Universidad Latina

Facultad de Ciencias de La Salud Dr. William C. Gorgas

Licenciatura en Tecnología Médica

Curso de Biología Celular y Molecular

ETM- 001

Profesora: Itzel del Carmen Méndez De Gracia

Confección de modelos estructurales de ADN

Y explicación grupal de los mismos

Tema:

Importancia Médica de Técnicas de DNA Recombinante

Primer Cuatrimestre

2 015

Introducción

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificación genética que permite la adición de una nueva secuencia de ADN al organismo, conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos. La producción de una proteína no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas recombinantes.

El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención dentro de la célula. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos.

Índice

1- Generalidades sobre el ADN recombinante2- Procedimientos3- Aplicaciones4- Producción y terapia con proteínas recombinantes

a- Producción en Bacteriasb- Producción en levadurasc- Producción en células de Insectosd- Producción en células de Mamíferos

5- PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE.6- Indicaciones Generales7- Modelos confeccionados en función del material presentado

Procedimiento

El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con la identificación desde un organismo de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto protéico de esa secuencia de ADN. Así se pueden producir cantidades ilimitadas de la proteína codificada por el susodicho gen. En términos simples, el procedimiento consiste en:

Localización de genes y sus funciones.

Clonación del ADN, y su posterior almacenamiento en genes.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Utilización de vectores de expresión.

Aplicaciones

El vector que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren resistencia a antibióticos específicos. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en el campo de la medicina y ha permitido el desarrollo de importantes avances terapéuticos como por ejemplo la producción de insulina recombinante.

Permite además la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgénicos, así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. El uso de ADN recombinantes puede también tener un impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta.

Con el uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes a insectos, hongos, bacterias y herbicidas, con mejores características de calidad durante poscosecha y con alto contenido nutricional. También ha permitido la clonación, expresión y producción mediante esta técnica de diversos antígenos, por ejemplo, la vacuna contra la hepatitis B5 y la vacuna contra el virus del papiloma humano.

Producción y terapia con proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes son aquellas que se producen mediante la técnica del ADN recombinante, es decir, expresando un gen de un organismo en otro organismo distinto. Para que estas proteínas sean útiles desde el punto de vista terapéutico tienen que conservar su actividad. Además, se debe evitar que sean inmunogénicas para el ser humano. Para ello es importante decidir para cada proteína recombinante cual es el organismo de expresión más adecuado.

Producción en bacterias

Estas proteínas recombinantes han intentado expresarse en bacterias como E. coli, ya que son fáciles de mantener, crecen rápido y se conoce bien su genoma. Sin embargo, el mayor problema que presenta la producción en bacterias es que en ellas no existe glicosilación proteica, por lo que algunas proteínas producidas en bacterias pierden totalmente su función. Aun así se han logrado producir con éxito algunas proteínas recombinantes en bacterias. La primera proteína recombinante que se produjo en E. coli fue la somatostatina, una hormona anti-crecimiento de 14 aminoácidos. Sin embargo, aunque desde el punto de vista científico fue un éxito, desde el punto de vista económico fue un fracaso, ya que su utilidad estaba reducida a personas con problemas de gigantismo y similares, que son poco comunes. Posteriormente se logró un gran éxito en este campo mediante la producción de insulina en bacterias. La insulina presenta la ventaja de no necesitar modificaciones postraduccionales, por lo que se evita este problema de su producción en bacterias. Además, la diabetes es una enfermedad muy frecuente en la sociedad, con unos 347 millones de diabéticos.7 En EEUU el 6% de la población (20 millones de habitantes) son diabéticos y esta enfermedad

es la 6ª causa de muerte. Antes de esta producción en bacterias, se usaba insulina porcina.

Producción en levaduras

Al ser células eucariotas y por lo tanto más similares a las humanas que las bacterias y ser muy fáciles de emplear industrialmente, las levaduras constituyen otro grupo de organismos susceptibles de producir proteínas recombinantes para uso humano. Sin embargo, aunque sí presentan glicosilación proteica, al contrario que las bacterias, esta es totalmente distinta a la humana, por lo que estas proteínas presentan problemas, en muchos casos incluso inmunogénicos.

Producción en células de insecto

Más cercanas aún a las células humanas que las levaduras son las de insecto, como las de Spodoptera frugiperda (una polilla parásito del maíz y del algodón), que se cultivan fácilmente in Vitro, aunque el medio de cultivo es caro. Dicho medio, además, no contiene suero, lo que hace más fácil el procesado de la proteína. Otra de las propuestas ha sido el uso no de células de insecto, sino de los insectos completos para la producción de estas proteínas. Para ello se infectan a los insectos con baculovirus modificados (que además no infectan a los seres humanos) para que expresen la proteína recombinante. Sin embargo, este sistema presenta exactamente el mismo problema que el de levaduras: que las células de insecto presentan glicosilación, pero esta es totalmente distinta a la de mamíferos.

Producción en células de mamífero

Al ser células más parecidas a las humanas, el procesamiento que sufren las proteínas recombinantes producidas en células de mamífero también es más similar, por lo que se conserva su función (aunque puede haber ligeros cambios en el patrón de glicosilación). Los inconvenientes de este método es que el crecimiento celular es más lento, tardando de 6 a 24 horas en duplicarse las células, que los

cultivos pueden sufrir contaminación de bacterias u hongos y que se puede contaminar el producto con virus que infecten a humanos. Para la producción en mamíferos se usan las células CHO, de ovario de ratón chino, que presentan la ventaja de que crecen bien y existen gran cantidad de mutantes de glicosilación. Además, se está intentando que los animales secreten estas proteínas en la orina, en la leche, etc.

PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE.

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación.

Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans (Stryer 1995). Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos (Bohinski 1991) y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos (Stryer 1995). Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

La función de las enzimas de restricción es la proteger al organismo de DNA extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado (Smith & Wood 1998).

Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restricción (las más conocidas se muestran en la tabla 1), las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII que se extrae de Haemophilus aegyptius.

Tabla 1: Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción Organismo de donde se extrae

EcoRI Escherichia coli

EcoRII Escherichia coli

HindII Haemophilus influenzae

HindII Haemophilus influenzae

HaeIII Haemophilus aegyptius

HpaII Haemophilus parainfluenzae

PstI Providencia stuartii

SmaI Serratia marcesens

BamI Bacillus amyloliquefaciens

BglII Bacillus globiggi

Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte: (1) corte con extremos cohesivos y (2) corte con extremos romos (ver Fig. 1) (Griffiths et al. 1998). Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados. De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos: las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombinante. Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión. Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.

Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.

Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción (Stryer 1995).

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción (Mateos 2000). Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) (Smith & Wood 1998, Mateos 2000) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio (Griffiths et al. 1998). Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas (Bohinski 1991, Stryer 1995) Fraser (1994), plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli,

Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano (Fraser 1994). Las potenciales aplicaciones en la medicina de estas enzimas podría llevar a curar varias enfermedades, este aspecto se verá a detalle más adelante.

Vectores de clonación.

Una vez que se han aislado los fragmentos de DNA de interés, por medio de enzimas, el siguiente paso es unirlos a un vector de clonación. Los vectores de clonación permiten la unión de los fragmentos de DNA extraño a su propio DNA por medio de sitios de restricción compatibles, sin afectar su replicación, por medio de un proceso de recombinación (Madigan et al. 1998, Moreira & Mendes 1998, Klug & Cummings 1999) El vector es el vehículo que transporta el gen o genes de interés al hospedero, que normalmente es una bacteria o una célula eucariota viva. Una vez dentro la célula, el vector se multiplica produciendo varias copias idénticas del gen que transporta (Moreira & Mendes 1998). Para que un vector sea utilizable en la tecnología de DNA recombinante, debería ser fácilmente recuperable de la célula hospedadora, además de no producir daños.

Actualmente, se usan diferentes tipos de vectores para la producción de DNA recombinante, los principales son los plásmidos, los bacteriófagos, los cósmidos, vectores transbordadores, células eucariotas y cromosomas artificiales, entre otros (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).

Plásmidos.

Los plásmidos (Fig. 2) son moléculas de DNA bicatenario de carácter extracromosómico y tienen la capacidad de replicarse autónomamente. Además de transportar los genes de interés para el investigador, los plásmidos transportan otros genes que le confieren propiedades importantes al hospedador, como ser la resistencia a ciertos antibióticos (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).

Los plásmidos pueden dividirse en dos grupos: plásmidos conjugables y plásmidos no conjugables. Los primeros promueven la conjugación entre bacterias, pasando de una célula a otra, y confiriéndola nuevas características codificadas en su genoma, los otros actúan

principalmente en procesos de transformación. Los plásmidos se clasifican en plásmidos de fertilidad, plásmidos de resistencia, plásmidos col, plásmidos degradativos y plásmidos virulentos (Moreira & Mendes 1998).

