Transcripcin de la ciclooxigenasa-2 est regulada por el virus del papiloma humano 16 E6 y E7 oncoprotenas: evidencia de un intercambio correpresor/Coactivator

Resumenciclooxigenasa (COX-2) se sobreexpresa en virus del papiloma humano (HPV)-inducida por enfermedades, incluyendo cncer de cuello uterino. Aunque oncoprotenas HPV E6 y E7 han sido vinculada causalmente a cervical carcinognesis, se desconocen sus efectos sobre la expresin gnica de COX-2. Aumento de los niveles de ARNm de la COX-2, las protenas y la sntesis de prostaglandina E2 fueron detectado en HPV16 E6 y E7-expresando cncer cervical clulas (CaSki y SiHa) en comparacin con una lnea de clulas de cncer de cuello uterino no infectada (C33A). Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 inducida por transcripcin de COX-2 mediante la activacin del receptor del factor de crecimiento epidrmico (RFCE).Ras! va quinasa activada por mitgeno protena. Curiosamente, HPV16 oncoprotenas estimulan sealizacin de EGFR, en parte, al inducir la liberacin de amphiregulin, un ligando EGFR. Los efectos inductivos de HPV16 E6 y E7 fueron mediados por atascamiento mejorada de activador protena-1 para el AMP cclico (cAMP)-elemento responsivo (59 / 53) del promotor COX2. Tambin se investig la contribucin potencial de activacin y corepressors a HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de COX2. Ensayos de inmunoprecipitacin de cromatina indicaron que las oncoprotenas E6 y E7 inducida por la contratacin de fosforilada c-Jun, c-Fos, UbcH5 y sensible al campo elemento vinculante protena protena / p300 al promotor de COX-2. En contraste, E6 y E7 inhiben la Unin de la histona deacetilasa receptor 3-nuclear correpresor (NCoR) complejo al promotor de COX-2. Por otra parte, la sobreexpresin de NCoR haba bloqueado E6 y E7-mediada por la estimulacin de la promotora de COX-2. Tomados en conjunto, estos resultados indican que oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimularon la transcripcin de la COX-2 induciendo un intercambio correpresor/coactivator. A nuestro conocimiento, este estudio tambin proporciona la primera evidencia que NCoR puede funcionar como un represor de la expresin gnica de COX-2.--- La ciclooxigenasa (COX-2) se sobreexpresa en el virus del papiloma humano (VPH) enfermedades inducidas, incluyendo el cncer cervical. Aunque el VPH E6 y E7 oncoprotenas han sido causalmente relacionado con la carcinognesis cervical, sus efectos sobre la COX-2 de expresin gnica son desconocidos. Se detectaron niveles aumentados de COX-2 mRNA, protena, y la prostaglandina E (2) la sntesis en HPV16 E6 y E7-expresin de clulas de cncer cervical (CaSki y SiHa) en comparacin con una lnea celular de cncer cervical no infectada (C33A). HPV16 E6 y E7 oncoprotenas inducidos COX-2 mediante la activacin de la transcripcin del receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) -> Ras -> activada por mitgeno va de la protena quinasa. Curiosamente, oncoprotenas HPV16 estimularon la sealizacin de EGFR, en parte, mediante la induccin de la liberacin de anfirregulina, un ligando de EGFR. Los efectos inductivos de HPV16 E6 y E7 fueron mediados por un aumento de unin de activador de la protena-1 a la AMP (cAMP) elemento -responsive cclico (-59 / -53) del promotor de la COX-2. La contribucin potencial de coactivadores y corepressors a HPV16 E6 y E7 mediada por la induccin de Tambin se investig la COX-2. Ensayos de inmunoprecipitacin de la cromatina indicaron que las oncoprotenas E6 y E7 induce el reclutamiento de fosforilados c-jun, c-Fos, UBCh5, y-AMPc que responde de unin a elemento de unin protena-protena / p300 con el promotor de la COX-2. En contraste, E6 y E7 inhiben la unin de la histona desacetilasa corepressor receptor (NCoR) complejo 3-nuclear al promotor de la COX-2. Por otra parte, la sobreexpresin de NCoR bloqueado S6- y la estimulacin del promotor de la COX-2 E7-mediada. Tomados en conjunto, estos resultados indican que HPV16 E6 y E7 oncoprotenas estimulados COX-2 mediante la induccin de la transcripcin de un intercambio corepressor / coactivador. Hasta donde sabemos, este estudio tambin proporciona la primera evidencia de que NCoR puede funcionar como un represor de la COX-2 de expresin gnica.

Introduccin El Cncer Cervical es la segunda causa ms comn de muerte por cncer entre las mujeres en todo el mundo y sigue siendo una causa importante de mortalidad entre las mujeres en edad reproductiva en los pases en desarrollo (1). En los Estados Unidos, f10, 000 mujeres son diagnosticadas con cncer cervical cada ao (2). Durante los ltimos 20 aos, fuerte evidencia epidemiolgica y experimental ha relacionado la infeccin con ciertos tipos de alto riesgo del virus del papiloma humano (VPH) con el desarrollo de cncer de cuello uterino (3). HPV16 representa f50% de todas las malignidades cervicales (4). Los tipos de HPV de alto riesgo codifican dos oncoprotenas, E6 y E7, los cuales estn involucrados en la transformacin celular (5). E6 y E7 estimulan la proliferacin celular al interferir con la funcin de protenas reguladoras en las clulas, incluyendo el tumor supresores p53 y Rb (6, 7). Adems de modulacin de supresores tumorales, oncoprotenas HPV E6 y E7 tienen otros efectos que contribuyen a la carcinognesis (8, 9). Recientemente, se han desarrollado vacunas profilcticas para prevenir el cncer cervical causado por el VPH tipos 16 y 18 (10). Por desgracia, estas vacunas son poco probable que sea un beneficio significativo a la gran cantidad de individuos con lesiones establecidas que ya estn infectadas con el VPH oncognico. Una comprensin detallada de los mecanismos que son moduladas por VPH E6 y E7 oncoprotenas podra fortalecer la justificacin para el uso de terapias dirigidas a prevenir o tratar el cncer de cuello uterino en individuos infectados. Cyclooxygenases (COX) cataliza el primer paso en la sntesis de prostaglandinas (PG) del cido araquidnico. Existen dos isoformas de COX. COX-1 se expresa constitutivamente en la mayora de los tejidos y parece mediar varias funciones fisiolgicas (11). Por el contrario, COX-2 es indetectable en los tejidos ms normales pero rpidamente es inducida por los oncogenes, factores de crecimiento, citoquinas y promotores de tumor (12 15). Mltiples lneas de evidencia sugieren que la COX-2 tiene un papel importante en la carcinognesis. COX-2 se sobreexpresa en las clulas transformadas y en varias malignidades, incluyendo cncer de cuello uterino (14, 16 19). En ratones transgnicos, la sobreexpresin de COX-2 condujo a cambios neoplsicos en el pecho, piel y pncreas (20 22). Crecimiento y formacin de tumores se redujeron en animales que fueron diseados para ser deficientes de COX-2 (23-25) o tratados con un inhibidor selectivo COX-2 (16, 26 29). El tratamiento con celecoxib, un inhibidor selectivo COX-2, ha demostrado eficacia en el tratamiento de los plipos colorrectales en seres humanos (30, 31). Recientemente, celecoxib tambin fue encontrado para ser activo en el tratamiento de mujeres con displasia cervical de alto grado (32). Varios diversos mecanismos potencialmente pueden explicar el vnculo entre COX-2 y malignidad. PGs COX-2 derivado pueden estimular la proliferacin celular, promover la angiognesis, aumentar la invasividad e inhiben la vigilancia inmunolgica y apoptosis (16, 33 37). Aunque COX-2 se sobreexpresa en enfermedades inducidas por HPV, incluyendo los cnceres cervicales y del pene (18, 19, 38, 39), es incierto si esto es una consecuencia de la transformacin de clulas o un efecto directo de las oncoprotenas HPV E6 y E7 en la transcripcin de la COX-2. Por lo tanto, el principal propsito del actual estudio fue determinar si oncoprotenas HPV16 E6 y E7 inducen la expresin gnica de COX-2. Mostramos que oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimularon la transcripcin de la COX-2 mediante la activacin del receptor del factor de crecimiento epidrmico (RFCE).Ras! quinasa activada por mitgeno (MAPK)! va activator protein-1 (AP-1). Lo importante, la sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 tambin caus disociacin de correpresor receptor nuclear (NCoR) de la promotora de COX-2 en asociacin con el reclutamiento de c-Jun/c-Fos fosforilada y el coactivador AMP cclico (cAMP)-protena de unin a protenas elemento responsivo obligatoria (CBP) / p300. A nuestro conocimiento, este estudio proporciona la primera evidencia que NCoR puede reprimir la expresin gnica de COX-2, un hallazgo que podra ayudar a explicar por qu COX-2 normalmente no se expresa en el epitelio normal.

