TINCIONES EN MICROBIOLOGIA.

1. TINCIÓN DE GRAM

La interpretación incluye la consideración de las características de la tinción, el tamaño, la forma

y la distribución de las bacterias.

En la realización de la tinción de Gram se utilizan los siguientes reactivos: violeta cristal, iodo de

gram, acetona y safranina.

Procedimiento:

Preparación de la placa.

a. A partir de las colonias en agar

1. En una placa limpia colocar una pequeña gota de solución salina estéril

2. Mezcle una colonia de la bacteria con la solución salina.

3. Deje secar al aire

b. A partir de un medio líquido o caldo

1. Utilizando un asa bacteriológica estéril tome una gota del caldo que presenta

crecimiento bacteriano. Extienda una capa de delgada sobre una placa limpia.

2. Deje secar al aire.

c. A partir de una muestra directa

1. Coloque una capa delgada de la muestra directamente sobre una placa limpia.

2. Deje secar al aire

Tinción:

1. Cubra la placa fijada con violeta cristal (en contacto con las bacterias cargadas

negativamente reacciona coloreándolas) durante un minuto.

2. Lave con agua

3. Cubra la placa con iodo gram (solución mordiente: fija las tinciones y aumenta la afinidad

entre el colorante y las bacterias) por un minuto.

4. Lave con agua.

5. Sosteniendo la placa en un ángulo, enjuague por pocos segundos la placa con alcohol

acetona (agente decolorante: elimina el colorante no fijado).

6. Cubra la placa con safranina (colorante de contraste) y deje pasar un minuto.

7. Enjuague con agua.

8. Deje secar la placa.

Lectura de resultados

1. Utilizando el objetivo de 10x evalué la placa. Una placa bien teñida tiene el fondo rosado.

2. Observe el número de células por campo (polimorfonucleares, mononucleares, células epiteliales)

si es una muestra directa.

3. Examine varios campos buscando la presencia de microorganismos.

4. Si no observa microorganismos, anote “No se observó microorganismos”.

5. Si observa microorganismos anote el tipo de morfología (bacilos, cocos, cocobacilos, levaduras) y

su resultado de gram (positivos, negativos), lo mismo que su distribución (en cadenas, pares,

aislados o en grupos). Anote la cantidad de bacterias que observa: ocasionales, escasas, regular

cantidad o abundantes.

2. TINCIÓN ZIELH-NEELSEN (BAAR)

Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identificación de

microorganismos patógenos, como M. tuberculosis o el género Apicomplexa (coccidios intestinales)

entre otros.

Fundamento:

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena

larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con

alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol

resistente. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por

sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere

calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender

el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo

que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la

energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las

bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se

utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

Procedimiento:

1. Prepare un frotis con el material clínico y dejar secar al aire libre.

2. Cubra toda la superficie de la placa con carbolfucsina

3. Flamee la placa con el mechero hasta que el colorante emita vapor. Evite la ebullición. Tiña

por 5 minutos. Adicione más colorante si es necesario para evitar que éste se seque.

4. Decante el colorante de las placas y lave con agua de la pluma y luego decolore con alcohol

ácido, hasta que la solución fluya incolora en la placa.

5. Lave con agua

6. Teñir con azul de metileno por 1 min. Lave con agua.

7. Escurrir y dejar secar. Observar con el objetivo de inmersión.

Interpretación de resultados:

Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que

se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

3. PRUEBA DE HECES POR AZUL DE METILENO.

Propósito:

Es la búsqueda de leucocitos polimorfonucleares y mononucleares en una muestra líquida coloreada

con azul metileno lo que permite identificar si se trata de un proceso viral o bacteriano.

Procedimiento:

1. Prepare un frotis con el material clínico y dejar secar al aire libre.

2. Cubra toda la superficie de la placa con carbolfucsina

3. Tiña por 5 minutos. Adicione más colorante si es necesario para evitar que éste se seque.

4. Decante el colorante de las placas y lave con agua de la pluma y luego decolore con alcohol

ácido, hasta que la solución fluya incolora en la placa.

5. Lave con agua

6. Teñir con azul de metileno por 1 min. Lave con agua.

7. Escurrir y dejar secar. Observar con el objetivo de inmersión.

Forma de reporte:

Reportar el porcentaje de leucocitos encontrados con el predominio del que tenga mayor porcentaje.

Polimorfonucleares……………%

Mononucleares…………………%

Interpretación:

Predominio de polimorfonucleares se asume que existe un proceso infeccioso de origen bacteriano.

Predominio de Mononucleares se asume que el proceso infeccioso es de origen viral.

4. HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) al 40%

Principio

El KOH disuelve la queratina y aclara la preparación sin afectar la morfología de los elementos

fúngicos, permitiendo una mejor visualización de los mismos.

Descripción de la técnica

Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos limpio, ubicar la muestra en el KOH y

cubrir con cubreobjetos. Dejar digerir 10 min. El efecto aclarante se acelera calentando la

preparación suavemente a la llama hasta el desprendimiento de las primeras burbujas.

Resultado

Los dermatofitos se observan como hifas hialinas, tabicadas y ramificadas de 4 a 6 μm de diámetro.

Las levaduras se visualizan como elementos esféricos u ovalados (blastosporos) que pueden

presentar brote y/o seudohifas. Los hongos miceliales se ven como hifas hialinas o pigmentadas,

tabicadas o no, de diámetro irregular según el hongo al que corresponde.

5. COLORACIÓN DE GIEMSA

Principio

Esta coloración es útil para búsqueda de levaduras intracelulares, como la fase tisular del

Histoplasma capsulatum (Hc) y Penicillium marneffei (Pm); observar los cuerpos intraquísticos (CI)

(ascosporos) de Pneumocystis jirovecii (Pj), describir la citología de las muestras clínicas y para

descartar infecciones virales producidas por Herpes, Citomegalovirus (CMV) y Molluscum

contagiosum.

Descripción de la técnica

Fijar la muestra con metanol por 1 min., luego inundar el extendido con la dilución de Giemsa por 20

min. Lavar el preparado con abundante agua y dejar secar al aire.

Resultado

Permite observar levaduras pequeñas y ovales en el interior de los macrófagos.

En el caso de Hc las levaduras se tiñen en casquete de color azul, con un halo claro debido a que la

pared del hongo no se colorea con este colorante. En Pm las células fúngicas presentan en su

interior un tabicamiento transversal. En los pacientes inmunosuprimidos graves, se pueden observar

estos elementos fuera de los macrófagos. Para Pj esta coloración tiñe solamente los cuerpos

intraquísticos (CI) (ascosporos) o formas tróficas, observándose el citoplasma de color celeste y

pequeños núcleos de color rojo-púrpura. La pared del quiste (asco) no se tiñe y se ve un halo claro

alrededor de los CI, observándose generalmente en grupos y ocasionalmente en macrófagos. El

porcentaje de sensibilidad de esta técnica para detectar Pj varía del 70 al 92% según diferentes

autores y dependiendo del material respiratorio analizado.

6. AZUL DE LACTOFENOL

Principio

El azul de lactofenol se emplea para observar hongos. El fenol inactiva las enzimas líticas de la

célula e impide que ésta se rompa; de igual forma, destruye la flora acompañante e inactiva a la

célula, quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se usa en

combinación con colorantes. El ácido láctico es un agente aclarante, preserva las estructuras

fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera

una película protectora. El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina

presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación. Una vez

preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un portaobjetos por medio de

una impronta (proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una estructura

utilizando una cinta adhesiva transparente).

Preparación de la impronta

1. Colocar el material necesario en la campana de seguridad

2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.

3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1cm2

4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.

5. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.

6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.

7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul de algodón.

8. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.

9. Observar en 40x.

7. TINTA CHINA O TINCION NEGATIVA (CAPSULAS)

Principio

La TCH es útil para observar la presencia de la cápsula de Cryptococcus spp (Cn), basada en la

coloración negativa. La cápsula repele las partículas de carbón de la TCH dando un halo claro, bien

demarcado alrededor de cada célula capsulada.

Descripción de la técnica

Colocar una gota de TCH y luego una gota del sedimento (fluido corporal, orina, LCR) en un

portaobjetos limpio, mezclar y cubrir con cubreobjetos. Examinar al microscopio con objetivo de 10x

y confirmar con 40x.

Resultados

La presencia de levaduras con o sin brote, con halo claro alrededor de la célula fúngica que indica

presencia de cápsula. Se debe tener en cuenta que los glóbulos blancos pueden repeler las

partículas de carbón de la TCH, pero presentan un halo irregular con granulaciones internas y

membrana nuclear, y la imagen no se observa tan nítida como la pared del Cn.

8. TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Fundamento

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores

ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio

óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán

las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Realización

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas.

1. Preparar los frotis bacterianos indicados.

2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del

mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.

Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora; es importante que la

muestra no se seque.

3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. Teñir con safranina 1 min.

5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

6. Secar la preparación.

7. Observar la preparación al microscopio. Anotar la disposición y la morfología de las tres especies

del género Bacillus.

Interpretación de los resultados

La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter

taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.