Transferencia de embriones en Porcino - Inicio · objetivo de obtener una mejora constante en los...
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El sector porcino está sometido a un proceso de evolución continuo con el objetivo de obtener una mejora constante en los rendimientos reproductivos en conjunción con una más eficiente conversión de las materias primas para finalmente obtener un producto que satisfaga las demandas del consumidor.
La mejora genética obtenida a través de los programas de selección son el motor que impulsa la evolución productiva en nuestros cerdos.
• Vía Animales Vivos Permite una mejora genética completa
Acarrea Riesgos Sanitarios Elevados Costes Económicos Compromete el bienestar animal
Intercambio de material genético
Riesgos Sanitarios
Estatus Sanitario en Riesgo
Entrada de nuevos patógenos
Desestabilización del equilibrio patogénico
Exige una adecuada adaptación y manejo sanitario de los animales así como un correcto uso de las cuarentenas
La mejora del estatus sanitario la sanidad a través de la aplicación de programas estrictos de bioseguridad y un mejor manejo sanitario son requisitos esenciales para alcanzar una producción rentable y eficiente.
Pérdidas en las granjas afectadas (US$/cerdo comercializado)
Enfermedad Reproducción Transición Engorde
PRRSV 7,29 2,86 4,34
M hyo 1,52 1,92 5,84
Influenza 1,65 1,62 3,37
PRRS + Mhyo 6,69
Holtkamp y cols, 2013
• Vía Semen Más seguro y económico
La mejora es sólo vía macho por lo que solo intervienen 50% genes
Pueden existir algunos riesgos sanitarios
Intercambio de material genético
La Alternativa TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
• Minimiza los riesgos sanitarios
• Permite introducir el genotipo completo
• Reduce los costes derivados del transporte
• Permite superar restricciones fronterizas
La Alternativa TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
• Minimiza los riesgos sanitarios
• Permite introducir el genotipo completo
• Reduce los costes derivados del transporte
• Permite superar restricciones fronterizas
• Evita los problemas de bienestar animal asociados al trannsporte de animales vivos
Lavado de los embriones en medio con antibióticos
(3-10 lavados)
La zona pelúcida es una barrera eficiente contra los patógenos
Los embriones intactos están libres de enfermedades
La Alternativa TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
• Minimiza los riesgos sanitarios
• Permite introducir el genotipo completo
• Reduce los costes derivados del transporte
• Permite superar restricciones fronterizas
Intercambio de Material Genético
Bisabuela (GGP)
Abuela (GP)
Madre (F1)
Transferencia Embrionaria
Núcleos de Selección Multiplicadores Granjas con núcleo cerrado
Obtención y transferencia de embriones porcinos
Obtención de los embriones
Evaluación de los embriones
Conservación de los embriones
Transferencia No quirúrgica de los embriones
Donantes
(Large White x Landrace)
Animales de alto valor genético
Preferiblemente con fertilidad probada (Multíparas)
Pueden ser superovuladas para aumentar el rendimiento de la obtención de embriones
Angel y cols, 2014
Los embriones obtenidos de cerdas donantes superovuladas no ven comprometida su viabilidad y permiten obtener similares tasas de gestación tras su transferencia no quirúrgica
La respuesta al tratamiento de superovulación puede ser muy variable dependiendo de:
• Raza / Línea Genética
• Granja (manejo)
• Individuo
• Estación
Es recomendable evaluar y ajustar el tratamiento a las condiciones particulares de las donantes
Detección del estro e Inseminación
1ª
Inseminación
Dosis seminal:
3000 x 10 sptz / 100 ml.
2ª
Inseminación
6
Inicio de celo
Día 0 Día 1 Día 2
D0= COMIENZO DEL ESTRO D0= hCG D0= PRIMERA INSEMINACIÓN D0= OVULACIÓN
CRONOLOGÍA DEL DESARROLLO EMBRIONARIO
Cronología: Tipo de embrión
Día 0
Inicio celo Día 1
Día 2 2-4 céls
Día 3 Día 4 Día 5
mórulas Día 6
blastocistos Día 7 Fín CIV
Existe cierta variabilidad dependiente de:
• Raza / Línea Genética
• Granja (manejo)
• Estación
• Azaperona • 2mg/kg body weight, im
Sedación
• Tiopental Sódico • 7 mg/kg body weight, iv
Inducción Anestesia
• Isofluorano • 3,5-5%, Inhalatorio
Mantenimiento anestesia
Anestesia
ba
e
dc
h
f
g
1. Se realiza una incisión el la línea media,
a través de la cual, se exterioriza parte
del aparato reproductor de la cerda. Se
realiza el recuento de cuerpos lúteos en
los ovarios.