La utilización y el diseño de plásmidos para ingeniería genética ha considerado que estos vectores contengan un número limitado de sitios de restricción (puesto que la posición es importante), y además que posean genes de resistencia para varios antibióticos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos usados para la construcción de DNA recombinante (Klug & Cummings 1999). Según Madigan et al. (1998), este plásmido presenta nueve características que lo hacen adecuado como vector de clonación:

1. Es pequeño, sólo tiene 4361 pares de bases.

2. Es estable cuando se encuentra dentro el hospedador.

3. Se pueden producir muchas copias de él, por medio de la inhibición de la síntesis de proteínas.

4. Es fácil de aislar en su forma súper enrollada.

5. Pueden clonar fragmentos insertos relativamente grandes.

6. Se conoce la secuencia completa de bases del mismo.

7. Existen sitios de restricción únicos para las principales endonucleasas.

8. Posee varios genes de resistencia a antibióticos.

9. Es fácil de introducir a los hospedadores.

Fagos y Bacteriófagos.

Los virus más empleados como vectores para DNA recombinante son los bacteriófagos lambda y M13, por su facilidad de incorporar genes de otros individuos a su genoma. La transducción especializada que presentan los fagos lambda hacen que sean usados como vectores, pero en este caso la recombinación se da dentro de la célula hospedadora y no en los tubos de ensayo (Madigan et al. 1998). Esta transducción especial se basa en un proceso de eliminación del grupo génico central del DNA del fago, por medio de enzimas de restricción, y la posterior

inserción y ligamiento del DNA exógeno, para luego proceder al empaquetamiento del virus.

Los fagos lambda silvestres no son útiles como vectores, por lo tanto se deben producir fagos modificados, que contengan el DNA foráneo. El proceso de incorporación de DNA foráneo se muestra en la Figura 3 (Madigan et al. 1998). Los pasos que se deben seguir para la clonación del fago lambda son los siguientes (según Madigan et al. 1998):

1. Aislar el DNA del fago vector y proceder a la digestión por enzimas de restricción.

2. Ligar los fragmentos esenciales del DNA del vector con el DNA foráneo.

3. Empaquetar el DNA híbrido en extractos celulares que contengan las proteínas de la cápside y la cola.

4. Producir la infección del hospedero.

Los fagos M13 son filamentosos (Moreira & Mendes 1998) y se caracterizan por presentar una cadena de DNA simple, la cual se replica dentro el hospedero formado una doble cadena, denominada forma replicativa. Este fago es útil porque resulta sencillo añadir una porción de DNA foráneo a su cadena lineal, mediante el empleo de enzimas de restricción apropiadas. Los vectores M13 también pueden ser usados para la secuenciación de DNA, mediante la elaboración de mapas de restricción, que hacen más fácil la secuenciación del material genético (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999), mediante un proceso previo de replicación del material genético a una estructura de doble hebra, puesto que las enzimas de restricción no son capaces de cortar cadenas simples.

Fig. 3 Pasos a seguir para la incorporación de DNA foráneo a un virus vector (Madigan et al. 1998).

Virus

En la actualidad existen muchos virus conocidos, sin embargo solamente se utilizan dos como vectores para el trasporte de DNA extraño. Esto se debe a que no todos los virus reúnen las condiciones necesarias que permitan insertar en su material genético otros genes y transportarlos hasta el hospedero. En la actualidad se está estudiando a posibilidad de

utilizar otros virus como vectores de clonación, entre ellos están el SV40, algunos adenovirus y algunos baculovirus (Moreira & Mendes 1998).

Se distinguen dos tipos principales de vectores de clonación en virus: los vectores de inserción y los vectores de sustitución. Los vectores de inserción son aquellos en los cuales se elimina una parte de DNA "no esencial" para la inserción de los genes foráneos, mientras que en los vectores de sustitución se reemplazan porciones del DNA "esencial" por medio de la acción enzimática sobre varios sitios de restricción (Moreira & Mendes 1998).

Cósmidos.

Los cósmidos son modernos vectores híbridos que emplean genes específicos del fago lambda: la secuencia cos. Estos vectores se construyen con la secuencia cos más la porción de DNA foráneo insertada en el extremo cohesivo de este fragmento. La porción cos se emplea porque es necesaria para el empaquetamiento del material genético dentro del virión lambda, las secuencias plasmídicas de replicación y la información necesaria para la resistencia a antibióticos (Madigan et al. 1998, Moreira & Mendes 1998, Klug & Cummings 1999).

El DNA foráneo se una con la secuencia cos y penetra en la célula como un virus, pero una vez que está dentro, se comporta como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma del fago lambda se ha eliminado, la porción de DNA foráneo que se puede introducir es mucho mayor (puede transportar hasta 50kb de DNA), lo cual constituye una ventaja frente a los otros vectores que sólo pueden transportar de 5 a 10kb.

Vectores transbordadores.

Otros vectores híbridos modernos, son los vectores transbordadores. Estos provienen de diferentes fuentes, como el virus SV40 y otros plásmidos o virus vegetales y/o animales. Tanto los cósmidos como los vectores transbordadores permiten clonar una mayor cantidad de DNA con un menor número de clones (Madigan et al. 1998). Los vectores transbordadores permiten introducir DNA extraño de hasta 50 kb de tamaño, en contraposición a los virus y plásmidos que están limitados para transportar de 5 a 10 kb únicamente, puesto que una porción de mayor tamaño desestabilizaría todo el genoma (Klug & Cummings 1999).

A menudo, los vectores transbordadores son usados para la investigación de la expresión génica.

Otros vectores.

Además de los vectores vistos anteriormente, existen otros que presentan algunas modificaciones útiles. Estos son los vectores de expresión y los vectores de secreción. Los vectores de expresión son aquellos que se emplean para obtener la síntesis de una proteína codificada por e gen clonado dentro el vector. Los vectores de secreción hacen una tarea similar y además exportan esta proteína fuera de la célula, porque contienen una secuencia señal (Madigan et al. 1998, Smith & Wood 1998).

Otros vectores de gran utilidad son los cromosomas bacterianos artificiales, los cuales son muy útiles para el estudio de cartografía y análisis de genomas eucarióticos complejos. Estos cromosomas bacterianos artificiales poseen los genes de replicación, varias copias del factor F y marcadores para la resistencia a antibióticos, y son capaces de transportar hasta un millón de bases nitrogenadas.

También se han desarrollado vectores a partir de células eucariotas. El más conocido y empleado consiste en un juego de cromosomas artificiales de levadura, los cuales son capaces de albergar segmentos muy grandes de DNA. Estos vectores son capaces de replicarse como si fueran cromosomas normales de levadura y poseen varios sitos de inserción de genes (Pérez–González et al. 1993).

Hospederos para el clonaje de material genético recombinante.

Una vez introducido el DNA foráneo en el vector, es necesario que éste sea incorporado a un sistema vivo para expresar los genes adicionados, la mayoría de las veces. Este hospedero, normalmente es una bacteria o una célula de levadura, aunque también se han introducido vectores de DNA recombinante en organismos eucariotas pluricelulares (Silva, 1999). Un hospedero debe presentar las siguientes características, para que sea considerado apto para la producción de clones de DNA recombinante:

1. Debe tener un crecimiento rápido, para poder observar varias generaciones en poco tiempo.

2. Poder crecer en un medio de cultivo económico, pues de lo contrario representarían costos muy elevados y el número de estudios estaría limitado por problemas económicos.

3. No ser patógeno, por seguridad del investigador y el personal de laboratorio.

4. Tener el mismo origen de replicación que el vector, para que así sea factible la inserción del DNA foráneo que éste transporta.

5. Tener las enzimas adecuadas que permitan la replicación adecuada del vector.

6. Ser un organismo del cual se tenga bastante conocimiento, como E. coli, puesto que mientras más información se tenga será más fácil explicar los fenómenos ocurridos.

Silva (1999) define una tabla (ver tabla 2) con los hospederos más usados en ingeniería genética:

La inserción del DNA foráneo, mediante el vector, se realiza generalmente por un proceso de transformación. Las células receptores crecen luego en una placa de cultivo, produciendo varias células genéticamente idénticas, llamadas clones, las cuales tienen incorporado el gen o genes que se desea expresar. En el proceso de inserción del DNA foráneo mediante el vector, no todos los intentos son exitosos, y alguna células no reciben el material genético extra, puesto que éstas deben estar en un estado competente para poder recibir DNA del medio externo, y la cantidad de célula, tiempo de duración y condiciones del medio para que las células entren en competencia depende de la célula y son características propias de cada especie. Estas células deben ser aisladas de las recombinantes por medio del uso de medios selectivos, puesto que normalmente el vector además contiene ciertos genes para la resistencia a antibióticos, un medio selectivo con diferentes antibióticos es una buena alternativa (Klug & Cummings 1999).

