Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativoLos fundamentos de la técnica se basan en las diferencias   entre   las paredescelulares   de   las   bacterias   Gram   positivas y   Gram  negativasLa   pared   celular   de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la carainterna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra elácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está ancladosolamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)Por el   contrario,   la capa  de  peptidoglucano  de   las  Gram negativas   es delgada,y   se   encuentra   unida   a   una segunda membrana   plasmática   exterior   (decomposición   distinta   a   la   interna)   por medio   de   lipoproteínas.   Tiene   una capadelgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. Lamembrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estasdiferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que esel material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.La diferencia  que se observa en  la   resistencia  a   la  decoloración,  se  debe a  quela  membrana externa  de  las  Gram negativas   es soluble   en   solventes   orgánicos,como   por   ejemplo   la   mezcla   de   alcohol/acetona.   La   capa de peptidoglicano queposee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristalvioleta/yodo que se formó previamente,  y por lo  tanto este complejo se escapa,perdiéndose  la  coloración azul-violácea.  Pero por el contrario, las Grampositivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporciónde peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sinoque este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que puedaescaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

Descripción de la tinción de GRAM:  Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia   se   debe   probablemente   al   hecho   de   que   en   el   caso   de   bacterias   gram-negativas,   la   mezcla   de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas   son   todavía   azules,   pero   las   gramnegativas   son   incoloras.   Para   poner   de  manifiesto   las   células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o  la  fucsina básica.  Después de  la  coloración de contraste  las  células gramnegativas son rojas,  mientras que  las grampositivas permanecen azules.

Deben  destacarse  algunos  aspectos   cruciales  de   la  tinción  de  Gram:  1)   El   tratamiento   con   cristal   violeta  debe preceder   al   tratamiento   con   yodo.   El   yodo   por   sí   solo   tiene   poca   afinidad   con   las   células.   2)   EI   proceso   de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. 3) Cultivos de más de 24 horas de teñidos pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. 2.4. 

Tinción diferencial: Método ácido resistente (ZIEHL-NEELSEN) Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen  ácidos  grasos   (ácidos  micólicos)  de   cadena   larga   (50  a  90  átomos  de   carbono)  que   les   confieren   la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. El frotis se tiñe durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave. 

Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar.

FUNDAMENTO La   propiedad   que   presentan   algunas   bacterias   de   resistir   la   decoloración   con   ácidos   fuertes   después   de   ser coloreadas   con   solución   de   fucsina   caliente,   permite   reunirlas   bajo   la   denominación   general   de   bacterias “ácidoresistentes” o “ácido-alcohol resistentes”. La ácido-alcohol resistencia es la capacidad de incorporar ciertos colorantes y retenerlos después de someterlos a la acción de ácidos y alcohol y está determinada por la presencia en la pared celular de los ácidos micólicos que son ácidos grasos de cadenas ramificadas de alto peso molecular (60 a 70 átomos de carbono). Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes, cortos, ligeramente curvos. El género Mycobacterium, incluido en esta clasificación, comprende especies patógenas para el hombre, animales y especies saprófitas. El grado de “ácido-alcohol resistencia” es variable entre las especies de este género y está relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo utilizarse esta diferencia para distinguirlos entre sí. Los bacilos “ácido-alcohol resistentes” (BAAR) se observan de color rojo al ser coloreados con los colorantes para Ziehl Neelsen, mientras que otros gérmenes y células toman distintos tonos de azul debido al azul de metileno que se utiliza como colorante de contraste. La coloración de Ziehl Neelsen consituye una técnica sencilla rápida y económica, de baja sensibilidad pero es una valiosa herramienta para detectar los casos de tuberculosis pulmonar.