2. Los embriones se recogen mediante el
lavado de la porción final de cada cuerno
uterino con 30 mL de protein-free embryo
recovery medium consisting of Tyrode's
lactate (TL)-HEPES-polyvinyl alcohol
(PVA)-modified medium (TL-HEPES-
PVA)
3. Tras la recogida, la incisión es suturada.
El procedimiento completo requiere
aprox. 15 min. La recuperación es total a
los 30-40 min.
Obtención de embriones
Valoración de los embriones Clasificación de los embriones según su estado de desarrollo
Día 2 Día 5 Día 6 Día 7
Valoración de los embriones
Clasificación de los embriones según la calidad embrionaria
Ovocitos no fecundados y embriones degenerados
Lavado de los embriones en medio con antibióticos
(3-10 lavados)
La zona pelúcida es una barrera eficiente contra los patógenos
Los embriones intactos están libres de enfermedades
Receptoras
(Large White x Landrace)
Multíparas
Nulíparas
No importa el valor genético de los animales
Preferiblemente con fertilidad probada (al menos 1-2 partos)
Procedentes del destete, con celo natural y buena condición corporal
(Martínez y cols.,2004)
Catéter de transferencia no quirúrgica de embriones (Deep Blue® ET Catéter, Minitube)
Firme
Flexible
Longitud: 1’60 m
Diámetro externo: 4 mm
Canal de trabajo: 0’7 mm
Receptoras No sedadas
Martínez y cols., 2002, 2004
La dificultad de la inserción del catéter puede variar en función de las características de la cerda receptora:
• Raza / Línea Genética Hemos observado mayor dificultad en razas blancas (Large White) en comparación con cerdas Duroc
La dificultad de la inserción del catéter puede variar en función de las características de la cerda receptora:
• Ciclo / Nº Partos Hemos observado mayor dificultad en nulíparas y cerdas con muchos partos.
Lo ideal son cerdas con un número de partos comprendido entre 1-4.
La dificultad de la inserción del catéter puede variar en función de las características de la cerda receptora:
• Individuo
Diferencias entre receptoras Se han observado particularidades anatómicas en cérvix y cuernos uterinos en diferentes razas e individuos que pueden explicar las diferencias en dificultad durante la inserción de la sonda de transferencia no quirúrgica.
Influencia del grado de Asincronia Donante-Receptora Diferencia entre el momento de inicio de celo en donante y receptora. 30 embriones (mórulas y/o blastocistos) transferidos por receptora
- 24 h 0 h + 24 h + 48 h
Receptoras (n) 9 31 74 18
Tasa Gestación (%) 11.1 % 61.3 % 85.1 % 50.0 %
Tasa de Parto (%) 0 % 61.3 % 81.1 % 50.0 %
LNT 10.5 ± 0.8 9.6 ± 0.4 9.2 ± 1.0
LNV 10.1 ± 0.8 8.9 ± 0.4 8.6 ± 0.9
Peso al nacimiento (Kg)
1.2 ± 0.1 1.7 ± 0.1 1.6 ± 0.1
Eficiencia Productiva de lechones (%)
20,6 % 24 % 14.3 %
Angel y cols, 2014
Preparación de la cerda receptora La cerda receptora en día 5-6 de ciclo (metaestro) carece de protección natural frente a una posible contaminación por lo que es crucial extremar las medidas higiénicas. • Disponer al animal en jaula de gestación, intentando garantizar la máxima
limpieza de la sala donde se realice la transferencia.
• Cuidar la limpieza y desinfección (clorhexidina) de la zona vulvar de la receptora
• Administrar dosis única de antibiótico (amoxicilina) • Utilización de material estéril exclusivamente.
