2017

TRABAJO PRACTICO N° 4: ANTIMICROBIANOS

MÉTODOS DE DIFUSIÓN Y MÉTODOS DE DILUCIÓN – CÁLCULO DE CIM Y CBM

Objetivos

- Que el estudiante conozca las distintas técnicas de difusión y dilución que permiten establecer el perfil de sensibilidad antimicrobiana de los

- Que el estudiante pueda calcular e interpretar la CIM y CBM

En la actualidad la utilización indiscriminada de antibióticos ha producido un aumento en la

resistencia de las bacterias. Es importante que el médico suministre el antibiótico cuando es

necesario y el correspondiente para eliminar al microorganismo . Para esto se utilizan pruebas

para conocer que antibiótico es efectivo para el microorganismo causal el cual se manifestará

SENSIBLE.

Materiales:

§ Cultivo Puro de un microorganismo

§ Placa con medio de Müeller-Hinton

§ Pinzas metálicas

§ Discos de antibióticos

Fig. N°1: foto extraída pág. sites.google.com

Fig. N° 2: Antibiograma es donde se observan las zonas de inhibición del desarrollo de la bacteria por parte del

antibiótico probado. tTomada de la página: www.brizuela-lab.com.ar

Figura N ° 3: Medición de los halos de inhibición. Tomado de http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com.ar/

Existen dos tipos de pruebas que miden este aspecto, uno es la “técnica de difusión en agar” en

donde se prueban diferentes antibióticos que están impregnados en discos de papel y se miden los

halos de inhibición del desarrollo bacteriano, (fig 2 y 3), y la otra técnica es “determinar para

conocer la concentración inhibitoria mínima” = CIM ó sea cual es la menor concentración del

antibiótico capaz de inhibir el desarrollo bacteriano y “la concentración bactericida mínima” =

CBM que es la menor concentración que elimina el 99.99 % de los microorganismos

Fig 4. Realiación de CIM y CBM.

IMPORTANTE !!!!

Para el tratamiento de las infecciones sistémicas la dosis del antibiótico en suero debe ser 3 a 5 veces el valor de la CIM Otra metodología para poder establecer el valor CIM para el microorganismo causal de un foco

infeccioso es “E-Test o épsilon test” el procedimiento consiste en inocular hisopando la

suspensión 0,5 MacFarland de la bacteria en 3 direcciones sobre un medio para antibiograma

(Müller Hinton) sobre el mismo se aplicará una tira de papel que contiene un gradiente de

concentración del antibiótico , se dejará incubar a 35-37 ° por 24 hs para posteriormente observar la

formación de una elipse de inhibición de crecimiento que corta por su extremo a la tira en una

determinada concentración que es el valor CIM

A) Preparación suspensión del microrganismo

B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.

2 ml Sol ATB

Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo

Seleccionar 4 - 5 colonias

Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF

en SF estéril.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Descartar

Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración

C) Siembra

Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)

Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal

Control de crecimiento +. Sin ATB

Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.

D) Determinación de la CIM y la CBM

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

A) Preparación suspensión del microrganismo

B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.

2 ml Sol ATB

Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo

Seleccionar 4 - 5 colonias

Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF

en SF estéril.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Descartar

Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración

C) Siembra

Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)

Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal

Control de crecimiento +. Sin ATB

Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.

D) Determinación de la CIM y la CBM

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo

Seleccionar 4 - 5 colonias

Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF

en SF estéril.

2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml

Descartar

Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración

C) Siembra

Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)

Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal

Control de crecimiento +. Sin ATB

Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.

D) Determinación de la CIM y la CBM

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

A) Preparación suspensión del microrganismo

B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.

2 ml Sol ATB

Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo

Seleccionar 4 - 5 colonias

Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF

en SF estéril.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Descartar

Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración

C) Siembra

Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)

Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal

Control de crecimiento +. Sin ATB

Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.

D) Determinación de la CIM y la CBM

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

A) Preparación suspensión del microrganismo

B) Preparación diluciones ATB - Caldo MH.

2 ml Sol ATB

Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo

Seleccionar 4 - 5 colonias

Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF

en SF estéril.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Descartar

Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración

C) Siembra

Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)

Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal

Control de crecimiento +. Sin ATB

Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.

D) Determinación de la CIM y la CBM

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

Pruebas de Pruebas de AntibiogramaAntibiograma -- Dilución en caldoDilución en caldo

Seleccionar 4 - 5 colonias

Cultivo puro - 24 Hs.Suspensión 0,5 MF

en SF estéril.