Figura 1. Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 inducen la transcripcin de COX-2. A, CaSki, SiHa y C33A las clulas se cultivaron en medio de cultivo durante 6 h. Este medio fue sustituido luego por medio fresco que contiene 10 Amol/L sodio Araquidonato. Treinta minutos ms tarde, el medio fue colectado para determinar cantidades de PGE2. Produccin de PGE2 se determin mediante inmunoensayo enzimtico. Columnas, es decir (n = 6); bares, SD *, P < 0.001, en comparacin con las clulas C33A. B, protena lisada celular (500 Ag) fue utilizado para immunoprecipitate COX-2 o h-actina de las clulas, tal como se describe en materiales y mtodos. Immunoprecipitates fueron luego cargado en gel de poliacrilamida-SDS 10%, electrophoresed y posteriormente transferida a nitrocelulosa. El inmunoblot fue sondeado con anticuerpos especficos para COX-2 o h-actina. C, ARN celular total fue aislado de las clulas CaSki, SiHa y C33A. RNA (10 Ag) fue agregado para cada carril. La mancha fue cruzado por hibridacin con sondas que reconocieron COX-2 mRNA y 18S rRNA. D, ncleos fueron aislados de clulas CaSki, SiHa y C33A. La COX-2 y 18S rRNA cDNAs fueron inmovilizados a membranas de nitrocelulosa y cruzado por hibridacin con las transcripciones de RNA nacientes etiquetadas. E y F, se analiz la expresin de COX-2 en C33A (E) o las clulas HEK293 (F) estable expresando su vector solo o HPV E6 o E7. Protena lisada de clulas (100 Ag) fue sometido a gel de SDS-poliacrilamida al 10%, electrophoresed y posteriormente transferida a nitrocelulosa. El inmunoblot fue sondeado con anticuerpos especficos para COX-2 o h-actina.

Materiales y mtodosMateriales. DMEM, MEM (EMEM) del guila, RPMI 1640 y LipofectAMINE eran de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Poly(deoxyinosinicdeoxycytidylic Acid) [poly(dI-dC)], antisueros de factor de crecimiento de h-actina y derivado de las plaquetas (PDGF), ratn normal IgG y o-nitrofenil-D-galactopiranosida eran de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). 2-Amino-3methoxyflavone (PD 98059), 600125 SP y AG1478 fueron de EMD Biosciences, Inc. (San Diego, CA). Reactivos de inmunoensayo enzimtico para los ensayos de PGE2 eran de Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI). [P 32]CTP, UTP [P 32] y [P 32] ATP eran de vida Perkin-Elmer y ciencias analticas (Wellesley, MA). Kits de cebado al azar eran de biociencias aplicadas Roche (Indianapolis, IN). Membranas de nitrocelulosa eran de Schleicher & Schuell Bioscience (Keene, NH). Reactivos para el anlisis de luciferasa fueron de luminiscencia analtica (San Diego, CA). El cDNA de 18S rRNA era de Ambion, Inc. (Austin, TX). Antisueros para COX-2, fosforilada de COX-1, c-Fos, c-Jun, c-Jun, NCoR1, Histona deacetilasa 3 (HDAC3), Transducina h-como 1 relacionados con protena (TBLR1), UbcH5 y CBP / p300 eran de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Antisueros de EGFR, fosforilada EGFR y kits para determinar actividades MAPK eran de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Western Blot los reactivos de deteccin [quimioluminiscencia mejorada (ECL)] fueron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). DNA plasmdico se prepar utilizando un kit de Promega Corp. (Madison, WI). Oligonucletidos fueron sintetizados por Sigmay Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX). ARN interferente pequeo (siRNA) a la protena verde fluorescente (GFP) y TBLR1 se obtuvo de Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO). Kits de cromatina (ChIP) de inmunoprecipitacin ensayo fueron comprados del Norte (Lake Placid, NY). Lneas celulares. Las clulas HEK293, SiHa, C33A y CaSki fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las clulas CaSki fueron mantenidas en RPMI 1640 con HEPES de Amol/L 25 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1% y 1% penicilina/estreptomicina. Las clulas C33A y SiHa fueron cultivadas en EMEM con 2 mmol/L de L-glutamina y Earle equilibrada solucin salina ajustado para contener bicarbonato de sodio 1,5 g/L y 0,1 mmol/L aminocidos no esenciales, piruvato de sodio 1,0 mmol/L y 10% SFB. Las clulas HEK293 fueron cultivadas en DMEM suplementado con 10% SFB. Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 se sobreexpresa en clulas HEK293 y lneas celulares C33A. Clones estable E6 y E7 se seleccionaron mediante Higromicina. Anlisis de la transcripcin reversa-PCR fue hecho para confirmar la expresin del transgn. Todas las clulas fueron crecidas a 60% de confluencia en un incubador de CO2/agua saturada de 5% en 37jC antes de ser colocado en el medio libre de suero durante 24 h. Posteriormente, se realizan tratamientos en medio libre de suero. Produccin de PGE2. Las clulas fueron plateadas en platos de seis pozos y crecidas hasta confluencia de 60% en medio de crecimiento. La cantidad de PGE2 liberada por las clulas se midi mediante inmunoensayo enzimtico. Produccin de PGE2 se normaliz a las concentraciones de protena. Western Blot. Lisados celulares fueron preparados por el tratamiento de las clulas con tampn de lisis [150 mmol/L de NaCl, 100 mmol/LTris (pH 8.0), 1% Tween 20, 50 mmol/L dietilditiocarbamato, 1 mmol/L de EDTA, 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoruro, 10Ag/mL aprotinina, inhibidor de la tripsina 10Ag/mL, leupeptin 10Ag/mL]. Lysateswere ultrasonicada durante 20 s en hielo y se centrifug a 10.000 g durante 10 min a sedimento el material particulado. Se midi la concentracin de protena del sobrenadante como se describi anteriormente (17).Protena (500 Ag) desde el sobrenadante fue preabsorbed con 20 AL normal de cabra IgG y 20 de IgG de conejo en 4jC; 20 entonces se agregaron de la protena G Plusagarose. La mezcla entonces se centrifug a 3.000 g durante 5 min en 4jC. El dibolo fue descartado. Antisuero de conejo (20 AL) COX-2 o h-actina entonces fue agregado para el sobrenadante; la mezcla se incub luego a 4jC en una plataforma oscilante para 1 h. protena A-agarosa (20 AL) entonces fue agregado, y la mezcla se incub en una plataforma oscilante de 16 h a 4jC; la mezcla entonces se centrifug a 3.000 g durante 5 min en 4jC. El sobrenadante fue desechado. Despus de lavar el sedimento cuatro veces con tampn de ensayo de radioinmunoprecipitacin, el sedimento se resuspendi y immunoblotting fue terminado. SDS-PAGE se realiz bajo condiciones en geles de poliacrilamida de 10% de reduccin. Las protenas resueltas fueron transferidas en hojas de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa