TRABAJO FIN DE ESTUDIOS · Esquema de los aminoácidos Ser o Thr glicosilados con los carbohidratos...
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TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
Síntesis de epítopos relacionados con la mucinaMUC1
David Madariaga Merino
MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA
Tutor: Jesús Manuel Peregrina GarcíaFacultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Curso 2010-2011
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Síntesis de epítopos relacionados con la mucina MUC1, trabajo final de estudiosde David Madariaga Merino, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García (publicado por la
Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA
Centro de Investigación en Síntesis Química (CISQ) Grupo de Síntesis Química de La Rioja U.A.-C.S.I.C.
SÍNTESIS DE EPÍTOPOS RELACIONADOS CON LA MUCINA
MUC1
Trabajo de investigación Proyecto Fin de Máster David Madariaga Merino
Junio 2011
Trabajo de investigación Nuria Martínez Sáez
Junio 2010
JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA, Catedrático de Química Orgánica del
Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y
FRANCISCO CORZANA LÓPEZ, Profesor Contratado Doctor de Química Orgánica
del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.
HACEN CONSTAR:
Que la memoria " SÍNTESIS DE EPÍTOPOS RELACIONADOS CON LA MUCINA
MUC1" ha sido realizada por el Licenciado DAVID MADARIAGA MERINO en
el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su
inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 30
créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo fin
de Máster.
Logroño, Junio 2011
Fdo.: Jesús Manuel Peregrina García Fdo.: Francisco Corzana López
A mi madre y a mi padre, por su apoyo incondicional desde siempre.
A mi hermana, por su ánimo y comprensión.
A mi familia y amigos, por estar siempre ahí.
Quién iba a imaginar que en escasamente dos años, que es lo que llevo
en el grupo, se pudiera aprender no solo a nivel académico sino a nivel personal,
la convivencia diaria y la ayuda que se me ha prestado siempre que la he
necesitado. Por eso, si hoy estoy aquí tan ilusionado es gracias a todos vosotros:
A Alberto, Pere, Héctor y Marimar por darme la oportunidad de entrar
en el grupo y haberme aconsejado, ayudado y formado, primero durante la
carrera y, posteriormente, en esta segunda etapa. También, agradecer
especialmente a Paco por su paciencia, su gran ayuda dentro y fuera del
laboratorio y su entusiasmo por la Química y el aprendizaje que hacen que se
contagien.
A todos y cada uno de mis compañeros de laboratorio sin los cuales el
trabajo de cada día no hubiera sido el mismo. Gracias a Fer, por conseguir tan
buen ambiente con su humor característico; a mi padre Charlie, por compartir
altruistamente su tiempo, dedicación y entusiasmo, aguantando, como nadie, mis
primeros pasos en la investigación; a Eva, por estar siempre con una sonrisa y
preocupada por suministrarme todo lo que fuera necesario consiguiendo que
todo fuera más cómodo; a Javi, del que siempre guardare un pequeño recuerdo,
que ha estado siempre a mano para solucionar cualquier pequeña duda; a Nuria,
por todas esas risas que cada día hacen que se vuelva con ganas cada mañana y su
paciencia con alguien que está todo el día acosándola a preguntas; a Victor S.,
por su gran sentido del humor y compañerismo, además de los buenos momentos
dentro y fuera del laboratorio; a Victor R., cuyo comportamiento modelo en el
laboratorio y su personalidad hacen que sea alguien indispensable en el día a día;
a Lara, no solo compañera de poyata, sino una gran persona a la que tengo
mucho que agradecer, que me ha ayudado cada día y que siempre ha estado
disponible para cualquier pequeña y tonta duda; a Iván, que desde el principio de
la carrera ha sido un apoyo incondicional y, aunque me robe sitio, sabemos que
todo lo puede solucionar una buena cerveza.
A los vecinos fotoquímicos, Alegría, Héctor, Marina, Pedro, Miguel
Ángel y Diego y su nueva adquisición, Anselmo, con los que ha sido imposible no
compartir más de un gran momento tanto fuera como dentro del edificio.
A mis compañeros de Máster: Ana, Manso, Patri, Irene, Pepetó e Iván, a
los que tanto he odiado las mañanas de los viernes.
A mis amigos, ellos saben quiénes son, que me han aguantado cuando
más lo he necesitado.
Por último, a toda mi familia, porque nunca han dejado de darme su
cariño y apoyo bajo ningún concepto.
Finalmente, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda
económica aportada para la realización de este proyecto:
• Gobierno de La Rioja, por la concesión del proyecto COLABORA
2010/05.
• Ministerio de Ciencia e Innovación, por la aportación económica al
proyecto CTQ2009-13814/BQU.
• Universidad de La Rioja, por la beca F.P.I. concedida en el 2011 y por
la subvención al grupo de investigación: Grupo de Síntesis Orgánica
Estereoselectiva.
• Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y científico
idóneo para el desarrollo de este trabajo.
ÍNDICE
Abreviaciones I
1. Introducción y objetivos 1
2. Antecedentes 9
2.1. Síntesis 11
2.1.1. Formación del enlace peptídico 11
2.1.2. Síntesis de péptidos en fase sólida 14
2.1.3. Formación del enlace O-glicosídico 17
2.2. Trabajos previos 20
3. Discusión de resultados 25
4. Conclusiones 39
5. Experimental 43
6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 63
I
Abreviaciones
δδδδ desplazamiento químico 1
H RMN resonancia magnética nuclear de protón 13
C RMN resonancia magnética nuclear de carbono-13
Ac acetilo
Ac2O anhídrido acético
AcOEt acetato de etilo
Ala, A alanina
Arg, R arginina
Asp, D ácido aspártico
Bn bencilo
Boc terc-butoxicarbonilo
Boc2O di-terc-butil dicarbonato
BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris(dimetilamino)fosfonio
tBu terc-butilo
BuOH butanol
tBuOK terc-butóxido potásico
c concentración (g/100 mL)
col. colaboradores
COSY COrrelated SpectroscopY
d doblete, día
DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida
dd doblete de dobletes
DIC N, N’-diisopropilcarbodiimida
DIEA diisopropiletilamina
DM dinámica molecular
DMF dimetilformamida
Et etilo
Et3N trietilamina
EtOH etanol
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo
GalNAc N-acetilgalactosamina
II
Gly, G glicina
HBTU hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-
dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio
His, H histidina
HOBt 1-hidroxibenzotriazol
J constante de acoplamiento
M molaridad
m multiplete
Me metilo
MeOH metanol
MeONa metóxido de sodio
MeSer metilserina
mmol milimol
NMP N-metilpirrolidona
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
Pro, P prolina
PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris(pirrolidin)fosfonio
R sustituyente alquilo o arilo, arginina
RMN resonancia magnética nuclear
s singlete, ázucar (del inglés, sugar)
Ser, S serina
SPPS solid-phase peptide synthesis
t triplete, tiempo
TBTU tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N´,N´-
tetrametiluronio
TFA ácido trifluoroacético
TfO triflato
THF tetrahidrofurano
TIS triisopropilsilano
Thr, T treonina
TMS trimetilsililo, tetrametilsilano
Val, V valina
3 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Los glicopéptidos y las glicoproteínas son algunas de las moléculas de
mayor interés biológico1 y están constituidas por una parte peptídica o proteica y
uno o varios restos carbohidrato (azúcar), que se unen entre sí mediante lo que se
denomina enlace glicosídico (Figura 1).
Figura 1. Glicoproteína MUC1 donde la cadena peptídica se encuentra glicosilada en la
treonina del epítopo PDTR.
Muchas de las propiedades que presentan estas glicoproteínas se
atribuyen a su alto número de residuos glicosilados, ya que ha observado un
notable aumento de su estabilidad proteica, reduciendo así su vulnerabilidad a la
degradación proteolítica, tanto química como enzimática.1d
Una de las formas más usuales e importantes de unión entre un
aminoácido y un carbohidrato es mediante el enlace O-glicosídico donde el azúcar
1 a) Buskas, T.; Thompson, P.; Boons, G.-J. Chem. Commun. 2009, 5335-5349; b) Essentials of Glycobiology (Eds.: Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J.; Freeze, H.; Hart, G. W.; Marth, J.), Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York, 1999; c) Pratt, M. R.; Bertozzi, R. C. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68; d) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998, 33, 151-208; e) Strous, G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57-92; f) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97-130; g) Glycopeptides and Glycoproteins: Synthesis, Structure, and Application en Topics in Current
Chemistry, (Ed.: Wittmann, V.), Springer-Verlag, Berlín, vol. 267, 2007.
4 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
se enlaza al grupo hidroxilo de una serina (Ser) o una treonina (Thr) de una cadena
peptídica. Este tipo de enlace puede ser de tipo α o β (Figura 2).