2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml 2 ml2 ml

Descartar

Cada tubo contiene 2 ml de caldo MH doble concentración

C) Siembra

Agregar a todos los tubos (excepto control -), 2 ml de la suspensión preparada en A)

Incubar a :35 - 37ºC, 24 Hs. en Atm Normal

Control de crecimiento +. Sin ATB

Control de crecimiento -Sin ATB ni m.o.

D) Determinación de la CIM y la CBM

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

CIM

CBM

Incubación:35 - 37ºC24 Hs. Atm Normal

Tuboscondiferentesconcentraciones deantibiótico

Secolocalamismacantidaddemicroorganismo

Fig 5. Valor de corte del Mic . Tomado de : http://www.biomerieux-diagnostics.com/etest

LO QUE DEBEMOS INTERPRETAR CON VALORES CIM Y CBM

ANTIFÚNGICOS:

Son los fármacos utilizados específicamente para tratamiento de infecciones por hongos y levaduras

(Fig 6), la terapéutica con los mismos ha sufrido una modificación en las últimas décadas,

dejándose de lado a los que pueden presentar mayor toxicidad o dificultades en su uso. Además se

fueron presentando resistencias.

Puede solicitar un mycograma de manera in vitro para estudio de las sensibilidades

Su clasificación puede ser en base al espectro, potencia, modo de acción.

Algunos antimicóticos son sistémicos o locales , su administración puede ser oral, tópica o

parenteral

CBM/CIM

MENOROIGUALA2 BACTERICIDA

MAYORA2 BACTERIOSTÁTICO

Fig 6. Sitio de acción de los antifúngicos. Tomado de http://www.medwave.cl/link.cgi/Medwave/PuestaDia/Cursos/3548

Por lo que resulta importante tener un conocimiento de las distintas sensibilidades a los diferentes

antimicóticos para optimizar el tratamiento antifúngico, para lo cual se pueden realizar 2

metodologías :

- DILUCIÓN EN CALDO

- DIFUSIÓN EN AGAR

DILUCIÓN EN CALDO:

Se coloca en tubos con un medio de cultivo adecuado ( caldo) para crecimiento de microorganismo

(hongo o levadura) se evalúa en diluciones decrecientes del antimicótico a ensayar. Así se

establecerá la CIM ( concentración inhibitoria mínima)

Se puede, también, evaluar en una microescala, es decir haciendo diluciones del antimicótico en

pocillos.

DIFUSIÓN EN AGAR:

Se inocula en un medio de cultivo sólido “agar” adecuado para el crecimiento de hongos o

levaduras y se depositan discos de papel impregnados del antifúngico a ensayar con una

concentración conocida. Después de incubar se observará una zona de inhibición del crecimiento

(halo) el tamaño del cual nos determinará si el hongo es sensible, intermedio o resistente para ese

antimicótico

El CLSI estandarizó el método de difusión en disco

La adición de azúcar al medio Müeller Hinton (para evaluación de sensibilidad) favorece el

crecimiento de las levaduras y aumenta la definición de los halos de inhibición. Fig 7.

Fig 7. Colocación de los discos en la placa de Müller Hinton.

TIPOS DE ANTIMICÓTICOS

Clasificación de los antifúngicos por su estructura:

Polienos Nistatina, natamicina, amfotericina B

Azoles Imidazol: micomazol, clotrimazol

Triazoles: fluconazol, itraconazol, ketoconazol

Triazoles de segunda generación: voriconazol, ravuconazol, posaconazol

Alilaminas Terbinafina, naftifina

Lipopéptidos Papulacandinas

Triterpenos glicosilados

Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina, micafungina

Pirimidinas fluoradas Flucitosina

Otros Yoduro de potasio, ciclopirox, tolnaftato, griseofulvin

Tanto para los antibióticos como para los antimicóticos los resultados de las lecturas de halos de

inhibición las se evalúan extrapolándolos en unas tablas estandarizadas por CLSI donde se

interpretan valores cortes por debajo de los cuales los microorganismos son RESISTENTES, rango

de sensibilidad intermedia y valores cortes por encima de los cuales se los cataloga de SENSIBLES.

Además, se pueden colocar los discos siguiendo determinadas estrategias de ubicación para poner

de manifiesto las resistencias (efecto de sinergia, achatamientos, manifestación de mecanismos de

inducción).

En caso de necesitarse se puede complementar con el valor CIM.