TRANSFERENCIA NO QUIRÚRGICA
1. Llenar la sonda con medio de transferencia usando una jeringa de 1 ml
2. Insertar la sonda a través del cervix mientras se realiza una ligera presión positiva con medio utilizando la jeringa
3. Una vez pasado el cervix, introducir un volumen de medio de 0.3 ml para eliminar los posibles restos de mucus
4. Insertar la sonda totalmente 5. Introducir mediante una jeringa de 1 ml los embriones
contenidos en 0.1 ml de medio 6. Introducir un volumen de 0.3 ml de medio para arrastrar a
los embriones fuera de la sonda
CONSERVACIÓN DE LOS EMBRIONES: ALTERNATIVAS
1. Conservación 0-6 h. Transferencia en la propia granja de obtención de
los embriones
2. Conservación 6-24 h. Transporte de los embriones en las horas
siguientes a la obtención hasta su llegada a la granja receptora
3. Conservación Indefinida. Criopreservación y almacenamiento de los
embriones en N2 líquido hasta la transferencia.
1. Conservación 0-6 h.
Transferencia en la propia granja de obtención de los embriones Los embriones se conservan en el propio medio de recogida a 37ºC hasta el momento de la transferencia.
2. Conservación 6-24 h.
Transporte de los embriones en las horas siguientes a la obtención hasta su llegada a la granja receptora. Permite el transporte por tierra o aire a distancias considerables dentro del territorio nacional o países vecinos
Evaluación de diferentes medios y condiciones para el transporte y conservación de embriones hasta 24 h
Martínez y cols, 2014
Resultados reproductivos tras la transferencia No quirúrgica de embriones cultivados 24 h a 37ºC en TL-Hepes-PVA
Martínez y cols, 2014
La posibilidad de transportar y conservar los embriones por periodos de hasta 24 h resulta fundamental para puesta en práctica de esta tecnología en un contexto real de granjas comerciales. En la actualidad se trabaja en evaluar alternativas y resultados que permitan la conservación por periodos de tiempo mayores , hasta 72 h , que prácticamente permitirían la distribución global de los embriones.
3. Conservación Indefinida. Criopreservación y almacenamiento de los embriones en N2
líquido hasta la transferencia. Situación ideal pues permite el transporte a cualquier lugar del planeta y simplifica la logística tanto en la granja donante como en la receptora.
Altas velocidades de enfriamiento
Elevadas concentraciones de crioprotectores
Vitrificación
Rall y Fahy (1985)
Solidificación de una solución viscosa a bajas temperaturas sin
la formación de cristales de hielo. El líquido se transforma en un
vidrio amorfo, como resultado del rápido enfriamiento,
conservando las propiedades físico-químicas de un líquido.
Ventajas
Se evita la formación de cristales de hielo
Reduce el tiempo de exposición al intervalo crítico de temperatura
Pajuela Super-OPS
•Contacto drecto con el N2 líquido •Mínimo volumen de medio
(Vajta y cols., 1997)
Tiempo
Temperatura
-196
-30
0
20
OPS Vitrificación (20,000°C / min) SOPS Vitrificación (36,000°C / min)
Vitrificación TCMm
TCM 199 Hepes + 20% NBCS
V1 (3 min) TCMm + 7,5% Me2SO + 7,5% EG
TCMm
TCM 199 Hepes + 20% NBCS
V2 (1 min) TCMm + % Me2SO + % EG
TCMm TCMm
V1
V2
(Vajta y cols.,1997)
Pese a la excelente supervivencia in vitro de embriones vitrificados y calentados (> 90% en Blastocistos y alrededor del 80% en Mórulas) y los buenos resultados tras la transferencia quirúrgica de estos embriones, su utilización en conjunción con la técnica de transferencia No quirúrgica no había permitido alcanzar los resultados esperados.
Resultados reproductivos tras la transferencia de embriones vitrificados 1. S-30. Transferencia quirúrgica de 30
embriones vitrificados
2. NsDU-30. Transferencia No quirúrgica de 30 embriones vitrifcados
3. NsDU-40. Transferencia No quirúrgica de 40 embriones vitrificados.
Martínez y col, 2015
La transferencia No quirúrgica de al menos 40 embriones vitrificados permite la obtención de resultados muy prometedores
La transferencia de embriones es una alternativa real para el intercambio de material genético que ha de desempeñar un papel decisivo en los programas de mejora genética en los próximos años
Es necesario seguir trabajando para superar las dificultades que aún limitan la aplicación de esta tecnología
En la actualidad ya se están poniendo en marcha las primeras iniciativas para el uso comercial de esta tecnología