Hospederos procariotas.

El primer hospedero empleado para clonación de DNA mediante esta técnica, y el más usado en la actualidad es E. coli. Esta bacteria, es posiblemente la mejor conocida por los científicos y se tiene gran

cantidad de información sobre su genoma y sus características fisiológicas (Madigan et al. 1998, Smith & Wood 1998). La cepa K12 de E. coli constituye un hospedero bastante bueno, por cumplir las condiciones anteriormente mencionadas. Sin embargo, E. coli en su forma nativa produce una retención de proteínas en el periplasma, haciendo difícil su aislamiento. Para contrarrestar este problema se han desarrollado cepas modificadas de esta bacteria, como ser E. coli mutantes para la bioremediación de ambientes contaminados con mercurio (Chen & Wilson 1997). Otra ventaja de E. coli es que puede aceptar una amplia gama de vectores, como los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos, entre otros (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).

Se ha usado a E. coli para la producción de muchas sustancias de interés médico, como proteínas y vitaminas, mediante la inserción de los genes que las codifican (Hashimoto & Ozaki 1999). Un ejemplo de esto, es la producción de grandes cantidades de insulina en cultivos de E. coli transgénica, cuyos productos están destinados a los enfermos de diabetes (Bohinski 1991), sin embargo en la actualidad se discute sobre los problemas que puede acarrear el uso de estas bacterias modificadas, puesto que los productos obtenidos no son de origen natural y existe la posibilidad que resulten tóxicos en cierta medida (Käppeli & Auberson 1998).

La tecnología de DNA recombinante llega aún más allá de la simple producción de proteínas, se han modificado cepas de E. coli para la bioremediación de hidrocarburos (Keasling & Bang 1998; Timmis & Pieper 1999; Coates & Anderson 2000) y mercurio (Chen & Wilson 1997), en ambientes altamente contaminados. El desglose de estas aplicaciones se verá más adelante,

Otro hospedero procariota utilizado en la tecnología de DNA recombinante es Bacillus subtilis. Esta bacteria normalmente no es patógena, no produce endotoxinas y secreta proteínas al medio. No existen tantos estudios de cómo usar esta bacteria como hospedero, como los existentes para E. coli, y muchas veces se presentan problemas al usarla como hospedador porque no es fácil adaptarla para la clonación de genes (Madigan et al. 1998), puesto que su maquinaria biosintética no es tan flexible como la de E. coli.

Hospederos eucariotas.

Si bien E. coli es un buen hospedero para muchos propósitos de ingeniería genética y DNA recombinante, tiene la desventaja de carecer de núcleo y otros organelos, y al ser un organismo procariótico, es posible que no exprese correctamente proteínas introducidas de origen eucariótico, por ello se ha visto la alternativa de emplear hospederos eucarióticos (Silva 1999).

En la actualidad se vienen usando también células eucariotas como hospederos para la clonación de DNA. Esto ha permitido que se amplíe notablemente el conocimiento que se tiene sobre cómo funciona la maquinaria genética de las células eucariotas. El hospedero eucariota más empleado es la levadura Saccharomyces cerevisiae, puesto que de ésta se conoce mucho desde el punto de vista genético (Madigan et al. 1998), y se tiene un "catálogo" completo de genes y mutaciones, así como la identificación del plásmido 2m , de origen natural, el cual constituye un excelente vector (Klug & Cummings 1999). Saccharomyces cerevisiae tiene un genoma de aproximadamente 2*107 pares de bases, contenidos en 17 cromosomas lineales, el plásmido 2m tiene 6318 pares de bases y es común encontrar muchas copias de él en cada célula –alrededor de 50 copias–, por lo cual se constituye en un organismo ideal para la clonación de DNA (Silva 1999).

Tomando como punto de partida la utilización de células de levadura como hospederos para clonaje molecular, se han desarrollado otros métodos para la producción de DNA recombinante en eucariotas. Uno de estos métodos es la construcción de cromosomas artificiales de levadura, los cuales se usan como vectores (Klug & Cummings 1999).

Aparte de las levaduras, se han usado otros hospederos eucarióticos para la clonación de DNA foráneo, como ser hongos (Aspergillus sp. y Neurospora crassa son los más usados) y algas unicelulares como Chlamydomonas reinhardtir. Además se han hecho algunas pruebas con cultivos de células animales y vegetales (Silva 1999). Los cultivos de células animales abren un vasto campo de investigación, muy relacionado con la medicina, ya que al tener células humanas en cultivo, por ejemplo, sería mucho más fácil estudiar fenómenos como el cáncer. Sin embargo, el utilizar cultivos de células animales, y en cierta medida cultivos vegetales, significa un costo muy elevado y menores posibilidades de manipulación que con un cultivo de bacterias (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).

Transfección y clonación del DNA.

Una vez que se aislado el fragmento a ser transportado, se lo ha insertado en el vector y se ha seleccionado un hospedador adecuado, se debe proceder con la transfección del material genético para que comience el proceso de clonación de DNA.

La transfección del DNA incluido en el vector se la debe hacer tomando en cuenta que la célula posee una barrera que la limita y escoge selectivamente qué sustancias penetrarán dentro de ella, esta barrera es la membrana celular. Para superar esta barrera, se han diseñado las técnicas de transfección de sustancias, que se encargan de abrir poros en la membrana o inducir la endocitosis por vías naturales (Reina 2000). Estos procedimientos se dividen en técnicas de permeabilización celular, microinyección y técnicas de transfección propiamente dichas.

Técnicas de permeabilización celular.

Esta técnica consiste en mantener a las células vivas por varias horas en una solución con condiciones diferentes a las del medio, para que la diferencia de concentraciones produzca la apertura de poros a todo lo largo de la membrana celular. Un efecto parecido se obtiene con el uso de detergentes suaves que disuelven parcialmente la membrana. Este sistema es conveniente y resulta económico, pero presenta dos grandes inconvenientes: la escasa duración del ciclo celular viable, y la pérdida incontrolable de componentes celulares (Reina 2000).

Microinyección.

Esta técnica permite la introducción de material ajeno a la célula mediante una micropipeta (Fig. 4), que se controla bajo un microscopio de alta resolución. Esta técnica es muy sensible, y requiere de equipo muy sofisticado y costoso, pero se obtienen buenos resultados, a pesar de no ser recomendable para el tratamiento de varias células ya que el trabajo se vuelve tedioso (Reina 2000).

Existen además sistemas de microinyección biológicos, como los virus, que inoculan su material genético dentro de la célula hospedadora, y es por ello que son muy usados como vectores.

Técnicas de transfección.

Estas técnicas han sido desarrolladas específicamente para la introducción de ácidos nucleicos dentro de las células, y han permito ampliar los conocimientos que se tenían sobre replicación, regulación génica y el funcionamiento de las células a nivel molecular, entre otras, que actualmente se aplican en el campo de la genética para la producción de plantas y animales transgénicos (Cavener 1992; Käppeli & Auberson 1998), líneas celulares modificadas, y una de sus principales aplicaciones es la construcción de DNA recombinante.

La introducción de una cadena de DNA recombinante en las que se ha situado una secuencia codificante, bajo una secuencia de regulación que se desea estudiar permite medir con facilidad las tasas de expresión genética en diferentes situaciones experimentales. Por otro lado, la introducción de un plásmido con secuencias codificante y reguladora permite la producción de una proteína deseada, en este caso se emplea a la célula hospedadora como una "fábrica" para este producto (Reina 2000).

Para los dos casos vistos anteriormente puede ser importante la selección de las células que han recibido el material genético incorporado de las que no, para ello se puede realizar un cultivo en medio selectivo, puesto que normalmente los plásmidos que se insertan incluyen también genes de resistencia a algunos antibióticos.

Las técnicas de transfección se pueden dividir en tres grupos:

• Métodos químicos: son aquellos en los que se forman complejos para que la células sean capaces de aceptar o incorporar una cierta molécula a su citoplasma, por medio del mecanismo normal de endocitosis. Para esta finalidad se usan el fosfato de calcio, el DEAE dextrano y el método de la lipofección, los dos primeros se unen al DNA formando complejos asimilables por la célula, mientras que la lipofección se basa en el recubrimiento de la molécula de DNA en un complejo de lípidos capaces de atravesar la membrana.

