Trabajo Grupal de Inmuno

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PRUEBAS SEROLOGICAS DE APOYO EN EL DIAGNOSTICO INMUNOLOGICO IMNUMOLOGIA Dr. Cesar Cevallos Columbus ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL BIOLOGIA - MICROBIOLOGIA INTEGRANTES: ANA SARAIH CARI FLORES 2008-32413 DIEGO ARMANDO ROJAS MEZA 2010-35471 GABRIELA GAVANCHO PAREDES 2009-34003 UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GRHOMANN

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PRUEBAS SEROLOGICAS DE APOYO EN EL DIAGNOSTICO

INMUNOLOGICO

IMNUMOLOGIA

Dr. Cesar Cevallos Columbus

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL BIOLOGIA - MICROBIOLOGIA

INTEGRANTES:

ANA SARAIH CARI FLORES 2008-32413 DIEGO ARMANDO ROJAS MEZA 2010-35471 GABRIELA GAVANCHO PAREDES 2009-34003

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GRHOMANN

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INDICE

1. INTRODUCCION………………………………………………………….………….. 2

2. Determinación de hormona gonadotropina coriónica………………………. 3Introducción 3Propiedades inmunoquímicas de la HGC 3La HGC en el embarazo 3Detección y cuantificación de HGC 4Pruebas de aglutinación para HGC 5Técnicas radioinmunes e inmunoenzimáticas 6Procedimiento 8Recomendaciones 8Interpretacion 8

3. Determinación de proteína C-reactiva (CRP)…………………………………. 4 Fundamento del método 10Muestras 10Procedimiento 10Lectura 11Utilidad clínica 11Monitoreo de la terapia 12Significado clínico 12Interferencias preanaliticas 13Interferencias por fármacos 13Resumiendo 13

4. Tipificación de grupos sanguíneos……………….……………………………. 14Determinación del grupo sanguíneo 14Determinación del sistema rh 19

5. Prueba de Coombs: Prueba directa e indirecta 21Fundamento aplicaciones 21Composicion de los reactivos 21Preparacion de los reactivos 21Almacenamiento y estabilidad 22Muestras 22Equipo adicional 22Reactivos adicionales 23Tecnica 23Control de calidad 24Notas 24Limitaciones del procedimiento 25

6. CONCLUSIONES……………………………….…………………………………….. 267. BIBLIOGRAFIA…………………………….………………………………………….. 27

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INTRODUCCION

En el presente trabajo daremos a conocer las pruebas serológicas de apoyo diagnóstico inmunológico entre estos:

Determinación de hormona gonadotropina coriónica. Determinación de proteína C-reactiva (CRP). Tipificación de grupos sanguíneos. Prueba de Coombs: Prueba directa e indirecta.

Teniendo en cuenta los fundamento de estas técnicas, su importancia en la inmunología y el procedimiento que se debe seguir en cada una de estas.Así como la aplicación que se da en el diagnóstico de serologico, los reactivos que se usan y los protocolos que se siguen en cada uno.

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I. DETERMINACION DE HORMONA GONADOTROPINA CORIONICA1) Introducción

La gonadotropina coriónica (HGC) es una hormona producida por las células trofoblásticas del blastocisto en desarrollo, y más tarde por el corion y la placenta, durante el embarazo. Esta hormona normalmente es sintetizada por el organismo en pequeñas cantidades, incrementándose en el embarazo para estimular al cuerpo lúteo, evitando que degenere, y estimulando la producción de esteroides (progesterona y otros) que mantienen el embarazo.

2) Propiedades inmunoquímicas de la HGCLa HGC es una glicoproteína de 38 kDa, compuesta por dos subunidades (α y β) unidas no covalentemente. La subunidad α consta de 96 aminoácidos, y su secuencia es idéntica tanto en esta hormona, como en la hormona luteinizante (LH), hormona estimulantedel folículo (FSH) y hormona estimulante de la tiroides (TSH). La cadena β, sin embargo, esespecífica para cada una de estas hormonas, a pesar de su alta homología (Kikuchi et al., 1994). Por ejemplo, las cadenas β de la HGC y LH poseen 94 (85%) de los primeros 110 aminoácidos de su secuencia en común. La β-HGC posee 145 aminoácidos (mientras que laβ-HL posee 121), por lo que últimos 24 residuos del extremo C-terminal no están presentes en la β-HL. Esta región C-terminal permite la preparación de anticuerpos que reconocen selectivamente a la HGC, tanto policlonales como monoclonales. En la actualidad, estos últimos han dado lugar a técnicas más sensibles y específicas que las disponibles hace algunos años.

3) La HGC en el embarazoLos niveles de HGC se incrementan rápidamente después de la primera semana de gestación, con un pico máximo entre la 7a y 10a semana, disminuyendo alrededor de la 12ª semana hasta alcanzar niveles bajos después de la 16a semana que se mantienen hasta el final del embarazo. Durante el primer trimestre, los niveles de HGC correlacionan con el progreso gestacional, lo cual es de ayuda para el seguimiento del desarrollo del feto y para detectar casos de hipofunción placentaria, que pueden sugerir un embarazo ectópico o una amenaza de aborto. En el segundo trimestre, la relación entre la HGC y el crecimiento fetal se pierde, por lo tanto la cuantificación de esta hormona no es un buen indicador del desarrollo gestacional, ya que puede ocurrir incluso muerte fetal in utero, sin afectar considerablemente los niveles de HGC. Otras hormonas como la progesterona, estrógenos y sus metabolitos (pregnandiol, estriol) pueden evaluar mejor el desarrollo del feto, sobre todo durante el último trimestre.