Figura 2. Esquema de los aminoácidos Ser o Thr glicosilados con los carbohidratos
N-acetilgalactosamina (GalNAc) y glucosa (Glc), mediante un enlace α-O-glicosídico y β-O-
glicosídico, respectivamente
De los diferentes tipos de O-glicoproteínas que se conocen, unas de las
más importantes son las mucinas. Estas moléculas están involucradas en diversos
procesos biológicos,2 como la inflamación, la respuesta inmunológica, la
comunicación intercelular, el crecimiento y adherencia celular y la actividad
anticongelante, entre otros. Además, tienen gran interés desde el punto de vista
terapéutico,3 especialmente en el desarrollo de vacunas para el tratamiento del
cáncer.4
En las mucinas, el primer residuo de carbohidrato unido a la cadena
peptídica es, generalmente, el N-acetilgalactosamina (GalNac), y se une a través de
2 a) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683-720; b) Sears, P.; Wong, C.-H. Cell. Mol. Life Sci.
1998, 54, 223-252. 3 a) Davis, B. G. Chem. Rev. 2002, 102, 579-601; b) Watt, G. M.; Lund, J.; Levens, M.; Kolli, V. S. K.; Jefferis, R.; Boons, G.-J. Chem. Biol. 2003, 10, 807-814; c) Lui, H.; Wang, L.; Brock, A.; Wong, C.-H.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1702-1703; d) Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G. Angew. Chem., Int.
Ed. 2004, 116, 827-833; e) Davis, B. G. Science 2004, 303, 480-482. 4 a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200-205; b) Moingeon, P. Vaccine
2001, 19, 1305-1326; c) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054; d) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7630-7635; e) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Glycobiology 2006, 16, 113R-136R; f) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nature Rev. 2005, 4, 477-488; g) Hollingsworth, M. A.; Swanson, B. J. Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 45-60; h) Trap, M. A.; Clausen H. Biochim.
Biophys. Acta 2008, 1780, 546-563.
5 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
un enlace α-O-glicosídico a serina o treonina. Esto es lo que se denomina antígeno
Tn (Figura 3).
Figura 3. Estructura del antígeno Tn
La mucina humana MUC1 es una glicoproteína asociada a la membrana
celular. Dicha molécula se encuentra sobreexpresada y deficientemente
glicosilada en una célula cancerosa, debido al mal funcionamiento de algunas
glicosiltransferasas. La pérdida de polaridad y la sobreexpresión de la MUC1 en
este tipo de células interfieren con la adhesión celular y evita el reconocimiento
por parte del sistema inmune de la célula tumoral, favoreciendo la creación de
metástasis. Por otro lado, la glicosilación parcial y con glicanos más cortos y
menos complejos de lo normal (Figura 4) hace que determinados antígenos (como
el Tn) que en las células normales se encuentran enmascarados por la presencia
de carbohidratos más externos, queden ahora expuestos en la superficie.5 Este
hecho convierte a las mucinas en prometedoras candidatas para la terapia contra
el cáncer (vacunas basadas en carbohidratos).6
5 a) Sell, S. Human Path. 1990, 21, 1003–1019; b) Hakomori, S.; Zhang, Y. Chem. Biol. 1997,
4, 97-104; c) Taylorpapadimitriou, J.; Epenetos, A. A. Trends Biotech. 1994, 12, 227–233; d) Gabius, H. J. Angew. Chem. 1988, 27, 1267–1276. 6 a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; b) Dziadek, S.; Kunz, H.
The Chem. Rec. 2004, 3, 308-321; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 836-863; d) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.; Olkiewicz, K.; Verbel, D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.; Livingston, P. O.; Scher, H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292-4298; e) Chen, X.; Lee, G. S.; Zettl, A.; Bertozzi, C. R. Angew.
Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6111-6116; g) Galonic, D. P.; Gin, D. Y. Nature 2007, 446, 1000-1007; f) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5021-5034.
6 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 4. Mucina sana y mucina con errores de glicosilación en una membrana celular
Estructuralmente, esta glicoproteína está formada por la repetición de la
siguiente secuencia de veinte aminoácidos: GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP; tiene
cinco puntos de O-glicosilación: las tres treoninas y las dos serinas. Además, esta
molécula presenta tres regiones importantes.
La primera de ellas es la secuencia GVTSA (glicina-valina-treonina-serina-
alanina), sustrato de partida para las enzimas GalNAc transferasas y un epítopo
reconocido por anticuepos.6a
La segunda es el fragmento PDTR (prolina-aspártico-treonina-arginina).
Esta secuencia peptídica también es un epítopo reconocido por distintos
anticuerpos del tipo anti-MUC1.7
7 a) Takeuchi, H.; Kato, K.; Denda-Nagai, K.; Hanisch, F.G.; Clausen, H.; Irimura, T. J.
Immunol. Methods. 2002, 270, 199-209. b) Burchell, J. M.; Gendler, S. J.; Taylor-Papadimitriou, J.; Girling, A.; Lewis, A.; Millis, R.; Lamport, D. Cancer Res. 1987, 47, 5476-5482.
7 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La tercera ha sido la menos estudiada. Sin embargo, recientemente, el
grupo de Kun, lleva varios años dedicado al desarrollo de nuevas vacunas contra el
cáncer basadas en la MUC1, observando8 que la glicosilación de la Thr en el
fragmento GSTAP (Glicina-Serina-Treonina-Alanina-Prolina, marcado en rojo en la
secuencia de la página anterior) aumenta de forma sustancial la afinidad de las
nuevas moléculas por un anticuerpo anti-MUC1 llamado SM3.
Lógicamente, y con el fin de diseñar vacunas cada vez más eficaces, es
imprescindible conocer en detalle los factores que gobiernan la interacción entre
el anticuerpo (proteína) y la MUC1. En este sentido, varios autores9,10señalan que
el esqueleto peptídico de la MUC1, con una disposición extendida, puede
favorecer las interacciones anticuerpo-glicoproteína.
En el presente trabajo se pretenden sintetizar los dos glicopéptidos que
se muestran en la Figura 5 con el fin de, en un futuro, poder corroborar esta
hipótesis e intentar racionalizar los resultados obtenidos por el grupo de Kunz. De
esta forma, se sintetizarán los glicopéptidos y sus análogos sin glicosilar, y fuera ya
del ámbito de este trabajo, se estudiará su interacción con distintas lectinas y/o
anticuerpos, permitiéndonos comprobar hasta qué punto la disposición espacial
de la cadena peptídica modula la interacción anticuerpo-glicopéptido para su
reconocimiento celular.
8 Westerlind, U.; Schröder, H.; Hobel, A.; Gaidzik, N.; Kaiser, A.; Niemeyer, C. M.; Schmitt,
E.; Waldmann, H.; Kunz, H., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 8263-8267. 9 Murray, A.; Spencer, D.I.R.; Missailids, S.; Denton,G.; Price M.R. Peptide Res. 1998, 52, 375-383. 10 Coltart, D.M.; Royyuru A.K.; Williams, L. J.; Glunz P.W.; Sames, D.; Kuduk, S.D.; Schwarz, J.B.; Chen, X-T.; Danishefsky, S.J; Live, D.H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9833-9844.
8 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 5. Péptidos y glicopéptidos objeto de síntesis y estudio.
2. Antecedentes
11 ANTECEDENTES
En el presente capítulo se describen los procedimientos sintéticos más
habituales para la formación de enlaces peptídicos y glicosídicos, algunos de los
cuales han sido utilizados para la obtención de los glicopéptidos objetivo de este
trabajo. Además, se recoge un breve resumen de la síntesis en fase sólida de
péptidos, así como de los trabajos previos y conclusiones más importantes
obtenidas por nuestro grupo de investigación en este campo.
SÍNTESIS
Formación del enlace peptídico
Un enlace peptídico se forma a partir de los grupos amina y ácido
carboxílico de los residuos implicados. Para ello, se requieren condiciones de
reacción bastante enérgicas ya que a temperatura ambiente simplemente se
generan las correspondientes sales. Por este motivo, es necesaria la previa
activación del grupo carboxilo, haciéndolo más reactivo frente al ataque
nucleófilo de la amina.1
Para dar solución a este problema se han desarrollado diferentes
estrategias y reactivos para aumentar la electrofilia del grupo ácido, que han sido
de gran ayuda en el avance de la investigación en este campo.
En este sentido, y para que se minimicen los procesos de racemización,
el procedimiento más extendido se basa en el empleo de agentes de
acoplamiento, ya que son capaces de generar especies muy reactivas, facilitando
en gran medida la formación del enlace amida (Esquema 1).
Las carbodiimidas son los reactivos de acoplamiento más utilizados en la
síntesis de péptidos convencional. La N,N’-diciclohexilcarbodiiamida (DCC) fue la
primera descrita y todavía hoy sigue siendo la más popular. Sin embargo, uno de
los mayores problemas asociados al uso de este agente de acoplamiento es el
elevado porcentaje de epimerización (en torno a un 10%). Otra de las
1 Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537.