fue luego se incubaron con anticuerpos primarios. Se utiliz el anticuerpo secundario IgG conjugado con peroxidasa de rbano. Las manchas blancas /negras probadas con el sistema de deteccin de la mancha blanca /negra occidental ECL segn las instrucciones del fabricante. Northern blotting. ARN celular total fue aislado de monocapas de clulas usando un kit de aislamiento de RNA de Qiagen, Inc. (Valencia, CA). ARN celular total (10 Ag) por lane fue electrophoresed en un gel de agarosa al 1.2% que contienen formaldehdo y transferido a membranas de nylon-apoyado. Despus de la coccin, las membranas fueron prehibridadas durante la noche en una solucin que contiene 50% formamida, cloruro de sodio 5 fosfato de sodio/EDTA tampn (SSPE), solucin de 5 Denhardt, 0.1% SDS, y Ag/mL 100 monocatenario ADN de esperma de salmn y luego hibridadas por 12 h a 42jC con sondas radiomarcado cDNA humano COX-2 y 18S rRNA. COX-2 y 18S rRNA sondas fueron etiquetadas con CTP [P 32] por cebado al azar. Despus de hibridacin,las membranas se lavaron dos veces por 20 min a temperatura ambiente en 2 PES y 0.1% SDS, dos veces por 20 min en la misma solucin en 55jC y dos veces por 20 min en 0.1 PES y 0.1% SDS en 55jC. Lavadas las membranas fueron sometidas luego a autorradiografa. Ensayo nuclear de la escorrenta. Las clulas (2,5 105) fueron plateadas en cuatro platos T150 para cada condicin. Las clulas se cultivaron en medio del crecimiento hasta f60% confluentes. Los ncleos fueron aislados y almacenados en nitrgeno lquido. Para el anlisis de la transcripcin, ncleos (1.0 107) se descongelan y se incubaron en tampn de reaccin [10 mmol/L de Tris (pH 8), 5 mmol/L de MgCl2, 0,3 mol/L de KCl] que contiene 100 ACi de Uridina 5-[a - 32P] trifosfato y 1 mmol/L de sin etiqueta nucletidos.Despus de 30 min, labelednascentRNAtranscriptswere aislado. El humano COX-2 y 18S rRNA cDNAs fueron inmovilizados en nitrocelulosa y prehibridadas durante la noche en tampn de hibridacin. Hibridacin se llev a cabo en el 42jC durante 24 h utilizando igual cpm/mL de transcritos de RNA nacientes etiquetados para cada grupo de tratamiento. Las membranas se lav dos veces con tampn SSC 2 por 1 h a 55jC y luego tratadas con 10 mg/mL de RNasa A en SSC 2 a 37jC durante 30 minutos, seca y autoradiographed. Plsmidos. Las construcciones de promotor de COX-2 (1.432 / + 59, 327 / + 59, 220 / + 59, 124 / + 59, 52 / + 59, KBM, ILM, CRM y ILM) fueron un regalo generoso de Dr. Tadashi Tanabe (Instituto Nacional de investigaciones cardiovasculares, Osaka, Japn; Ref. 40). HPV16 E6 y E7 vectores de expresin eran de Dr. Craig Woodworth (Universidad de Clarkson, Potsdam, NY). El cDNA humano de COX-2 fue generosamente proporcionado por el Dr. Stephen M. Prescott (Fundacin de investigacin mdica de Oklahoma, Oklahoma City, OK). Vectores de expresin quinasa regulada por seales extracelulares (ERK) fueron proporcionados por el Dr. Melanie Cobb (Southwestern Medical Center, Dallas, TX). Los vectores de la expresin de c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) fueron un regalo del Dr. Roger Davis (Universidad de Massachusetts, Worcester, MA). Las construcciones de Ras fueron regalos de Dr. Geoffrey Cooper (Universidad de Harvard, Cambridge, MA). Los vectores de expresin para la Royal Air Force-1 y deficiencia de la cinasa de la Royal Air Force-1 se obtuvieron del Dr. Ulf Rapp (Universidad de Wurzburgo, Wurzburgo, Alemania). pSVbgal se obtuvo de Promega. Vectores de la expresin de NCoR y SMRT eran de Open Biosystems, Inc. (Huntsville, Alabama). Ensayos de transfeccin transitoria. Las clulas fueron sembradas a una densidad de 5 104 por pozo en platos de seis pozos y crecidas hasta un 50% a 60% de confluencia. Para cada pocillo, 2 Ag de ADN plsmido se introdujeron en las clulas usando 8 Ag LipofectAMINE segn las instrucciones del fabricante. Despus de 7 h de incubacin, el medio fue reemplazado por medio basal. Se midieron las actividades de luciferasa y h-galactosidasa en extracto celular. Oligonucleotides.Oligonucleotidescontaining COX-2 promotor sitios fueron sintetizados de la siguiente manera: CRE, 5-AAACAGTCATTTCGTCACATGGGCTTG-3 (sentido) y 5-CAAGCCCATGTGACGAAATGACTGTTT-3 (antisentido); mutante CRE, 5-AAACAGTCATTTAATCACATGGGCTTG-3 (sentido) y 5-CAAGCCCATGTGATTAAATGACTGTTT-3 (antisentido); factor nuclear-nB (NFnB), 5-AGGAGAGTGGGGACTACCCCCTCTG-3 (sentido) y 5-AGAGGGGGTAGTCCCCACTCTCCT-3 (antisentido); y el factor nuclear-interleucina-6 (NF-IL-6), 5-CCCACCGGGCTTACGCAATT-3 (sentido) y 5-AATTGCGTAAGCCCGGTGGG-3 (antisentido). Los oligonucletidos fueron sintetizados por las biotecnologas Genosys. Ensayo de turno movilidad electrofortica. Las clulas se cosecharon y se prepararon extractos nucleares. Para atar los estudios, se utilizaron oligonucletidos que contiene elementos de respuesta en el promotor de la COX-2. Los oligonucletidos complementarios se recuecen en 20 mmol/L de Tris (pH 7,6), 50 mmol/L de NaCl, MgCl2 de 10 mmol/L y 1 mmol/L de TDT. El oligonucletido recocido se fosforila al final 5-con quinasa de [g - 32P] ATP y T4 Polinucletido. La reaccin de unin fue realizada por incubacin 5 Ag deprotena nuclear en 20 mmol/L de HEPES (pH 7,9), 10% de glicerol, albmina de suero bovino de 300 Ag y 1 poly(dI-dC) Ag en un volumen final de 10 AL 10 min a 25jC. Los oligonucletidos marcados fue haba agregado a la mezcla de reaccin y permiti a incubar un adicional 20 min a 25jC. Las muestras fueron electrophoresed en gel de poliacrilamida nondenaturing 4%. El gel fue luego secado y sometido a autorradiografa en 80jC. Ensayo de chIP. Ensayo de chIP se realiz con un kit (norte) segn las instrucciones del fabricante. Las clulas (1 106) fueron reticuladas en una solucin de formaldehdo 1% durante 10 minutos a 37jC. Las clulas fueron lisis en 200 buffer de SDS y sonicadas para generar fragmentos de ADN de 200 a 1.000 bp. Despus de la centrifugacin despejado el sobrenadante se diluy hasta 10 veces con ChIP de bfer y se incubaron con 1.5 Ag del anticuerpo indicado en 4jC. Complejos inmunes se precipit, lavados y eluidos como se recomienda. DNAprotein enlaces cruzados fueron invertidas por calentamiento de la 65jC durante 4 h, y los fragmentos de ADN fueron purificados y disuelto en agua AL 50. Cada muestra (10 AL) fue utilizado como una plantilla para la amplificacin por PCR. Secuencias de oligonucletidos de COX-2 para iniciadores PCR fueron 5-AAAGCTATGTATGTATGTGCTGCAT-3 y 5-AACCGAGAGAACCTTCCTTTTTAT-3. Este