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Es importante tener en cuenta que existen procesos patológicos que pueden inducir incrementos de HGC y que podrían ser confundidos con un embarazo. Estos incluyen algunas neoplasias (teratomas de ovario, corioepitelioma), eclampsia, enfermedades del tejido trofoblástico, polihidramios y mola hidatiforme. La mayoría de estos estados pueden ser diferenciados de un embarazo normal realizando curvas de seguimiento de los niveles de HGC, en cuyo caso se observarán curvas con fluctuaciones irregulares o anormales. Una única determinación aislada no es suficiente para predecir el desarrollo gestacional. En el hombre, el carcinoma testicular también puede causar una elevación del nivel de HGC.

Niveles de hormona gonadotropina coriónica durante el embarazo. El trazo representa el promedio, con una amplia franja de variación biológica.

4) Detección y cuantificación de HGCLos primeros métodos empleados para detectar la HGC fueron los bioensayos. Por ejemplo, la prueba de Ascheim-Zandek (que data de 1928) utilizaba ratas inmaduras, a las cuales se les inyectaba orina y se observaba si había hiperemia en los ovarios. En la prueba de Friedman (1931) se inyectaba orina por vía intravenosa en conejas adultas para observar si ocurría ovulación precoz. La prueba de Galli-Mainini (1947) empleaba sapos machos adultos (Bufo marinus) inyectándoles orina por vía intraperitoneal, y observando la aparición de espermatorrea. Estos bioensayos fueron pronto reemplazados por técnicas inmunológicas, de mayor reproducibilidad, sensibilidad, y simplicidad. Las principales técnicas utilizadas son las de aglutinación (inhibición y reversa), técnicas radioinmunes, inmunocromatográficas e inmunoenzimáticas. En especial, estas últimas se han adaptado muy bien al trabajo con analizadores automatizados.

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5) Pruebas de aglutinación para HGCLos métodos manuales más utilizados, sobretodo en laboratorios pequeños, se basan en técnicas de aglutinación reversa y de inhibición de la aglutinación. Actualmente también han tenido gran auge los métodos inmunocromatográficos e inmunoenzimáticos de uso popular (sin recurrir al laboratorio), utilizando formatos sencillos. Sin embargo, es importante mencionar la gran heterogeneidad que se ha demostrado entre este tipo de productos, en términos de su calidad, eficiencia y control.Las técnicas de aglutinación reversa emplean un medio de soporte particulado (látex) recubierto generalmente con anticuerpos monoclonales anti-βHGC. Al mezclar el látex con una muestra de orina que contiene la hormona, ocurrirá una aglutinación pasiva de laspartículas. Estas técnicas de aglutinación reversa pueden ser afectadas por un exceso de hormona en la muestra (fenómeno de post-zona), en cuyo caso se debe diluir la muestra.Por otra parte, las técnicas de inhibición de la aglutinación tienden a tener una mayor sensibilidad física, y además, no se ven afectadas por un exceso de antígeno (HGC) en las muestras. En estas técnicas, se dispone de partículas de látex recubiertas con HGC, y por otro lado, de anticuerpos anti-HGC (monoclonal o policlonales) en solución.Las partículas aglutinan al ser mezcladas con el anti-HGC. Pero, si se agrega al sistema una muestra que contiene antígeno libre (HGC en la orina), la aglutinación se inhibe, ya que los anticuerpos se unirán a la hormona presente en la muestra, por un fenómeno de competencia.De esta forma, la aglutinación de las partículas refleja la ausencia de la hormona, y viceversa, la no-aglutinación significa presencia de la hormona. Debe notarse que la interpretación de la lectura de ambas pruebas (reversa e inhibición), es radicalmente diferente.Existen diversas formas de reactivos comerciales basados en inhibición de la aglutinación. Por un lado, están las pruebas rápidas en lámina, de lectura en 2 min. Estas utilizan por lo general partículas de látex recubiertas con HGC y poseen una sensibilidad de 0,5-2,0 UI/ml (según el tipo de anticuerpos en que se basen, y otros factores). Por otra parte, están las pruebas en tubo (o en placas de microaglutinación), que utilizan eritrocitos recubiertos con HGC. Estas son por lo general un poco más sensibles (0,1-0,5 UI/ml), pero con un tiempo de lectura mayor, hasta de 2 horas. En sus inicios, los reactivos comerciales detectaban la HGC completa (mediante anticuerpos policlonales contra ambas subunidades).Actualmente, la mayoría de los reactivos utilizan algún anticuerpo monoclonal contra la subunidad β.Las pruebas en lámina y en tubo no están diseñadas para cuantificar los niveles de HGC en orina. Sin embargo, conociendo la sensibilidad del método

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y el título de la hormona en la muestra, es posible obtener una estimación de la concentración de HGC en orina, en UI/ml, multiplicando: (título de hormona en orina) x (sensibilidad del método). Por lo general este análisis se realiza en muestras de orina de 24 horas, con el fin de uniformar valores y obviar las diferencias por variaciones de concentración en muestras aisladas de orina. En estos casos el resultado se expresa en UI/24 horas, calculado de la siguiente manera: (título de HGC) x (sensibilidad del método) x (ml de orina en 24 horas).

