INTRODUCCIÓN

En el presente laboratorio abordaremos dos temas fundamentales para el curso de

Microbiología: MICROSCOPIO COMPUESTO Y TINCION GRAM o

COLORACIÓN DE BACTERIAS.

El uso adecuado de un microscopio es una de las destrezas más importantes que debe

aprender un estudiante microbiología. Los microscopios se desarrollaron a finales del siglo

XVII y hoy en día, continúan siendo importantes para la identificación de hongos y algunos

otros microorganismos. Es por eso que los estudiantes debemos aprender como utilizarlos y

cuidarlos adecuadamente.Y en cuanto al tema de Tinción de Bacterias, definiremos el uso

de colorantes, del método Gram, y utilizando las muestras hechas en la semana anterior con

los medios de cultivo, hallaremos los tipos de Bacteria y que Bacterias son específicamente.

OBJETIVOS

MICROSCOPIO COMPUESTO

Manejar correctamente el microscopio conociendo la función de cada parte del

microscopio.

Conocer, mediante la observación de las muestras, cual es el objetivo apropiado

para observarlas (1Ox; 43x; 97x).

Enseñar el cuidado y mantenimiento apropiado de los microscopios. Aprender los pasos de un adecuado manejo del enfoque y observación de muestras

con el microscopio.

TINCIÓN DE LAS BACTERIAS (Método Gram)

Mediante este método podemos teñir las bacterias, para su mejor descripción

Determinación de bacterias Gram (+) ó Gram (-)

El método de tinción de bacterias sirve para diferenciar entre distintas

formas de microorganismos.

Podemos usar amplificaciones mayores.

FUNDAMENTO TEORICO

MICROSCOPIO COMPUESTO

Un microscopio compuesto tiene más de un lente objetivo. Los microscopios compuestos

se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan

finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y

organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por

tres sistemas:

* El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y

detener los instrumentos a observar.

* El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal

manera que producen las ranuras de luz.

* El sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de

los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

Sabemos que existen dos tipos de microscópicos: Simple y Compuesto.

MICROSCOPIO SIMPLE

Consiste en una lente o cristal de aumento montado en una armazón graduable provisto de

un soporte para la conveniente colocación del objeto y de un espejo que refleja la luz.

MICROSCOPIO COMPUESTO

Se diferencia del simple por que consta de dos juegos de lentes, uno conocido como

objetivo, y el otro por ocular; montado en un tubo (como observaremos a continuación en la

figura siguiente). Podemos conseguir un enfoque preciso con la ayuda de un tornillo

micrométrico. Los microscopios compuestos dan un aumento mayor que los simples; y son

necesarios para ver y examinar objetos tan minúsculos como las bacterias.

Un microscopio compuesto se divide en dos partes: Mecánica y óptica. A continuación

veremos cada una de las partes.

PARTE MECÁNICA

Principales componentes de los microscopios, descripción general y usos

Componente Descripción

BaseParte de metal o plástico sobre la cual descansa el resto de las partes del microscopio.

BrazoColumna en forma de “C” que se proyecta de la base y que sostiene a la platina y a los componentes ópticos.

PlatinaPlataforma plana unida a la parte inferior del brazo sobre la cual se colocan los portaobjetos o muestras a observar.

Cierre del Diafragma o Condensador

Manija debajo de la abertura de la platina que consiste de un grupo de piezas de metal a manera de obturador que regula la cantidad de luz que atraviesa al portaobjetos colocado en la platina.

CondensadorNo está presente en todos los microscopios – colecta los rayos de luz del iluminador y los enfoca – incrementa la resolución, aumenta el contraste de la muestra.

Botón de ajuste del condensador knob

Sube y baja el condensador.

CabezalParte cilíndrica/vertical unida en la parte superior del brazo que sostiene el sistema óptico.

RevólverPlato giratorio que sostiene los objetivos (lentes), unido a la parte inferior del cabezal, puede dársele la vuelta para cambiar los lentes (objetivos).

Principales componentes de los microscopios, descripción general y usos

Componente Descripción

Ajuste del macrométrico

Botón grande que mueve el cabezal hacia arriba y abajo para observar la muestra en el enfoque macrométrico.

Ajuste del micrométrico

Botón pequeño que mueve el cabezal a distancias más cortas, de manera más lenta y es usado para observar a la muestra con un enfoque más nítido.

Iluminador, Fuente lumínica

Controla la cantidad de luz que se transfiere a la muestra.

OcularesTubo de metal corto, removible que contiene lentes ubicados en la parte superior del tubo, generalmente de 10X, 43X, 97X de aumento.

Ajuste de DioptríaAjuste usado para compensar la diferencia de observación de los ojos.

Objetivos (lentes)Tubos de metales pequeños, atornillados dentro del revólver que incrementa el aumento de la muestra (a menudo se refieren sólo como objetivos).

Espejo Usado para reflejar la luz a través de la muestra.

Eje giratorio del espejo

Usado para ajustar el espejo para que refleje la luz a través de la muestra.

Lentes auxiliaresTambién se les refiere como lentes suplementarios, pueden ser encontrados en microscopios de disección en la base de la cubierta de los objetivos o cabezal.

TINCIÓN DE BACTERIAS

DEFINICIÓN DE COLORANTES O TINTES

Un tinte se define como una sustancia o compuesto orgánico que tienen los grupos

cromóforo y auxocromo ligados al núcleo bencénico.

Existen varios métodos de tinción pero estos están agrupados en tres tipos de tinción

específicos, los cuales pasaremos a mencionar.