12 ANTECEDENTES
carbodiimidas más empleadas es la N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), debido a la
gran solubilidad de las ureas que se forman como subproductos. Cuando se
emplean las carbodiimidas como agentes de acoplamiento, se recomienda la
utilización de aditivos como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt),2 que aceleran la
reacción y reducen el riesgo de racemización. En la Figura 1 se muestran las
estructuras de estos compuestos.
Figura 1. Estructura de las carbodiimidas y aditivos utilizados en la síntesis de péptidos.
En los últimos años han surgido nuevos reactivos que minimizan la
formación de subproductos no deseados a la vez que reducen los tiempos de
reacción, lo que hace que su utilización se haya extendido considerablemente
(Figura 2).
Figura 2. Estructura de algunas sales de fosfonio (BOP, PyBOP) y sales de uronio (HBTU, TBTU)
utilizadas como agentes de acoplamiento.
2 Konig, W.; Geiger, R. Chem. Ber. 1970, 103, 788-798.
13 ANTECEDENTES
La mayoría son sales de fosfonio o uronio que, en presencia de una
base, pueden convertir el carboxilato del aminoácido protegido en una especie
activada. Las más empleadas son el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) y el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-
tris(pirrolidin)fosfonio (PyBOP).3 Entre las sales de uronio se encuentran el
hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-
metilmetanaminio (HBTU)4 y el tetrafluoroborato de N-óxido de N-[(1H-
benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio (TBTU),5 entre los
más comunes.
Esta metodología, basada en los agentes de acoplamiento, ha sido muy
utilizada por nuestro grupo de investigación, en particular el empleo de TBTU y
HBTU, ya que se obtienen buenos rendimientos. Por ello, es el procedimiento que
se empleará en este estudio para la formación del enlace peptídico (Esquema 1).
Esquema 1. Ejemplo de reacción de formación de un enlace peptídico con un agente de
acoplamiento
3 Martínez, J.; Bali, J. P.; Rodríguez, M.; Castro, B.; Magous, R.; Laur, J.; Lignon, M. F. J.
Med. Chem. 1985, 28, 1874-1879. 4 Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth, W.; Gillessen, D. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-
1930. 5 Poulain, R. F.; Tartar, A. L.; Deprez, B. P. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1495-1498.
14 ANTECEDENTES
Tanto la cadena peptídica creciente, como el aminoácido que se desea
incorporar a ésta, son compuestos bifuncionales que poseen un grupo ácido y un
grupo amino en sus extremos. Para asegurar la formación del enlace amida entre
los dos grupos deseados, evitando reacciones laterales y polimerizaciones
incontroladas, se debe bloquear o proteger convenientemente la amina y el
carboxilo que no se desee que reaccionen. De este modo, en la construcción de la
cadena peptídica, se deben ir alternando pasos de protección, formación de
enlaces amida y desprotección, para liberar los grupos reactivos que van a
participar en la formación del siguiente enlace.
Los grupos protectores de aminas más usuales suelen ser el
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o el terc-butoxicarbonilo (Boc), que dan lugar a
carbamatos, fácilmente eliminables cuando ya no son necesarios. Los ácidos
carboxílicos se protegen comúnmente en forma de ésteres: terc-butílico (CO2tBu),
alílico (CO2Allyl), bencílico (CO2Bn), etc.
Esto es la base de la síntesis en fase sólida de péptidos que ahora se
desarrollará en mayor profundidad.
Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, solid-phase peptide synthesis)
En 1963 Merrifield describió por primera vez la idea de una síntesis de
péptidos en fase sólida6 (en inglés, SPPS: solid-phase peptide synthesis) y hoy en
día es la manera más habitual y sencilla de obtener péptidos. Este método se basa
en la unión del aminoácido a través del grupo carboxilo terminal a un soporte
insoluble (llamado resina) y la posterior elongación secuencial, aminoácido tras
aminoácido, de la cadena peptídica. El método de síntesis en fase sólida presenta
numerosas ventajas respecto a la síntesis de péptidos en disolución:
• Buenos rendimientos ya que, debido a la fijación del péptido a un soporte
sólido, se pueden emplear excesos de reactivos que se eliminan
fácilmente tras sencillos procesos de lavado y filtrado. No se producen
6 Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154.
15 ANTECEDENTES
pérdidas de péptido puesto que el soporte sólido al que está unido
permanece en el mismo recipiente durante todo el proceso.
• Las operaciones de lavado y filtrado son más sencillas y susceptibles de
automatización.
El crecimiento de la cadena peptídica tiene lugar siempre por el extremo
N-terminal mediante la adición sucesiva de los aminoácidos que tienen el grupo
ácido libre, mientras que el extremo amino y las cadenas laterales están
convenientemente protegidos.
La estrategia de trabajo seguida ha sido la conocida como Fmoc/tBu que
emplea el primero como protector temporal del grupo amino y grupos del tipo
terc-butil para proteger las cadenas laterales de los aminoácidos.
La cadena peptídica se sintetiza sobre un soporte polimérico insoluble
llamado resina por la unión del aminoácido C-terminal. El crecimiento de la
cadena tiene lugar desde el extremo carboxilo hacia el extremo amino del
péptido. El conector entre el soporte polimérico y el primer aminoácido variará
dependiendo del tipo de péptido que se desee obtener (carboxilo, amida,
aldehído, etc.).
El grupo protector del amino se elimina antes de la unión del siguiente
aminoácido. La eliminación del grupo protector Fmoc se realiza en medio básico,
con piperidina. Una vez que el grupo amino se encuentra libre, se une el
aminoácido siguiente, previa activación, al aminoácido anterior formando el
enlace peptídico. El proceso de acoplamiento requiere la activación del grupo
carboxilo del aminoácido entrante de modo que éste sea susceptible de
reaccionar con el grupo amino de la cadena de péptido creciente. Este proceso de
desprotección y acoplamiento se repite tantas veces como sea necesario hasta
completar la secuencia del péptido deseado. Una vez sintetizada la cadena
peptídica, ésta se separa del soporte polimérico y se eliminan los grupos
protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos, habitualmente en una
única etapa
16 ANTECEDENTES
En el Esquema 2 se muestra una visión global de las reacciones que
tienen lugar desde que se introduce la resina en el sintetizador junto a los
aminoácidos hasta la obtención de un péptido.
Esquema 2. Etapas llevadas a cabo en SPPS hasta la obtención de un tetrapéptido.
17 ANTECEDENTES
Formación del enlace O-glicosídico
En la mayor parte de las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran
unidos a la cadena peptídica mediante enlaces O-glicosídicos. Esta incorporación
de la parte carbohidrato al péptido es un paso clave en la obtención de estos
productos y se ha llevado a cabo mediante la síntesis de un building block: un
aminoácido que, previamente glicosilado, se incorpora en el sintetizador
automático para producir el esqueleto peptídico completo de la molécula
objetivo. Otra alternativa sería llevar a cabo la glicosilación directa del aminoácido
deseado que ya forma parte de la cadena peptídica final. Sin embargo, esta última
glicosilación suele darse con bajos rendimientos.
En la formación de un enlace O-glicosídico pueden obtenerse dos
estereoisómeros distintos: los anómeros α y β. En general, para una silla 4C1,
presente en la mayor parte de los monosacáridos, el enlace α tiene el grupo OR
en axial, mientras que en un enlace β-O-glicosídico, éste ocupa la posición
ecuatorial (Figura 3).
Figura 3. Anómeros α y β para un enlace O-glicosílico, en una silla 4C1.
Como ya se ha comentado en el apartado Introducción, el enlace O-
glicosídico entre el GalNAc y el grupo hidroxilo de la L-serina o la L-treonina
muestra generalmente configuración α. Aunque en la bibliografía se han
publicado varias revisiones acerca de la formación de enlaces O-glicosídicos,1,7
a
continuación, se pasa a describir algunas de las metodologías más habituales para
la formación del enlace α-O-glicosídico, con GalNAc.
7 a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362; b) Boons, G. J. Tetrahedron 1996,
52, 1095-1121; c) Davis, B. G. J. Chem. Soc. Perk. T 1 2000, 2137-2160; d) Arsequell, G.;
Valencia, G. Tetrahedron-Asymmetr. 1997, 8, 2839-2876; e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg.
Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112.
18 ANTECEDENTES
Método del tricloroacetimidato
Uno de los métodos para obtener mayoritariamente el anómero α es el
desarrollado por Wong y colaboradores,8 que utilizan el tricloroacetimidato como
activador para la glicosilación de un derivado de treonina. Con esta metodología
en dos pasos se forma el enlace α-O-glicosídico mejorando el rendimiento global y
obteniendo los anómeros α y β en proporción 2:1, respectivamente (Esquema 3).