Fundamento de la inhibición de la aglutinación. Una muestra negativa para el antígeno a determinar (HGC), va a resultar en una lectura de aglutinación del

látex-hormona. Unamuestra positiva para el antígeno inhibirá la aglutinación, al interaccionar los anticuerpos con elantígeno libre.

6) Técnicas radioinmunes e inmunoenzimáticasEn estas se utilizan radioisótopos o enzimas como marcadores, respectivamente. Su sensibilidad física es mucho mayor, llegando hasta el ámbito de los picogramos (10-12 g), lo cual permite utilizar incluso suero para realizar la determinación (Cuadro 16.1). Existen muchas variantes disponibles, siendo los reactivos inmunoenzimáticos los que han ganado más terreno. Como se mencionó, su simplicidad los ha llevado hasta el punto de ser utilizados en pruebas que están a disposición del público general, en algunos países, como prueba preliminar a la visita formal a un laboratorio. La alta sensibilidad de las técnicas basadas en marcaje permite diagnosticar un embarazo aún antes de la falta de menstruación.

Es importante tener presente que todas las técnicas descritas determinan la presencia de HGC y no necesariamente la existencia de un feto. En caso de un resultado negativo, si la sospecha de embarazo continúa, se debe repetir la determinación unos días después, ya que en una etapa muy temprana del embarazo los niveles de HGC pueden estar aún muy bajos.

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Un cuidado particular de la mayoría de técnicas para la detección de la HGC que utilizan suero, es el efecto que pueden causar los altos niveles de factores reumatoides o de anticuerpos heterófilos en las muestras. Estos anticuerpos pueden entrelazar, como si fueran la hormona, a los anticuerpos de captura y detección. De este modo pueden ocasionar un resultado falsamente positivo. La detección de HGC, en mujeres que no presentan embarazo, es un importante signo de alerta para tumores, y se han documentado casos drásticos de terapia antitumoral en mujeres que mostraban resultados a los postres falsos en esta determinación.

Valores de referencia de HGC en suero, mediante radioinmunoensayo (RIA).

Comparación de métodos para la determinación de HGC.

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7) Procedimiento

I. Detección de HGC por inhibición de la aglutinación en lámina (látex).1. Recoger una muestra de orina, preferiblemente la primera de la mañana,

en un recipiente limpio de vidrio o plástico. Mantener en refrigeración (hasta por 24 hr) o congelar para plazos mayores. Para determinaciones cuantitativas se debe obtener orina de 24 hr. Si la muestra es turbia se debe centrifugar o filtrar.

2. Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Estos consisten en látex recubierto con HGC y una solución de anti-HGC (policlonal o monoclonal).

3. En una lámina de fondo oscuro limpia, colocar 1 gota del anti-HGC, luego agregar 2 gotas de la muestra y mezclar. Correr siempre un control positivo y un control negativo.

4. Agregar 1 gota del látex, previamente homogenizado. Mezclar lentamente por 2 min y leer por aglutinación.

II.Detección de HGC por inhibición de la hemaglutinación en placas de 96 hoyos.

1. Preparar la muestra cómo se describió para la prueba anterior.2. Asignar un hoyo (fondo en "U") para cada muestra, así como para los

controles (-) y (+) en una placa para aglutinaciones.3. Agregar 25 μl del anti-HGC a cada hoyo. Luego agregar 100 μl de

cada muestra y de los controles.4. Agregar 50 μl de la suspensión de eritrocitos sensibilizados con HGC

(previamente homogenizada). Mezclar suavemente, y dejar en reposo durante 2 hr. Evitar perturbaciones mecánicas durante la incubación.

5. Leer por hemaglutinación, observando los patrones de sedimentación de las células. Un botón o punto en el fondo indica la ausencia de aglutinación, mientras un tapete extendido de células indica aglutinación.

8) RECOMENDACIONES1. Los residuos de orinas anteriores falsearan la prueba.2. Tubos diferentes a los apropiados distorsionan la lectura3. No deben mezclarse los goteros o tocar con ellos los tubos de ensayo.4. Los reactivos deben agregarse en el orden establecido.