• Métodos físicos: son aquellos en los que se produce una introducción mecánica del DNA, como la microinyección (que se vio anteriormente) o la electroporación, que consiste en aplicar una carga eléctrica al medio para forzar la apertura de poros de membrana por donde penetran las sustancias.

Clonación de DNA.

Una vez que se ha realizado el proceso de transfección comienza la etapa de la clonación de DNA dentro de la célula hospedadora. Este proceso es diferente en procariotas que en eucariotas, y por ello se verán ambos casos por separado.

Clonación en procariotas: En las células procariotas como E. coli el proceso de clonación de ácidos nucleicos se da una vez que se obtienen los organismos recombinantes, a partir de los cuales se obtienen clones por simple división. Para ello se seleccionan las células que si recibieron el DNA foráneo mediante el vector, y se las aísla en un nuevo medio de cultivo, dándoles condiciones ideales para que crezcan y se reproduzcan. Esta selección es un proceso que requiere cuidado y existen varias técnicas para hacerlo. Uno de estos métodos es la selección rápida, en la que se eliminan a los no mutantes en un medio selectivo (Smith & Wood 1998), otro método frecuentemente usado es el de rastreo o cribado (Klug & Cummings 1999), que consiste en separar a los organismos mutantes de acuerdo a la característica que se ha introducido, este método fundamentalmente se aplica cuando se usan plásmidos como vectores. El método de réplica también se usa para este efecto, siendo una variación de la selección rápida, puesto que consiste en tomar una "réplica" (Fig. 5) de la placa original y sembrarla en un medio selectivo.

Clonación en eucariotas: En algunos eucariotas "inferiores" como la levadura Saccharomyces cerevisiae se pueden aplicar los mismos métodos que se usan en la selección de procariotas mutantes, mientras que para hospederos más "avanzados", como ser tejidos vegetales se usan técnicas de complementación, usando una cadena de DNA complementario (DNAc), en el cual se da una selección de los mutantes mediante la aplicación de enzimas de restricción (Smith & Wood 1998).

La clonación de DNA en células mutantes también puede evidenciarse mediante el uso de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores específicos que van a reaccionar con un tipo específico de secuencia, y permiten distinguir dos tipos celulares distintos en base a sus características genéticas (Olmos et al. 1999, Klug & Cummings 1999).

APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE EN LA ACTUALIDAD.

Las aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante están revolucionando el mundo moderno, puesto que éstas van desde el diseño de nuevos medicamentos y curas para enfermedades hasta la producción de plantas mejoradas, pasando por un amplio espectro de aplicación industrial, además de contribuir a la biología y a la genética con una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que operan en los sistemas vivos.

Utilidad y aplicabilidad de la tecnología de DNA recombinante en el estudio genético.

La posibilidad de introducir secuencias foráneas de DNA al genoma de una célula, para que ésta lo exprese como si fuera suyo ha revolucionado el estudio de la genética es muchos aspectos, ya que ha permitido entender mejor cómo se dan los mecanismos de regulación y expresión génica, y por la misma vía se han mejorado las técnicas de mapeo y cartografía de genes.

La construcción de genes artificiales tanto en procariotas como en eucariotas (Griffiths et al. 1998) ha sido un punto de partida muy importante para comprender la dinámica de la información genética en los sistemas vivos, ya que se ha visto que los diferentes tipos celulares se diferencian en la expresión de un mismo material genético, lo cual produce un resultado distinto cada vez. Esta técnica también ha sido el medio para la detección y comprensión de varias enfermedades genéticas.

Esta técnica se está usando actualmente para la cartografía de genes humanos, que dado el tamaño y la complejidad de este genoma, es una tarea ardua y morosa si se la realiza con las técnicas tradicionales de mapeo genético por medio de frecuencias de recombinación, siendo además este método impreciso por la influencia de la interferencia.

La detección de enfermedades genéticas y otros problemas relacionados se ha visto obstaculizada por la imprecisión de las técnicas tradicionales de cartografía, pero hoy en día es posible efectuar estos análisis con mayor precisión utilizando como marcadores a los RFLP (polimorfismos de longitud fragmentos de restricción), los cuales se producen por la acción de diferentes enzimas de restricción, y estos fragmentos son altamente específicos y cualquier variación da la posibilidad de detectar mutaciones, ya sean éstas de carácter mendeliano o no. Incluso esta técnica puede ser empleada para el estudio del ligamiento de genes, ya

que si se construyen familias de RFLP en varias generaciones es posible incluso detectar genes completamente ligados, lo que a veces no se puede hacer con las técnicas tradicionales pues no se pueden diferenciar de los genes no ligados (Klug & Cummings 1999).

Otra ventaja de la tecnología de DNA recombinante es que abre la posibilidad de realizar mutaciones direccionales (Griffiths et al. 1998), que a diferencia de las mutaciones naturales, que ocurren de una manera aleatoria, permiten analizar una característica en particular, sin importar la complejidad o el comportamiento del organismo a diferentes condiciones.

Además la posibilidad de realizar mutaciones dirigidas reduce al máximo el sesgo que representan sobre los resultados las mutaciones adicionales no detectables que se puedan dar en el proceso de inducción de mutagénesis por técnicas físico–químicas.

La producción de cromosomas artificiales ha abierto las puertas a un campo antes poco comprendido por los científicos: la regulación de la expresión genética. Hasta hace algunos años todavía no se tenía claro el proceso o los procesos por los cuales una sola célula inicial daba lugar a diferentes tipos celulares, y cómo un mismo genoma podía codificar diferentes proteínas en cada uno de estos tipos celulares. La introducción de cromosomas artificiales en estos distintos tipos celulares ha llevado a comprender y evidenciar el mecanismo de regulación de esta expresión, y estos aplicación ha sido también un importante punto de partida para verificar la existencia y comprender el funcionamiento de las secuencias de regulación de genes y los mecanismos por los cuales actúan los interruptores moleculares (Tjian 1995, Fishel 1998). Estos estudios también han ayudado de cierta manera a comprender mejor el funcionamiento de varias enzimas relacionadas con la replicación y reparación de ácidos nucleicos, como las enzimas de restricción y las polimerasas.

Adicionalmente, la posibilidad de producir grandes cantidades de una proteína por medio de cultivos bacterianos de células modificadas, ha llevado a reducir notablemente los costos de enzimas industrializadas, que se usan para la mayoría de los estudios en esta rama de la biología.

Aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante en el campo de la medicina y la salud.

La medicina y la salud son quizá los campos de aplicación más beneficiados con el descubrimiento y la implementación de la tecnología de DNA recombinante, puesto que ésta ha permitido detectar y buscar alternativas y tratamientos para numerosas enfermedades, la detección de enfermedades genéticas, la producción de sustancias y medicamentos revolucionarios, y como complemento a esto se han desarrollado también terapias genéticas para varios males que aquejan diariamente a miles de personas.

Producción de sustancias útiles y medicinas.

Esta es una de las primeras aplicaciones que se encontró para la tecnología del DNA recombinante en el campo de la medicina. La producción de proteínas, enzimas, vitaminas y ácidos nucleicos por medio de bacterias mutantes (Hashimoto & Ozaki 1999) ha permitido la obtención de estas sustancias en grandes cantidades a precios mucho más bajos, haciéndolas más accesibles al público.

El ejemplo clásico de esto y una de las mayores producciones bacterianas por DNA recombinante es la producción de insulina en cepas de E. coli modificadas (Bohinski 1991). La insulina es una hormona de carácter proteico que se sintetiza en los islotes de Langerhans en el páncreas de los mamíferos (Eckert et al. 1998), la cual se encarga de regular los niveles de azúcares en el organismo mediante un complejo sistema de cascadas enzimáticas. La diabetes es una enfermedad que afecta a millones de personas en el mundo, y produce una deficiencia en la síntesis de esta proteína, por lo cual a los enfermos de diabetes se les debe administrar una dosis diaria de insulina. Hasta hace algunos años esta insulina se extraía de otros mamíferos y su costo era elevado, pero la tecnología de DNA recombinante permitió introducir el gen que la codifica en el genoma de E. coli, la cual produce esta proteína como si fuese propia, incluso se ha visto que en algunos cultivos ésta llega a constituir un 40% de la carga proteica total de la célula. Entonces, un cultivo celular de reducido costo puede producir una gran cantidad de insulina, haciéndola más accesible para los enfermos que padecen diabetes.