Esquema 3
Otro ejemplo en el que se obtiene mayoritariamente el anómero α a
partir de tricloroacetimidatos es el realizado por el grupo de Toyokuni, para la
serina debidamente protegida, donde la mezcla de anómeros se separa por
cromatografía flash (Esquema 4).9
Esquema 4
8 Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y-Y.; Case D.A.; Wong C-H. J. Am. Chem. Soc.
2007, 129, 13527-13536. 9 Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673-2676.
19 ANTECEDENTES
Metodología de Schmidt
Otra de las metodologías más extendidas es la desarrollada por el grupo
de Schmidt para la obtención del enlace α-O-glicosídico con GalNAc.10,11
Este método se basa en una adición de tipo Michael, en medio básico,
de un alcohol al 2-nitro-D-galactal o 2-nitro-D-glucal adecuadamente protegidos,
formándose los correspondientes productos de glicosilación (Esquema 5).
Esquema 5
En general, este método permite obtener mayoritariamente el anómero
α, si bien, el control de la selectividad depende de la base empleada. Así, se
obtiene una alta selectividad α con bases fuertes como tBuOK, mientras que las
bases tipo amina, como NEt3, favorecen la formación del anómero β.
Metodología de Koenigs-Knorr
El método Koenigs-Knorr es uno de los procedimientos más antiguos de
glicosilación.12
Se basa en el empleo de haluros derivados de carbohidratos, como
grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo aceptor. Un ejemplo
de glicosilación α, mediante la metodología Koenigs-Knorr, es el utilizado por
Liebe y Kunz en la síntesis de un antígeno asociado a tumores (Esquema 6).13
Este
10
Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609-1613. 11
Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706-707. 12
Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981. 13
Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.
20 ANTECEDENTES
procedimiento permite el escalado a gramos fácilmente con rendimientos
elevados.
+
CO2tBu
HO NHFmoc
O
AcO
AcO
BrN3
OAc O
AcO
AcON3
OAc
O
NHFmoc
CO2tBu
Me
MeAgClO4/Ag2CO3 (1:11)CH2Cl2/tolueno (10:9)
47%
Esquema 6
Este será el procedimiento experimental que se ha desarrollado en el
presente trabajo y que dará lugar a la síntesis de los building blocks que aparecen
incluidos en los compuestos 3 y 4, ello es debido a la baja reproducibilidad de la
metodología anterior, ya que al obtenerse un nitro derivado debe llevar asociado
un paso de hidrogenación a un grupo amino que se realiza con amalgama de
níquel platinado con los riesgos que ello supone.
TRABAJOS PREVIOS
Ya se ha comentado en la Introducción la gran importancia de las
glicoproteínas en los procesos biológicos.
Es conocido que la α-O-glicosilación de proteínas tiene un profundo
efecto de organización sobre el esqueleto del péptido, forzándolo a una
conformación extendida.14,15
Varias investigaciones han intentado encontrar una
explicación para este hecho, puesto que para discernir cómo las glicoproteínas
interaccionan con sus blancos biológicos, es esencial mejorar nuestra
comprensión de los mecanismos que permiten que el carbohidrato modifique el
equilibrio conformacional del esqueleto peptídico.
En la actualidad, esta conformación extendida de la cadena peptídica se
explica mediante la formación de un enlace de hidrógeno que tiene lugar entre el
NH del GalNAc y el oxígeno carboxílico del aminoácido al que está unido, como se
14
Coltart, D. M.; Royyuru, A. K.; Williams, L. J.; Glunz, P. W.; Sames, D.; Kuduk, S.; Schwarz,
J. B.; Chen, X.-T.; Danishefsky, S. J.; Live, D. H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9833-9844. 15
Pratt, M. R.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68.
21 ANTECEDENTES
propone en el estudio llevado a cabo por Danishefsky y col.1b
(Figura 4a). Este
enlace de hidrógeno “bloquea” la orientación del carbohidrato con respecto al
esqueleto peptídico.16
a b
Figura 4. a) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de treonina de la cadena peptídica a través de
enlaces de hidrógeno. b) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de serina de la cadena peptídica a
través de moléculas de agua.
Sin embargo, y atendiendo a la geometría, el enlace de hidrógeno
propuesto entre el GalNAc y el aminoácido al que está unido presenta valores
fuera del intervalo de un enlace de hidrógeno convencional.17
Debido a esta controversia, nuestro grupo de investigación se planteó
demostrar si esta interacción es la responsable o no de la conformación extendida
del esqueleto peptídico.
16
a) Mimura, Y.; Inoue, Y.; Maeji, N. J.; Chûjô, R. Int. J. Pept. Prot. Res. 1989, 34, 363-368;
b) Shuman, J.; Qiu, D.; Koganty, R. R.; Longenecker, B. M.; Campbell, A. P. Glycoconjugate
J. 2000, 17, 835-848; c) Tachibana, Y.; Monde, K.; Nishimura, S.-I. Macromolecules 2004,
37, 6771-6779. 17 Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina,
J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 14640-14648.
22 ANTECEDENTES
Los resultados experimentales y teóricos obtenidos en este estudio
apuntan en la dirección de la existencia de una molécula de agua puente entre las
partes carbohidrato y peptídica e indican que las moléculas de agua circundantes
son también esenciales para mantener la conformación bien definida (Figura 4b).
Aunque estos resultados son para el glicopéptido modelo más pequeño, la
existencia de tales interacciones carbohidrato-péptido a través de moléculas de
agua puente podría explicar las características particulares de las glicoproteínas
tipo mucina.
Tras obtener estas conclusiones, se decidió abordar la molécula análoga
de treonina, ya que es conocido que la rotación alrededor de la cadena lateral, en
α-O-D-GalNAc-L-Thr está restringida, característica que no se observa en sus
análogos de serina.18
El estudio estructural llevado a cabo por nuestro grupo19
indica que no
solo la rotación de la cadena lateral está restringida en los derivados de treonina
sino que, más importante, se produce un cambio en la orientación del
carbohidrato (Figura 5) lo que podría conllevar unas implicaciones biológicas
asociadas a dicha disposición espacial.
18
a) Naganagowda, G. A.; Gururaja, T. L.; Satyanarayana, J.; Levine, M. J. J. Pept. Res. 1999,
54, 290-310. b) Kindahl, L.; Sandström, C.; Norberg, T.; Kenne, L. Carbohyd. Res. 2001, 336,
319-323. c) Kogelberg, H.; Solis, D.; Jiménez-Barbero, J. Curr. Opin. Struct. Biol. 2003, 13,
646-653. 19 Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.;García de Luis, M.; Asensio, J. L.; Jiménez-
Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 9458-9467.
23 ANTECEDENTES
Figura 5. Diferentes orientaciones del carbohidrato según el aminoácido al que se una:
disposición casi paralela en Ser y perpendicular en Thr.
Como la orientación tridimensional del residuo GalNAc en distintos
glicopéptidos previamente estudiados17,20 difiere considerablemente cuando el
aminoácido al que está unido es serina o treonina (Figura 5) y, teniendo en cuenta
que estas diferencias estructurales entre serina y treonina pueden jugar un papel
decisivo en la actividad biológica, se decidió, como continuación lógica del
trabajo, estudiar en detalle los factores que están directamente implicados en
esta alteración del comportamiento conformacional. Por tanto, en el presente
trabajo se ha abordado, en primer lugar, la síntesis de la región de la mucina
MUC1 correspondiente a la secuencia GSTAP tanto sin glicosilar (compuesto 1),
como glicosilado con α-O-GalNAc (compuesto 2). En segundo lugar, se
sintetizaron los análogos de GSSAP (compuesto 3 y 4) para conocer el efecto
producido al glicosilarse y los efectos de la orientación del carbohidrato en cada
uno de los derivados.
20
a) Tachibana, Y.; Fletcher, G. L.; Fujitani, N.; Tsuda, S.; Monde, K.; Nishimura, S.-I.
Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 856-862. b) Yeh, Y.; Feeney, R. E. Chem. Rev. 1996, 96,
601-617. c) Ben, R. N. ChemBioChem 2001, 2, 161-166.
3. Discusión de
resultados
27 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Como ya se ha comentado en el capítulo Introducción, el objetivo de
esta investigación es la síntesis de la secuencia GSTAP (glicina-serina-treonina-
alanina-prolina), GSSAP (glicina-serina-serina- alanina-prolina) y sus derivados
glicosilados (Figura 1), ya que es uno de los epítopos principales de la MUC1.
Figura 1. Péptidos y glicopéptidos objeto de síntesis.
A. Síntesis de los péptidos 1 y 2
La síntesis de los compuestos 1 y 2 se llevó a cabo mediante la
metodología de SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) que se ha explicado en
el capítulo Antecedentes. Por ello, ahora abordaremos el tema desde un punto de
vista más aplicado.