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9) INTERPRETACIONPara la lectura se interpretan los esquemas celulares en el fondo del tubo de ensayoPrueba positiva = un botón claramente definidoPrueba negativa = un tapiz difuso de células

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II. DETERMINACION DE PROTEINA C-REACTICA (CRP)

A. Fundamento del métodoLa proteína c reactiva sérica con 6 mg/L  o concentraciones más elevadas, provoca una aglutinación  de las partículas de látex recubiertas con anti-proteína C reactiva.Características diagnósticasLa PCR sintetizada en el hígado, en respuesta a factores liberadores y por los adipocitos; pertenece a la familia de las pentraxinas. Es  uno de los reactantes de fase aguda más sensibles. La PCR activa la vía clásica del complemento en respuesta  a la reacción inflamatoria.El rol fisiológico de esta proteína es unirse a la fosfocolina expresada en la superficie de las células moribundas o muertas, y algunos tipos de bacterias, con el fin de activar el sistema del complemento C1Q.Los niveles en plasma aumentan enormemente en infarto de miocardio, estrés, traumatismos, infecciones, inflamaciones, intervenciones quirúrgicas y en procesos neoplásicos. El aumento de la PCR de hasta 2000 veces superior  al normal se produce en las primeras 24-48 horas, aunque dicho aumento no es especifico.Este incremento se debe a un aumento de la concentración plasmática de IL-6 , que es producida por los macrófagos, células endoteliales y  linfocitos T, como también lo hacen los adipocitos.El diagnóstico clínico no debe realizarse en base a un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

B. Muestras Suero recogido mediante procedimiento estándar. La PCR es estable 7 días a 2-8° C.

C. Procedimiento1.      Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.2.      Depositar 50 µL de la muestra a ensayar y una gota de control en

círculos separados de la tarjeta visualizadora.3.      Homogeneizar el reactivo con suavidad antes del ensayo, mantener vial

del reactivo en posición vertical y añadir a cada círculo una gota del reactivo próxima a la muestra analizar.

4.     Mezclar con la ayuda de un palillo desechable, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.

5.      Agitar la tarjeta a 100 r.p.m. durante 2 minutos.

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D. Lectura

Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación dentro del minuto siguiente a la parada del agitador.Resultados positivos: la presencia de aglutinación indica una concentración de PCR en el suero igual o superior a 6 mg/L .Los   sueros positivos pueden titularse. Para la titulación, realizar diluciones dobles en NaCl  9 g/L. se define el titulo como la dilución mayor que da resultado positivo. La concentración aproximada de PCR puede obtenerse multiplicando el título obtenido por 6mg/L.Resultados negativos: la  ausencia de aglutinación indica un contenido de PCR en el suero inferior a 6 mg/L.

E. Utilidad clínica· Evaluación: su determinación es una medida de un proceso inflamatorio,

injuria aguda, Infección bacteriana o inflamatoria como la fiebre reumática y la artritis reumatoide en fase aguda. Es una prueba inespecífica.

· Se usa como prueba rápida ante la presunción de infección bacteriana (PCR alta) contra infección vírica (PCR baja). Sensible a la activación de neutrófilos.

· Es útil en detección de infecciones ocultas, particularmente, en leucemias y en pacientes luego de una operación.

· La PCR reacciona con el polisacárido de los neumococos, con DNA, nucleótidos, lípidos y otros polisacáridos.

· Se usa de forma semejante a la eritrosedimentación, pero es más sensible, es un indicador de respuesta mejor que la eritrosedimentación. Indica la intensidad de la enfermedad.

· Evaluación: la PCR puede usarse para la detección temprana de infecciones post operatoria.

· Diagnóstico diferencial de apendicitis y enfermedad pelviana inflamatoria aguda.

· De enfermedad de Crohn (PCR alta) de colitis ulcerosa (PCR baja). De artritis reumatoide (PCR alta) de lupus eritematoso sistémico no complicado (PCR baja).

· Evaluación: es útil en proyectar la severidad de la pancreatitis, junto con la proteína amiloide A del suero.

· Screening para distinguir pielonefritis de hidronefrosis no complicada.

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F. Monitoreo de la terapia:Seguimiento del tratamiento con agentes antiinflamatorios (luego del tratamiento, la PCR se normaliza antes que la eritrosedimentación). En la fiebre reumática su nivel es elevado durante la Fase aguda y desciende a niveles normales con el tratamiento adecuado. En la mayoría de los pacientes con artritis reumatoide activa, los niveles de PCR están elevados y aunque disminuyen con la terapéutica, puede ocurrir que los valores normales no se recuperen. Para evaluar pacientes con artritis es preferible la medición en suero que en líquido sinovial.Una elevada concentración de PCR en suero carece de valor diagnóstico fuera del contexto clínico del paciente. La concentración de esta proteína aumenta de forma muy rápida en las enfermedades inflamatorias, incluso pocas horas de haberse iniciado alcanza un máximo en los primeros días y decrece hasta niveles no detectables al cabo de unos 10 días.Esta prueba detecta casos de pacientes con fiebre reumática y artritis reumatoidea.

G. Significado clínico:

La proteína C reactiva es positiva en las siguientes situaciones:· Fiebre reumática· Artritis reumatoide· Infarto al miocardio· Cáncer activo o diseminado· En el postoperatorio no complicado disminuye después del cuarto día de postoperatorio.· * Otras enfermedades autoinmunes (Síndrome de Reiter, Enfermedad de Crohn, vasculitis,LED, etc.)· Infarto pulmonar· Problemas de rechazo de trasplantes· Traumatismos· Infecciones bacterianas· Enfermedad maligna, enfermedad de Hodking, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica, gamapatía monoclonal de origen indeterminado (MGUS),trombocitosis ,depresión, poliarteritis nodosa, infección por virus sincitial respiratorio, neumonía bacteriana, infección por Mycoplasma pneumoniae, neumonía atípica, fluorosis, apendicitis aguda, colitis ulcerosa, Enterocolitis, diverticulitis, pancreatitis aguda.