Posiblemente el segundo producto de esta naturaleza en la lista de ventas es la hormona humana del crecimiento (Smith & Wood 1998), la cual se produce en grandes cantidades por medio de cultivos bacterianos y se usa para el tratamiento del enanismo. Cuando existe un problema en el suministro de esta hormona por parte de la hipófisis el

organismo sufre un crecimiento reducido y en algunos casos atrofia de ciertos tejidos. Antiguamente se extraía esta hormona en mínimas cantidades de cadáveres, pero ésta era insuficiente incluso para pretender hacer un tratamiento a un solo individuo. Hoy en día esta hormona se produce a escala industrial en cepas modificadas de E. coli.

La capacidad de hacer que bacterias modificadas produzcan ciertas sustancias en cantidades ha marcado una revolución en el campo de la medicina farmacéutica, puesto que hizo factible la producción en masa de medicamentos, a los que se añaden ciertas vitaminas, factores de crecimiento y/o proteínas de escasa disponibilidad en la naturaleza. Incluso se han hecho pruebas modificando bacterias para alterar sus vías metabólicas para que éstas transformen sus propios productos metabólicos en sustancias específicas (Hashimoto & Ozaki 1999), esto se hace por medio de la adición de enzimas específicas al genoma, las cuales se encargan de modificar los productos metabólicos, por ejemplo se pueden producir aminoácidos a partir de intermediarios del ciclo de Krebs añadiendo genes de transaminasas. Esta tecnología puede aplicarse por dos vías, la primera es la conversión directa, e la que una enzima específica transforma un determinado sustrato para dar lugar a un solo producto, la segunda estrategia consiste en emplear rutas metabólicas completas y alterarlas para este mismo fin.

Klug & Cummings (1999) hacen referencia a la producción de productos farmacéuticos en huéspedes animales. Esta es una aplicación de la biotecnología mediante la cual es posible producir ciertas sustancias añadiendo el o los genes que la(s) codifican en las células de algún animal. Recientemente se ha podido incorporar con éxito las principales proteínas de la leche materna a la leche de las vacas, este proceso se ha ido produciendo poco a poco, introduciendo una proteína por generación, y actualmente se crían vacas en Estados Unidos, cuya leche contiene cerca de un 80% de las proteínas de la leche materna humana. Este sin duda, sería un excelente sustituto a las leches maternas artificiales que se comercializan actualmente.

Detección y tratamiento de enfermedades genéticas.

Las técnicas de clonación selectiva de DNA, entre las que se incluye el DNA recombinante, permiten el estudio de muchas enfermedades genéticas. El aislamiento y clonación de un determinado gen responsable de una enfermedad genética provee información importante para diseñar estrategias de mitigación del mal o incluso

puede dar las luces para la producción de una cura. Dos de las enfermedades genéticas que se han estudiado mediante la técnica de RFLP son la neurofibromatosis y el síndrome de Marfan.

La neurofibromatosis afecta a 1 de cada 3000 individuos y produce una variedad de defectos en el sistema nervioso, que son responsables en gran medida de los problemas de aprendizaje y de la aparición de tumores benignos en el cerebro. Esta enfermedad se produce por un alelo autosómico y es de carácter recesivo. La cartografía de este gen por los métodos tradicionales resulta una tarea prácticamente imposible, puesto que el estudio de las familias de genes relacionadas con este mal representaría una cartografía completa de los 22 cromosomas humanos, puesto que tienen una elevada tasa de mutación espontánea.

Mediante la técnica del RFLP se ha podido establecer una cartografía parcial del NF1, por medio de la elaboración de un mapa de exclusión (en este tipo de mapa, se toman posibilidades y se las va descartando de acuerdo a las evidencias experimentales obtenidas), posteriormente se pudo conseguir la secuencia completa de aminoácidos y la secuencia genética de este gen, lo cual permitió identificar a la proteína neurofibromina, responsable de a pérdida de memoria y de los tumores. Ya una vez que se identificó y caracterizó esta proteína, los científicos y los médicos han emprendido una nueva investigación en busca de un medicamento que pueda minimizar sus efectos.

Otro candidato ideal para este estudio es el síndrome de Marfan, que afecta a varios órganos del cuerpo, produciendo en la mayoría de los casos, una muerte por ruptura de los principales vasos sanguíneos (Cummings 1995). El gen responsable de esta enfermedad fue identificado mediante la técnica de los genes candidatos. Esta técnica es una alternativa de cartografía de genes, que consiste en analizar proteínas, enzimas u hormonas que se cree son responsables de la enfermedad, y en base a su secuencia de aminoácidos se eligen genes que se piensa son los que codifican estas proteínas, estos son los genes candidatos, una vez que se ha seleccionado un grupo de genes candidatos se va haciendo una evaluación más profunda y descartando genes, hasta hallar el gen responsable más probable. El aislamiento y el clonaje de estos genes se lo realiza en base a los principios detallados en la primera parte. La desventaja de este método es que se puede aplicar solamente si se tiene información previa del tema, no es útil para estudios que comienzan desde cero.

Este análisis ha reflejado que los problemas que conlleva el síndrome de Marfan están relacionados a problemas con la proteína fibrilina, la cual es parte importante de las membranas oculares, los huesos y los vasos sanguíneos, y es por eso que los que padecen esta enfermedad tienen problemas de vista, huesos y arterias débiles y usualmente mueren por un aneurisma al realizar un esfuerzo muy fuerte.

Los dos ejemplos anteriores muestran la aplicación de las técnicas de DNA recombinante para el estudio de enfermedades en adultos afectados, pero ¿es posible detectar estas enfermedades antes del parto?. En respuesta a esta pregunta se han desarrollado los métodos de detección prenatal de enfermedades. Existen dos métodos principales para este efecto: a amniocentesis y la extracción de vellosidades coriónicas. El primero se basa en la extracción de una muestra del líquido amniótico que protege al feto dentro las membranas embrionarias, y el segundo e la extracción de una pequeña muestra de tejido del corion, una de las membranas de protección embrionaria (Klug & Cummings 1999).

Ya sea con la muestra de líquido amniótico o con la de tejido de corion, se procede a hacer una serie de análisis bioquímicos de las células, que inicialmente dan información acerca del sexo, tipo de sangre y otra información básica del feto. Posteriormente, el material genético de estas células puede ser sometido a enzimas de restricción y mediante tecnología de DNA recombinante se hacen cultivos con genes de interés (en este caso, la enfermedad a detectar debe ser conocida y debe ser posible aislar su secuencia), para ver el efecto que produce en estos, y de esta manera se determina si el feto padece o no una determinada enfermedad (Fig. 6).

Las enfermedades que más comúnmente se detectar prenatalmente son la talasemia y la anemia de células falciformes, porque de éstas ya se sabe mucho y se tiene un conocimiento previo de dónde se ubican, y por consiguiente es fácil aislar los fragmentos de DNA para producir el cultivo en un hospedero y determinar el comportamiento que tendrá esa sección.

La detección de enfermedades genéticas se ha revolucionado con la implementación médica de la técnica de nucleótidos específicos y rastreo genético (Klug & Cummings 1999). Esta técnica, cuya

abreviatura es ASO, utiliza en condiciones adecuadas, una sonda que se denomina oligonucleótido específico de alelo (de esta frase se deriva la abreviatura ASO, en inglés) el cual hibridará sólo con su secuencia complementaria y no con otras secuencias, aunque éstas varíen sólo en un nucleótido. Para rastrear enfermedades como la anemia de células falciformes, se utiliza esta técnica combinada con análisis de PCR, ya sea este tradicional o una modificación específica, tal como un PCR de baja temperatura (Iakobashvili & Lapidot 1999). En este método se produce una extracción de DNA por lisis en los glóbulos blancos de la sangre, y posteriormente este DNA es desnaturalizado por calor. Luego se produce una amplificación del gen en cuestión (para el caso de la anemia falciforme, el gen de la b–globina, por ejemplo) mediante la técnica de PCR. Se coloca una gota del DNA amplificado en un filtro, y se hibridiza con un ASO, y luego se lee el resultado en los filtros, de haber hibridación la molécula resultante es demasiado grande para atravesar los poros del filtro.

Terapia génica.

El rastreo y caracterización de los genes que producen las enfermedades genéticas desde un principio tuvo la finalidad de ofrecer un tratamiento a estas enfermedades, de esto surge el concepto de terapia génica, la cual consiste en transferir alelos normales a un individuo enfermo para eliminar su problema. Ya se han hecho varios experimentos en ratones y otros animales, en los cuales se ha logrado exitosamente restaurar el funcionamiento normal de un alelo por la inserción de la cadena correcta mediante un vector. El que hayan resultado exitosos los ensayos realizados en ratones abre la mente a creer que en unos años más este tipo de terapia pueda ser usada para curar las cientos de enfermedades genéticas de los humanos (Griffiths et al. 1998, Klug & Cummings 1999).