La elección de la resina (Figura 2) es una etapa muy importante ya que,
por un lado, determina cómo se va a obtener el extremo C-terminal (en nuestro
caso -CONH2) y, por otro, condiciona la etapa de cleavage (liberación del péptido)
28 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
que, en la mayoría de los casos desprotege simultáneamente las cadenas laterales
de los aminoácidos. La activación de la resina, que es el paso siguiente, consiste
en la liberación del grupo protector del grupo amino, en nuestro caso Fmoc, con
piperidina (base) en DMF y así tener lista la resina para acoplar el primer
aminoácido.
Figura 2. Resina utilizada en SPPS (Rink Amide MBHA resin, Novabiochem®)
A continuación, siguiendo la estrategia de Fmoc/tBu, se añade la prolina
ya que es el primer aminoácido que se quiere acoplar, protegido el grupo amino
en forma de –NHFmoc. Para que la unión sea efectiva se añade HBTU como
pegador y diisopropiletilamina (DIEA) como base en dimetilformamida (DMF)
como disolvente. Hay que tener en cuenta que se trabaja con 10 equivalentes de
amina por cada equivalente de resina.
Seguidamente, para que el proceso continúe, hay que desproteger el
grupo N-terminal de forma análoga a la desprotección de la resina.
El proceso de acoplamiento y desprotección de Fmoc se repite tantas
veces como aminoácidos se acoplen; en nuestro caso, al sintetizar un
pentapéptido se repetirá cinco veces este ciclo.
Posteriormente, como queda el extremo del péptido como un amino
terminal, se procede a la acetilación del último residuo, en nuestro caso de la
glicina con anhídrido acético y piridina (Figura 3).
29 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Figura 3. Acetilación del último residuo de la cadena peptídica.
Finalmente, se procede a la liberación o cleavage del péptido de la
resina mediante la combinación de ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano
(TIS) y agua (Figura 4). Tras la adición de éter frío precipita el péptido 1 que
finalmente se purifica con un cartucho C-18 de fase reversa.
Figura 4. Proceso de liberación del péptido (cleavage).
Cuando se introduce como building block un glicosil-aminoácido, los
grupos hidroxilo del carbohidrato vienen protegidos en forma de acetatos, lo que
implica una etapa de liberación de dichos acetatos extra que consiste en una
mezcla de MeO-/MeOH que se añade justo antes de su purificación. Además, al no
tratarse de un aminoácido sencillo, el tiempo de acoplamiento en el sintetizador
se ve incrementado para favorecer su unión en la cadena peptídica.
En el apartado Experimental se encuentran las especificaciones de este
proceso para cada uno de los péptidos y glicopéptidos de estudio. El resumen de
toda la síntesis del compuesto 1 queda reflejado en el Esquema 1.
30 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 1. Síntesis en fase sólida del péptido 1.
31 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
B. Síntesis de los glicopéptidos 3 (GST*AP) y 4 (GSS*AP)
La estrategia sintética seguida para la obtención de los
pentaglicopéptidos 3 y 4 fue idéntica para ambos y consistió en la síntesis del
building block correspondiente, acondicionando convenientemente el
carbohidrato y el aminoácido para llevar a cabo el acoplamiento de ambos
mediante la reacción de Koenigs-Knorr.
B.1. Síntesis de los building blocks
Los glicosil-aminoácidos 5 y 6 que aparecen en la Figura 5 son el objetivo
de este apartado. Éstos serán los que se utilicen en la SPPS para obtener los
compuestos 3 y 4, respectivamente.
Figura 5. Building blocks utilizados en la síntesis de los compuestos 3 y 4.
B.1. a. Preparación del carbohidrato
El galactal 7 se hace reaccionar con nitrato de cerio y amonio (CAN) y
azida de sodio (NaN3) bajo atmósfera inerte, una metodología1 que ha
1 a) Lemieux, R. U.; Ratcliffe, R. M. Can. J. Chem. 1979, 57, 1244. b) Heggemann, C.; Budke, C.; Schomburg, B.; Majer, Z.; Wißbrock, M.; Koop, T.; Sewald, N. Amino Acids 2010, 38, 213-222.
32 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
demostrado ser bastante eficaz en este tipo de derivados, ya que tras su
purificación se obtiene el compuesto 8 con un 81% de rendimiento (Esquema 2).
Esquema 2
Tras hacer la columna al crudo de reacción se obtiene el compuesto 8
como mezcla de varios de varios isómeros posibles, pero al hacerlo reaccionar con
un LiBr se obtiene el derivado que tiene el bromo en α (Esquema 3).2 Así, se
obtiene la bromoazida (compuesto 9), que es sensible a la humedad y a la luz.
Esquema 3
B.1. b. Preparación del aminoácido
A continuación, se prepara el aminoácido con los grupos funcionales
dispuestos de tal forma que la reacción con el producto 9 sea óptima.
Utilizaremos como ejemplo la treonina teniendo en cuenta que para la serina se
2 Liu, M.; Young Jr, V. G.; Lohani, S.; Live, D.; Barany, G. Carbohyd. Res. 2005, 340, 1273-
1285.
33 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
actúa exactamente igual, apareciendo su descripción detallada en la parte
Experimental.
Se parte de treonina comercial (compuesto 10) cuyo grupo amino se
protege con Fmoc y el alcohol con tritilo (Trt). Como se quiere tener libre el grupo
alcohol para realizar la unión al carbohidrato, hay que realizar una protección
ortogonal. Por ello, se protege el grupo ácido carboxílico en forma de éster
carboxílico mediante una sencilla reacción con tricloroacetimidato de terc-butilo
bajo atmósfera de argón (Esquema 4).
Esquema 4
El siguiente paso de la síntesis fue la desprotección del –OH del derivado
de treonina 11 con triisopropilsilano y ácido trifluoroacético en diclorometano
(Esquema 5).
Esquema 5
B.1. c. Acoplamiento mediante Koenigs-Knorr
Una vez que ya se tienen los productos 9 y 12, se sigue la metodología
descrita por Koenigs-Knorr 3 que emplea derivados de plata para que la reacción
3 a) Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981; b) Liebe, B.; Kunz, H. Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.
34 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
tenga lugar con un rendimiento aceptable, como se ilustra en el Esquema 6,
obteniéndose el precursor del building block 5.
Esquema 6. Reacción de Koenigs-Knorr
A continuación, es necesario reducir la azida del carbohidrato a amina y
posteriormente, acetilar. El primer paso se realiza mediante una disolución de
trimetilfosfina 1M y agua,4 desechando dos métodos que antes se habían probado
y fueron menos eficaces dando peores rendimientos (trifenilfosfina5 en lugar de
PMe3 o ácido tioacético para reducir y acetilar en un solo paso6).
Finalmente, el tratamiento con anhídrido acético y piridina y una
posterior etapa de desprotección del tBu con TFA y CH2Cl2 permiten obtener el
compuesto 5, que tras realizar una purificación por columna cromatográfica, se
consiguió aislar con un rendimiento del 64 % (Esquema 7).
4 Avenoza, A.; Peregrina, J. M.; San Martín, E. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 6413-6416. 5 Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154. 6 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron 1997, 53, 369-390.
35 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 7
El producto 5 es el building block adecuado para poder obtener el
glicopéptido 3, mediante síntesis en fase sólida.
En los Esquemas 8 y 9 se muestra un resumen de la síntesis de los dos
building blocks que se necesitan para llevar a cabo la SPPS de nuestros
glicopentapéptidos 3 y 4.
B.2. Síntesis en fase sólida incorporando glicoaminoácidos
Finalmente, se llevó a cabo la SPPS de forma análoga a la descrita en el
apartado A de este mismo capítulo. Lo único que hay que tener en cuenta es que
al tratarse de compuestos que se obtienen en la escala del miligramo, el exceso
que se debe utilizar en el sintetizador no es de 10 equivalentes por equivalente de
resina, sino que se baja hasta 5 equivalentes/equivalente de resina. Además, con
el objetivo de que el acoplamiento sea más efectivo, la etapa de acoplamiento del
glicosil-aminoácido aumenta hasta 1 h. Se necesita una etapa adicional para la
eliminación de los grupos acetato del carbohidrato, mediante una mezcla
MeO-/MeOH. Así, se completaría la síntesis de los compuestos 3 y 4.
Un esquema general de la SPPS de ambos glicopéptidos se muestra en el
Esquema 10.