Los tipos de tinción son:

A. Tinción simple: 1. Colorantes básicos

2. Colorantes ácidos

3. Colorantes indiferentes

B. Tinción compuesta: 1. Tinción de Gram

2. Tinción de ácidos resistentes

C. Tinción de estructuras: 1. Feulgen (para material nuclear)

2. Tinción de endósporas

3. Tinción de pared celular

4. Tinción de flágelos

5. Tinción de cápsulas

El método que usaremos para estudiar para la descripción de bacterias es el método de

Tinción de Gram.

TINCIÓN DE GRAM

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en

microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su

nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza

tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una

primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram

positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las

que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales de vidrio:

- Portaobjetos

- Tubo de ensayo

Medios de cultivo:

- Agar nutritivo

- Caldo nutritivo

Colorantes:

- Cristal violeta (azul o morado)

- Lugol

- Safranina (rojo)

- Alcohol – Acetona

Equipo:

- Mechero

- Inoculador

- Microscopio

PROCEDIMIENTO

1. Secamos el portaobjetos pasando por el fuego

2. Preparamos el frotis de Agar nutritivo y Caldo nutritivo.

3. Dejamos secar al ambiente.

4. Fijamos al calor ( 3 veces)

5. Teñimos con cristal violeta por 20 segundos.

6. Lavamos con agua por 2 segundos.

7. Cubrimos el frotis con lugol durante 1 minuto.

8. Decoloramos con agua por 2 segundos.

9. Contracolorear con safranina y dejar que se tiña por 20 segundos.

10. Lavamos con agua y lo secamos con papel filtro.

11. Examinamos en el Microscopio con objetivo de 97X luego de secarse.

MICROSCOPIO COMPUESTO

CONCLUSIONES

- Pudimos determinar el

tipo de Bacteria presente en las muestras que preparamos.

- Los resultados que se obtuvimos en su mayoria de la coloración Gram fueron

Streptococos.

- Conluimos que es necesario seguir el procedimiento con el debido cuidado pues al

inicio no logramos los resultados esperados.

RECOMENDACIONES

- Es necesario realizar correcta y minuciosamente los procedimientos del frotis y la

fijación para obtener los resultados correctos.

- Es recomendable tener en cuenta saber el manejo del microscopio correctamente

para no dañar el microscopio.

- Se recomienda seguir el procedimiento minuciosamente, pues si no se corre el

riesgo de no obtener ningún resultado.

CUESTIONARIO

1. Establecer la diferencia entre poder de resolución y abertura numérica.

- Resulta evidente que el poder de resolución de un Microscopio óptico está

restringido por los valores limitados de la abertura numérica y la longitud de onda

de la luz visible.

2. Completar:

-

3. Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son transmitidas por el

aire, agua y alimento.

-

4. Responder

Partes del Microscopio Funcion(es)Ocular lFunción del ocular es presentar al ojo dicha imagen de la

forma más legible posible, agrandándola lo que sea necesario

Objetivo Función principal de un cualquier objetivo es obtener una imagen del objeto observado lo más nítida y luminosa posible

Condensador Es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación

Diafragma de Iris Es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados

Tornillo Macrometrico Sirve para alejar o acercar el tubo y la platina. Se obtiene la imagen de la muestra (enfoque o ajuste grueso).

Tornillo Micrometrico Sirve para dar claridad a la imagen. Se logra el ajuste fino

ENFERMEDAD SÍNTOMAS PRINCIPALES

ALIMENTOS TÍPICOS

MODO DE TRANSMISIÓN

Salmonelosis Diarrea, dolor

abdominal, dolor de

cabeza, fiebre y

náuseas

Huevos, carnes y

productos lácteos sin

pasteurizar.

Comienzan entre las 8 y 48 horas

después de comer el alimento

contaminado y dura entre 1 y 8 días.

Escherichia coli Dolor de cabeza,

diarrea y dolor

abdominal severo.

Leche sin pasteurizar,

vegetales crecidos con

estiércol, etc.

Comienzan entre 3 y 9 días después de

ingerir el alimento contaminado, dura

de 2 a 9 días si no hay complicaciones.

Listeria

monocytogenes

Leche sin pasteurizar y

quesos blandos, carnes

de ave, paté de carne,

ensaladas, etc.

Fiebre repentina,

escalofríos, dolor de

espalda, dolor

abdominal y diarrea.

Comienza dentro de las 24 horas

después de comer el alimento

contaminado. Dura entre 2 y 7 días.

a) ¿Existen diferencias químicas entre las paredes celulares de las Bacterias gram

positivas y gram negativas?

- Las bacterias gram negativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las

bacterias gram positivas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas son

también más delgadas que las de las gram positivas; las paredes de las bacterias

gram negativas tienen una cantidad mucho menor de peptido-glucano con ligaduras

cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias gram positivas.

b) Afecta la edad del cultivo a la reacción de Tinción de Gram.

- La edad del cultivo afecta a la reacción de tinción Gram pues cultivos viejos de

algunas bacterias gram positivas pierden la facultad de retener el cristal violeta y se

tiñen con la safranina.

5. Hacer una lista de Bacterias Gram positivas y Gram negativas con las enfermedades

que provocan.

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Bacillus subtilis Achromobacter

Clostridium tetani Brucella ovis

Corynebacterium diphtheriae Klebsiella pneumoniae

Lactobacillus acidophilus Escherichia coli

Streptococcus pyogenes Salmonella typhi

-

BIBLIOGRAFÍA

1. Wesley A. Volk Microbiología Basica

Ed. Harlon – Año 1996

México (sexta edición)

2. A. J. Salle Bacteriología

Ed. Gustavo Gili – Año 1960

Barcelona (cuarta edición)

3. Harry Seeley Microbiología en Acción

Ed. Blume – Año 1973

ANEXOS

Estafilococos

Muestra Nº 01

Muestra Nº 02