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H. Interferencias preanaliticasAumentada: Trauma, cirugía, neonatos, embarazo, trabajo de parto, trasplante renal, hemodiálisis, endotoxinas, ejercicio; fumadores, altitud. En personas de edad avanzada.             Disminuida: alcoholFalsos positivos: los sueros con alta concentración de factor reumatoideo pueden elevar falsamente los títulos de PCR, por reacción inespecíficas. Muestras a menos 20°c afectan los resultados.

I. Interferencias por fármacosAumentado: Estrógenos, anticonceptivos orales (efecto de los estrógenos).Disminuido: anticonceptivos orales (efecto de la progesterona), antibióticos, budenosida, dexametasona, dopexamina, genfibracil, lefluonomide, metrotexato, antiflamatorios no esteroides, penicilamina, pentopril, prednisolona, prednisona, prinonide, sulfasalazona.

J. Resumiendo o Confirma presencia de patología aguda (infección, infarto de miocardio,

trombosis venosa profunda)o sugiere presencia de enfermedades crónicas (artritis reumatoidea,

enfermedades del tejido conectivo)o Puede predecir la probabilidad de infarto de miocardio, accidente

cerebro vascular (ACV), angina de pecho.o Puede diferenciar colitis ulcerosa de enfermedad de crohn.

o Detecta complicaciones infecciosas post operatorias

o Diagnósticos y monitoreo de infecciones cuando las pruebas son muy

lentas y/o imposibles.o Rápida identificación de infecciones en pacientes de alto riesgo,

neonatos, inmunosuprimidos y trasplantes de médula ósea.o Diferenciación entre infección febril bacteriana y viral.

o Puede monitorear la terapia con antibióticos.

o Indica presencia de infección como consecuencia de la ruptura de

membranas.

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III. TIPIFICACION DE GRUPOS SANGUINEOS

1.1 Determinación del grupo sanguíneo

1.1.1 Definición

Es un método para decirle cuál es el tipo específico de sangre que usted tiene. El tipo de sangre que usted tenga depende de si hay o no ciertas proteínas, llamadas antígenos, en sus glóbulos rojos.

La sangre a menudo se clasifica de acuerdo con el sistema de tipificación ABO. Este método separa los tipos de sangre en cuatro categorías:

Tipo A

Tipo B

Tipo AB

Tipo O

Su tipo de sangre (o grupo sanguíneo) depende de los tipos que haya heredado de sus padres.

1.1.2 Nombres alternativos

Determinación del grupo sanguíneo ABO (hemoclasificación); Pruebas cruzadas; Determinación del Rh.

1.1.3 Forma en que se realiza el examen

La sangre se extrae de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca una banda elástica alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presión y hacer que las venas se llenen de sangre.

Luego, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulación y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado.

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En los bebés o niños pequeños, el área se limpia con un antiséptico y se punza con una aguja o lanceta puntiaguda. La sangre se puede recoger en una pipeta (tubo pequeño de vidrio), en una lámina portaobjetos, en una tirilla de examen o en un recipiente pequeño. Finalmente, se puede aplicar un vendaje en el sitio de la punción si hay algún sangrado.

El examen para determinar el grupo sanguíneo se denomina sistema o tipificación ABO. Su sangre se mezcla con anticuerpos contra sangre tipo A y tipo B, y la muestra se revisa para ver si los glóbulos sanguíneos se pegan o aglutinan. Si dichos glóbulos se aglutinan, eso significa que la sangre reaccionó con uno de los anticuerpos.

El segundo paso se llama tipificación o prueba inversa. La parte líquida de la sangre sin células (suero) se mezcla con sangre que se sabe que pertenece al tipo A o al tipo B. Las personas con sangre tipo A tienen anticuerpos anti-B y las que tienen sangre tipo B tienen anticuerpos anti-A. El tipo de sangre O contiene ambos tipos de anticuerpos. Estos dos pasos pueden determinar con precisión el tipo de sangre de una persona.

La determinación del grupo sanguíneo también se hace para decir si usted tiene o no una sustancia llamada factor Rh en la superficie de los glóbulos rojos. Si uno tiene la sustancia se considera Rh+ (positivo) y los que no la tienen Rh- (negativo). La tipificación del Rh utiliza un método similar al sistema ABO.

1.1.4 Preparación para el examen

No se necesita preparación especial para este examen.

1.1.5 Lo que se siente durante el examen

Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación punzante. Posteriormente, puede haber una sensación pulsátil o una contusión en el sitio donde se insertó la aguja.

1.1.6 Razones por las que se realiza el examen

Este examen se hace para determinar el tipo de sangre de una persona. Los médicos necesitarán conocer su tipo de sangre cuando

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le vayan a hacer una transfusión de sangre o un trasplante, debido a que no todos los tipos de sangre son compatibles entre sí. Por ejemplo:

Si usted tiene sangre tipo A, únicamente puede recibir sangre tipo A y tipo O.