primer conjunto abarca el tramo de promotor de COX-2 de nucletido 7to 621, que incluye el sitio de unin de CRE. PCR se realiz en 94jC para 30 s, 60jC para 30 s y 72jC para 45 s de 30 ciclos. Los productos PCR generados a partir de la plantilla ChIP fueron ordenados y se confirm la identidad de la promotora de COX-2. Estadsticas. Se hicieron comparaciones entre grupos de prueba t de Student. La diferencia entre los grupos de P < 0,05 fue considerado significativo.Resultados HPV16 E6 y E7 inducen la transcripcin de la COX-2. Inicialmente, se compararon los niveles de produccin de PGE2 en dos HPV16-expresando lneas celulares de cncer de cuello uterino (CaSki y SiHa) frente a una lnea de clulas de cncer de cuello uterino no infectados con VPH (C33A; Ref. 41). Como se muestra en la figura 1A, las lneas celulares tanto CaSki y SiHa producen PGE2 ms que la lnea celular C33A. Para determinar si estas diferencias en la biosntesis de PGE2 potencialmente reflejaban diferencias en la expresin de COX-2, se realiz el anlisis de immunoblot. En consonancia con las diferencias observadas en la produccin de PGE2, CaSki y SiHa lneas celulares expresaron niveles ms elevados de la protena COX-2 que C33A las clulas (Fig. 1B). Similarmente, los niveles de ARNm de la COX-2 fueron ms altos en las clulas CaSki y menor en las clulas C33A (Fig. 1). Escurrimientos nucleares se hicieron para comparar las tasas de la transcripcin de la COX-2 entre las lneas tres celulares. Las tasas de transcripcin de COX-2 fueron ms altos en las clulas CaSki y menor en las clulas C33A (Fig. 1 D). colectivamente, estos resultados sugieren la posibilidad que HPV16 oncoprotenas activan transcripcin de COX-2, llevando a niveles ms altos de produccin de PGE2 en lneas celulares HPV16infected (CaSki y SiHa) que en la lnea celular (C33A) que fue infectada por VPH. Para evaluar esta posibilidad, investigamos si overexpressing HPV16 E6 o E7 inducida por COX-2. Sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 caus un marcado incremento en los niveles de la COX-2 en ambos C33A (Fig. 1E) y las clulas HEK293 (Fig. 1F). Por el contrario, los niveles de la COX-1 fueron afectados (datos no mostrados). Definir el mecanismo de sealizacin mediante el cual HPV16 E6 y E7 inducen COX-2. A continuacin intentamos definir la va de transduccin de seal por el cual HPV16 E6 y E7 estimularon transcripcin de COX-2. Activacin de receptores tirosina kinasas, incluyendo el EGFR, puede estimular la transcripcin de la COX-2 (16, 17). Por lo tanto, investigamos si overexpressing HPV16 E6 o E7 aument la actividad tirosina quinasa EGFR en las clulas C33A. Overexpressing tampoco oncoprotena viral inducida EGFR, EGFR actividad tirosina quinasa y la expresin de COX-2 (Fig. 2A-C). A continuacin se realizaron experimentos para determinar si la activacin EGFR causal estuvo vinculada a induccin de COX-2. AG1478, un inhibidor de la tirosincinasa EGFR, suprimi la induccin de la COX-2 en las clulas C33A que sobreexpresa HPV16 E6 o E7 (Fig. 2D y E). Porque EGFR puede activarse mediante mecanismos intracelulares o extracelulares, Investigamos si un anticuerpo en el sitio de ligando EGFR suprimido HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2. Como se muestra en la Figura 2B y C, HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2 fue suprimida por este anticuerpo neutralizante. En contraste, control anticuerpos (IgG y anti-PDGF) no suprimi los niveles de la COX-2. Lo importante, EGFR puede activarse mediante varios ligandos diferentes. Con esto en mente, se realizaron experimentos para identificar el ligando EGFR que era responsable de HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2. En particular, un anticuerpo amphiregulin, un ligando EGFR, haba bloqueado HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2 (Fig. 2F). En este contexto, observamos que amphiregulin lanzamiento fue aumentar f2-veces en ambas lneas celulares HPV16 overexpressing E6 y E7 C33A (datos no mostrados). Tambin se midieron los niveles de actividad tirosina quinasa EGFR en clulas SiHa, CaSki y C33A. En consonancia con las diferencias observadas en los niveles de la protena COX-2 (Fig. 1B), las lneas celulares CaSki y SiHa expresaron niveles ms altos de EGFR y haba fosforilada EGFR que C33A las clulas (Fig. 2). En mayor apoyo del papel para la activacin del EGFR sealizacin conduccin expresin COX-2, el tratamiento con AG1478 (Fig. 2 H) o los anticuerpos al EGFR o amphiregulin suprimieron los niveles de la COX-2 en clulas CaSki (Fig. 2I). Transfecciones llevaron a cabo para definir la va de transduccin de seal corriente abajo de EGFR que era responsable de HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2. Overexpressing Ras o Raf estimul la actividad promotora de COX-2(datos no mostrados). Overexpressing formas dominantes negativos de quinasa Raf o Ras abrogado HPV16 E6 y E7-mediada por estimulacin de la actividad promotora de COX-2 (Fig suplementarios. S1). Ras de sealizacin puede alterar la expresin gnica mediante la activacin de las MAPKs distintas (42). Por lo tanto, era importante, para investigar si el aumento de la actividad MAPK contribuy a HPV16 E6 - y E7mediated la induccin de la COX-2. Inicialmente, se compararon las actividades MAPK en las dos HPV16-expresando cervical lneas celulares de cncer (CaSki y SiHa) frente a una lnea de clulas de cncer de cuello uterino no infectada con VPH (C33A). En consonancia con las diferencias observadas en la expresin de COX-2 (Fig. 1B) y produccin de PGE2 (Fig. 1A), las lneas celulares CaSki y SiHa expresan mayores niveles de actividad de ERK1/2 y JNK que C33A las clulas (Fig. 3A y C). Enfoques farmacolgicos y genticos a continuacin fueron utilizados para evaluar el vnculo entre la actividad MAPK y expresin de la COX-2 en clulas HPV16 E6 - y E7expressing. En el primer experimento, utilizamos PD 98059, un inhibidor especfico de la quinasa MAPK, que impide la activacin de ERK1/2. Tratamiento con PD 98059 suprime la expresin COX-2 en las clulas CaSki (Fig. 3B); SP 600125, un inhibidor de JNK, tambin suprime los niveles de la COX-2 (Fig. 3D). Para profundizar ms sobre la importancia de las MAPK en la mediacin de la induccin de la COX-2, se realizaron una serie de transfecciones. En concordancia con los resultados farmacolgicos, overexpressing dominantes negativos de ERK1 o JNK suprimi HPV16 E6 o E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2 (Fig. 3E).