36 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 8. Ruta sintética del glicoaminoácido 5 (derivado de treonina)
37 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 9. Ruta sintética del glicoaminoácido 6 (derivado de serina)
38 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
R
R'
FmocHN COOHPro
Ala
A. Desprotecciónde la resina
H3CO O
HN
Nle
O HN
O
O
1 mL piperidina3 mL DMF H3CO O
NH2
Nle
O HN
FmocHN COOH
FmocHN COOH
FmocHN COOH
H3CO O
NH
Nle
O HN
O
Pro
N
O
NH
Ala
Ser
OHN
R' R
Thr
O
NH
OH
FmocHN COOH
Gly
O
H2N
SerGly
NH2
O
Pro
N
O
NH
Ala
OHN
R' R
Thr
O
NH
OHO
AcHN
SerGly
1. 1 mL Ac2O, 2 mL piridina, 2h2. 1.9 mL TFA, 50 L TIS, 50 L H2O, 1h
178 mg (0.1 mmol NH2)
Rink Amide MBHA resin
B. Acomplamiento ydesprotección Fmoc
C. Acetilación de residuos finalesy liberación de la resina
SPPS
a) 3.40 mg HBTU, 1 mL DIEA, 2 mL DMFb) 1 mL piperidina, 3mL DMF
B
= Polímero (estireno - 1% DVB)
Nle = Norleucil
5: R = Me, R' = -O-GalNAc(OAc)36: R = H, R' = -O-GalNAc(OAc)3
3': R = Me, R' = -O-GalNAc(OAc)34': R = H, R' = -O-GalNAc(OAc)3
NH2
O
Pro
N
O
NH
Ala
OHN
R' R
Thr
O
NH
OHO
AcHN
SerGly
2 mL MeOH
1 mL MeO-/MeOHD. Desprotección de los grupos
-OH del carbohidrato
3: R = Me, R' = -O-GalNAc4: R = H, R' = -O-GalNAc
Esquema 10. Síntesis en fase sólida de los glicopéptidos 3 y 4.
4. Conclusiones
41 CONCLUSIONES
Se ha llevado a cabo la síntesis de una de las secuencias más
importantes de la mucina MUC1, el epítopo GSTAP (1), así como del derivado con
serina GSSAP (2). También se han obtenido los dos análogos glicosilados en el
tercer residuo, es decir, GST*AP (3) y GSS*AP (4) (* = α-O-GalNAc).
La síntesis se ha realizado mediante una metodología en fase sólida
donde el primer paso ha sido la preparación del building block a partir del
carbohidrato GalNAc y el aminoácido correspondiente, usando la reación de
Koenigs-Knorr. Posteriormente, este building block se incorporó al sintetizador
automático de pétidos utilizando Fmoc como grupo protector de amina y TBTU
como agente de acoplamiento para la formación del enlace amida.
De este modo, se ha conseguido sintetizar los pentapéptidos 1 y 2 y los
glicopentapéptidos 3 y 4 (Figura 1), en la escala del miligramo. Se obtuvieron 20
mg de los compuestos 1 y 2 mientras que de los derivados glicosidados 3 y 4 se
consiguieron 19 y 17 mg, respectivamente.
Figura 1. Péptidos y glicopéptidos objeto de estudio.
42 CONCLUSIONES
Todos los compuestos que aparecen en la Figura 1 fueron caracterizados
por técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y análisis de masas.
Posteriormente a este trabajo, se realizará el análisis conformacional de los
glicopéptidos sintetizados combinando resonancia magnética con cálculos de
Dinámica Molecular. También se pretende estudiar su interacción con distintas
lectinas y/o anticuerpos, como ya se ha hecho en el grupo, permitiendo
comprobar hasta qué punto la disposición espacial de la cadena peptídica y del
carbohidrato modula la interacción anticuerpo-glicopéptido.
Del mismo modo, en un futuro, se pretenderá llevar a cabo la síntesis,
estudio conformacional y de afinidad biológica cuando está asociado a otro
epítopo de reconocimiento de la MUC1, la secuencia PDTR, mediante un trabajo
similar al anteriormente descrito.
5. Experimental
45 EXPERIMENTAL
Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y
13C se realizaron en un
espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los
desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes
de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo,
con TMS como referencia interna y agua deuterada, con referencia interna del
propio disolvente.
Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se
realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización
ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.
La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel
(Polychrom SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz
ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido
fosfomolíbdico en etanol.
La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06
mm (230-240 mesh).
Todas las reacciones se llevaron a cabo empleando disolventes secos.
La síntesis en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Model
433A Peptide Synthesizer de Applied Biosystems, cuyo tratamiento de datos se
hizo con el software SynthAssist 2.0.
46 EXPERIMENTAL
Nitrato de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-αααα-D-galactopiranosa (8)
Se añaden en un schlenk nitrato de cerio y amonio (30.20 g, 55.1 mmol)
y azida de sodio (1.79 g, 27.5 mmol) bajo atmósfera inerte a -20 °C. Se adiciona
gota a gota una disolución de tri-O-acetil-D-galactal (5.00 g, 18.6 mmol),
compuesto 7, en CH3CN seco (80 mL) dejándose 10 h en agitación. Se extrae con
éter (50 mL) y con H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con
Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de
columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt, 6:4) obteniéndose el compuesto 8
(2.622 g, 81%) como un aceite amarillo.
1H RMN (400 MHz, CD3Cl) δ (ppm): 2.03, 2.10, 2.18 (3s, 9H, 3CH3), 3.82 (q, 1H, J2,3
= 10.8Hz, H-2), 5.08 (q, 1H, J3,4 = 3.2 Hz, H-3), 5.42 (m, 1H, H-4), 5.60 (d, 1H, J1,2 =
9.0 Hz, H-1)
47 EXPERIMENTAL
αααα-D-Tri-O-acetil-2-azido-1-bromo-2-desoxigalactosa (9)
Se hace reaccionar bajo atmósfera inerte y durante 8 h una disolución
del compuesto 8 (2.62 g, 6.68 mmol) en CH3CN seco (50 mL) con LiBr (2.90 g, 33.4
mmol). Se añade CH2Cl2 (100 mL) y H2O (50 mL), extrayéndose la fase orgánica con
H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se
filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de columna sobre gel
de sílice en hexano/AcOEt (de 8:2 a 6:4) obteniéndose el compuesto 9 (2,03 g,
77%) como un aceite amarillo.
1H RMN (400 MHz, CD3Cl) δ (ppm): 2.02, 2.04, 2.14 (3s, 9H, 3CH3), 3.96 (q, 1H, J2,3
= 10.5 Hz, H-2), 4.48 (m, 1H, H-5), 5.33 (q, 1H, J3,4 = 3.25 Hz, H-3), 5.49 (q, 1H, J4,5 =
2.7 Hz, H-4), 6.47 (d, 1H, J1,2 = 4.0 Hz, H-1)
48 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Thr(OTrt)-tBu (10)
El compuesto 10 (3.00 g, 5.14 mmol) se disuelve en una mezcla
CH2Cl2/THF 4:1 (10:2.5 mL) bajo atmósfera inerte. Se adiciona 2,2,2-
tricloroacetimidato de terc-butilo (4.49 g, 20.55 mmol) dejando en agitación 10h.
Después, se añade AcOEt (50 mL) y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 al 10%
(2 x 100 mL) y NaCl saturado (1 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se
seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por
cromatografía de columna sobre gel de sílice en proporción hexano/AcOEt, 8:2
obteniéndose el compuesto 11 (2.81 g, 87%), como un sólido blanco.
1H RMN (400 MHz, CD3Cl) δ (ppm): 1.38 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3 Thr), 1.53 (s, 9H,
tBu),
2.06–2.20 (m, 9H, Ac), 3.67 (dd, 1H, J = 11.5 Hz, 3.7 Hz, H2S), 4.10–4.15 (m, 2H, CH2
Fmoc), 4.27–4.50 (m, 6H, Hα Thr, Hβ Thr, CHFmoc, H5S, 2 H6S), 5.14 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H1S),
5.37 (m, 1H, H3S), 5.50 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H4S), 7.33–7.44, 7.65–7.67, 7.78–7.80 (m,
8H, Fmoc)
13
C RMN (100 MHz, CD3Cl) δ(ppm): 19.3 (Cγ Thr), 21.0, 21.0, 28.7 (Ac), 28.3 (tBu),
47.8 (CHFmoc), 58.1 (C2S), 59.6 (Ca Thr), 62.2 (CH2 Fmoc), 67.4 (C4S), 67.6 (C5S), 67.9 (C6S),
68.4(C3S), 76.7 (Cβ Thr), 83.3 (CtBu), 99.6 (C1S), 120.3, 120.3, 125.3, 125.3, 125.7,
125.7, 127.5, 128.0, 141.7, 141.7, 144.2, 144.2 (arom.), 157.4, 169.5, 169.6, 170.2,
170.8 (C=O).