La terapia génica tiene ya una cierta historia, en un principio se aplicaba en humanos, inoculando al organismo dosis significativas de la proteína faltante o defectuosa, por ejemplo, se administraban fuertes dosis de insulina a enfermos de diabetes, con la finalidad de que una elevada concentración de la proteína funcional restaure la secuencia genética. Desafortunadamente este tipo de terapia génica no tuvo éxito, y los estudios derivados a investigar el o los mecanismos necesarios para el reemplazo de una secuencia defectuosa por una normal, mediante el uso de vectores y técnicas de DNA recombinante.

Este proceso todavía está en fase experimental y aún no hay datos sobre ensayos exitosos en humanos, todas las prueba realizadas se han hecho en invertebrados como Drosophila y en mamíferos pequeños como Mus musculus. Si bien el proyecto genoma ya ha dado una versión preliminar de la secuencia de los 23 cromosomas humanos, y las técnicas de transferencia de genes están cada día más avanzadas, todavía resulta difícil aislar genes específicos sanos en humanos, y más difícil aún el implantarlos en el sitio correcto, en un organismo enfermo. El tamaño y la complejidad del genoma hacen de ésta una ardua tarea.

Lucha contra el cáncer.

Anualmente millones de personas mueren de cáncer. Esta enfermedad ha sido extensamente estudiada por los científicos, pero aún no se han podido dar curas para este mal, pues todavía no se tiene claro cómo se origina exactamente, y cuáles son los mecanismos que operan para su tratamiento. Hasta ahora se sabe que el cáncer es producto de una mutación en un sitio importante del genoma, que ocasiona que las células se reproduzcan sin control generando tumores y destrucción de tejidos. Se han hecho muchos estudios a nivel molecular y se han lanzado cientos de hipótesis, pero todavía no se tiene nada concreto que permita diseñar una cura.

Uno de los estudios más interesantes al respecto se lo ha realizado aislando y estudiando los factores que determinan la muerte celular, pero investigaciones recientes han mostrado que la solución puede ser más simple todavía, Fraser (1994) observó que en algunos organismos existen enzimas denominadas endo–exonucleasas –aisladas de E. coli–, que se encargan de la reparación del DNA y la muerte celular. Esta quizá sea la respuesta al cáncer, puesto que esta enzima bifuncional es capaz de quitar o añadir nucleótidos al DNA para corregir errores, y si fuera posible introducir el gen que la codifica en las células cancerosas, se abre la oportunidad de una reparación in vivo de la secuencia mutada, y de esta manera detener e incluso tal vez, revertir el efecto del cáncer en uno o más tejidos.

Si bien estas enzimas se han aislado inicialmente en E. coli y han sido ampliamente estudiadas por medio de la tecnología de DNA recombinante, y otros métodos como el PCR, se ha encontrado evidencia que existen enzimas parecidas a estas en Saccharomyces cerevisiae y se ha dejado abierta la posibilidad de que existan algunas enzimas parecidas a estas en los mamíferos.

Si llegara a concretarse un estudio al respecto y éste revelara la factibilidad de introducir el gen que codifica las endo–exonucleasas en células humanas, posiblemente la lucha contra el cáncer habría encontrado un remedio, y la solución a este problema sería aplicar una terapia génica de inclusión de DNA foráneo para reparar el material dañado.

Aplicaciones forenses.

La tecnología de DNA recombinante ha pasado a ser un fuerte aliado de la medicina forense y la investigación criminal. Características genéticas específicas están siendo usadas como pruebas contundentes en cientos de juicios hoy en día, puesto que basta una célula de donde se pueda aislar DNA para identificar a una persona, con menos de un 1% de error. Esta técnica se viene usando desde hace algunos años para pruebas de paternidad, problemas de inmigración (para determinar razas) y como una huella molecular para identificar criminales. No obstante, estos procedimientos han levantado fuertes críticas éticas, ya que en algunos casos estos resultados llevan a discriminaciones raciales y a problemas familiares.

Actualmente se usan los minisatélites o VNTR (secuencias muy repetitivas en tandeo) como huellas moleculares (Smith & Wood 1998, Klug & Cummings 1999) puesto que al ser éstas altamente variables, la combinación de los distintos satélites y la posición de cada uno es una característica única de cada persona, la cual no se puede modificar, ocultar o borrar.

La tecnología de DNA recombinante y las plantas: aplicaciones en la agricultura.

La aplicación del DNA recombinante en la agricultura ha tenido una gran aceptación por parte de los grandes productores, puesto que esta revolucionaria técnica permite obtener especies transformadas a las cuales se les añaden o acentúan características especiales, como resistencia a herbicidas, mayor producción de vitaminas, etc.

Actualmente hay una gran cantidad de plantas que se pueden transformar, entre estas están los cítricos, que son los grupos en los que se han hecho más estudios y pruebas, muchas de ellas exitosas, todavía se sigue tratando de transformar los cereales como el trigo y el maíz, pero aún no se ha tenido éxito. Lo cultivos de papa, soya, rábano y

tabaco, sin embargo, son fáciles de transformar y se han hecho muchas pruebas introduciendo material genético usando como vector a la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que forma asociación naturalmente con estas plantas (Smith & Wood 1998).

La bacteria Agrobacterium tumefaciens posee un plásmido inductor de tumores (Ti) que produce un crecimiento tumoroso o callo en las plantas (Smith & Wood 1998). Este callo es un conjunto de células vegetales no diferenciadas, que producen unas sustancias químicas llamadas opinas, de las cuales se alimenta esta bacteria. El proceso de DNA recombinante para este caso sigue la siguiente dinámica: el fragmento de DNA a incluir en la planta es aislado y lo inserta en la región de homología del plásmido Ti, luego se induce a la formación del callo por acción de las bacterias y éstas introducen en plásmido con el DNA foráneo en un cromosoma –de manera aleatoria– en las células del callo. Posteriormente las plantas se regeneran a partir del callo, expresando el material genético introducido (Fig. 7).

Este método ha servido para introducir una gran variedad de genes en estas plantas, uno de los experimentos más conocidos es la planta de Nicotiana tabacum con genes de luciferasa, la cual brilla en la noche. Esta planta luminiscente es sin embargo sólo un atractivo visual, puesto que no tiene ninguna utilidad, y detrás de la polémica que ha levantado la construcción de esta planta, están muchas otras a las que sí se les ha hecho modificaciones útiles, como frutos que se pudren más lentamente, plantas que llevan vacunas o plantas resistentes a plagas y herbicida.

Gramíneas resistentes a herbicidas.

Uno de los más grandes problemas que enfrentan los agricultores es la aparición de malas hierbas en sus campos de cultivo. Usualmente estas hierbas se combaten usando sustancias químicas muy variadas, denominadas genéricamente herbicidas. Estos herbicidas, sin embargo, también afectan a las gramíneas del cultivo y las matan, por lo cual su aplicación es sumamente riesgosa, puesto que además de matar las hierbas indeseables se matan las plantas de cultivo.

Mediante la técnica del DNA recombinante se han producido gramíneas resistentes a algunos herbicidas como el glifosfato. Esto se ha logrado

mediante modificaciones que incrementan la síntesis de la EPSP sintetasa, encargada de sintetizar aminoácidos, esta enzima se encuentra en los cloroplastos y es la primera en verse afecta por el glifosfato, pero al aumentar la síntesis de ésta, el efecto de los herbicidas es mínimo, puesto que se puede continuar con la síntesis de aminoácidos de una manera prácticamente normal (Klug & Cummings 1999).

Investigaciones similares se han hecho en este campo, para añadir a las plantas factores de resistencia contra enfermedades virales (como el virus mosaico del tabaco), contra plagas de insectos e incluso contra sequías prolongadas. Actualmente se trabaja mucho en este campo y próximamente los centros de abastecimiento, tales como supermercados, ofrecerán a la venta productos transgénicos como estos.

Plantas y vacunas transgénicas.

Otra de las aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante en las plantas es la producción de plantas transgénicas con vacunas. Las formas tradicionales de producción de vacunas son la utilización de capas inactivadas o atenuadas de la bacteria o virus. La tecnología del DNA recombinante ha permitido el desarrollo de vacunas genéticas o también llamadas vacunas de subunidad, en las que se producen grandes cantidades de una proteína de superficie del virus o la bacteria contra la cual se desea hacer la vacuna, y esta proteína va a generar los anticuerpos necesarios para hacer frente a la enfermedad.