Figura 2. HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2 es dependiente de la activacin del EGFR. A, C33A las clulas fueron transfected estable con vector vaco (V), HPV16 E6 (E6), o E7 de HPV16 (E7). Protena lisada de clulas (500 Ag) fue objeto de inmunoprecipitacin con anticuerpos phosphotyrosine, EGFR, o h-actina. Los immunoprecipitates fueron sometidos luego a Western blotting. Las manchas blancas /negras probadas con los anticuerpos a fosforilada EGFR (pEGFR), EGFR y h-actina. B y C, C33A las clulas transfected estable con el vector vaco, HPV E6 (B), o VPH E7 (C) se cultivaron en medio con o sin el tratamiento indicado anticuerpo (AC) para 12 h. D y E, C33A las clulas transfected estable con HPV E6 (D) o HPV E7 (E) fueron tratadas con 0 a 500 nmol/L de AG1478 de 12 h. F, C33A las clulas transfectadas estable con E6 VPH o HPV E7 se cultivaron en medio con anticuerpos amphiregulin (AR) o IgG para 12 h. B a F, protenas lisado de clulas (100 Ag) fue sometido a gel de SDS-poliacrilamida al 10%, electrophoresed y posteriormente transferida a nitrocelulosa. Los immunoblots fueron sondeados secuencialmente con anticuerpos especficos para COX-2 o h-actina. G, los niveles de fosforilada EGFR y EGFR se compararon en clulas SiHa, CaSki y C33A. El anlisis de Immunoblot se llev a cabo como se describi anteriormente. H, CaSki las clulas fueron tratadas con 0 a 500 nmol/L de AG1478 de 12 h. Posteriormente, protena lisada de clulas (500 Ag) fue objeto de inmunoprecipitacin con anticuerpos de COX-2 o h-actina y los immunoprecipitates fueron sometidos a Western blotting. Yo, CaSki las clulas se cultivaron en medio con o sin los anticuerpos indicados para 12 h. Posteriormente, se realiz anlisis como (H).

Figura 3. Actividades de ERK1/2 y JNK son importantes para HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la expresin de COX-2. Se midieron las actividades de ERK1/2 (A) y JNK (C). B, las clulas fueron tratadas con vehculo (carril 1) CaSki o 100 Amol/L PD 98059 (carril 2) para 8 H.d., CaSki las clulas fueron tratadas con vehculo (carril 1) o 1Amol/L SP 600125 (carril 2) para 8 h.B y D, despus de los tratamientos indicados, 500 Ag de protena lisado celular fueron immunoprecipitated con los anticuerpos a COX-2 o h-actina. Los immunoprecipitates fueron luego cargan en un gel de poliacrilamida-SDS 10%, electrophoresed y posteriormente transferida a nitrocelulosa. Immunoblots fueron sondeados por separado para COX-2 y h-actina. E, C33A las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de una construccin de 5-regin sin traducir de COX-2 humana ligada a la luciferasa (327 / + 59) y 0,2 Ag de pSVbgal. VPH E6 y E7 del VPH, las clulas que recibieron 0.45 Ag de expresin vector HPV16 E6 o E7, respectivamente. VPH E6 + DN ERK1 y VPH E6 + DN JNK, clulas recibi 0.45 Ag de expresin vectores para E6 HPV16 y formas dominantes negativos ERK1 o JNK, respectivamente. E7 HPV + DN ERK1 y E7 HPV + DN JNK, clulas recibi 0.45 Ag de expresin vectores para E7 de HPV16 y ERK1 o JNK dominantes negativos, respectivamente. La cantidad total de ADN en cada reaccin se mantuvo constante en 2 Ag utilizando el correspondiente vector de expresin vaca. Veinticuatro horas despus de la transfeccin, las clulas eran lisis y se midieron las actividades del reportero. Actividad de luciferasa representa los datos que han sido normalizados para actividad h-galactosidasa. Columnas, es decir (n = 6); bares, SD

Figura 4. Localizacin de la regin del promotor de COX-2 que media los efectos de las oncoprotenas HPV16 E6 y E7. Un diagrama esquemtico del promotor humano de COX-2. Las clulas C33A fueron transfectadas con 0.9 Ag de una serie de creaciones humanas de promotor-luciferasa COX-2 (1.432 / + 59, 327 / + 59, 220 / + 59, 124 / + 59 y 52 / + 59). VPH E6 y E7 de HPV, clulas que tambin recibieron 0.9 Ag de vector de expresin de oncoprotenas HPV16 E6 y E7. B, C33A las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de una serie de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59, KBM, ILM y CRM). KBM, 327 / + 59 construccin de promotor de COX-2 en el cual el sitio NF-nB fue mutagenized; ILM, 327 / + 59 construccin de promotor de COX-2 en el cual el sitio NF-IL-6 fue mutagenized; CRM, 327 / + 59 construccin de promotor de COX-2 en el cual la CRE fue mutagenized. Columnas negras, las clulas que tambin recibieron 0.9 Ag del vector de la expresin de E6 HPV16; columnas grises, las clulas que tambin recibieron la oncoprotena E7 del HPV16. A y B, todas las clulas recibieron 0.2 Ag de pSVbgal. La cantidad total de ADN en cada reaccin se mantuvo constante en 2 Ag mediante el uso de vectores vaca. Actividades de reportero se midieron en extracto celular 24 h despus de transfeccin. Actividad de luciferasa representa los datos que han sido normalizados para actividad h-galactosidasa. Columnas, es decir (n = 6); barras, SD

VPH (C33A). En consonancia con las diferencias observadas en la expresin de COX-2 (Fig. 1B) y produccin de PGE2 (Fig. 1A), las lneas celulares CaSki y SiHa expresan mayores niveles de actividad de ERK1/2 y JNK que C33A las clulas (Fig. 3A y C). Enfoques farmacolgicos y genticos a continuacin fueron utilizados para evaluar el vnculo entre la actividad MAPK y expresin de la COX-2 en clulas HPV16 E6 - y E7expressing. En el primer experimento, utilizamos PD 98059, un inhibidor especfico de la quinasa MAPK, que impide la activacin de ERK1/2. Tratamiento con PD 98059 suprime la expresin COX-2 en las clulas CaSki (Fig. 3B); SP 600125, un inhibidor de JNK, tambin suprime los niveles de la COX-2 (Fig. 3D). Para profundizar ms sobre la importancia de las MAPK en la mediacin de la induccin de la COX-2, se realizaron una serie de transfecciones. En concordancia con los resultados farmacolgicos, overexpressing dominantes negativos de ERK1 o JNK suprimi HPV16 E6 o E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2 (Fig. 3E). El elemento sensible al campamento, AP-1 y NCoR estn involucrados HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la transcripcin de la COX-2. Overexpressing HPV16 E6 o E7 causada un significativo aumento en la actividad de promotor de COX-2 con todo COX-2 promotor canceladura construcciones, excepto el 52 / + 59 construir (Fig. 4A), sugiriendo que el sitio CRE puede ser responsable de mediar los efectos de las oncoprotenas. Para evaluar esta posibilidad, se realizaron transfecciones utilizando construcciones de promotor de COX-2 en la que distintos elementos haban sido mutados. Como se muestra en la Figura 4B, mutagenizing la CRE sitio caus una prdida de la sensibilidad a HPV16 E6 y E7. En contraste, mutando el NF-nB o NF-IL-6 sitios no tuvo efecto en HPV16 E6 o E7-mediada por la activacin del promotor de COX-2. A continuacin se realizaron ensayos de turno movilidad electrofortica (EMSA) para identificar el factor de transcripcin responsable de HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2. Overexpressing HPV16 E6 o E7 condujo a mayor