Si usted tiene sangre tipo B, únicamente puede recibir sangre tipo B y tipo O.

Si usted tiene sangre tipo AB, puede recibir sangre tipo A, B, AB y O.

Si usted tiene sangre tipo O, únicamente puede recibir sangre tipo O.

La sangre tipo O se le puede dar a alguien con cualquier tipo de sangre, razón por la cual las personas con este tipo de personas son llamadas donantes de sangre universales.

La determinación del grupo sanguíneo es especialmente importante durante el embarazo. Si se detecta que la madre tiene sangre Rh negativa, entonces el padre también debe ser evaluado. Si el padre tiene sangre Rh positiva, entonces la madre necesita recibir un tratamiento para ayudar a prevenir el desarrollo de sustancias que le pueden hacer daño al feto. Ver: incompatibilidad Rh

Si usted es Rh+, puede recibir sangre Rh+ o Rh-, pero si es Rh-, únicamente puede recibir sangre Rh-.

1.1.7 Valores normales

Tipificación ABO:

Si sus glóbulos sanguíneos se pegan o aglutinan al mezclarse con:

Suero anti-A, usted tiene sangre tipo A.

Suero anti-B, usted tiene sangre tipo B.

Sueros anti-A y anti-B, entonces usted tiene sangre tipo AB.

Si los glóbulos sanguíneos no se pegan o aglutinan cuando se agrega suero anti-A y anti-B, usted tiene sangre tipo O.

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Prueba inversa:

Si la sangre se aglutina únicamente cuando se agregan células B a la muestra, usted tiene sangre tipo A.

Si la sangre se aglutina únicamente cuando se agregan células A a la muestra, usted tiene sangre tipo B.

Si la sangre se aglutina cuando se agregan cualquiera de los tipos de células a la muestra, usted tiene sangre tipo O.

La falta de aglutinación de los glóbulos sanguíneos cuando la muestra se mezcla con ambos tipos de sangre indica que usted tiene sangre tipo AB.

Tipificación del Rh:

Si los glóbulos sanguíneos se pegan o aglutinan al mezclarlos con suero anti-Rh, usted tiene sangre de tipo Rh positivo.

Si la sangre no coagula al mezclarse con suero anti-Rh, usted tiene sangre de tipo Rh negativo.

1.1.8 Cuáles son los riesgos

Los riesgos asociados con la toma de una muestra de sangre pueden ser:

Desmayo o sensación de mareo

Punciones múltiples para localizar las venas

Sangrado excesivo

Hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel) Infección (un riesgo leve en cualquier momento que se

presente ruptura de la piel)

1.1.9 Consideraciones especiales

Existen muchos antígenos además de los mayores (A, B y Rh). Muchos antígenos menores no se detectan rutinariamente durante la determinación del grupo sanguíneo. Si no se detectan, usted puede

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aún experimentar una reacción al recibir ciertos tipos de sangre, incluso si los antígenos A, B y Rh son compatibles.

Un proceso llamado pruebas cruzadas, seguido de una prueba de Coombs, puede ayudar a detectar estos antígenos menores y se realiza de manera rutinaria antes de las transfusiones, excepto en situaciones de emergencia.

1.1.10 Determinación del sistema AB0

Material1.- sangre total2.- suero anti-A3.- suero anti-B4.- suero anti-A1Portaobjetos

Método. Prueba en porta- Extraemos una muestra de sangre mediante una jeringa con

anticoagulante (citrato sódico).- Preparamos dos portaobjetos con solución de anticuerpos: una

marcado con la letra A (citrato anti-A) y el otro marcado con la letra B (presenta anticuerpos anti B)

- Pipeteamos una gota en el centro de la solución de anticuerpos de cada muestra aplicada posteriormente.

- Mezclamos con cuidado mediante una punta y observamos los resultados: si hay agregación se formarán pequeños grumos; indicador que la sangre de nuestra muestra presenta un grupo sanguíneo A (si hay agregación en el portaobjetos A), B (si hay agregación en el portaobjetos B) y AB (si hay agregación en ambos).

Interpretación de los resultados• La sangre problema es del grupo A si aglutina a los 3 minutos con

el suero anti A y no aglutina con el suero anti-B.• La sangre problema es del grupo B si aglutina a los 3 minutos con

el suero anti B y no aglutina con el suero anti-A.• La sangre problema es del grupo AB si aglutina con el suero anti A

y con el suero anti B.• La sangre problema es del grupo 0 si no aglutina ni con el suero

anti A ni con el suero anti-B.

Compatibilidades transfusionales del grupo AB0

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• Un individuo del grupo A es receptor de sangre del grupo A y 0 y donante para individuos del grupo A y grupo AB.

• Un individuo del grupo B es receptor de sangre del grupo B y 0 y donante para individuos del grupo B y grupo AB.

• Un individuo de grupo AB es receptor de sangre del grupo A, de sangre del grupo B y del grupo 0 y donante sólo para individuos del grupo AB.