La aplicación de esta técnica de biotecnología funciona así: se aísla el fragmento de DNA que codifica la proteína de superficie que irá a constituir la vacuna de subunidad, se utiliza como vector el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y se produce una planta recombinante a partir del callo formado (se sigue el mismo proceso visto anteriormente), una vez desarrolladas las plantas, éstas expresarán el antígeno contra la enfermedad (Klug & Cummings 1999). De esta manera se producen grandes cantidades de vacuna a costos reducidos, y la administración de la misma se hace más fácil, puesto que estos vegetales podrían ser comercializados para su consumo normal, luego de una certificación previa de los efectos colaterales que pueda tener el consumo de estas plantas alteradas genéticamente. Esta técnica se ha aplicado con éxito en la producción de antígenos para la hepatitis B en plantas de tabaco.

Todavía falta hacer una gran cantidad de estudios en esta área, pero las perspectivas actuales muestran una interesante potencialidad a la producción de vacunas de subunidad en plantas transgénicas, ya que esto abriría la posibilidad de prevención de muchas enfermedades mortales, para las cuales no se conocen vacunas tradicionales, y además deja abierta la posibilidad de una vacunación por medio de los alimentos.

¿Cuán seguro es consumir plantas transgénicas?

Si bien todos los ensayos y pruebas que se han hecho con plantas transgénicas han estado delimitados muy claramente por un límite de seguridad, existen razones para dudar de que el consumo de productos transgénicos sea totalmente inocuo y esto deja abierta una pregunta que hacen Käppeli & Auberson (1998): ¿Cuán seguro es "suficientemente seguro" en la ingeniería genética de plantas?. Estos autores plantean que si bien se tienen todos los cuidados necesarios y se realizan los procedimientos de DNA recombinante de la manera más profesional y responsable posible, siempre existen factores naturales de variación que escapan al control de los investigadores y pueden resultar peligrosos para el consumidor.

Los productos transgénicos pueden resultan potencialmente tóxicos para el consumidor final, pues nunca se sabe a ciencia cierta el efecto que pueden causar las mutaciones inducidas al individuo, las cuales pueden derivar en la producción secundaria de toxinas o incluso pueden llegar a producir enfermedades. Cuando se aísla un fragmento de DNA para ser incluido en una planta por medio de la técnica de A. tumefaciens, el investigador controla y predice el efecto primario que ocurrirá con el campo, es decir, este efecto primario es el fenotipo que se espera obtener con la modificación, el mismo que ha sido muy bien delineado, con límites conocidos y cuyo efecto es predecible con un elevado grado de certeza.

Además de este efecto primario, pueden presentarse uno o más efectos secundarios, los cuales son los fenotipos y reacciones inesperadas. Estos efectos secundarios se dan por muchas causas en los individuos transgénicos, pero la principal explicación es que las plantas son sistemas vivos con un genoma flexible y dinámico, expuesto a otras mutaciones, cambios espontáneos, fenómenos de recombinación y errores en la replicación del DNA. Cualquiera de estos factores es capaz

de generar un efecto secundario, que produzca un fenotipo diferente al esperado, potencialmente dañino.

Puesto que estos procesos de variación, responsables de los efectos secundarios, son impredecibles y no están considerados dentro del estudio inicial, no se sabe exactamente cuál es su efecto puesto que no se tiene un conocimiento completo del cambio ocurrido a nivel molecular.

Otra causa de efectos secundarios es un defecto en el proceso de transfección del DNA foráneo desde el plásmido Ti (vector) hacia las células del callo, como ambos son sistemas biológicos dinámicos sometidos a constante variación, a veces ocurre un desplazamiento en el área de transferencia de material genético y se transfieren otros fragmentos a parte o en lugar del fragmento de interés, produciendo cambios no deseables.

Todos estos factores hacen de la ingeniería genética en plantas un campo muy promisorio para el futuro, pero potencialmente peligroso, y la comercialización de productos transgénicos debería darse una vez realizados estudios profundos de los impactos a la salud y el ambiente que estos vegetales modificados puedan causar.

Producción de animales transgénicos mediante DNA recombinante.

Si bien la aplicación de la tecnología de DNA recombinante para la producción de animales transgénicos se viene realizando desde hace algunos años en los principales centros de investigación científica del mundo, todavía se levanta polémica acerca de la ética y la manipulación genética de animales, y más aún de humanos.

Numerosos estudios realizados en animales transgénicos han permitido entender mejor la evolución de los sistemas de regulación génica (Cavener 1992), la mayor parte de estos estudios se han hecho en Drosophila melanogaster y ratones de laboratorio. Dichos experimentos han sido un importante respaldo para las investigaciones que trataron y todavía tratan de dilucidar por completo el funcionamiento de las regiones de control de los genes, y el cómo operan los promotores y los inhibidores de genes, y el papel que éstos tienen en la diferenciación celular y la producción diferencial de proteínas de acuerdo a lo que se denominó un subprograma de vida.

Ya no es un secreto para nadie, que en Estados Unidos se han producido vacas transgénicas, cuya leche contiene además proteínas humanas, propias de la leche materna de esta última especie. Un reciente documental del Discovery Channel mostró a estas vacas pastando como cualquier vaca normal, externamente se ven idénticas a organismos normales, pero su genoma ha sido alterado para la producción de proteínas adicionales. Este proyecto tiene miras de buscar sustitutos "naturales" (si cabe el término) para la leche materna humana, pues se ha visto que los sustitutos sintéticos que se comercializan actualmente pueden tener efectos secundarios sobre los lactantes.

Chile es en este momento el segundo mayor productor de salmón del mundo, lo cual ha obligado a esta industria a buscar nuevas alternativas para asegurar su producción, protegiendo a los salmones de enfermedades (Bioplanet 2000). En la actualidad son muchas las enfermedades que atacan a los salmones y producen grandes pérdidas económicas a los productores de salmón, además del efecto nocivo que tiene una gran epidemia sobre el equilibrio de los ecosistemas. Actualmente no se conocen muchos tratamientos o vacuna contra estas enfermedades, y los estudios realizados son aún insuficientes como para proveer una solución por este lado.

Por ello, es que el Instituto Tecnológico del Salmón, en Chile, ha planteado otra solución: la biotecnología. Para este fin, la compañía chilena de biotecnología Bios, ha desarrollado una serie de vacunas genéticas (Gurunathan et al. 2000) que permitan a los salmones adquirir resistencia contra estas bacterias, todavía poco conocidas. Este método es altamente eficiente, puesto que la producción de anticuerpos es alta desde un principio y condiciona al organismo a estimular y reforzar su sistema inmunológico. Bajo el lema "es mejor prevenir que curar", se han desarrollado además vacunas genéticas para enfermedades virales potenciales, asegurando de esta manera a producción de salmón de la industria chilena.

Sobre estos métodos de vacuna genética, sin embargo, todavía faltan realizar estudios de efectos secundarios que puedan resultar potencialmente tóxicos al consumidor final.

La tecnología de DNA recombinante y el ambiente: bioremediación.

Los problemas de contaminación actualmente están recibiendo gran atención por parte de las autoridades ambientales en el mundo entero.

Si bien los problemas de contaminación no se pueden revertir, en la actualidad existe otra alternativa: la bioremediación. Bioremediación se define como el proceso de descontaminación mediante la inducción de bacterias capaces de degradar las sustancias contaminantes. Si bien esta técnica tiene apenas 10 años de antigüedad e investigación, hoy en día son muchas las aplicaciones que se le da. Se emplea bioremediación para la degradación de petróleo, de metales pesados, de insecticidas e incluso para combatir radiación.

La bioremediación puede aplicarse usando bacterias silvestres que tengan la capacidad de degradar el contaminante con el que se está tratando, sin embargo, en muchos casos se deben construir bacterias –mediante técnicas de DNA recombinante– para la remediación de un contaminante determinado.

Si bien se conocen cerca de 70 géneros de bacterias silvestres que pueden ser usadas para bioremediación, la producción de bacterias modificadas va ganando terreno e importancia día a día. Numerosos estudios (Keasling & Bang 1998, Timmis & Pieper 1999, Coates & Anderson 2000, Pieper & Reineke 2000, Sayler & Ripp 2000) ha utilizado bacterias modificadas genéticamente para la descontaminación de ambientes, con un impacto mínimo a largo plazo, puesto que al ser éstos descontaminadotes agentes biológicos, reducen y controlan su población luego de cumplir su función, y viven en los ambientes junto con el resto de la microflora.

En muchos casos, es necesaria la construcción de estas cepas recombinantes, puesto que todavía no se conocen organismos silvestres capaces de efectuar algunos tipos de degradación. Coates & Anderson (2000) describen la construcción de bacterias recombinantes para la degradación anaeróbica de contaminantes ambientales, proceso aún poco estudiado y poco común en la naturaleza (la mayoría de los procesos de degradación de contaminantes requieren de oxígeno). Estudios como el de Katja & Top (1997) sugieren una transferencia de genes a los microorganismos del suelo para acentuar las características de biodegradación en cepas nativas de ese medio.