atascamiento de la protena nuclear al sitio CRE de la promotora de COX-2 (Fig suplementarios. S2A). Este aumento de atar a la CRE de COX-2 fue competido por incubacin extracto nuclear de clulas overexpressing HPV16 E6or E7 con un centesimal exceso de sondas CRE o AP-1 sin etiquetar (Fig suplementarios. S2B y C). Encuadernacin no fue competido cuando extractos nucleares se incubaron con un centesimal exceso de etiqueta CEBP-a, NF-nB o mutante CRE sondas. Supershifts llevaron a cabo para determinar la composicin de la protena de unin a nuclear compleja que reconoci la CRE. Como se muestra en la Fig. suplementaria. S2D y E, tanto fosforilada c-Jun y c-Fos estaban presentes en el complejo de clulas overexpressing HPV16 E6 C33A. Fosforilada c-Jun y c-Fos tambin estuvieron presentes en el complejo en clulas overexpressing HPV16 E7 C33A (datos no mostrados). En consonancia con las diferencias observadas en la expresin de COX-2 (Fig. 1B) y transcripcin (Fig. 1D), altos niveles de protenas nucleares de unin a la CRE de COX-2 fueron encontrados en clulas CaSki y SiHa HPV16 infectados contra las clulas no infectadas C33A (Fig suplementarios. S2F). Supershifts se realizaron usando la protena nuclear de las clulas CaSki. En concordancia con los resultados en las clulas C33A overexpressing E6 y E7 de HPV16, fosforilada c-Jun y c-Fos se identificaron en el atascamiento complejo (Fig suplementarios. S2G). Para examinar ms lejos el mecanismo por cual HPV16 E6 o E7 estimular la transcripcin de la COX-2, se realizaron ensayos de ChIP. Complejos de protena-DNA fueron immunoprecipitated con diversos anticuerpos y encuadernados fragmentos de ADN fueron recuperados y sometidos a la PCR semicuantitativa con oligonucletidos especficos para la promotora de COX-2. La Unin de unphosphorylated c-Jun al promotor de COX-2 no fue alterada en las clulas C33A que sobreexpresa HPV16 E6 o E7 (Fig. 5A). En contraste, la sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 condujo a aumento obligatorio de c-Fos y CBP/p300, un coactivador de AP-1 mediada por transcripcin. Recientemente, NCoR fue encontrada para servir como un punto de control que controla el intercambio de seal dependiente de c-Jun / complejos correpresor de c-Jun/c-Fos/coactivator complejos (43). Por lo tanto, tambin se investig si la sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 modulada NCoR vinculante a la CRE de COX-2. En particular, NCoR vinculante fue sobresedo en asociacin con aumento obligatorio de c-Fos y CBP/p300 (Fig. 5A). En contraste, atascamiento del mediador silenciamiento altamente relacionado del retinoico cido y la hormona tiroidea receptor (SMRT) fue afectadas (datos no mostrados). Se utiliz una estrategia similar para comparar clulas CaSki y SiHa, las lneas de celulares de cncer cervical de dos HPV16expressing, con las clulas C33A, la lnea celular de cncer de cuello uterino que es infectada por VPH. En particular, los niveles ms altos de encuadernacin de c-Fos y CBP/p300 fueron detectados en las clulas CaSki, con los niveles ms bajos de la Unin de cada una de estas protenas que se encuentran en las clulas C33A (Fig. 5A). Se observ el patrn opuesto de enlace para NCoR. Ms especficamente, el ms alto nivel de enlace de NCoR fue encontrado en las clulas C33A y el menor nivel de enlace en CaSki clulas (Fig. 5A). Consistentes con los efectos represivos de NCoR, actividad promotora de COX-2 fue ms baja en las clulas C33A y mayor en las clulas CaSki (Fig. 5B, una). En particular, overexpressing NCoR pero no SMRT caus una reduccin marcada en actividad promotora de COX-2 en CaSki clulas (Fig. 5B, b) y bloqueado HPV16 E6 y E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2 en las clulas C33A (Fig. 5B, c y d). Colectivamente, la mayor Unin de la AP-1 y CBP/p300 y atar reducido de NCoR a la CRE de COX-2 en HPV16 E6 y E7-expresando cncer cervical lneas celulares (CaSki y SiHa) frente a los no infectados C33A celular linecorrespondedtothe differencesin COX-2 transcripcin (Fig.1D) y la actividad promotora de COX-2 (Fig. 5B, un) que fueron observados. Estudios anteriores de regulacin gnica dependiente AP 1 indican un papel esencial de la fosforilacin de c-Jun NH2-terminal para el reclutamiento de TBLR1dependent de la maquinaria proteoltica necesaria para NCoR y HDAC3 despido y coactivator exchange (43, 44). Por lo tanto, investigamos si HDAC3 y TBLR1 fueron destinados a la promotora de COX-2. Como se muestra en la figura 5, a, la sobreexpresin de oncoprotenas HPV16 E6 y E7 conducido a la prdida de HDAC3 vinculante al promotor de COX-2. Por otro lado No en el enlace de TBLR1 que el promotor de la COX-2 se observ diferencia en la sobreexpresin de HPV16 oncoprotenas (Fig. 5, a). Sin embargo, TBLR1 fue encontrada para ser funcionalmente importantes para la estimulacin mediada por la oncoprotena HPV16 de transcripcin de COX-2 (Fig. 5, b y c). Ms especficamente, siRNA a TBLR1 haba bloqueado HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la actividad promotora de COX-2. Seal-dependiente de la fosforilacin de c-Jun tambin es conocida como causantes de reclutamiento TBLR1-dependiente de la enzima ubiquitina-conjugadoras UbcH5, conduce a la eliminacin proteoltica del complejo NCoR-HDAC3 (43, 44). Para determinar si HPV16 mediada por la oncoprotena activacin de JNK result en reclutamiento de c-Jun fosforilada y UbcH5 a la promotora de COX-2, se realizaron ensayos de ChIP. Como se muestra en la figura 5, la sobreexpresin de HPV16 E6 y E7 condujo a enlace mejorada de c-Jun fosforilada y UbcH5 al promotor de COX-2. Del mismo modo, atascamiento de c-Jun fosforilada y UbcH5 al promotor de COX-2 fue realzada en HPV16 E6 - y E7-expresando las clulas CaSki y SiHa en comparacin con la lnea de la clula infectada C33A (Fig. 5).Discusin COX-2 se sobreexpresa en enfermedades relacionadas con el VPH, incluyendo cncer de cuello uterino (18, 19, 38, 39). En el presente estudio, mostramos que oncoprotenas HPV16 E6 y E7 indujo la expresin gnica de COX-2. La induccin de la COX-2 por el HPV16 oncoprotenas fue mediada por la activacin de la RFCE.Ras!MAPK.Va AP-1. Varias observaciones apoyan un papel crtico para EGFR en HPV16 mediada por la oncoprotena induccin de COX-2. La sobreexpresin de E6 o E7 en clulas C33A estimula la expresin y la fosforilacin de EGFR mientras induccin de COX-2. Tratamiento con AG1478, un inhibidor de la tirosincinasa EGFR o bloqueo del anticuerpo del sitio ligando de EGFR haba abrogado HPV16 mediada por la oncoprotena induccin de COX-2. Lo importante, tanto AG1478 como los anticuerpos neutralizantesEGFR tambin los niveles de la COX-2 en clulas infectadas HPV16 CaSki suprimidos. EGFR puede activarse a travs de mecanismos intracelulares o extracelulares (45-47). El hecho de que un anticuerpo neutralizante EGFR bloqueado HPV16 mediada por la oncoprotena induccin de COX-2 sugiere un proceso extracelular. En consonancia con esta nocin, HPV16 oncoprotenas estimulan la liberacin de amphiregulin, un ligando