobreel mtodo de marcacin intracelular: Losresultados son espectacularessin embargo, elmtodo es tcnicamente complicado y requierede la cooperacin entre fisilogos y anatomistas,un matrimonio difcil de consolidar.

El Profesor Maxwell Cowan, investigador de grantrayectoria en el uso de tcnicas de trazado devas neuronales, escribi el prlogo del texto atlassobre el cerebro de ratn basado en la tcnica deGolgi (59), cuyo autor es Facundo Valverde, del

Instituto Cajal (quizs el ms importanteneurobilogo experto en la tcnica de Golgi delas ltimas cuatro dcadas). Cowan destaca allla vigencia e importancia del mtodo de Golgi:Lo que conocemos hoy sobre la morfologaneuronal se debe, en gran parte, al materialestudiado por este mtodolos mtodos demarcacin intracelular, en las mejores manos,revelan una mayor complejidad de lasarborizaciones axonal y dendrtica. Sin embargo,aunque con ellos se pueden obtener mejoresimgenes de la estructura de neuronasindividuales, no ofrecen las imgenes panormicas

esplndidas que una buena preparacin de Golgipuede proveer. Por lo tanto, el mtodo de Golgies ms adecuado cuando el objetivo es estudiarla arquitectura neuronal completa de cualquierregin del cerebro (59). Lpez-Garca es aun msenftico en su defensa: el mtodo de Golgi estvigente en la investigacin neuromorfolgicaesinservible para algunos tipos de estudios einsustituible para la mayora (58). Pero la pruebams importante de su vigencia la constituye elnmero de publicaciones cientficas realizadasdurante los ltimos aos. En una rpida revisinde los resmenes registrados en PubMed,correspondiente slo a los ltimos cinco aos(2001-2006), se encontraron ms de un centenarde referencias sobre trabajos de investigacin quehan utilizado el mtodo de Golgi. Gran parte deellos se ha llevado a cabo con la tcnica de Golgi-Cox modificada por Gibb y Kolb (61). Estos

investigadores lograron estandarizar un protocoloque ofrece tres ventajas: impregna cerebroscompletos de pequeos animales, produceresultados menos azarosos y garantiza imgenes

excelentes de las dendritas y sus espinas. Esimportante destacar que muchos de los recientestrabajos realizados con el mtodo de Golgicorresponden a estudios sobre neuropatologahumana o experimental (62-67). Finalmente, unaprueba ms de la vigencia de este mtodo deimpregnacin neuronal es el hecho de que todava,y por extrao que parezca, se publicanmodificaciones a la tcnica de Golgi (68-71).

Agradecimientos

El autor recibi entrenamiento sobre la tcnica deGolgi-ME en el Instituto de Neurociencias de la

Universidad Miguel Hernndez (Alicante, Espaa).Conflicto de intereses

Ninguno.

Financiacin

Instituto Nacional de Salud y Colciencias,proyecto 2104-04-11805, y una beca de doctorado.

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