• Un individuo del grupo 0 es receptor sólo de sangre del grupo 0 y donante para individuos de todos los grupos. (Donante universal).

1.2 Determinación del sistema RhEl sistema Rh es un sistema muy complejo donde pueden aparecer diferentes Ag: D, C, E, c, e.Una sangre se considera Rh+ si presenta el Ag D, y se considera Rh- si no presenta el Ag D.Además, en algunos de estos Ag se han encontrado variedades antigénicas, siendo el de mayor interés el Du, también llamado Rh positivo débil. Es importante tipificar este Ag y no confundir la sangre con un Rh - (Prueba de Coombs).De todos estos antígenos, el que presenta mayor capacidad antigénica es el D, por lo que en la determinación rutinaria del Rh sólo se investiga el Ag D.Material

La técnica es igual que para la determinación del grupo sanguíneo, sólo que en este caso usaremos suero anti-D.

Método- Extraemos una muestra de sangre mediante una jeringa con

anticoagulante (citrato sódico).- Preparamos un portaobjetos con solución de anti- D.- Pipeteamos una gota de la muestra en el centro de la solución de

anticuerpos aplicada posteriormente.- Mezclamos con cuidado mediante una punta y observamos los

resultados: si hay agregación se formarán pequeños grumos; indicador que la sangre de nuestra muestra presenta un grupo sanguíneo Rh +.

Interpretación de los resultados

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• La sangre problema es del grupo Rh+ si aglutina a los 3 minutos con el suero anti-D.

• La sangre problema es del grupo Rh- si no aglutina a los 3 minutos con el suero anti-D.

Compatibilidades transfusionales del grupo AB0.-• Un individuo del grupo Rh + es receptor de sangre del grupo Rh + y del

grupo Rh-.• Un individuo del grupo Rh- es receptor de sangre del grupo Rh- y no del

grupo Rh+.

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VI. PRUEBA DE COOMBS: PRUEBA DIRECTA E INDIRECTA

A. FUNDAMENTO

La prueba de la antiglobulina o prueba de Coombs, permite la detección e identificación de globulinas ligadas inmunológicamente a los hematíes.

La adición del reactivo antiglobulina a los mismos ocasionará su aglutinación.

B. APLICACIONES Prueba de Coombs Indirecto

- Detección de anticuerpos irregulares

- Pruebas de compatibilidad

- Determinación de fenotipos

- Identificación y titulación de anticuerpos

Prueba de Coombs Directo

- Enfermedad hemolítica del recién nacido

- Anemia hemolítica autoinmune

- Reacción hemolítica post-transfusional

C. COMPOSICION DE LOS REACTIVOS

El reactivo de anti-globulina humana es una mezcla de anti-IgG humana policlonal y C3d monoclonal.

El reactivo coloreado verde permite comprobar visualmente la adición del mismo a todos los tubos.

ANTI-HUMAN

GLOBULIN

Suero de conejo anti-IgG humana purificada.

Anticuerpo monoclonal anti-C3d (murino).

Tampón estabilizante. Azida sódica <0,1%. Colorantes: Patent

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Blue y Tartrazine.

Precauciones: Se aconseja manipular los reactivos y las muestras con las precauciones debidas. Usar guantes y ropa protectora.

Aviso: Los reactivos contienen azida sódica. Evitar el contacto con la piel y mucosas.

D. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Los reactivos están listos para su uso.

E. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

1. Todos estos reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen bien cerrados a 2-8ºC y se evita la contaminación durante su uso. No usar los reactivos una vez caducados.

2. No congelar o exponer el reactivo a altas temperaturas. La conservación del producto a temperatura distinta de la recomendada acelera la perdida de reactividad de producto.

3. Estos reactivos deben ser claros y transparentes. La presencia de turbidez puede indicar contaminación microbiana.

4. Descartar el contenido del vial, en caso de turbidez, rotura o pérdida de contenido.

F. MUESTRAS

Las muestras de sangre pueden ser extraídas con o sin anticoagulante. Se debe realizar el ensayo lo antes posible tras su extracción. Conservar las muestras a 2-8ºC.

Ensayar el suero antes de 24 horas, mantenido a 2-8ºC desde la separación del coagulo.

No se debe usar muestras hemolizadas o contaminas.

G.EQUIPO ADICIONAL

- Tubos de vidrio (10x75 mm ó 12x75 mm).

- Pipetas Pasteur.

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- Baño a 37ºC.

- Centrifuga Sero-fuge o similar.

H. REACTIVOS ADICIONALES

- Tampón Fosfato (PBS): 8,5-9,0 g/L NaCl (0,145 mol/L–0,154 mol/L) pH 7,0 ± 0,2 a 22 ± 1ºC.

- Hematíes control: Negativo (hematíes Rh negativos sensibilizados con Anti-D) y Positivo (hematíes Rh positivos sensibilizados con Anti-D débil).

I. TECNICA

I. Test de Coombs Indirecto

1. En un tubo de hemólisis depositar 1 gota de suero problema.2. Añadir 1 gota de suspensión de hematíes lavados (como mínimo 1

vez) al 3% en PBS.3. Mezclar e incubar a 37ºC durante 30-60 minutos.4. Lavar la mezcla 3 veces con abundante PBS.