de la RFCE. Lo ms importante, un anticuerpo amphiregulin bloquea la induccin de la COX-2 por el HPV16 oncoprotenas en clulas C33A y suprime la expresin de COX-2 en clulas CaSki. En particular, estos resultados son consistentes con la evidencia anterior que la activacin de sealizacin de EGFR puede conducir COX-2 transcripcin y biosntesis de PG (16, 47). Se llevaron a cabo experimentos adicionales para definir la va de transduccin de seal corriente abajo de EGFR que mediada por la induccin de la COX-2. Consistente con estudios previos (14, 17), la va Ras estuvo implicada. Dominantes negativos para Ras y Raf-1 bloquean HPV16 E6 y E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2. Varias lneas de evidencia sugieren que HPV16 inducida COX-2 mediante la activacin de JNK y MAPKs ERK. En primer lugar, las actividades de ERK1/2 y JNK fueron superiores en HPV16 E6 - y E7-expresando las clulas de cncer de cuello uterino (CaSki y SiHa) en comparacin con la lnea celular de cncer de cuello uterino no infectada (C33A). En segundo lugar, inhibidores de la quinasa MAPK y JNK suprimen los niveles de la COX-2 en clulas CaSki (Fig. 3B y D). En tercer lugar, la sobreexpresin de dominantes negativos de ERK1 y JNK suprimi la induccin de la actividad promotora de COX-2 por HPV16 E6 y E7 (Fig. 3E). Previamente, la activacin de JNK estuvo vinculada a mayor transcripcin de EGFR (48). Es razonable especular, por lo tanto, que la mayor actividad JNK contribuye a la sobreexpresin de COX-2 en clulas de cncer cervical expresando E6 y E7 de HPV16 y EGFR. Tambin Divulgamos que la induccin de la actividad promotora de COX-2 por oncoprotenas HPV16 E6 y E7 fue mediada a travs de una Unin AP-1 sitio ubicado 53 nucletidos aguas arriba del sitio Inicio transcripcional (Fig. 4). EMSAs demostr mayor Unin de fosforilada c-Jun y c-Fos, componentes del factor de transcripcin AP-1 del complejo, a la CRE de la promotora de COX-2 en clulas de cncer de cuello uterino HPV16 E6 - o E7expressing (Fig suplementarios. S2). Este resultado fue confirmado por anlisis del ChIP (Fig. 5). La importancia funcional de la AP-1 se estableci porque HPV16 E6 y E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2 fue suprimida por mutagenizing la CRE (Fig. 4B). Colectivamente, estos resultados son consistentes con la evidencia anterior que la estimulacin de las MAPKs resulta en la induccin de AP-1 dependiente de la transcripcin de la COX-2 (16, 17). Activacin y corepressors son importantes para AP-1 mediada por regulacin de la transcripcin de genes (43). Previamente, el coactivador CBP/p300 fue encontrado para ser muy importante para AP-1 mediadainduccin de la expresin de COX-2 (49, 50). En consonancia con esta nocin, ChIPassays revel una mayor asociacin entre CBP/p300 y la promotora de COX-2 en clulas oncoprotena-expresin HPV16 (Fig. 5). En condiciones basales, el correpresor NCoR complejo se ha encontrado para imponer un intercambio activo blockof de c-Jun de c-Jun/c-Fos heterodmeros (43). Esta funcin de control de NCoR es relevada por complejos de NCoR-HDAC3 de whichdirectsremovalof de seal-dependentphosphorylationofc-Jun, a travs de la contratacin de un complexleadingtoproteosomedegradation(43) especfico ubiquitinylation.En este estudio, se muestra por primera vez que NCoR acta como un control transcripcional de AP-1 mediada por la estimulacin de la transcripcin de la COX-2. Esta conclusin se basa en varios resultados. ChIP los anlisis indicaron que las oncoprotenas E6 y E7 inhibicin la Unin de la NCoRHDAC3 correpresor complejo mientras que induce el reclutamiento de fosforilada c-Jun, c-Fos, UbcH5 y CBP/p300 al promotor de COX-2. Compatible con NCoR funciona como un correpresor, se observ una relacin inversa entre el grado de interaccin NCoR con el promotor de la COX-2 (Fig. 5) y los niveles de transcripcin de COX-2 (Fig. 1). Se observaron altos niveles de interaccin entre NCoR y el promotor de la COX-2 en la lnea celular de HPV16 infectados C33A en el cual COX-2 transcripcin era insignificante. Sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 en clulas C33A condujo a una disminucin marcada en la interaccin NCoR con el promotor de la COX-2 (Fig. 5A) y un aumento en la expresin de COX-2 (Fig. 1E) recproco. Por otra parte, la interaccin entre NCoR y el promotor de la COX-2 fue insignificante en las clulas infectadas HPV16 CaSki en que COX-2 transcripcin era robusto. La sobreexpresin de NCoR tambin suprimi HPV16 E6 o E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2 (Fig. 5B, c y d). El hallazgo que NCoR inhibe la expresin de COX-2 en condiciones basales puede resultar muy importante para explicar por qu COX-2 normalmente no se detecta en las clulas epiteliales normales. Adems de proporcionar evidencia que NCoR inhibe la expresin de COX-2, este estudio muestra por primera vez que HPV oncoprotenas modulan la funcin de la correpresor NCoR. Nuestros resultados en combinacin con informes anteriores (43, 44) sugieren fuertemente un modelo por el que la activacin de JNK estimul la fosforilacin de c-Jun, provocando, a su vez, la degradacin y ubiquitinacin mediada por UbcH5de la NCoR-HDAC3 correpresor complejo y contratacin del complejo coactivator consistentes en fosforilada c-Jun-c-FosCBP/p300 (Fig. 6). Por lo tanto, oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimulan COX-2 transcripcin induciendo un intercambio correpresor/coactivator. Adems de HPV16 E6 y E7, otros oncoprotenas VPH pueden tener efectos similares. Por ejemplo, expresin E5 HPV puede causar un aumento dependiente de ligando en la fosforilacin de EGFR (51, 52) y por lo tanto, puede tambin inducir la transcripcin de COX-2. Los resultados de este estudio proporcionan otras ideas potencialmente significativos. Hemos demostrado que oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimularon la transcripcin de la COX-2 mediante el EGFR.Ras!MAPK.Va AP-1. Varios de estos efectos podra predecirse a apoyo sostenida infeccin con el VPH. Por ejemplo, como se dijo anteriormente, COX-2 PGs derivadas pueden estimular la proliferacin y la angiognesis la clula mientras que inhibe la apoptosis e inmune vigilancia (16, 33, 34, 37). De hecho, el tratamiento a corto plazo con el celecoxib inhibidor COX-2 produce una disminucin en los marcadores de ambos la proliferacin celular yangiognesis en pacientes con cncer cervical (53). Activacin del EGFR se reconoce bien a promover la mitognesis y angiognesis (45). Varios investigadores han demostrado importante diafona entre COX-2 y EGFR en otros contextos (46, 47). Por lo tanto, la sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 podra iniciar un ciclo de retroalimentacin positiva por el que la activacin del EGFR resulta en expresin realzada de la COX-2 y mayor sntesis de PGs, lder, a su vez, a un nuevo aumento en la actividad EGFR. Colectivamente, estos cambios inducidos por la oncoprotena HPV16 podra predecirse para apoyar una infeccin de HPV sostenida y promover la carcinognesis.