49 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Thr-tBu (12)
El compuesto 11 (1.78 g, 2.84 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (100 mL). Se
añade tetraisopropilsilano (5 mL) y ácido trifluoroacético (1 mL). Después de 2h de
reacción, se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice
(hexano/AcOEt, 1:1), obteniéndose el compuesto 12 (0,345 g, 82%) como un
sólido blanco. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los
descritos en la bibliografía.1
1 Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.
50 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Thr(αααα-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (13)
Se añade el compuesto 12 (345 mg, 0.868 mmol) con tamiz molecular,
tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL) bajo atmósfera de argón y la mezcla se agita
durante 1h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (263 mg, 0.955
mmol) y AgClO4 (23 mg, 0.113 mmol), manteniéndose la agitación durante 1 h. Se
añade el compuesto 9 (342.15 mg, 0.868 mmol) disuelto en una mezcla de
tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8 h de reacción, se filtra en tierra de
diatomeas, se evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100
mL) y H2O (2 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4
anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de
sílice (hexano/AcOEt, 6.5:3.5) obteniéndose el compuesto 13 (376 mg, 61%) como
una espuma blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son
idénticos a los descritos en la bibliografía.2
2 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron 1997, 53, 369-390.
51 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Thr(αααα-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (5)
Sobre el compuesto 13 (387 mg, 0.545 mmol) se añade una disolución
1M de PMe3 (1.09 mL, 1.09 mmol) y H2O (20 µL, 1.11 mmol), dejándose con
agitación durante 3 h. Se evapora la disolución y se añade Ac2O (3 mL) y piridina (6
mL). Se deja reaccionar durante 2h y se evapora. Se añade TFA (2.5 mL) en CH2Cl2
(2.5 mL). El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 9:1)
obteniéndose el compuesto 5 (258 mg, 64%) como un sólido blanco. Sus
propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la
bibliografía.2
52 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Ser(OTrt)-tBu (15)
El compuesto 14 (2.00 g, 3.51 mmol) se disuelve en una mezcla
CH2Cl2/THF 4:1 (10:2.5 mL) bajo atmósfera inerte. Se adiciona 2,2,2-
tricloroacetimidato de terc-butilo (3.07 g, 14.04 mmol) dejando en agitación 10h.
Después, se añade AcOEt (50 mL) y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 al 10%
(2 x 100 mL) y NaCl saturado (1 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se
seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por
cromatografía de columna sobre gel de sílice en proporción hexano/AcOEt, 8:2
obteniéndose el compuesto 15 (1.91 g, 87%), como una espuma blanquecina. Sus
propiedades físicas y datos espectroscópicos son iguales a los descritos en la
bibliografía.1
53 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Ser-tBu (16)
2t
El compuesto 15 (1.43 g, 2.29 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (100 mL) y, a
continuación, se añade tetraisopropilsilano (5 mL) y ácido trifluoroacético (1 mL).
Tras 2 h de reacción, se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice
(hexano/AcOEt, 1:1), obteniéndose el compuesto 16 (0.720 g, 82%), como un
sólido blanco. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los
descritos en la bibliografía.1
54 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Ser(αααα-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (17)
Se añade el compuesto 16 (650 mg, 1.69 mmol) y tamiz molecular, en
una disolución de tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL), bajo atmósfera de argón y la
mezcla se agita durante 1 h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (512
mg, 1.86 mmol) y AgClO4 (46 mg, 0.22 mmol), manteniéndose la agitación durante
1 h. Se añade el compuesto 9 (342 mg, 1.69 mmol) disuelto en una mezcla de
tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8h, se filtra en tierra de diatomeas, se
evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100 mL) y H2O (2 x
100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y
se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt,
6.5:3.5) obteniéndose el compuesto 17 (853 mg, 71%) como una espuma
blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los
descritos en la bibliografía . 2
55 EXPERIMENTAL
Fmoc-L-Ser(αααα-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (6)
Sobre el compuesto 17 (387 mg, 0.556 mmol) se añade una disolución
1M de PMe3 (1.09 mL, 1.09 mmol) y H2O (0.02 mL, 1.11 mmol), dejándose con
agitación durante 3 h. Se evapora la disolución y se añade Ac2O (3 mL) y piridina (6
mL). Se deja reaccionar durante 2h y se evapora. Se añade TFA (2.5 mL) en CH2Cl2
(2.5 mL). El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 9:1)
obteniéndose el compuesto 6 (253 mg, 64%) como un sólido blanco. Sus
propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la
bibliografía. 2
56 EXPERIMENTAL
Procedimiento general para la obtención de péptidos y
glicopentapéptidos por SPPS.
En el reactor tipo Vessel del sintetizador automático de péptidos se
introduce la resina Rink Amide MBHA de Novabiochem® (178 mg, 0.1 mmol de
NH2). En los diferentes cartuchos se introduce 1 mmol del correspondiente
aminoácido o glicosil-aminoácido convenientemente protegidos.
El proceso se inicia lavando la resina con una disolución al 22% de
piperidina en N-metilpirrolidona (NMP) durante 10 minutos. Posteriormente, el
equipo expulsa el cartucho de iniciación y añade al reactor el del primer
aminoácido junto con DIEA (1 mL), HBTU (3.4 mg) y DMF (2 mL). Después de 10
min, hace lavados sucesivos con piperidina (1 mL) y DMF (3 mL) durante 30 min.
El proceso continúa con la expulsión del cartucho cogiendo el siguiente,
repitiéndose el proceso tantas veces como (glicosil)aminoácidos haya para
acoplar. Cuando se opera con un glicosil-aminoácido, el tiempo de acoplamiento
se eleva a 60 min. Por último, se retira la resina del reactor y se introduce en un
tubo de plástico añadiéndose piridina (1 mL) y Ac2O (2 mL) manteniéndose la
agitación durante 2 h. A continuación, se filtra y se lava con DMF y CH2Cl2.
Seguidamente, se añade TFA (1.90 mL), TIS (50 µL) y H2O (50 µL) y se
deja agitando durante 2 h. Transcurrido este tiempo, se añade éter frío a la
mezcla, observándose la precipitación del péptido. Seguidamente, se filtra
lavándose con éter. El sólido se desecha y se lava con H2O, recogiéndose esta
disolución acuosa para obtener, tras la purificación por un cartucho C-18, el
péptido o glicopéptido deseado.
Si se trata de un glicopéptido, antes de la purificación se añade MeOH (2
mL) y una mezcla 0.5 M en MeO-/MeOH (1 mL) en agitación durante 1h. A
continuación, se añade resina Dowex®, que previamente ha sido lavada con DMF
57 EXPERIMENTAL
y CH2Cl2, hasta que se comprueba que el pH es neutro. Finalmente, se filtra y se
lava con H2O, obteniéndose el glicopéptido tras su evaporación.
En la Imagen 1 se puede observar el modelo utilizado para llevar a cabo
la SPPS así como las diferentes partes y reactivos de las que dispone.
Imagen 1. Fotografía del dispositivo instrumental Model 433A Peptide Synthesizer de Applied
Biosystems, utilizado para la síntesis de péptidos en el presente trabajo.
58 EXPERIMENTAL
N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L - treoninil- L alaninil- L -prolinamida
Ac-L-Gly-L-Ser- L-Thr- L-Ala-L-Pro-CONH2 (1)
Siguiendo la metodología general para la obtención de síntesis de
péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1mmol),
Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Thr(O
tBu)-Fmoc (341 mg, 1 mmol), Ala-Fmoc
(311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol) obteniéndose el péptido 1.
HRMS (ESI) (m/z) 473.2354 [M+H]+; calculado C19H33N6O8
+: 473.2315
1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 1.19 (d, 3H, J = 6.4 Hz, MeThr), 1.35 (d, 3H, J = 7.1
Hz, MeAla), 1.88 – 1.97 (m, 1H, Hγ Pro ), 1.98 – 2.08 (m, 5H, Ac, Hβ Pro, Hγ Pro), 2.29 (m,
1H, Hβ Pro), 3.65 (dt, 1H, J = 10.1, 6.7 Hz, Hδ Pro), 3.75 – 3.92 (m, 3H, 2Hβ Ser , Hδ Pro),
3.96 (s, 2H, 2Hα Gly), 4.17 – 4.25 (m, 1H, Hβ Thr), 4.32 – 4.40 (m, 2H, Hα Pro, Hα Thr),
4.53 (t, 1H, J = 5.5 Hz, Hα Ser), 4.60 (q, 1H, J = 7.0 Hz, Hα Ala).
13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 15.4 (CH3 Ala), 18.8 (CH3 Thr), 21.7 (CH3CO), 24.6
(Cβ Pro), 29.5 (Cγ Pro), 42.5(CGly), 47.8 (Cδ Pro), 55.4 (Cα Ser), 58.9 (Cα Thr), 60.3 (Cα Pro),
61.0 (Cβ Ser), 66.9 (Cβ Thr), 171.2, 171.9, 172.2, 172.8, 174.9, 177.0 (6 CO).