Lavado (Nota 1): llenar el tubo con PBS (aprox. 4 mL) y centrifugar los hematíes el tiempo adecuado para que sedimenten bien los hematíes, decantar el el sobrenadante. Repetir la operación 2 veces más. Decantar completamente tras el último lavado.

5. Añadir 2 gotas de Anti-globulina humana.6. Mezclar y centrifugar a 1000 f.c.r. durante 20 segundos o por una

fuerza y tiempo equivalentes (Nota 2).

Prueba de Coombs Directo

- Preparar una suspensión de hematíes problema 3% en PBS.- Depositar 1 gota de la suspensión en un tubo de hemólisis.- Proseguir según lo indicado en los apartados 3 al 5 del Test de

Coombs Indirecto.

Lectura (Nota 3)

Golpear suavemente el tubo para desprender el sedimento y examinar la presencia o ausencia de aglutinación.

- Reacción negativa:

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La resuspensión de los hematíes es homogénea.

- Reacción positiva:

Los hematíes positivos permanecen aglutinados una vez resuspendidos.

Interpretación

- Reacción positiva:

La aglutinación de los hematíes problema es indicativa de la presencia de anticuerpos, teniendo en cuenta las limitaciones del procedimiento.

- Reacción negativa: La ausencia de aglutinación de los hematíes problema es indicativa de un resultado negativo, teniendo en cuenta las limitaciones del procedimiento, y confirma la ausencia anticuerpos en los hematíes ensayados.

J. CONTROL DE CALIDAD

Para confirmar la validez de los resultados negativos añadir una gota (50 μL) de hematíes sensibilizados con anti D (Hematíes Control de Coombs), centrifugar y leer en busca de aglutinación (ver Apartado 6 y Lectura de la Prueba en tubo). Si los hematíes no aparecen aglutinados, el ensayo es inválido y debe repetirse.

K. NOTAS

Nota 1. Efectuar el lavado de los hematíes sin interrupción.

Nota 2. Centrifugar y leer los resultados inmediatamente después de la adición de la Anti-globulina. Retrasos en la lectura pueden provocar disociación del complejo antigeno-anticuerpo, dando falsos resultados negativos o reacciones débiles.

Nota 3. Leer los tubos inmediatamente después de su centrifugación.

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L. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

- El lavado inadecuado de los hematíes, la contaminación de los reactivos con trazas de suero, tiempos de incubación y centrifugado incorrectos, mal control de la temperatura e inadecuada conservación u omisión de los reactivos dan reacciones negativas falsas.

- Los hematíes problema, tanto de pacientes como de donantes, con Pruebas Directas positivas darán un falso resultado positivo si se les practica la Prueba de la antiglobulina Indirecta.

- El suero usado no debe ser conservado más de 24 h a 2-8ºC o 1 mes a –20ºC ya que el anti-Complemento puede perder su actividad.

- El reactivo no aglutina los hematíes sensibilizados con fragmentos C4d.

- Ningún test es capaz individualmente de detectar todos los anticuerpos clínicamente significativos.

- El reactivo debe ser usado tal como se suministra, sin diluir y sin adiciones.

- El reactivo ha sido formulado y validado usando tubos de vidrio.

- El uso e interpretación de los resultados debe llevarse a cabo por personal formado y cualificado, de acuerdo con la normativa de cada país.

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IV. CONCLUSIONES

Se logró aprender bibliográficamente las técnicas, su importancia en la inmunología y el procedimiento que se debe seguir en cada una de estas.

Las respuestas inmunitarias contra la mayoría de los antigenos inducen la producción específica de anticuerpos y linfocitos T efectores.

Este reconocimiento entre el antigeno – anticuerpo o linfocito sienta las bases del diagnóstico inmunológico.

El estudio de las inmunoreacciones se realiza mediante el empleo de técnicas inmunológicas basadas en la detección de y evaluación de la respuesta humoral (anticuerpos y complemento) o de base celular (linfocitos T y fagocitos).

Estas pruebas serológicas en inmunología ayudan a Identificación de problemas de salud, determinación de la distribución de una enfermedad, determinación de la incidencia y prevalencia de una enfermedad, evaluación del sistema inmune del individuo o de una población, medición de la inmunidad materna, programación de calendarios de vacunación, evaluación de programas o campañas de vacunación.

V. BIBLIOGRAFIA

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PDF

ARBELAES G., Carlos A.. “SISTEMA DE GRUPO SANGUINEO ABO”. 2009

Ballester Santovenia, Adalberto; de la Campa, Jesús Diego; Pérez Pérez, Mayra. “PRUEBA DE COOMBS”. Manual de Prácticas Médicas - Hospital Hermanos Ameijeiras.

Lomonte, B. (2009) Técnicas de Laboratorio en Inmunología Clínica, 122 pp. Universidad de Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/

SITIOS WEB

http://microjulieth.blogspot.com/2012/04/pruebas-inmun-ologicas-en-el.html

http://averaorg.adam.com/content.aspx?productId=118&pid=5&gid=003345

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