Figura 5. Transcripcin de la COX-2 est regulada por HPV16 E6 y E7 oncoprotenas mediante un intercambio correpresor/coactivator. Un ChIP se realizaron los ensayos. Se realiz una comparacin entre las clulas C33A que sobreexpresa vector HPV16 E6 y E7 de HPV16. Adicionalmente, se realizaron comparaciones entre C33A, SiHa y CaSki lneas celulares de cncer. Fragmentos de cromatina eran immunoprecipitated con los anticuerpos indicados, y en la regin promotora de COX-2 fue amplificada por PCR. Secuenciacin de ADN se llev a cabo, y el producto PCR fue confirmado para ser el promotor de la COX-2. Hemos podido detectar el promotor de la COX-2 (7 a 621) cuando se utiliz IgG normal o anticuerpo fue omitido en el paso de inmunoprecipitacin. B, a, C33A, SiHa y CaSki clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59). b, clulas fueron transfectadas con 0.9 CaSki Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59). Vector, clulas que tambin recibieron 0.9 Ag del vector; NCoR, las clulas que tambin recibieron 0.9 Ag de vector de expresin para NCoR; SMRT, clulas que tambin recibieron 0.9 Ag de expresin para SMRT. c, las clulas C33A fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59). Vector, las clulas que recibieron 0.9 Ag del vector solo; Vector + VPH E6, clulas que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de la expresin del vector para HPV16 E6; NCoR + VPH E6, clulas que recibieron 0.45 Ag de vector de expresin para NCoR y 0.45 Ag de la expresin del vector para HPV16 E6. d, C33A las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59). Vector, las clulas que recibieron 0.9 Ag del vector vaco solo; Vector + E7 HPV, las clulas que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de la expresin del vector para HPV16 E7; NCoR + E7 de HPV, las clulas que recibieron 0.45 Ag de vector de expresin para NCoR y 0.45 Ag de la expresin del vector para E7 de HPV16. a d, todas las clulas recibieron 0.2 Ag ofpSVbgal. La cantidad total de ADN en cada reaccin se mantuvo constante en 2 Ag mediante el uso de vectores vaca. Actividades de reportero se midieron en extracto celular 24 h despus de transfeccin. Actividad de luciferasa representa los datos que han sido normalizados para actividad h-galactosidasa. Columnas, es decir (n = 6); bares, SD. C, a, ChIP se realizaron ensayos. Se realiz una comparacin entre las clulas C33A que sobreexpresa vector HPV16 E6 y E7 de HPV16. Adicionalmente, se realizaron comparaciones entre C33A, SiHa y CaSki lneas celulares de cncer. Fragmentos de cromatina eran immunoprecipitated con los anticuerpos indicados, y en la regin promotora de COX-2 fue amplificada por PCR. Secuenciacin de ADN se llev a cabo, y el producto PCR fue confirmado para ser el promotor de la COX-2. Hemos podido detectar el promotor de la COX-2 (7 a 621) cuando se utiliz IgG normal o anticuerpo fue omitido en el paso de inmunoprecipitacin. b y c, C33A las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59). Vector, las clulas que recibieron 0.9 Ag del vector vaca solo. las clulas b, HPV E6, que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de la expresin del vector para HPV16 E6; VPH E6 + siRNA GFP, clulas que recibi 0.45 Ag del vector de la expresin de E6 HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a GFP; VPH E6 + siRNA TBLR1, clulas que recibi 0.45 Ag del vector de la expresin de E6 HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a TBLR1. las clulas c, E7 de HPV, que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de la expresin del vector para HPV16 E7; E7 HPV + siRNA GFP, las clulas que recibieron 0.45 vector de expresin Ag de E7 de HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a GFP; E7 HPV + siRNA TBLR1, las clulas que recibieron 0.45 vector de expresin Ag de E7 de HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a TBLR1. b y c, todas las clulas recibieron 0.2 Ag ofpSVbgal. Actividades de reportero se midieron en extracto celular 24 h despus de transfeccin. Actividad de luciferasa representa los datos que han sido normalizados para actividad h-galactosidasa. Columnas, es decir (n = 6); bares, SD. D, Se realizaron ensayos de chIP. Se realiz una comparacin entre las clulas C33A que sobreexpresa vector HPV16 E6 y E7 de HPV16. Adicionalmente, se realizaron comparaciones entre C33A, SiHa y CaSki lneas celulares de cncer. Fragmentos de cromatina eran immunoprecipitated con los anticuerpos indicados, y en la regin promotora de COX-2 fue amplificada por PCR. Secuenciacin de ADN se llev a cabo, y el producto PCR fue confirmado para ser el promotor de la COX-2. Hemos podido detectar el promotor de la COX-2 (7 a 621) cuando se utiliz IgG normal o anticuerpo fue omitido en el paso de inmunoprecipitacin.Figura 6. Esquema de va por la cual HPV16 oncoprotenas regulan la expresin de COX-2. Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimulan la produccin de amphiregulin y as activan EGFR.Ras!Sealizacin MAPK. El resultado, a su vez, la fosforilacin de c-Jun, conduciendo a la degradacin de TBLR1-dependiente del NCoR/HDAC3 correpresor complejo y reclutamiento del coactivador CBP/p300 y fosforilada heterodmero de c-Jun/c-Fos al promotor de COX-2. Este correpresor / intercambio coactivator accionado por HPV oncoprotenas conduce a mayor transcripcin de COX-2.