Quizá uno de los casos más llamativos por su importancia, es el propuesto por Chen & Wilson (1997) para la construcción de cepas de E. coli modificadas capaces de bioremediar mercurio. Todavía no se han encontrado bacterias silvestres capaces de remediar contaminación por este metal, pero si bacterias que pueden hacerlo menos tóxico para el

ambiente, cambiándolo de forma a complejos orgánicos. Sin embargo, la posibilidad de construcción de una cepa capaz de bioremediar este metal pesado, abre las puertas al tratamiento de áreas afectadas por la industria, en especial la minería, que vierte grandes cantidades de residuos con mercurio a suelos y aguas.

Campo de aplicación del DNA recombinante en la industria.

En la actualidad existen muchas aplicaciones industriales para la tecnología de DNA recombinante. Los productos que se generan a partir de organismos recombinantes son muchos y tienen diferentes finalidades, que van desde la industria vitícola hasta la producción de medicamentos.

El microorganismo protagonista en la industria por DNA recombinante es la levadura Saccharomyces cerevisiae, que al ser un organismo eucariota simple del cual se tiene ya un gran conocimiento, se facilita la producción de sustancias mediante su maquinaria biosintética. Actualmente se usan cepas de levadura modificadas para la producción a gran escala de taumatina y quimosina (Smith & Wood 1998). La taumatina es una proteína de origen vegetal, unas 200 veces más dulce que la sacarosa y es usada comercialmente en edulcorantes y como aditivo para muchos alimentos. La quimosina, también conocida como renina, es una proteína que se utiliza en grandes cantidades para la producción de queso.

Otra aplicación de levaduras modificadas genéticamente está dada en la industria de los vinos (Pérez–González et al. 1993). Se han construido cepas de levadura recombinante que expresen el gen de la b –(1,4)–Endoglucanasa, una enzima que reacciona con los azúcares del mosto, dándole al vino un aroma a frutas más intenso y agradable. Esta modificación de la levadura del vino, favorece al proceso de micro vinificación, induciendo una fermentación más rápida del mosto, sin alterar la calidad y el sabor del vino. El proceso de modificación de esta cepa de levadura es complejo y requiere de equipo sofisticado (ver Pérez–González et al. 1993 para mayor información), puesto que se debe asegurar el correcto funcionamiento de la cepa ya que su aplicación es de gran escala, y un error en la construcción de la cepa puede representar pérdidas millonarias para la industria, pero su

correcta aplicación también genera un movimiento económico significativo.

Como ya se vio en la parte de aplicaciones médicas, las bacterias recombinantes se usan ampliamente para la producción de ciertos medicamentos y enzimas a gran escala. Este método de producción también ha revolucionado la industria farmacéutica, puesto que desde hace algunos años que este método ha reemplazado la producción tradicional de insulina, enzimas, hormonas y otros, lo cual ha llevado a una masificación de su uso y una considerable reducción de costos. Si se compara el costo y rendimiento de la extracción de microlitros de hormona de crecimiento de cadáveres, con los volúmenes diarios que puede proveer un cultivo de E. coli recombinante ya diferencia es abismal: gracias a la industrialización mediante tecnología de DNA recombinante, millones de personas en el mundo pueden acceder ahora a tratamientos médicos con este tipo de proteínas.

El campo de la investigación genética y la biología en general, también se han visto favorecidas con la producción de gran escala y menor costo de proteínas y enzimas necesarias para las investigaciones que se realizan en los diferentes campos de estas ciencias.

Discusiones y conclusiones.

La tecnología de DNA recombinante es una técnica de reciente aplicación, que a tenido un gran impacto en la ciencia y diversos aspectos de la vida cotidiana.

Los principios de esta metodología se han ido perfeccionando con el tiempo, los estudios que se han ido realizando sobre vectores y hospederos han abierto las puertas al uso de nuevos métodos de aplicación de este principio, tales como el desarrollo de cromosomas artificiales, los mismos que han permitido entender mejor los sistemas de regulación génica y la expresión.

La genética se ha visto especialmente beneficiada por el desarrollo de esta tecnología, ya que ha permitido el estudio de mecanismos y procesos complejos, que de otra manera habrían tomado décadas en ser dilucidados. La genética y la biotecnología son dos ramas muy relacionadas que se benefician mutuamente, el beneficio que da la biotecnología a la genética se lo acaba de explicar, y a su vez la genética beneficia a la biotecnología, al propiciar el desarrollo de nuevas

técnica y procedimientos en respuesta a las necesidades de los investigadores.

La capacidad de aislar fragmentos específicos de DNA e insertarlos dentro de otro organismo para su expresión y su clonación, ha permitido y permitirá la investigación en genes. En la actualidad esta técnica permite la detección de enfermedades genéticas tanto en individuos adultos como en individuos prenatales, mediante una combinación de la tecnología de DNA recombinante con la técnica de PCR.

Este cambio dinámico en la tecnología de DNA recombinante ha propiciado su aplicación en un conjunto heterogéneo de campos, como ser la industria, la agricultura y la bioremediación. La posibilidad de crear organismos recombinantes que expresen genes ajenos a su genoma hace que se puedan masificar procesos industriales a costos más bajos, que se puedan crear plantas transgénicas que lleven vacunas, vitaminas o que tengan una mayor resistencia a la putrefacción, aunque la seguridad de consumir alimentos transgénicos está todavía en tela de juicio. De la misma manera, hoy en día se producen animales transgénicos en los que se experimentan terapias génicas, también se producen animales con gran resistencia a enfermedades o que puedan producir proteínas humanas en su leche.

La medicina actual ha experimentado un gran desarrollo desde que se pueden producir proteínas y otras sustancias útiles en gran cantidad y a bajos costos por medio de cultivos bacterianos. Se han planteado terapias génicas que permitan sustituir los alelos defectuosos que producen las más de 500 enfermedades hereditarias conocidas, por alelos normales para combatir estos males que acechan a millones de personas en el mundo.

Esta tecnología de DNA recombinante ha abierto las puertas a la aplicación masiva de la bioremediación, puesto que al poder crear organismos transgénicos capaces de degradar contaminantes, con un efecto ambiental colateral mínimo, se puede hacer frente de una manera más efectiva a los problemas ambientales de contaminación, ya sea esta por hidrocarburos, metales pesados o radiación.

Si bien la aplicabilidad de la tecnología de DNA recombinante ha llegado a diversos campos y ha dado grandes resultados, todavía se discute cuán seguro es el utilizar estos productos alterados genéticamente, porque el investigador controla y determina los efectos primarios que se

vayan a producir, pero escapan de su control los efectos secundarios que se puedan producir por los procesos naturales de variación propios de los seres vivos, y una alteración significativa –de carácter aleatorio– en los organismos transgénicos de uso común (alimentos, cepas industriales, etc.) representaría un daño económico y humano muy grande si no se toman las previsiones del caso.

También se discute mucho acerca de la ética de experimentar con humanos, puesto que el factor intrínseco de variación puede dar resultados inesperados, sin embargo esta experimentación también puede conllevar aspectos positivos como la posibilidad de encontrar una cura para el cáncer.

En síntesis, la tecnología de DNA recombinante es una de las principales herramientas de biotecnología con la que cuenta el mundo actual, que al tener una variedad tan amplia de aplicaciones, que van junto con un cambio y mejoramiento dinámico constante, hacen que sea posible extender los horizontes de la cultura humana más allá de los límites que se tenían hace algunos años, y por consiguiente ha llevado a mejorar la calidad de vida de millones de personas que se han visto beneficiadas con estas aplicaciones. Sin embargo, se debe tener muy en cuenta que la utilización de ésta y otras técnicas de biotecnología conllevan riesgos potenciales y problemas éticos que no pueden ni deben pasar desapercibidos.

6- Indicaciones Generales:

Después de Haber analizado el contenido, presentado anteriormente sobre el ADN recombinante:

1- Los estudiantes de tecnología médica trabajaran en la confección de un modelo de estructura, funcionamiento y aplicación del mismo.

2- Los temas pueden abarcar campos sobre:a- Medicinab- Terapias génicasc- Agriculturad- Bioplásticose- Metabolizar el petróleof- Genes para enfermedades

g- Investigación en humanosh- Clonación moleculari- Biorremediar ambientes contaminadosj- Silenciamiento del RNA

3- Incluir Algunos cuestionamientos éticos4- Presentar el material seleccionado para explicarlo en charla5- Presentar mural con las imágenes de los modelos y parte de la

información que ayuda a comprender en que consiste.