59 EXPERIMENTAL
N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L - serinil- L alaninil- L -prolinamida
Ac-L-Gly-L-Ser- L-Ser- L-Ala-L-Pro-CONH2 (2)
2
Siguiendo la metodología general para la obtención de síntesis de
péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol),
Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Ser(O
tBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Ala-Fmoc
(311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol) obteniéndose el péptido 2.
HRMS (ESI) (m/z) 481.2005 [M+Na]+; calculado C18H30N6O8 Na
+: 481.2017
1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 1.33 (d, 3H, J = 7.1 Hz, MeAla), 1.85 – 1.96 (m, 1H,
Hγ Pro ), 1.96 – 2.07 (m, 5H, Ac, Hβ Pro, Hγ Pro), 2.20 – 2.32 (m, 1H, Hβ Pro ), 3.63 (dt,
1H, J = 10.2, 6.7 Hz, Hδ Pro), 3.73 – 3.90 (m, 5H, 4Hβ Ser, Hδ Pro), 3.94 (s, 2H, 2Hα Gly),
4.34 (dd, 1H, J = 8.5, 5.5 Hz, Hα Pro), 4.42 – 4.52 (m, 2H, 2Hα Ser), 4.59 (q, 1H, J = 7.0
Hz, Hα Ala).
13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 15.4 (CH3 Ala), 21.7 (CH3CO), 24.6 (Cγ Pro), 29.5 (Cβ
Pro), 42.5(CGly), 47.7 (Cα Ala), 47.7 (Cδ Pro), 55.3 (2 Cα Ser), 58.9 (Cα Thr), 60.3 (Cα Pro), 61.0
(2Cβ Ser), 170.9, 171.9, 171.9, 172.7, 174.9, 177.0 (6 CO)
60 EXPERIMENTAL
N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L-(αααα-O-D-N-acetilgalactosaminil)- treoninil- L-
alaninil- L-prolinamida
Ac- L-Gly- L-Ser- L-Thr-(αααα-O-D-GalNHAc)- L-Ala- L-Pro
Siguiendo la metodología general para la obtención de síntesis de
péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol),
Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), el building block de Thr (compuesto 5, 318 mg,
0.474 mmol), Ala-Fmoc (311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol)
obteniéndose el glicopéptido 3.
HRMS (ESI) (m/z) 698.2998 [M+Na]+; calculado C18H30N6O8 Na
+: 698.2968
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.27 (d, 3H, J = 6.3 Hz, MeThr), 1.38 (d, 3H, J =
7.1 Hz, MeAla), 1.89 – 2.14 (m, 9H, NHCH3 S, NHCH3, Hβ Pro, 2Hγ Pro), 2.27 – 2.36 (m,
1H, Hβ Pro), 3.64 – 3.80 (m, 4H, Hδ Pro, H3S, 2H6S), 3.85 – 4.05 (m, 7H, 2Hβ Ser , Hδ Pro,
2Hα Gly, H4S, H5S), 4.11 (dd, 1H, J = 11.0, 3.8 Hz, H2S), 4.34 – 4.42 (m, 2H, H2S, , Hα Pro
), 4.51 - 4.62 (m, 2H, Hα Thr, Hα Ser), 4.66 (m, 1H, Hα Ala), 4.92 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S).
13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 18.0 (CH3 Ala), 20.8 (CH3 Thr), 24.2,24.8 (2 CH3CO),
27.2 (Cβ Pro), 32.1 (Cδ Pro), 32.8 (Cγ Pro), 45.0(Cα Gly), 50.10 (C2S), 57.7 (Cα Ala), 59.8 (Cα
Thr), 62.65 (Cβ Ser), 63.67 (C6S), 63.88 (Cα Ser), 70.59 (C3S), 71.13 (C4S), 73.90 (C5S),
77.65 (Cβ Thr), 101.1 (C1S), 173.3, 174.3, 174.9, 175.1, 176.4, 177.4, 179.5 (7 CO).
61 EXPERIMENTAL
N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L-(αααα-O-D-N-acetilgalactosaminil)-serinil- L-
alaninil- L-prolinamida
Ac- L-Gly- L-Ser- L-Ser-(αααα-O-D-GalNHAc)- L-Ala- L-Pro
2
Siguiendo la metodología general para la obtención de síntesis de
péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), Ser(tBu)-
Fmoc (383 mg, 1 mmol el building block de Ser (compuesto 6, 328 mg, 0.50
mmol), Ala-Fmoc (311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337.4 mg, 1 mmol) obteniéndose
el glicopéptido 4.
HRMS (ESI) (m/z) 684.2800 [M+Na]+; calculado C26H43N7O13 Na
+: 684.2811
1H NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm): 1.36 (d, 3H, J = 7.1 Hz, MeAla), 1.93 (m, 1H, Hγ Pro),
1.98 – 2.08 (m, 8H, NHCH3 S, NHCH3, Hβ Pro, Hγ Pro), 2.28 (dt, 1H, J = 15.7, 7.8 Hz, Hβ
Pro), 3.60 – 3.92 (m, 11H, 2Hδ Pro, 4Hβ Ser, H3S, H4S, H5S, 2H6S), 3.94 (s, 2H, 2Hα Gly), 4.14
(m, 1H, H2S), 4.34 (dd, 1H, J = 8.5, 5.5 Hz, Hα Pro), 4.50 (t, 1H, J = 5.5 Hz, Hα Ser), 4.56
– 4.62 (m, 1H, Hα Ala), 4.65 (t, 1H, J = 5.2 Hz, Hα Ser-S), 4.86 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S).
13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 15.5 (CH3 Ala), 22.1 (2 CH3CO), 24.7 (Cγ Pro), 29.5
(Cβ Pro), 42.5(CGly), 47.5 (Cα Ala), 47.7 (C2S), 55.2 (Cα Ser-S), 55.3 (Cα Ser-S), 60.3 (Cα Pro),
61.1 (2Cβ Ser), 66.8 (C6S), 67.7 (C3S), 68.5 (C4S), 71.3 (C5S), 97.7 (C1S), 170.5, 171.8,
172.6, 174.4, 174.9, 177.0 (6 CO)
6. Anexo:
Espectros de Resonancia
Magnética Nuclear
65 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
A continuación se presentan los espectros de RMN mono y
bidimensionales de los productos 1 – 4.
Los espectros de 1H,
13C, COSY y HSQC fueron tratados y representados
con el software MestreNova (5.2), a partir de los archivos fid y ser obtenidos del
espectrómetro Bruker Avance- 400 MHz.
66 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13C RMN 100 MHz en D2O
1.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.8f1 (ppm)
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
15.4
18.8
21.7
24.6
29.5
30.2
42.5
47.8
55.4
58.9
60.3
61.0
66.9
171.2
171.9
172.2
172.8
174.9
177.0
67 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
0.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6f2 (ppm)
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
f1 (ppm)
68 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13C RMN 100 MHz en D2O
1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.0f1 (ppm)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
15.4
21.6
24.6
29.5
42.5
47.7
47.7
55.3
55.4
60.3
61.0
170.9
171.9
172.8
174.9
176.9
69 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
f1 (ppm)
f1 (ppm)
70 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13C RMN 100 MHz en D2O
3.00
2.95
9.37
1.02
1.27
3.07
7.40
0.81
1.94
2.18
1.41
0.54
1.26
1.28
1.37
1.39
1.94
1.96
1.97
1.99
2.28
2.30
2.32
2.33
2.35
3.68
3.69
3.70
3.72
3.73
3.75
3.76
3.77
3.77
3.78
3.79
3.80
3.81
3.87
3.88
3.89
3.91
3.92
3.94
3.97
3.98
4.01
4.03
4.05
4.09
4.10
4.12
4.13
4.36
4.37
4.38
4.39
4.58
4.58
4.59
4.65
4.66
4.92
4.93
18.0
20.8
24.2
24.8
27.2
32.1
32.8
45.0
50.1
50.2
52.2
57.7
59.8
62.6
63.7
63.9
70.6
71.1
73.9
77.7
101.1
173.3
174.3
174.9
175.1
176.4
177.4
179.5
N
OH2N
O
O
HN
OO
NH
HOO
HN
AcHN
O
OH
HO
AcHN
3
HO
3
71 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
f1 (ppm)
f1 (ppm)
72 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
1H RMN 400 MHz en D2O
13C RMN 100 MHz en D2O
1.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.2f1 (ppm)
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
15.5
21.7
22.1
24.7
29.5
42.5
47.7
49.7
53.2
55.3
60.3
61.1
61.2
66.8
67.7
68.5
71.3
97.7
170.5
171.8
172.6
174.4
174.9
177.0
73 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
COSY en D2O
HSQC en D2O
f1 (ppm)
f1 (ppm)